Аутологичная трансплантация нервов против множественных переносов нервов при повреждении верхнего плечевого сплетения туловища: исследование на модели крыс

Краткое содержание

Установив у крыс модели повреждения верхнего плечевого сплетения на уровне корня с помощью трансплантации нервов или переноса нервов, мы обнаружили, что обе группы достигли схожей мышечной силы; Прививки животных демонстрировали превосходную координацию движений.

Аннотация

Повреждения плечевого сплетения верхней части туловища (C5-C6) нарушают абдукцию плеча и сгибание локтя. При разрывах C5-C6 с сохранившимися проксимальными пнями традиционным методом остаётся нервная трансплантация (NG). Перенос нервов (НТ) является единственным жизнеспособным вариантом при авульсиях C5-C6. Текущий мировой стандарт для нейротерапии включает процедуры тройной переноски: спинномозговой вспомогательный нерв (SAN) на надлопаточный нерв (SSN), процедуру Оберлина и процедуру Лихавенгвонгса. Недавние клинические тенденции показывают расширение числа показаний на NT, включая сценарии разрыва корня, обусловленные тем, что дистальный NT значительно сокращает расстояние регенерации аксонов. Для прямого сравнения в этом исследовании были установлены две модели на крысах, имитирующих эти клинические стратегии: 1) модель NG, в которой пеньки C5-C6 были пересадены к SSN и верхней части ствола; 2) модель множественного NT, включающая вышеуказанные три процедуры. Функциональное восстановление (балл Очиай, тест на стопу Барта и тест на груминг Терзиса), электрофизиологические параметры и восстановленное количество сенсорных аксонов оценивались на 8 и 16 неделях после операции. На 8-й неделе статистически значимых различий в функциональных результатах между группами не было. К 16 неделям, хотя результаты Очиаи и Терзиса оставались сопоставимыми, NG показал значительно лучшие результаты на тесте Барта. С электрофизиологической точки зрения НТ показала значительно более высокие показатели восстановления мышечно-кожных, подмышечных и надлопаточных нервов на 8-й неделе. Однако к 16 неделям эти электрофизиологические преимущества уже не были статистически значимыми. На 8-й неделе у NG уже было больше регенерированных сенсорных аксонов в мышечно-кожном и подмышечном нервах, при этом количество SSN было схожим. К 16 неделям НГ превзошел NT по количеству сенсорных аксонов для всех трёх нервов. Эти результаты в модели резкого пересечения C5-C6 на крыс показывают, что в течение 16 недель после операции НГ достигает сопоставимого функционального и электрофизиологического восстановления, сопоставимого с нейрофизиологическим процессом, при этом обеспечивая превосходное восстановление сенсорной и координированной моторной функции. Однако для определения трансляционной значимости этих результатов необходимы дальнейшие исследования с более длительным наблюдением.

Введение

Травмы плечевого сплетения обычно классифицируются на повреждения верхней части туловища (C5–C6, с участием C7 или без него), повреждение нижней части туловища (C8–T1) и повреждение пан-сплетения (C5–T1). Сжимающая сила, направленная на голову и плечо, обычно приводит к повреждению верхней части туловища. Поскольку верхние трансфораминальные связки на уровнях корня C5–C7 частично рассеиваются вверх по передаче травматического силы, разрыв этих корней — особенно C5 — в межпозвоночном отверстии не является^{редкостью 1}. Однако сильное насилие всё равно может привести к аульсиям корней и даже распространяться на нижнюю часть ствола. Когда верхняя конечность насильно отвлекается в горизонтальной плоскости, преобладают вульсии корня нижнего ствола; При большей силе может произойти полная аульсия плечевого сплетения. Из-за отсутствия верхних трансфораминальных связок, защищающих корни C8–T1, практически все травматические повреждения нижней части ствола являются корневыми^{авульсиями 2}. Таким образом, что касается паттерна повреждения корня, корни C5–C6 более склонны к разрыву, тогда как корни C7–C8–T1 более подвержены авульсии. Эти патоанатомические характеристики критически важны для выбора подходящей хирургической стратегии.

Травмы верхней части туловища клинически характеризуются потерей абдукции плеча и сгибания локтя. У пациентов с разрывами C5–C6, у которых ещё присутствуют жизнеспособные проксимальные корневые пни, традиционной стратегией является трансплантация нервов (NG): остаточные корни C5 и C6 перемещаются — обычно с помощью аутотрансплантатов суральных нервов — к передним и задним отделениям верхнего ствола и к надлопаточному^{нерву 3}. Когда корни C5 и C6 авульзированы, перенос нервов (NT) становится единственным реконструктивным способом. Операционный алгоритм, принятый большинством центров по всему миру, объединяет три процедуры: спинномозговой вспомогательный нерв к надлопаточному нерву, один пучок локтевого нерва с бицепсовой ветвью мышечно-кожного нерва (процедура Оберлина) и длинную головочную ветвь трицепса от лучевого нерва к передней ветви подмышечного нерва (процедура Лихавенгвонга^).

За последнее десятилетие показатели NT в реконструкции плечевого сплетения постепенно расширялись: некоторые авторы теперь рекомендуют методы переноса даже для разрывов корня, утверждая, что дистальные переносы значительно сокращают регенеративное расстояние и, следовательно, ускоряют моторное ^{восстановление 5,6,7}. Однако до сих пор эти отчёты были сосредоточены исключительно на результатах мышечной силы после операции; Оценки ловкости и координированных движений — переменных, критически определяющих качество функционального восстановления, — остаются отсутствующими.

Учитывая, что остаточные корневые пни содержат большую долю сенсорных^{волокон 8} и исключают необходимость дальнодействующей корковой перекарты после^{реконструкции 9}, мы предполагаем, что при постганглионных разрывах C5–C6 NG с использованием жизнеспособных корневых пней C5–C6 в качестве источника регенерирующих аксонов обеспечивает более высокое общее качество функционального восстановления по сравнению с NT. Поскольку крыса широко признана идеальной экспериментальной моделью для повреждения плечевого сплетения и^{ремонта} 10,11,12, мы установим две взрослые модели постганглиозных поражений C5–C6, реконструированных с помощью НГ или НТ соответственно. Для сравнения двух групп и проверки изложенной гипотезы будут использованы поведенческие, электрофизиологические оценки и регенерированные сенсорные аксони.

Протокол

Этот протокол был утверждён Комитетом по защите животных и этике кафедры лабораторной работы с животными Фуданьского университета (Номер одобрения: 2019 Huashan Hospital JS-008).

Создание модели крысы
Повреждение верхней части туловища левой стороны
Температура в комнате поддерживалась на уровне 23–25 °C. Крысы Спраг-Доули были анестезиированы внутрибрюшническим раствором 1% натрия пентобарбитала (0,4 мл/100 г массы тела). После введения анестезии крысу помещали на операционную доску, а передние конечности были отведены под углом 90° от ствола. Шея, грудь, подмышечная мышь, а у животных только у NG — обе задние конечности были выбриты. Кожу дезинфицировали повидон-йодом. Шейный разрез длиной 3 см был сделан от криковидного хряща до верхней границы верхней черновой кости. Под операционным микроскопом подкожная ткань и глубокая фасция были рассеканы слой за слоем, чтобы обнажить грудинную мышцу, грудину, большую и малую грудную мышцы. Эти четыре мышцы были втянуты с помощью стерильных специально изготовленных ретракторов с бумажными скрепками. Дистальные концы ретракторов закреплялись резинками к операционной плате, а натяжение регулировалось для оптимального экспозиции при защите внутренней яремной вены. Были идентифицированы передние и средние скаленные мышцы, а надключичная часть плечевого сплетения в межскаленном пространстве была обнажена (рисунок 1A). Корни C5 и C6 были пересечени на 5 мм дистально от соответствующих межпозвоночных отверстий, затем резецирован сегмент 5 мм для создания определённого зазора (рисунок 1B). В группе NT проксимальные пни C5 и C6 были пришиты к соседним мягким тканям, чтобы предотвратить проникновение регенерирующих аксонов в дистальный путь.

Создание модели NG
L-образный разрез был сделан вдоль дорсолатеральной стороны задней лапы, через латеральную пересадку и вверх по латеральной стороне нижней части ноги. Под операционным микроскопом подкожная ткань и глубокая фасция рассекивались слой за слоем, заботясь о защите маленькой подкожной вены, затем обнажили и извлекали суральный нерв. Двусторонние суральные нервы имели общую длину 8 см. После обрезания периневральной соединительной ткани каждый нерв делился на восемь сегментов диаметром 1 см. Надлопаточный нерв был перерезан в месте своего происхождения из верхнего ствола. Один трансплантат использовался для перехода от C5 к надлопаточному нерву; три трансплантата из C5 и четыре трансплантата с C6 на верхний корпус (рисунок 1C).

Создание модели Нового Завета
Средняя линия шейного разреза была удлинена примерно на 2,5 см в сторону верхней части руки.  В точке, где выходит латеральная грудная кожная ветвь, крупная грудная мышца была разрезана вдоль волокна между большой грудной мышцей и бицепсами. Более глубокий малый грудной мышц был тупо рассечен, чтобы обнажить плечевое сплетение, проходящее под большой грудной мышцами. Локтевый нерв берётся из медиального пуповина и протекает наиболее медиально внутри сегмента пуповины (рисунок 1D). Мышечно-кожный нерв начинается от бокового мозга, проходит под нижней границей большого тереса в руку и, наконец, входит в живото мышцы бицепса плеча, проходя наиболее латерально внутри сегмента пуповины (рисунок 1D). Лучевой нерв начинается от задней спины, проходит под нижней границей широчайшего спинного сухожилия в заднюю часть плеча и отделяет три ветви, снабжающие длинные, медиальные и латеральные головки трицепса. Подмышечный нерв также берёт начало из заднего мозга, проходит через четырёхугольное пространство и делится на передние и задние ветви, которые иннервируют дельтовидную мышцу.

Перенос спинномозгового вспомогательного нерва на надлопаточный нерв
Грудино-ключно-сомастовидная мышца была втянута в средний разрез шейного отдела, чтобы открыть спинномозговой вспомогательный нерв. Нерв выходит из-под двубрюшной мышцы, достигает средней трети медиальной границы грудино-ключковидной мышцы, отдаёт грудино-ключно-соместовидную ветвь, продолжается вдоль задней границы этой мышцы и опускается латерально в шее для иннервации трапециевидной мышцы. Грудино-ключно-сомастовидная ветвь была пересечена для устранения натяжения вспомогательного нерва, которое могло бы нарушить место коаптации после переноса. Трапециеобразная ветвь была разделена в месте входа в мышцу. Надлопаточный нерв был пересечен в его происхождении дистально от верхней части ствола. Трапециеобразная ветвь вспомогательного нерва была коаптирана к надлопаточному нерву одним синтетическим полипропиленовым швом размером 10-0 (рисунок 1E).

Перенос локтевого нерва на моторную ветвь мышечно-кожного нерва (процедура Оберлина)
Основной ствол мышечно-кожного нерва был мобилизован дистально, пока вся моторная ветвь бицепса не была полностью открыта. На уровне средней трети моторной ветви бицепса был извращён пучок диаметром 6 мм с латеральной стороны локтевого нерва, и его дистальный конец был резко перерезан. Моторная ветвь бицепса была перерезана в её происхождении от мышечно-кожного нервного ствола. Мобилизованный локтевый пучок был прикреплён к моторной ветви бицепса одним синтетическим полипропиленовым швом 10-0. Полное обнажение моторной ветви бицепса служит двум целям: (1) для определения точного места для отбора пучка из локтевой нерва и (2) для обеспечения безнатяжной коаптации после переноса (см. рисунок 1F).

Перенос ветви лучевого длинноголового трицепса на переднюю ветвь подмышечного нерва (процедура Leechavengvongs)
Крыса была переведена в положение лежа, а передняя конечность была отведена под углом 90° к стволу. Спинная часть левой верхней части руки была выбрита и продезинфицирована. Продольный разрез длиной 3,5 см был сделан на спинной стороне левого плеча, простирающийся от плечевого сустава до среднего плечевого уровня. Под операционным микроскопом подкожная ткань и глубокая фасция были рассечени слой за слоем. Дельтовидная мышца была втянута, чтобы открыть подлежащее квадратное пространство, где из этого пространства выходили основной ствол подмышечного нерва и сопутствующие задние круговые плечевые сосуды. Подмышечный нерв был мобилизован дистально, пока все передние и задние отделения не были полностью обнажены непосредственно перед входом в дельтовидную мышцу живота. В том же разрезе был идентифицирован основной ствол лучевого нерва между длинной и латеральной головками трицепса. Лучевой нерв был мобилизован дистально, пока вся моторная ветвь к длинной головке трицепса не стала чётко визуализирована (рисунок 1G). Ветвь длинной головки трицепса была перерезана при входе в мышцу и отражалась проксимально, чтобы приблизиться к передней ветви подмышечного нерва. Передняя ветвь подмышечного нерва была перерезана в месте своего происхождения от основного ствола и отражалась дистально. Ветвление длинноголового трицепса к передней ветви подмышечного нерва было коаптирано одним синтетическим полипропиленовым швом 10-0 (рисунок 1H).

После завершения всех реконструкций нервов каждое хирургическое поле промывалось стерильным физиологическим раствором, а каждое место коаптации тщательно осматривалось для подтверждения целостности. Все разрезы были закрыты слоями: большая грудная мышца была приближена 5-0 швами из шелка (необходимыми только в шейном разрезе группы NT), затем подкожная фасция и кожа. Поскольку каждая нервная коаптация проводилась без напряжения, послеоперационная иммобилизация верхней конечности была ненужна.

Поведенческая оценка
Очкиаи 13
Крысу поднимали за хвост так, чтобы её тело было подвешено на 30 см над столом, и наблюдалась оза обеих передних конечностей. Крысу помещали на узкую взлётно-посадочную полосу (50 см в длину × 10 см в ширину) на столе, чтобы наблюдать за её походкой на передних конечностях во время ходьбы. Вся подиумная полоса была покрыта белой бумагой, а стартовая часть была увлажнена чёрными чернилами. Когда крыса идёт вперёд, появляются чёткие следы. 0 баллов — при подвешенном положении обе передние конечности свободно свисают прямо к полу (рисунок 2A-1); во время ходьбы ни одна из передних конечностей не тащит (рисунок 2A-2). 1 точка — при подвешенном состоянии поражённая передняя конечность слегка сгибается и сгибается (рисунок 2B-1); во время ходьбы наблюдается лёгкое волочение из-за ограниченного сгибания локтя (рисунок 2B-2). 2 точки — при подвешенном состоянии поражённая передняя конечность полностью согнута и приведена (рисунок 2C-1); во время ходьбы заметно сильное волосение (рисунок 2C-2).

Тест на неисправность стопы^{Барта 13}
Была подготовлена горизонтальная металлическая решётка (50 см × 38 см), поднятая на 11 см над столом; каждый квадрат сетки имеет размер 1,5 см. Крыса была размещена на сетке; всякий раз, когда поражённая передняя конечность проскальзывает через отверстие сетки, это фиксируется как «неисправность стопы» (рисунок 3). Количество ошибок стопы, произведённых поражённой конечностью за 2 минуты, было подсчитано.

Тест на груминг Терциса¹⁴
Крысу поместили в открытую прозрачную наблюдательную коробку. Примерно 1–3 мл обычного физиологического раствора было распылено на морду и лицо крысы, и наблюдались попытки удалить капли воды.

Степень 0 — отсутствует реакция со стороны поражённой конечности.
Степень 1 — поражённая конечность сгибается в локте и достигает рта, но не может дотянуться до носа (рисунок 4A).
Степень 2 — поражённая конечность достигает носа (рисунок 4B).
Степень 3 — поражённая конечность достигает выше носа, но не достигает глаза (рисунок 4C).
Степень 4 — поражённая конечность достигает глаза, но не достигает уха (рисунок 4D).
Степень 5 — поражённая конечность достигает уха или за ним (рисунок 4E).

Комплексный потенциал действия мышц (CMAP)
Крыса была анестезиирована, обездвижена и подготовлена, как описано ранее в протоколе, а надключичная часть и сегмент пуповина плечевого сплетения были обнажены. Чёрный записывающий игольчатый электрод вводился в брюшко целевшей мышцы (бицепс плеча, дельтовидный или инфраспинат). Красный записывающий электрод вводился в соединение сухожилия и мышцы той же мышцы. Зелёный эталонный электрод был помещён между чёрным и красным электродами (рисунок 5). Все электроды вставляются на глубину 2 мм, а с обеих сторон используются идентичные места вставки. Нерв аккуратно поднимали стимулирующим электродом для обследования. Был подан один импульс квадратной волны интенсивностью 0,5 мА и длительностью 0,2 мс; Задержка и амплитуда CMAP были зафиксированы. В качестве эталонной использовалась контралатеральная (здоровая) сторона (присваивалось значение 1). Были рассчитаны коэффициенты задержки задержки ([задержка на поражённой стороне/задержка на здоровой стороне] × 100 %) и скорость восстановления амплитуды ([амплитуда на поражённой стороне/амплитуда на здоровой стороне] × 100 %).

Иммунофлуоресцентное окрашивание
Миелинизированные волокна были маркированы антинейрофиламентом 200 (NF200); среди них моторные миелинизированные волокна различались по совместной маркировке с антихолиновой ацетилтрансферазой (ChAT). Волокна, положительные на NF200, но отрицательные на ChAT, поэтому классифицировались как сенсорные миелинизированные^{волокна 15}.

Для группы нервного трансплантата основной ствол мышечно-кожного, подмышечного и надлопаточного нервов был извращён дистально от второго места шва на поражённой конечности. В группе переноса нервов ветви бицепса мышечно-кожного нерва, передняя ветвь подмышечного нерва и надлопаточный нерв были удалены от соответствующих мест коаптации. Сегмент 3 мм каждого нерва был погружен в 4% параформальдегида и фиксирован при 4 °C в течение 24 часов.

Образцы были ориентированы перпендикулярно продольной оси, вложены в парафин и последовательно разрезаны с толщиной 3 мкм. После депарафинизации извлечение антигена проводилось в буфере ЭДТА 0,01 М (pH 8,0) с использованием микроволновой печи. Секции инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами, разбавлёнными в PBS (ChAT, 1:200; NF200, 1:500), затем следуют промывания с PBS и 50-минутная инкубация при комнатной температуре с вторичными антителами (Cy3-конъюгированный козлый анти-кролик, 1:300; Alexa Fluor 488-конъюгированный козлый антимышиный анти-мышиный препарат, 1:400), защищённый от света. Ядра были контрокрашены DAPI. Целые сечения каждого нерва были снимены под флуоресцентным микроскопом с слайд-сканером.

NF200 визуализировался с зелёной флуоресценцией, а ChAT — с красной флуоресценцией; NF200-положительные/отрицательные профили ChAT-отрицательных подсчитывались как сенсорные миелинизированные волокна. Пять случайно выбранных срезов из каждого нерва были проанализированы с помощью ImageJ. Общее количество сенсорно миелинизированных волокон во всём поперечном сечении учитывалось для каждого среза, а среднее значение пяти срезов считалось окончательным подсчётом для этого образца нерва.

Статистический анализ
Размер выборки (n = 8 на группу) был проспективно рассчитан с помощью G*Power с использованием размера пилотного эффекта сенсорного счёта аксонов (Коэн d = 2,31) для получения мощности ≥ 80 % при α = 0,05. Все статистические анализы проводились с помощью GraphPad Prism. Данные представлены как медиана (межквартильный диапазон) [M (p25–p75)]. Сравнения между группами проводились с тестом Mann-Whitney U. Значение P < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

На первый день после операции у крыс с NG и NT наблюдалась полная потеря абдукции плеча и сгибания локтя в оперированной конечности; Когда спинная часть поражённой передней конечности была уколота во время удержания животного, ни одна из групп не проявила синдрома отмены или вокализации. На 8-й неделе функция плеча и локтей улучшилась в обеих группах; Тот же стимул теперь вызывал ломку. К 16-й неделе было зафиксировано дальнейшее — хотя и неполное — восстановление. Когда уколывали спинну...

Обсуждение

Целью данного исследования было проверить нашу гипотезу о том, что реконструкция травм плечевого сплетения с использованием остаточной трансплантации нервного корня даёт в целом лучший результат по сравнению с переносом нервов. Взрослые крысы с разрывами C5–C6 были разделены на две группы: одна проходила реконструкцию верхнего ствола с помощью трансплантации нервов, а другая — через перенос спинномозгового вспомогательного нерва, ветви лучевого нерва с длинной головкой трицепса и фасцику...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1 и раз; Раствор для извлечения цитратного антигена	Servicebio	G1219-1L
1 и раз; Раствор для извлечения антигена Tris-EDTA (ph 8.0)	Servicebio	G1207-1L
1 и раз; Раствор для извлечения антигена Tris-EDTA (ph 9.0)	Servicebio	G1218-1L
10-0 ПРОЛЕН	Johnson& Johnson Med Tech	W2790
5-0 МЕРСИЛК	Johnson& Johnson Med Tech	SA82G
Alexa Fluor 488-конъюгированный козий антимышиный IgG (H+L)	Servicebio	GB25301
Анти-160 кДа нейрофиламентная среда мыши mAb	Servicebio	GB12763-100
Антихолиновая ацетилтрансфераза pAb у кролика	Servicebio	GB11070-1-100
Антифлуоресцентное средство для тушения	Servicebio	G1401
Бычий сывороточный альбумин	Servicebio	GC305010-5g
ChAT	Servicebio	GB11070-1
Cy3 конъюгированный козлый антикроличий IgG (H+L)	Servicebio	GB21303
DAPI	Servicebio	G1012-10
Машина вложения	GET Electronics (Hui ZHOU) Co., Ltd.	JB-P5
Флуоресцентный микроскоп	Nikon	Eclipse C1
Четырёхканальный электромиограф	Дантес	DT440
G*Power	Университет Генриха Гейне Dü Ссельдорф	3.1.9.7
Контроллер высокоскоростной камеры	Nikon	DS-U3
ImageJ	Национальные институты здравоохранения	1.8.0
Микрохирургические инструменты	Фабрика микроприборов Нинбо Чэнхэ	6804
Микроволновая печь	Galanz	P70D20TL-P4
Рабочий микроскоп	Шанхайский завод по производству медицинских оптических приборов	SXP-1B
Пипетт	Эппендорф	100221588457
Призма	GraphPad  Программное обеспечение	10.1.2
Ротационный микротом	Leica	RM2016
Сканер	Epson	V300
Спраг Доули Рэт	Shanghai Sippe-Bk Lab Animal	OR-1001
Тканевый автофлуоресцентный гаситель	Servicebio	G1221-5ML
Маркировка тканей Pen‌	Gene Tech	GT1001