Этот протокол демонстрирует инъекции височной вены для внутривенной передачи педиатрических раковых клеток неонатальным мышам, что позволяет точно и воспроизводимо моделировать иммунные реакции на ранние стадии на рак. Метод позволяет оценить влияние вмешательств, таких как иммуномодуляция или терапия, при их применении в неонатальный период.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модель неонатальной внутривенной трансплантации для оценки иммунной активности в раннем возрасте против раковых клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Более половины всех педиатрических видов рака возникают в утробе, при этом прогрессирование явного заболевания продолжается в течение неонатального периода. Хотя иммунотерапии теперь предлагают новые варианты лечения для многих детей с раком, то, как иммунитет в раннем возрасте влияет на прогрессирование рака и реакцию на лечение, остаётся до конца непонятным. Для устранения этого разрыва потребуется оценка терапевтических вмешательств в неонатальный период, когда иммунные ответы принципиально отличаются от ответов в более позднем детстве и взрослом возрасте.
Здесь мы описываем модель неонатальной трансплантации, интегрирующуюся с биолюминесцентной in vivo визуализацией для изучения влияния иммунной модуляции в раннем возрасте на детские виды рака.
Инъекция клеток, помеченных люциферазой, в височную вену, полученная из двух случаев рака, инициированных утробой, достигла воспроизводимой прививки опухоли у сингенетических реципиентов возрастом от 1–2 дней, без смертности, связанной с процедурой, и с высоким процедурным успехом, подтвержденным биолюминесцентной визуализацией. Используя иммуномодуляцию, вызванную инфекцией, как экспериментальную переменную, мы показали, что внутрибрюшинная инфекция мышиным цитомегаловирусом через пять дней после трансплантации приводит к заметному снижению нагрузки на острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), но не при нейробластоме (НБ). Эта платформа позволяет изучать специфические для рака различия в реакции на иммуномодуляцию в раннем возрасте и подчеркивает важность контекста опухоли при моделировании взаимодействий иммунно-раковых отношений в раннем возрасте.
В совокупности эта методология предоставляет универсальную и высоковоспроизводимую платформу для изучения неонатальных иммунных механизмов, связанных с онкологическим иммунным надзором, инфекционно-ориентированной иммуномодуляцией и терапевтическим вмешательством. Помимо ALL и NB, этот подход может быть адаптирован для дополнительных педиатрических злокачественных заболеваний и иммуномодуляторных стратегий, поддерживая механистические исследования и доклиническую оценку вмешательств при раке в раннем возрасте.
Введение
Недавние достижения в иммунотерапии значительно улучшили результаты для некоторых пациентов с раком, однако их оптимальное применение у маленьких детей требует глубокого понимания того, как развивающаяся иммунная система выявляет и уничтожает раковые клетки. Хотя примерно 50% детских онкологических заболеваний возникают в утробе, включая B-клеточную острую лимфобластную лейкемию (B-ALL) и NB, растущие данные свидетельствуют о том, что постнатальные события критически влияют на эволюцию заболевания и клиническийисход 1,2.
Иммунные ответы новорождённых количественно и качественно отличаются от ответоввзрослых 3. При отсутствии полностью развитого адаптивного иммунитета защита новорождённых во многом зависит от материнских антител и врождённых иммунных клеток. Однако эти врождённые эффекторы функционально менее эффективны, чем взрослые, из-за гипочувствительности, присвязанной клеточной клетки, и усиленной активации иммуносупрессивных путей, что делает новорождённых особенно уязвимыми к инфекции 4,5,6. Однако влияние этих характеристик на способность незрелой иммунной системы создавать эффективные противораковые реакции остаётся недостаточно изученным.
Моделирование противоракового иммунитета в раннем возрасте требует точной и воспроизводимой доставки раковых клеток и иммуномодуляторов или патогенов в короткое послеродовое окно, когда иммунная функция ограничена. Инъекция в височную вену — это неонатальный внутривенный (IV) метод, который лучше всего соответствует этим требованиям и обеспечивает высокий процессуальный успех, низкую смертность, минимальный стресс при обращении и совместимость с последовательными вмешательствами, такими как вызов при инфекции или терапевтическоевведение 7,8,9,10.
В этом исследовании мы опирались и модифицировали ранее проверенные методы внутривенного введения новорождённых и универсальность биолюминесцентной in vivo визуализации, чтобы описать модель трансплантации с целью изучения влияния ранней инфекции на прогрессирование раковых клеток у детей. Этот подход позволяет внутривенно вводить клетки B-ALL или NB, помеченные люциферазой, детёнышам в возрасте 1–2 дня, а затем иммуномодуляцию через внутрибрюшинное (I.p.) введение мышиного цитомегаловируса (mCMV) на 7-й день после родов (P7). Прогрессирование рака было оценено через 10 дней после заражения (P17).
Хотя доступ к височной вене ограничен ограниченным постнатальным окном (P0–P3), эта методология повышает воспроизводимость и экспериментальный контроль, предоставляя универсальную платформу для изучения влияния иммунных механизмов раннего возраста на иммунонадзор при раке, взаимодействие инфекций и рака и ответы на иммунотерапию. Кроме того, этот подход способствует эффективному самонахожанию трансплантированных клеток, что позволяет воспроизводимо создавать модели заболеваний для механистических исследований.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры (рисунок 1) проводились в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными и были утверждены Комитетом по уходу за животными Университета Британской Колумбии (протокол A23-0169).
1. Генерация лейкемических клеток, помеченных люциферазой
- Выделение лейкемических клеток у лейкемических мышей Eμ-Ret
- Анестезиировать мышей в индукционной камере объёмом 1 л с 5% изофлурана и 1 л·мин-1 кислородом до достижения глубокой хирургической плоскости (потеря рефлекса выпрямления и медленное, регулярное дыхание).
- После подтверждения глубокой анестезии прекратите прием изофлурана и введите углекислый газ (CO₂) с высокой скоростью потока (в 3–4 раза выше стандартной скорости постепенного смещения; например, 6–8 л·мин для камеры 10 л) без перемещения животного между камерами. Поддерживайте воздействие CO₂ не менее 5 минут после прекращения дыхания, чтобы обеспечить смерть.
- Вентилируйте и собирайте отходы перед открытием камеры.
- Подтвердите смерть при отсутствии сердцебиения и дыхания, затем выполните вывих шейки матки как вторичный физический метод в соответствии с институциональными требованиями.
- Переложите тушу в биозащитный шкаф, подтвердите смерть, зафиксируйте пол и вес тела, а снажную поверхность обрабатывайте 70% этанолом.
- Сделайте разрез по средней линии живота, отражайте кожу и перитонеальную стенку, а также вырежьте селезёнку в стерильный PBS объемом 5 мл.
- Вскрытие большеберцовой и бедренной кости с обеих ног, удаление излишней ткани и удаление селезёнки в стерильных условиях. Немедленно перенесите селезёнку в стерильный, ледяной раствор с фосфатным буфером (PBS) объёмом 5 мл для сохранения жизнеспособности клетки.
- Обрабатывайте селезёнку.
- Гомогенизировать ткань селезёнки в 1 мл буфера лизиса 1× эритроцитов (эритроцитов) (использовать 2 мл для селезёнки > 200 мг). Инкубировать 2–3 минуты при комнатной температуре.
- Закалить лизис, добавив 10 мл PBS + 2 % плодовой бычьей сыворотки (FBS) (FACS буфер), профильтровать через сито 40 мкм и провести центрифугу при 350 × г в течение 5 минут при 4 °C.
- Суспензируйте пеллету селезёнки в буфере FACS 5 мл.
- Обработайте костный мозг.
- Вырезать оба эпифиза и промыть каждую кость буфером FACS объемом 1 мл с помощью шприца 1 мл с иглой 29 калибра в трубку на 15 мл.
- Центрифугуйте суспензию ячейки, сбросьте супернатант и ресуспензировать клетки в 1 мл 1× буфера лизиса эритроцитов, инкубировать 2 минуты при RT, затем закалить лизис, добавив буфер FACS на 10 мл, профильтровать через сито диаметром 40 мкм и центрифугировать при 350 × г в течение 5 минут при 4 °C.
- Сбросьте супернатант и подвесьте таблетку BM в буфере FACS объемом 1 мл, прокручивая трубу вверх и вниз.
- Аккуратно происпользуйте вихрь и профильтруйте через сито 40 мкм, если нужно.
- Ресуспендировать 0,5 × 10^6 лейкемических клеток в культурной среде с объёмом 200 мкл (например, модифицированная орлиная среда Dulbecco (DMEM)), дополненная 20 % FBS и интерлейкином-7 (IL-7; 250 pg·mL-1).
Точка паузы: Держите ячейные суспензии на льду до 2 часов перед нанесением окраски.
- Лентивирусная трансдукция лейкемических клеток:
- Семенные мышиные костные клетки, полученные из костного мозга, при 1 × 10^5 клеток на яме в пластине с 24 лунками за 24 часа до трансдукции, чтобы обеспечить присоединение и достижение 70–80% слияния.
- Пластинчатые лейкемические клетки (0,5 × 10^6 клеток в итоговом объёме 200 мкл) в нетканевой культуре обработанной пластинкой с 24 лунками.
- Добавьте самоинактивирующийся (SIN) лентивирусный вектор, кодирующей двойной репортер, состоящий из люциферазы жука-клика красного (CBR) и усиленного зелёного флуоресцентного белка (eGFP), управляемых конститутивным промотором убиквитина, с множественностью инфекции (MOI): 10–20, вирусным титром: ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1 (единицы трансдукции на миллилитр) при конечном объёме трансдукции 200 мкл вместе с полибреном (8 мкг·мл-1; Sigma, H9268-5G).
ВНИМАНИЕ: Полибрен является цитотоксичным при высоких концентрациях. Не превышает 8 мкг·мл-1. Обрабатывайте лентивирус в условиях удержания уровня биобезопасности 2 (BSL-2). - Запечатайте пластину парапленкой и центрифугой при 1200 × г на 20 минут при комнатной температуре (RT).
- После спинокуляции переносят трансдуцированные лейкемические клетки на стромальный монослой и культурируют в течение 24 часов при 37 °C, 5% CO₂ в DMEM + 20 % FBS + IL-7 (250 pg·mL-1) для поддержки выживаемости клеток и экспрессии репортеров.
ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотики могут быть добавлены после 24 часов при необходимости, но их следует избегать во время вирусной трансдукции. - Через 24 часа соберите неадгезирующие лейкемические клетки и дважды промыйте стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) 350 × г в течение 20 минут при 4 °C, чтобы удалить остаточный вирус и полибрен.
- Ресуспензировать клетки в стерильной PBS на 1 × 10^7 клеток·мЛ-1 для трансплантации.
Точка паузы: после промывки клетки можно поддерживать в одном и том же состоянии культуры до 48 часов до трансплантации, если это необходимо.
- Трансплантация во взрослых мышей NSG (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rgtm1Wjl/SzJ)
- Используйте мышей NSG возрастом 4–6 недель в качестве получателя.
- Прогрейте мышь 5 минут с помощью подогревающей подушки или лампы для расширения хвостовых вен.
- Фиксируйте мышь с помощью акрилового ограничителя.
- Введите 1 × 10^6 клетки в стерильную PBS объёмом 100 мкл через боковую хвостовую вену с помощью инсулинового шприца калибра 29 калибра. Анестезия не требуется (если только это не требует институциональные правила)
- Мягко прижимайте место инъекции, чтобы предотвратить кровотечение.
ВНИМАНИЕ: Избегайте экстравазации. Успешная внутривенная инъекция не приводит к отсутствию видимого отёка. - Проводите мониторинг мышей два раза в неделю на предмет развития заболевания.
- Сортировка GFP+ лейкемических клеток
- При начале болезни собирайте BM или селезёнку у лейкемических мышей NSG.
- Подготовьте подвеску с одной ячейкой, как описано выше.
- Окрашивайте клетки с помощью красителя жизнеспособности (7-AAD).
- Используйте флуоресцентно-активированную сортировку клеток (FACS) для сортировки лейкемических клеток GFP+.
- Для сортировки используйте высокоскоростной сортировщик ячеек и следуйте стратегии гейтинга: прямое рассеяние (FSC) против бокового рассеяния (SSC) → исключение мусора, FSC-A против FSC-H → селективных синглетов, жизнеспособность — отрицательный → выделение живых клеток, GFP+ гейт → изолировать репортерно-положительные лейкемические клетки.
- Соберите отсортированные клетки в пробирки с DMEM + 20 % FBS. Целевая чистота после сортировки: ≥ 95 % GFP+ клеток.
Точка паузы: Отсортированные клетки можно хранить на льду до 2 часов до криоконсервации.
- Криоконсервация отсортированных клеток
- Отсортированные клетки повторно суспендируют в концентрации 5 × 10^6 клеток/мл в замороженной среде, содержащей 90 % FBS и 10 % диметилсульфоксида (DMSO).
- Аликвотируйте 1 мл на криовиал, помещайте флаконы в морозильник на основе изопропанола и храните при −80 °C на ночь (12–18 часов).
- Перенесите флаконы в жидкий азот (LN₂) для длительного хранения.
ВНИМАНИЕ: ДМСО токсичен и легко всасывается через кожу. Обращайтесь с перчатками и работайте быстро.
Точка паузы: клетки могут долго храниться в жидком азоте до использования в экспериментах по неонатальной трансплантации.
2. Генерация NB-клеток с люциферазой
ПРИМЕЧАНИЕ: У TH-MYCN трансгенных мышей развиваются спонтанные опухоли NB и поддерживаются по утверждённым институциональным протоколам ухода за животными. Используемый лентивирусный вектор совпадает с описанием в разделе 1.2.
- Сбор опухоли и диссоциация тканей
- Эвтаназия мышей с опухолями TH-MYCN согласно утверждённым рекомендациям по уходу за животными.
- Извлекать подкожные или брюшные NB опухоли в стерильных условиях.
- Взвесьте ткань опухоли и измельчите на фрагменты размером ~1–2 мм с помощью стерильных ножниц.
- Переместить ткань в буфер пищеварения примерно 5 мл на 0,5 г опухолевой ткани в конической трубке объёмом 15 мл, состоящей из DMEM, дезоксирибонуклеазы I (DNase I; 50–100 U·mL-1) и смеси ферментов на основе коллагеназы (10 мкг·мл-1 конечная концентрация).
- Инкубировать при 37 °C в встряхивающем инкубаторе при 150 об/мин в течение 30 минут.
ВНИМАНИЕ: Ферментные реагенты для пищеварения могут вызывать раздражение кожи и глаз. Надевайте перчатки и защиту для глаз. - После пищеварения аккуратно втягивайте пипетку вверх и вниз, чтобы дополнительно диссоциировать ткани. Фильтруйте суспензию через сито 70 мкм в новую трубку.
- Центрифуга при 300 × г в течение 5 минут при комнатной температуре (20–22 °C).
- Отбросьте супернатант и ресуспензируйте пеллеты в DMEM с добавлением 10% FBS.
- Проведите лизис эритроцитов с использованием буфера лизиса RBS, как описано ранее в разделе 1.1.
- Центрифуга при 300 × г в течение 5 минут и ресуспендировать гранулы в 10 мл с высоким содержанием глюкозы DMEM с добавлением 10% FBS и 50 мкм 2-меркаптоэтанола.
ВНИМАНИЕ: 2-меркаптоэтанол токсичен и летучий. Проводите обращение в вытяжке с химическими выпарителями.
Точка паузы: Клетки могут оставаться на льду до 1 часа перед трансдукцией.
- Лентивирусная трансдукция
- Пеллет 2 × 10^6 NB-клеток при 300 × г в течение 5 минут и полностью удалить супернатант.
- Ресуспензировать клеточную гранулу непосредственно в концентрированном лентивирусном векторе с концентрацией 14 мкл (тот же вектор, описанный в разделе 1.2; вирусный титр ≥ 1 × 10^8 TU·mL-1, приблизительный MOI: 10–20).
- Инкубировать смесь клеток и вирус в течение 5 минут при 37 °C в увлажнённом инкубаторе (% CO₂).
- Добавьте 200 мкл высокоглюкозного ДМЭМ + 10% ФБС и продолжайте инкубацию в течение 2 часов при 37 °C, 5% CO₂.
ВНИМАНИЕ: Лентивирусные векторы должны обрабатываться при условиях BSL 2. - Четыре раза трансдуцированы клетки с высоким содержанием глюкозы DMEM для удаления остаточного вируса.
- Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью трипан-синего исключения.
ВАЖНО: Всегда держите матричную подготовку на льду, чтобы предотвратить преждевременное гелирование.
- Подкожная имплантация мышам NSG
- Ресуспензировать клетки при 5 × 10^6 клеток на 100 мкл в холодной матриксе базальной мембраны (внеклеточное матрикс, редукционированное фактором роста).
- Анестезируйте мышей NSG возрастом 6–8 недель (см. раздел 1.1) с помощью ингаляционного изофлурана (2–3% кислорода).
- Смесь ячейки и матрицы загрузить в предварительно охлаждённый шприц объёмом 1 мл, оснащённый иглой 27 калибров.
- Введите 5 × 10^6 клеток в общим объёме 100 мкл подкожно в боковую область.
- Следите за мышами до полного восстановления после наркоза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите сразу после смешивания с матрицей, чтобы предотвратить затвердевание внутри шприца. - Позволить опухолям вырасти до ~1 см в диаметре.
- Сортировка ячеек
- Извлекать опухоли и создавать одноклеточные суспензии, как описано в разделах 2.1–2.2.
- Обогащать клетки, маркированные люциферазой, с помощью FACS на основе экспрессии GFP, следуя стратегии гейтинга, описанной в разделе 1.4.
- Проведите два последовательных раунда сортировки, чтобы достичь чистоты ≥ 95% положительной по GFP.
- Криоконсервация
- Криоконсервированные отсортированные клетки, как описано в разделе 1.5.
Точка паузы: Клетки можно долго хранить в жидком азоте для будущих экспериментов по трансплантации.
- Криоконсервированные отсортированные клетки, как описано в разделе 1.5.
3. Подготовьте клеточную суспензию для инъекции височной вены
- Быстро оттаять криоконсервированные лейкемические клетки с люциферазой или NB-клетки в водяной ванне при температуре 37 °C, пока не останется небольшой ледяной кристалл.
- Немедленно продезинфицируйте наружную часть флакона 70 % этанолом, затем переведите содержимое в 9 мл предварительно нагретого DMEM + 10 % FBS в конической трубке объемом 15 мл.
- Центрифугировать при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C, аспирировать супернатант и снова подвесить гранулу в стерильной, ледяной PBS.
- Определите жизнеспособность с помощью исключения трипана синего и гемоцитометра (или автоматического счётчика клеток). Используйте только подвески с ≥ 80% жизнеспособности.
- Пропустите суспензию ячейки через сито 40 мкм для удаления комков.
ВНИМАНИЕ: Клеточные сгустки увеличивают количество неудачных инъекций и повреждения тканей. - Отрегулируйте концентрацию, чтобы подготовить 20 мкл на новорождённого, содержащего 1 × 10^4 лейкемических клеток (для лейкемической трансплантации) или 5 × 10^4 NB клеток (для трансплантации NB).
- Держите ячейку в суспензии на льду и аккуратно перемешивайте сразу перед загрузкой шприца, чтобы сохранить однородность.
Точка паузы: Если жизнеспособность остаётся ≥ 80%, держите клетки на льду до 2 часов до инъекции.
4. Инъекция височной вены (щенки P1–P2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Неонатальная височная вена может проводиться без анестезии. Однако кратковременная гипотермическая иммобилизация часто используется для уменьшения подвижности и повышения точности инъекций. Использование гипотермической иммобилизации запрещено некоторыми институциональными комитетами по уходу за животными — исследователи должны консультироваться с соответствующим институциональным комитетом перед проведением этой процедуры. Если ваше учреждение одобрило, следующие шаги эффективны для гипотермической иммобилизации.
- Подготовьте небольшой контейнер, выстлан стерильной салфеткой, и предварительно охладите её, положив на лёд.
- Отместить щенков (послеродовой день 1–2; P1–P2) на салфетке внутри контейнера для гипотермической иммобилизации в течение 2–3 минут, пока спонтанное движение не будет заметно уменьшено.
ВАЖНО: Не позволяйте щенкам напрямую контактировать со льдом (используйте контейнер и барьер для салфеток постоянно). - Загрузите 60 мкл подвески ячейки в стеклянный шприц объёмом 100 мкл и прикрепите иглу 30-го калибра. Выпустите суспензию обратно в трубку, чтобы заполнить мёртвый объём шприца и иглы. После запуска мёртвого объёма аспирируйте 20 мкл суспензии ячейки для инъекции, чтобы не было воздушных пузырьков. Используйте мышей BALB/c и TH-MYCN в качестве реципиентов лейкемических и NB клеток соответственно.
- Подготовьте трансосветленную сцену, разместив холодный источник света под платформой из плексигласа.
- Наденьте увеличительные очки (или используйте стереомикроскоп), чтобы визуализировать место инъекции.
- Положите стерильную салфетку с центральным отверстием на сцену и разместите щенка так, чтобы виден високовой вена.
- Положите небольшой кусочек пластилина (пластилина) рядом с головой щенка, чтобы стабилизировать иглу во время инъекции.
- Введите скошенную иглу в видимую височную вену и медленно вводите суспензию клетки, наблюдая сосудистую пломбу для подтверждения успешной внутривенной вводки.
- После инъекции приложите мягкое давление на место инъекции стерильной ватной палочкой. Положите щенка на тёплую поверхность для восстановления (примерно при 37 °C, например, грелку на низком уровне с полотенцем), пока движение и розовый цвет не вернутся.
- Следите за щенком в течение 5–10 минут после восстановления, затем возвращайте его на плотину.
ВНИМАНИЕ: Избегайте перегрева во время восстановления. Используйте барьерный слой и контролируйте его постоянно. - Сразу прополосните шприц PBS, затем очищающим раствором для шприца и завершите 70% этанолом.
5. Подготовка и заражение вирусом
- Выполнять все процедуры, связанные с мышиным цитомегаловирусом (mCMV) в рамках сдерживания BSL-2 в соответствии с институциональными разрешениями по биобезопасности и уходу за животными.
- Обрабатывайте вирусные запасы в сертифицированном биологическом шкафе класса II и проводите инфекции животных в назначенных зонах процедур BSL-2.
- Проводить подготовку и обращение с вирусами в сертифицированном биологическом шкафу класса II, а также проводить заражения животных в специально отведённых зонах процедур BSL-2.
- Наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая лабораторный халат или одноразовый халат, перчатки и защиту для глаз. Рассматривайте все материалы, содержащие вирус (шприцы, подстилки, клетки и поверхности) как потенциально инфекционные.
- Минимизируйте использование острых предметов и немедленно утилизируйте иглы в одобренные контейнеры для биологической опасности. Дезинфицируйте рабочие поверхности и оборудование после использования. Утилизировать все твёрдые и жидкие отходы как биологически опасные в соответствии с институциональными процедурами.
- Инфицировать мышей на P7 (5–6 дней после трансплантации лейкемических клеток).
- Разморозьте вирусный аликвот на льду, аккуратно перемешайте инверсией и оставьте на льду во время приготовления. Избегайте повторяющихся циклов замораживания и оттаивания (используйте одноразовые аликвоты).
- Подготовьте mCMV с 2 × единицами образования бляшек (PFU)/mL в PBS и вводите щенкам внутрибрюшно (i.p.) 1 × 10^4 PFU в 50 мкл PBS с помощью иголки 30 калибра. Вводите в нижний правый квадрант брюшной полости под малым углом, чтобы избежать повреждения брюшной полости.
ВНИМАНИЕ: mCMV инфекционен (BSL-2). Используйте соответствующее удержание и дезактивацию. - Зафиксируйте идентификацию животных, возраст, экспериментальную группу, дозу вируса, объём и детали инъекций.
6. Биолюминесцентная визуализация (BLI)
ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите BLI при P7 (5–6 дней после инъекции клетки и до инфекции) и P17 (через 10 дней после заражения), как описано ниже.
- Растворить D-люциферин в PBS при 10 мкг·μл-1. Фильтруйте-стерилизуйте с помощью фильтра 0,22 мкм, аликвот, и храните при −20 °C, защищённом от света.
ВНИМАНИЕ: D-люциферин чувствительный к свету. Минимизируйте воздействие света во время подготовки и использования. - Вводите D-люциферин в 50 мкл на одного малыша с помощью иголки 30 калибра.
- Анестезировать щенков изофлураном (индукция 3–4 %, поддержание 1,5–2 %) в кислороде (0,8–1,0 л·мин-1). Поддерживайте температуру тела на подогретой сцене визуализации (примерно 37 °C).
ВНИМАНИЕ: Изофлуран — летучий анестетик. Используйте одобренный вапорайзер и систему очистки. - Поместить анестезиированных щенков в систему визуализации мелких животных (детали прибора приведены в таблице материалов).
- Получайте биолюминесцентные и рентгеновские изображения с постоянными настройками экспозиции через 10 минут после введения D-люциферина (настройки BLI: время экспозиции 120 с для P7 и 30 с для P17, бининг B4 для P7 и B4 для P17, поле зрения (FOV) 25, диафрагма 1.2, высота объекта 1.5 и рентгеновские настройки: высокое разрешение, высокая мощность).
Точка паузы: Сохраняйте файлы изображений сразу после создания изображения; Анализ можно провести позже. - Анализируйте изображения с помощью соответствующего программного обеспечения BLI, определяя области интереса (ROI), охватывающие всё тело каждой мыши, и количественно оценивая излучаемый свет в виде фотонов·1·см⁻2·sr⁻1.
- Экспортировать количественно оценённые значения ROI для дальнейшего статистического анализа.
7. Сбор лейкемических клеток у мышей, пересаженных в клетки
- Извлекать лейкемические клетки и создавать одноклеточные суспензии, как описано в разделе 1.1.
8. Окрашивание и получение методом проточной цитометрии
- Подсчитывайте клетки и центрифугные суспензии при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C и повторно суспензировать на 1 × 10^7 клеток·мл-1 в буфере FACS.
- Перенесите 100 мкл (1 × 10^6 ячейки) в проточные цитометрические трубки полистирола.
- Добавьте антитело, блокирующее Fc-рецепторы (анти-CD16/32; 1 мкл на пробирку) и инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
- Приготовьте мастер-смесь антител в буфере FACS и добавьте в каждую пробирку CD19-FITC, BP1-PE, B220-APC и отрицательные маркеры линии (TER119-PerCP, CD3-PerCP, CD11b-PerCP), 1 мкл каждого антитела на 1 x 10^6 клеток в буфере FACS 100 мкл.
- Инкубировать 20 минут при комнатной температуре в темноте.
- Промывайте буфером FACS объемом 5 мл, центрифугой и ресуспензией в буфере FACS объемом 200 мкл, содержащем 7-AAD (3 мкл) и счётные шарики (6 мкл; 6 000 шариков).
- Подготовьте контроли компенсации с одним окрашением с использованием шариков или клеток для захвата антител и получите контрольные данные вместе с экспериментальными образцами.
- Возьмите образцы с помощью потокового цитометра, используя стандартные настройки детектора FITC/PE/APC/PerCP и среднюю скорость расхода. Собирайте события, пока не наберёте 1 000 бусин.
- Экспортировать файлы FCS и анализировать с помощью программного обеспечения для анализа потоковой цитометрии (перечисленного в таблице материалов) с использованием установленной стратегии гейтинга (рисунок 2D).
- Вычислите абсолютное количество клеток на селезёнку или костный мозг с помощью подсчётных бусин, умножая количество целевых событий, полученных на 1 000 бусин, на коэффициент масштабирования 6 (добавлено 6 000 бусин) и нормализуя до общей клеточности органа на основе доли окрашенных клеток (1 × 10^6 клеток).
9. Построение графиков и статистический анализ
ПРИМЕЧАНИЕ: Генерируйте графики и выполняйте статистический анализ данных BLI и потоковой цитометрии с помощью программного обеспечения (указано в таблице материалов).
- Представлены данные как среднее ± стандартной ошибке среднего значения (SEM).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ни одно животное не было исключено из этого исследования. - Для BLI сравнивайте группы PBS и mCMV отдельно на P7 и P17 с помощью непарных тестов Манна–Уитни с применением коррекции Холма–Шидака для корректировки множественных сравнений между временными точками.
- Анализировать результаты потоковой цитометрии с помощью двухстороннего непарного теста Манна–Уитни.
- Определите статистическую значимость как p < 0,05.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Инъекция височной вены обеспечивает эффективную неонатальную прививку клеток лейкемии и нейробластомы
Для моделирования влияния инфекции в раннем возрасте на прогрессирование детского рака внутривенно через височную вену вводились в сингенетические детёныши возрастом 1–2 дней через височную вену. Успешная трансплантация была подтверждена через пять дней после трансплантации с помощью BLI и рентгеновской визуализации как при лейкемии (рисунок 2A
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Понимание того, как раннее развитие иммунного развития влияет на прогрессирование рака, крайне важно для разработки иммуномодуляторных стратегий, соответствующих возрасту. В этом исследовании мы описываем воспроизводимую платформу неонатальной трансплантации, которая обеспечивает точный временной контроль приращения раковых клеток и модуляции иммунота в критический период послеродовой иммунной незрелости. Сочетая внутривенное вводное введение через височную вену и BLI, эта модель позволя...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана операционными грантами Канадских институтов исследований здравоохранения для G.S.D.R. (MOP-126122). А.Ф. получил постдокторскую стипендию Программы исследований детского рака имени Майкла Куччоне (MC3RP).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 100µL, Microliter Syringe, Luer Tip | Hamilton | 80601 | - |
| 30 G Needle | BD | 305106 | - |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | - |
| Ami-X imaging system | Spectral Instruments Imaging | - | - |
| anti-mouse B220- APC | Biolegend | 103212 | - |
| anti-mouse CD19-FITC | Biolegend | 152404 | - |
| anti-mouse CD3ε- PerCP | Biolegend | 100326 | - |
| anti-mouse Ly-51-PE | Biolegend | 108308 | Также называется BP1 |
| anti-mouse TER119- PerCP | Biolegend | 116226 | - |
| anti-mouse/human CD11b- PerCP | Biolegend | 101230 | - |
| Aura software | Spectral Instruments Imaging | - | version 4.0.8 |
| BD Accuri C6 | BD | - | - |
| BD Fortessa X-20 | BD | - | - |
| Cleaning solution | Hamilton | 18310 | - |
| CountBright Absolute Counting Beads | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 2770930 | 6 µL contains 6000 beads |
| D-Luciferin | GoldBio | eLUCK-1G | - |
| DMEM | Gibco | 11965092 | - |
| DNase I | Sigma | 1.13E+10 | - |
| Falcon 40µm Cell Strainer, Blue, Sterile, Individually Packaged | FALCON | 352340 | - |
| FBS | Gibco | A5256701 | - |
| FlowJo software | BD | - | v10.8 |
| GeltrexTM | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | - |
| GraphPad Prism software | Dotmatics | - | v10.4.1 |
| LE.5209 Cold light source | Euromex | - | - |
| Liberase™ TM Research Grade | Sigma | 5.4E+09 | - |
| NSG mice | Jackson Labrotary | 5557 | NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ |
| Polybrene | Sigma | H9268-5G | - |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | 101301 | - |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | - |
Ссылки
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat Rev Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).
- Hwee, J., et al. A systematic review and meta-analysis of the association between childhood infections and the risk of childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 118 (1), 127(2018).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
- Tsafaras, G. P., Ntontsi, P., Xanthou, G. Advantages and Limitations of the Neonatal Immune System. Front Pediatr. 8, 5(2020).
- Basha, S., Surendran, N., Pichichero, M. Immune Responses in Neonates. Expert Rev Clin Immunol. 10 (9), 1171-1184 (2014).
- Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat Rev Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous Injections in Neonatal Mice. J Vis Exp. (93), e52037(2014).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread Gene Delivery and Structure-Specific Patterns of Expression in the Brain after Intraventricular Injections of Neonatal Mice with an Adeno-Associated Virus Vector. J Virol. 75 (24), 12382-12392 (2001).
- Wasala, L. P., Hakim, C. H., Yue, Y., Yang, N. N., Duan, D. Systemic Delivery of Adeno-Associated Viral Vectors in Mice and Dogs. Methods Mol Biol. 1937, 281-294 (2019).
- Glascock, J. J., et al. Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice. J Vis Exp. (56), e2968(2011).
- Farrokhi, A., et al. Early-life infection depletes preleukemic cells in model of hyperdiploid B-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 144 (8), 809-821 (2024).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim. 40 (5), 155-160 (2011).
- Pavathuparambil, A. M. N., et al. Facial vein injection of human cells in severe combined immunodeficiency (SCID) neonatal mice. MethodsX. 5, 1281-1286 (2018).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
