Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мультимодальный подход к оценке регенерации костей и работы каркасов

332 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69483

⸱

13 февраля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Condensed Matter, Applied Physics and Nanoscience, Brazilian Center for Research in Physics, 3Alberto Luiz Coimbra Institute for Graduate Studies and Research in Engineering (COPPE), Federal University of Rio de Janeiro, 4Brazilian Synchrotron Light Laboratory (LNLS), Brazilian Center for Research in Energy and Materials (CNPEM)

В этой статье

Краткое содержание

Мы предлагаем протокол оценки регенерации костей на различных иерархических уровнях. Этот мультимодальный подход позволяет проводить структурный анализ на различных масштабах длины, эффективно решая задачи подготовки образцов. Он также обеспечивает надёжный рабочий процесс для оценки эффективности биоматериалов в стимулировании регенерации костей.

Аннотация

Клинический успех имплантата во многом зависит от его способности способствовать восстановлению кости и облегчать остеоинтеграцию. Хотя были достигнуты значительные успехи в проектировании новых каркасов, тщательная оценка эффективности имплантата на различных масштабах костей не была достаточно изучена. Кость — это иерархически организованная ткань с сложной структурой, варьирующейся от организации коллагенных фибрилл и их минерализации на наночных и микрометровых масштабах до макроскопического расположения компактной и компенсирующей кости. Такая иерархическая организация крайне важна для обеспечения функции костей и механической работы. В этом контексте комплексная оценка влияния биоматериалов на восстановление костей на различных масштабах необходима для оценки эффективности и безопасности имплантированных материалов. Однако подготовка образцов для интегрированного мультимодального анализа представляет собой техническую сложность. В этой работе мы представляем протокол, предназначенный для оценки регенерации костей на различных иерархических уровнях и анализа интерфейса между недавно образованной костью и имплантированной каркасой. Этот подход предоставляет надёжный метод оценки эффективности каркасов в индукции восстановления костей. Сочетание выбранных трёхмерных и двумерных методов визуализации крайне важно для правильной оценки сложной минерализированной ткани, формирующейся в процессе заживления костей

Введение

Кость — это сложная, иерархически организованнаяткань 1,2. Понимание структурной организации крайне важно для решения фундаментальных вопросов, связанных с тем, как клетки влияют на архитектуру тканей и как структурные изменения влияют на механическуюфункцию 3. В этом контексте ремоделирование костей после травмы остаётся центральной темой исследований. Заживание переломов — это сложный многоэтапный процесс, начинающийся с начального воспалительного ответа, затем ангиогенез и дифференциация предшественников-клеток в хондроциты и остеобласти 4,5. Много обсуждается роль биоматериалов в стимулировании остеоинтеграции, особенно о биосовместимости и их способности предотвращать инкапсуляциюволокна 6.

Распространённым методом оценки остеоинтеграции, стимулируемой биоматериалами, является оптическая микроскопия, которая позволяет проводить как количественный, так и качественный гистологический анализ. Этот подход показал себя надёжным и эффективным способом оценки успеха костныхимплантов 7,8. Тем не менее, ряд вопросов, связанных с иерархической организацией костей, нельзя исследовать с помощью одного подходавизуализации 3, особенно гистологический, который ограничен по крайней мере частично ограничением увеличения метода.

Достижения в трёхмерной визуализации оказались необходимыми для понимания иерархической организации костей. Такие методы, как микрокомпьютерная томография (микроКТ; либо синхротронное излучение, либо традиционные лабораторные рентгеновские источники)9,10,11, двухлучковая сканирующая электронная микроскопия (FIB-SEM), связанная с томографией срезаи видом 12,13,14, и трансмиссионная электронная томография 15,16, предоставили новые знания об архитектуре костей на различных масштабах.

На основе различных подходов 3D-визуализации была предложена модель иерархической организации костей, которая изначально выделила девять различных уровней структурыкости 1. Эта схема недавно была пересмотрена и расширена, охватив примерно 12 иерархических уровней, служа ценным ориентиром для изучения взаимосвязи между структурой и функцией костнойткани 2,17. Важно, что эта предлагаемая иерархическая модель служит основой для оценки успеха восстановления костей после травмы. Оценка того, воспроизводит ли регенерированная костная ткань нативную иерархическую структуру, является ключевым стандартом при оценке качества заживления костей, особенно при использовании биоматериалов в повреждённом участке.

Хотя использование различных методов визуализации для изучения организации костейобсуждалось 6, 7, 18, 19, 20, мало исследовано относительно рабочего процесса, интегрирующего различные методы визуализации для оценки структуры минералов костей на различных пространственных масштабах. Как уже упоминалось, кость — это сложная составная ткань, состоящая из органической фазы (клетки, коллаген и макромолекулы) и минерализованного матрица. С точки зрения подготовки образцов эта сложность представляет собой технические сложности, связанные с проникновением растворителя через образец, секционированием твёрдого образца и интеграцией различных стратегий визуализации на одном образце.

Ключевым новшеством в этой работе стало создание воспроизводимого, коррелятивного и многомасштабного рабочего процесса визуализации с использованием трёхмерной визуализации и дополнительных методов. Как показано на рисунке 1A, рабочий процесс устроен так, чтобы один и тот же образец можно было последовательно изучать с использованием различных методов визуализации. Поскольку некоторые из этих методов являются разрушительными или требуют секционирования, рабочий процесс начинается с неразрушительных методов и переходит к методам, включающим резку или удаление материала.

Этот рабочий процесс подготовки и анализа образцов широко применим к твёрдым или минерализованным образцам, включая кортикальную и трабекулярную кости, предимплантационные каркасы и оценку интерфейса кость и биоматериалы после имплантации. Комбинируя методы визуализации, охватывающие разные поля зрения и диапазоны разрешения (рисунок 1B), рабочий процесс позволяет анализировать образцы от сантиметрового масштаба до микрометрового и нанометрового масштабов. Хотя последовательность оптимизирована для поддержки корреляционного анализа одного образца, каждая техника также может применяться независимо в соответствии с экспериментальной целью. Такой подход позволяет подробно оценить остеоинтеграцию биоматериалов и оценить восстановленный рост костей в области заживления.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Результаты, представленные в этом протоколе, были получены на основе экспериментальной процедуры, проведённой в предыдущемисследовании 21. Все процедуры проводились в соответствии с этическими рекомендациями Этического комитета по использованию и уходу за экспериментальными животными Федерального университета Флуминенсе, Бразилия (CEUA/UFF: 779). Кратко, 20 самцов крыс Wistar весом от 300 до 400 г были случайным образом распределены в две группы: Sham и cHA-микросферная имплантация. Все животные подвергались операции, при которой образовался дефект длиной 2 мм в большеберцовом диафизе. Группа Шама служила контролем тромба для оценки регенерации костей при некритическом дефекте, тогда как экспериментальная группа получила микросферы CHA37, имплантированные в участок дефекта. Через 7 и 21 день животных эвтаназировали с помощью передозировки общей анестезии, а также собирали блокаду большеберцовой кости из каждой группы и времени (7 и 21 день). Качество костей и объём новообразованной кости оценивались с помощью оптической микроскопии и микроКТ.

1. Фиксация образца и вложение смолы

  1. Сразу после эвтаназии удалите большеберцовую кость с имплантированным биоматериалом и переместите её в флакон с фиксационным раствором Карновского (2,5% глутаральдегида, 4% формальдегида в буфере какодилата 0,1 M). Храните образец при -4 °C не менее 1 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте и помещайте фиксатор под вытяжку, чтобы предотвратить воздействие летучих веществ. Вся химическая обработка должна выполняться с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ), а при необходимости должны внедряться дополнительные технические меры безопасности.
  2. Перенесите образец из фиксатива в флакон с буфером какодилата 0,1 M. Держите образец в мягком вращении, меняя буфер 2 раза с интервалом в 10 минут. На этом этапе обрежьте края образца с помощью небольшой пилы для облегчения инфильтрации смолы. При нарезке образца держите его влажным в буфере с какодилатом 0,1 м, чтобы предотвратить высыхание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите сэмпл в буферном объёме, который будет как минимум в 2 раза больше объёма сэмпла. Это следует соблюдать для всех растворов и смолы, используемых в этом протоколе. При работе с химическими компонентами, упомянутыми выше, работайте в вытяжной камере и носите соответствующие средства индивидуальной защиты. Соберите фиксирующий раствор и какодилировать буферные отходы в чётко маркированные, химически совместимые контейнеры с правильно подобранными крышками. Соблюдайте институциональные стандартные операционные процедуры (SOPs) для безопасного хранения и утилизации опасных химических отходов.
  3. Начать процесс обезвоживания с увеличением концентрации ацетона (10%, 30%, 50%, 70%, 90% и 100%). Держите образец в ротации по 30 минут при каждой концентрации. Повторите шаг с 100% безводным ацетоном три раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с ацетоном используйте в капюшоне с дымом и используйте соответствующие СИЗ. После использования соберите остатки растворителя в чётко маркированные, химически совместимые контейнеры с правильно установленными крышками. Следуйте институциональным стандартам безопасности для безопасного хранения и утилизации опасных химических отходов.
  4. Инфильтруйте шпоровой смолой, передавая образец через серию градуированных соотношений ацетона к смоле: 2:1, 1:1, 1:2, и в конечном итоге — чистую смолу. Каждый этап должен длиться 12 часов и выполняться в ротации при комнатной температуре. После постепенной инфильтрации ацетона в смолу замените чистую смолу 2 раза. Затем переместите образец в форму с чистой смолой и полимеризуйте при 70 °C в течение 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смола была подготовлена в соответствии с техническими характеристиками для достижения средней жесткости. При работе со шпорной смолой используйте вытяжку с дымом и надевайте подходящие средства индивидуальной защиты. После использования соберите остатки в чётко маркированные, химически совместимые контейнеры с правильно установленными крышками. Следуйте институциональным стандартам безопасности для безопасного хранения и утилизации опасных химических отходов.

2. Визуализация образцов с использованием микрокомпьютерной рентгеновской томографии (микроКТ)

ПРИМЕЧАНИЕ: микроКТ используется для оценки положения имплантата и регенерации костей. Это также помогает выявить потенциальные области интереса для дальнейшего анализа. Этот шаг следует выполнять с образцом, встроенным в смолу.

  1. Используйте держатель для образца, предоставленный производителем, в качестве основы, чтобы убедиться, что образец находится надёжно расположен и предотвратит перемещение во время сканирования. Используйте материалы низкой плотности для опоры, такие как полистирол, марля или микроцентрифугные трубки.
  2. Визуализируйте с помощью следующих оптимальных параметров сканирования: напряжение/ток лампы = 60 кВ/133 мА; угловой шаг = 0,33°; усреднённые кадры = 5; размер вокселя = 5 мкм; режим вращения = 180°. Для образцов с металлическими имплантатами используйте алюминиевый фильтр на 360 ° и 0,5 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время регенерации костей толщина трабекулярноподобной тканой кости обычно находится в пределах разрешения традиционной микроКТ-визуализации. Для точной количественной оценки традиционных морфометрических параметров трабекулярной кости, таких как толщина трабекулярной кости, расстояние и число, рекомендуется использовать минимальный размер вокселя (5 мкм, как указано). Если область интереса (ROI) превышает поле зрения (FOV) при этом номинальном разрешении, сначала используйте функцию мультисканирования для тайлизации ROI. Рассмотрите возможность увеличения размера вокселя только в крайнем случае, если возврат не может быть зафиксирован через мультисканирование.
  3. После сканирования исходные данные получения состоят из серии пронумерованных файлов изображений. Провести реконструкцию с помощью программного обеспечения, предоставленного производителем, с акцентом на минимизацию артефактов в области интереса образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Часто встречаются артефакты изображений вдоль границ изображений, особенно в областях, которые не будут анализироваться. Финальный том можно обрезать с помощью программного обеспечения производителя, чтобы убрать эти области.
  4. Анализируйте восстановленный том с помощью различных программ для 3D-визуализации, таких как Avizo, VGStudio Max, CTVox иDragonfly 22. Используйте цифровые фильтры изображений для удаления артефактов. В этом случае для этой цели используйте метод снятия шума с нелокальнымисредствами 19.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения сглаживания фильтра Denoise при нелокальных средствах должны быть минимальны, чтобы не мешать важным деталям интерфейса.

3. Подготовка образца для оптической микроскопии

  1. Выберите направление секционирования образца согласно экспериментальной цели. Большеберцовая кость может быть разделена как поперечно, так и продольно вдоль длинной оси кости. Используйте поперечное сечение для получения последовательных сечений, покрывающих весь объём дефектов. Продольное сечение уместно для оценки регенерации кости вдоль длинной оси. Однако этот подход содержит только одну часть дефекта.
    1. Используйте низкоскоростной алмазный пильный диск, чтобы разрезать образец на срезы диаметром 1 мм, следуя экспериментальной стратегии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется использовать алмазный диск толщиной от 0,006 до 0,012 дюйма. Более тонкие лезвия позволяют выполнять высокоточные резки с минимальными потерями материала из-за толщины лезвий.
    2. Наполните жидкий резервуар, пока уровень жидкости не покроет нижний край лопасти.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дистиллированная вода подходит для образцов костей. Однако если ожидается чрезмерное нагревание, например, с образцами с металлическими имплантатами, используйте масло, предоставленное производителем оборудования, для заполнения резервуара.
    3. Закрепите образец на держателе образца и прикрепите его к рычагу инструмента. Убедитесь, что образец устойчив и горизонтально относительно поверхности диска. Используйте регуляторы позиционирования, чтобы подстроить область разрезания образца под диск.
    4. Начните резать образец на более высоких скоростях (210–250 об/мин) и применяйте низкое давление, пока на образце не появится вмятина. Затем уменьшите скорость (до 93 - 124 об/мин), чтобы секционирование было плавно и предотвратить чрезмерную вибрацию.
    5. Остановите пилу сразу после завершения резки. Правильно отрегулируйте систему, чтобы резка прекращалась сразу после отделения образца от исходного блока.
  2. Осмотрите образец с помощью стереомикроскопа. Начните с низкого увеличения (например, 5x-10x) для осмотра всего образца, затем увеличите увеличение (например, 20x-40x), чтобы выбрать интересующую область в соответствии с научным вопросом. Точный диапазон увеличения может варьироваться в зависимости от используемого инструмента. В этой работе были выбраны области с более высокой плотностью интерфейсов между недавно образованной костью и биоматериалом для дальнейшего анализа.
  3. Крепление образца для разрежения
    1. Крепите образец на опору, чтобы облегчить правильное обращение при полировке. Если образец предназначен исключительно для анализа оптической микроскопии, прикрепите его непосредственно к пластиковой накладке с помощью суперклея на ранее отполированной стороне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать пластиковые затворы из-за их улучшенной адгезии. Также можно использовать стеклянные стекли (после тщательной промывки нейтральным мылом). Однако стеклянные стекла увеличивают риск отслоения образца при полировке.
    2. Для образцов, которые будут дополнительно анализироваться с помощью корреляционного подхода, устанавливайте их на двухкомпонентную алюминиевую трубку. В рамках этого протокола была разработана самодельная алюминиевая трубка, состоящая из внутреннего сплошного цилиндра диаметром 2,5 см и внешнего полого цилиндра, обеспечивающего механическую поддержку при полировке. Образец крепится к внутреннему твёрдому цилиндру.
    3. Поместите внутренний алюминиевый цилиндр на горячую пластину и нагрейте его до температуры, подходящей для плавления воска (обычно около 60-70 °C, в зависимости от типа используемого воска).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пчелиный воск тоже подходит. При работе с монтажным воском работайте внутри вытяжной вытяжки и носите соответствующие средства индивидуальной защиты. После использования собирайте остатки в чётко маркированные, химически совместимые контейнеры с правильно подобранными крышками. Следуйте институциональным стандартам безопасности для безопасного хранения и утилизации опасных химических отходов.
    4. Нанесите небольшое количество воска на поверхность цилиндра и дайте ему полностью расплавиться.
    5. После плавления положите образец с интересующей поверхностью на покрытую воском поверхность и аккуратно прижмите его для полного контакта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интересующая поверхность должна быть обращена к поверхности цилиндра, чтобы истончение осуществлялось с противоположной стороны. Избегайте чрезмерного использования воска, так как это может привести к неровному креплению и ухудшению качества полировки.
    6. Снимите цилиндр с горячей пластины и дайте воску затвердеть при комнатной температуре.
  4. Мониторинг толщины образца во время полировки
    1. Для контроля толщины образца в процессе полировки используйте отражающую микроскопию при минимальном и промежуточном увеличении (например, 10x-20x). Схема, иллюстрирующая калибровку микроскопа и измерение толщины образца, показана на рисунке 2.
    2. Калибруйте ось Z микроскопа стандартным накладным слоем, который обычно имеет толщину около 150 мкм. Отметьте одну сторону покрытия красным перманентным маркером, а соседнюю область с противоположной стороны — синим маркером. Закрепите накладку на стеклянный затвор.
    3. Используя ручку тонкого фокуса и микрометровую шкалу, сначала сфокусируйтесь на нижней поверхности накладного слоя, а затем на верхней.
    4. Запишите значение Z-смещения. Это значение соответствует толщине скольжения (примерно 150 мкм) и служит эталоном.
    5. При полировке образца периодически используйте калибровку по оси Z, чтобы оценить толщину образца, не вынимая её из алюминиевого цилиндра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта техника позволяет быстро и неразрушительно оценивать толщину при полировке. В качестве альтернативы образец можно извлечь из крепления и измерить с помощью цифрового суппорта или микрометра.
  5. Разбавка и полировка
    1. Начните грубую и промежуточную полировку с использованием наждачной бумаги с зернистостью 1200, 2500 и 4100. Цель этого этапа — уменьшить толщину образца примерно до 0,15 мм при удалении значительных неровностей поверхности.
    2. Начните с наждачной бумаги зернистостью 1200, затем переходите к зернистости 2500. Во время этого процесса приложите лёгкое давление. Периодически контролируйте толщину образца с помощью отражательной микроскопии во время полировки.
    3. После достижения желаемой толщины полируйте обе стороны образца наждачной бумагой зернистостью 4100. Полировка может выполняться вручную или с помощью полуавтоматической полировочной машины с низкой скоростью вращения. Тщательно очищайте образец дистиллированной водой на каждом этапе полировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание образцов и наждачной бумаги влажными во время полировки помогает снизить тепло и предотвращает загрязнение поверхности от более грубой наждачной бумаги.
    4. Для окончательной полировки нанесите небольшое количество алмазной пасты (например, 6 мкм или 3 мкм) на фетровую полировочную ткань, установленную на полировочном диске. Выберите размер частицы алмазной пасты в зависимости от поверхностной шероховатости образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Паста диаметром 6 мкм подходит для предварительной тонкой полировки, тогда как 3 мкм рекомендуется для окончательной полировки зеркала. По возможности последовательное использование обеих паст даёт наилучший результат. Тем не менее, удовлетворительная полировка всё ещё может быть достигнута только с помощью пасты диаметром 6 мкм.
    5. Аккуратно полируйте обе стороны образца с минимальным давлением. Используйте сжатый воздух или хлопок, чтобы высушить отполированную поверхность образца перед микроскопическими исследованиями.
    6. Чтобы отделить образец от цилиндра, нагрейте воск с помощью горячей пластины и очистите остатки воска с образца с помощью безводного ацетона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с воском и безводным ацетоном работайте внутри вытяжки и носите соответствующие СИЗ. После использования собирайте остатки в чётко маркированные, химически совместимые контейнеры с правильно подобранными крышками. Следуйте институциональным стандартам безопасности для безопасного хранения и утилизации опасных химических отходов.
    7. Разместите образец между стеклянным стеклом и накладным слоем с использованием погружного масла в качестве монтажной среды и оцените ориентацию коллагенового волокна с помощью поляризованной световой микроскопии. Начинайте с низкого увеличения (например, 5x-10x) для обследования образца и увеличивайте до промежуточного увеличения (например, 20x-40x) для выявления потенциальных областей для дальнейших исследований с помощью электронной микроскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для продолжения соответствующего рабочего процесса и последующего анализа образца с помощью сканирующей электронной микроскопии рекомендуется не герметизировать образец.

4. Подготовка образца для сканирующей электронной микроскопии

  1. Аккуратно снимите образец из стеклянного стекла. Аккуратно снимите крышку с стеклянного затвора с помощью наконечника пипетки. Используйте фильтрующую бумагу для удаления излишков погружного масла. Промой образец нейтральным мылом. Промывайте в небольшом контейнере, чтобы избежать случайной потери образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если на образце осталось остаточное погружение масла, аккуратно очистите поверхность ватной палочкой, слегка увлажненной 70% этанолом.
  2. Оставьте образец сушиться на воздухе на фильтрующей бумаге. Для сушки образца также можно использовать сжатый воздух или хлопок. Когда образец полностью высыхает, закрепите образец на обрезке с помощью угольной ленты. Покройте образец слоем золота толщиной 10 нм, чтобы предотвратить зарядку во время визуализации.
  3. Используйте микроскоп с двумя лучами FIB-SEM для изучения образца различными методами.
    1. В режиме СЭМ (сканирующей электронной микроскопии), используя либо вторичные, либо обратно рассеянные электроны, оценивайте морфологию образца, биоматериал и недавно образованный костный интерфейс в областях, ранее выбранных оптической микроскопией.
    2. В режиме сфокусированной ионно-сканирующей электронной микроскопии (FIB-SEM) проводите томографию с срезанием и видом.
  4. В режиме SEM с детектором вторичных электронов выбирайте области, ранее проанализированные с помощью поляризованной световой микроскопии и SEM, для проведения среза-энд-виза томографии.
  5. Регулируйте параметры для объёма траншеи, размера пикселя и толщины среза в зависимости от интересующих признаков. В нашей установке проводилась томография с нарезом и видом с объёмом траншеи 15 мкм x 10 мкм x 10 мкм, размером пикселя 20 нм и толщиной среза 60 нм. Рекомендуется использовать изометрический размер вокселя, когда это возможно, для повышения качества изображения во всех трёх измерениях (XYZ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры могут различаться в зависимости от конкретной системы FIB-SEM. Проконсультируйтесь с оператором оборудования, чтобы определить оптимальные условия на основе ваших аналитических требований и возможностей системы.

5. Выравнивание, обработка фильтров и сегментация томографии FIB-SEM slice-and-view

  1. Томография с нарезом и видом создаёт серию изображений, которые нумеруются последовательно. Чтобы продолжить выравнивание, преобразуйте серию в MRC-файл, обычно называемый стеком.
  2. Выполните генерацию MRC-файлов и выравнивание стека изображений с помощью программного обеспечения IMOD.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие программные обеспечения, такие как Avizo и FIJI/ImageJ, также предлагают плагины для выравнивания стеков. Для подробной информации обратитесь к документации каждой программной специализации. Кроме того, работы Педди идр. 23. предлагает обзор подходов, применяемых при выравнивании стеков.
  3. Чтобы сгенерировать MRC-файл, откройте терминал или командную строку, перейдите к папке с последовательностью изображений и выполните следующую команду: tif2mrc imagerootfile*.tif stackname.mrc
    1. Для изображений, которые не в формате TIFF, используйте raw2mrc. Добавьте -g (например, tif2mrc -g) для преобразования 24-битных RGB-изображений в 8-битные оттенки серого. Это значительно сократит время вычислений.
  4. Запустите Etomo с терминала и выберите опцию Align Serial Sections. Следуйте последовательности для выравнивания стека: (1) Загрузите невыровненный стек в один кадр. (2) Вкладка Алгин с использованием начального автовыравнивания. (3) Создайте вкладку Stack с помощью Make Aligned Stack, затем откройте выровнённый стек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс может занять несколько минут, в зависимости от размера стека и производительности системы.
  5. После завершения просмотра результата. Выровнённый файл стека будет называться stackname_ali.mrc.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура использует стандартные настройки системы для выравнивания стеков. Однако параметры, связанные с начальным выравниванием и финальной генерацией стека, могут быть изменены в зависимости от предпочтений пользователя. Для подробной информации обратитесь к документации IMOD: https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/serialalign.html.
  6. Выполните дополнительную фильтрацию изображений с помощью программного обеспечения Avizo. Откройте выровнённый стек и последовательно примените следующие фильтры: фильтр быстрого преобразования Фурье (FFT), доступный в плагине Sandbox Filter (выберите опцию вертикальной ориентации полосы, значение допуска: 2), мастер коррекции затенения (настройка выбора маски для покрытия всей теневой площади изображения, с нормизующим коэффициентом 100), эквализация гистограммы (конфигурация по умолчанию) и нелокальные средние значения (настройка значений до 5; 0.1; 10; 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогичные фильтры доступны в других программах для анализа изображений. В FIJI/ImageJ мы рекомендуем следующую последовательность: фильтр FFT, вычитание фона, усиление локального контраста (CLAHE) и фильтр нелокальных средних.
  7. Переходите к сегментации изображений и 3D-рендерингу с помощью программного обеспечения. Доступны различные стратегии сегментации, включая ручную сегментацию и пороговую сегментацию. Дополнительные инструменты, такие как алгоритм Watershed, помогают автоматизировать процесс и сократить время сегментации.

6. Подготовка образца для трансмиссионной электронной микроскопии

  1. Подготовьте ламеллы с помощью сфокусированной ионно-лучевой сканирующей электронной микроскопии (FIB-SEM) для оценки интерфейса костей и биоматериала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если имплантированный биоматериал не керамический или металлический, как в данном исследовании, ультратонкие срезы, подходящие для трансмиссионной электронной микроскопии (TEM), с помощью ультрамикротома. Однако важно отметить, что разрез минерализованных материалов может значительно сократить срок службы алмазного ножа.
  2. После окрашивания ультратонких участков в течение 20 минут в водном растворе 5% уранилацетата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с уранилацетатом используйте в капюшоне и носите соответствующие средства. После использования соберите остатки растворителя в чётко маркированные, химически совместимые контейнеры с правильно установленными крышками. Следуйте институциональным стандартам безопасности для безопасного хранения и утилизации опасных химических отходов.
  3. Анализируйте разделы с помощью TEM. Для комплексного анализа сочетайте визуализацию с дифракцией электронов по выбранной области (SAED), энергодисперсионной рентгеновской спектроскопией (EDS) и электронной томографией.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Первоначальный анализ образцов, встроенных в смолу, проводится с помощью микрокомпьютерной томографии (microCT). Эта неразрушающая техника облегчает 3D-визуализацию всей области дефекта, что позволяет проводить как количественный, так и качественный анализ образца. Контраст в микроКТ-визуализации в основном обусловлен разницей плотности материалов, присутствующих в образце. Рисунок 1 иллюстрирует микроКТ-анализ некритического дефекта в большеберцовой кости к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для изучения архитектуры костей и оценки эффективности биоматериалов в индукции остеоинтеграции применялись различные методывизуализации 7,21,22,23,24. В этом протоколе мы разработали рабочий процесс, включающий рентгеновскую микротомографию, оптическую микроскопию и электронную микроскопию для анализа минерализированной костн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами авторов следующих бразильских агентств: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq/Бразилия) и Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). Мы благодарим LABNANO/CBPF и CENABIO/UFRJ за предоставленные возможности электронной микроскопии. Доработка языка и коррекция грамматики проводились с помощью ChatGPT (OpenAI, GPT-5.1, 2025). Все правки были проверены и проверены авторами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ацетон Merck67-64-1
Алюминиевый цилиндрДомашнийн/д
Avizo версия 2022.1ThermoFisherн/дпрограммное обеспечение для фильтрации изображений, сегментации и 3D-визуализации
Какодиловая кислота, соль натрия, тригидратТед Пелла18851порошок для какодилатного буфера. Приготовьте стандартный раствор размером 0,2 M
Алмазная полировочная смесь 3 и микро; m размерТед Пелла895-8
Алмазная полировочная смесь 6 и микро; m размерТед Пелла895-9
Алмазное колесо x.006South Bay TechnologyDWH 3063
Алмазное колесо x.012South Bay TechnologyDWH 4122
Фетр полировочную тканьТед Пелла816-20
Плоские капсулы с вложениемEMS70021
Стеклянная крышкаКниттельн/д
Стеклянная горкаКниттельн/д
Глутаральдегид, 25% ЭМТед Пелла18426/18427
Золотой распылитель K550XEMITECHн/д
ImageJНациональные институты здравоохранения (NIH)программное обеспечение для обработки изображений, фильтрации, сегментации и 3D-визуализации
IMOD версии 5.1Университет Колорадопрограммное обеспечение для обработки изображений, сегментации и 3D-визуализации
Машина для полиировки с проколываниемSouth Bay TechnologyМодель 910
низкоскоростная алмазная колесная пила и bbsp;South Bay TechnologyМодель 650
Набор для вложения с низкой вязкостьюEMS14300набор для смолы SPURR. Подготовьтесь в соответствии с техническими характеристиками 
Micro-CT Skyscan 1273 Brukerн/д
Микроскоп Jeol 2100F 200kV Чёльн/д
Микроскоп Olympus BX51Олимпн/д
Микроскоп Tescan Lyra3Tescanн/д
Микроскоп Zeiss AxioplanZeissн/доснащён пластиной первого порядка lambda
Параформальдегид, электромагнитный классSigmaP6148порошок для раствора формальдегида. Приготовьте запасной раствор на 16%
Пластиковый слайдЭкзакт41500
Монтажный воск QuickStick 135South Bay Technologyн/д
Наждачная бумага  Крупные размеры 1200н/дн/д
Наждачная бумага  Размеры зернистости 2500н/дн/д
Наждачная бумага  Зернистость 4100н/дн/д
Super GlueЛоктайтн/д
Водорастворимый охлаждающий жидкость South Bay Technologyн/д
Фильтрующая бумага Whatmann первого классаSigmaWHA1001150

Ссылки

  1. Reznikov, N., Shahar, R., Weiner, S. Bone hierarchical structure in three dimensions. Acta Biomater. 10 (9), 3815-3826 (2014).
  2. Buss, D. J., Kröger, R., McKee, M. D., Reznikov, N. Hierarchical organization of bone in three dimensions: A twist of twists. J Str Biol: X. 6, (2022).
  3. Grandfield, K., Gustafsson, S., Palmquist, A. Where bone meets implant: The characterization of nano-osseointegration. Nanoscale. 5 (10), 4302-4308 (2013).
  4. Loi, F., Córdova, L. A., Pajarinen, J., Lin, T., Yao, Z., Goodman, S. B. Inflammation, fracture and bone repair. Bone. 86, 119-130 (2016).
  5. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
  6. Shah, F. A., Thomsen, P., Palmquist, A. Osseointegration and current interpretations of the bone-implant interface. Acta Biomater. 84, 1-15 (2019).
  7. Palmquist, A. A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration. J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).
  8. Sim, J. H., Yeo, I. S. Light Microscopy Analysis of Bone Response to Implant Surfaces. Microsc Today. 24 (4), 28-33 (2016).
  9. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  10. Müller, R. Hierarchical microimaging of bone structure and function. Nat Rev Rheumatol. 5 (7), 373-381 (2009).
  11. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  12. Buss, D. J., Reznikov, N., McKee, M. D. Crossfibrillar mineral tessellation in normal and Hyp mouse bone as revealed by 3D FIB-SEM microscopy. J Str Biol. 212 (2), 107603(2020).
  13. Binkley, D. M., Deering, J., Yuan, H., Gourrier, A., Grandfield, K. Ellipsoidal mesoscale mineralization pattern in human cortical bone revealed in 3D by plasma focused ion beam serial sectioning. J Str Biol. 212 (2), 107615(2020).
  14. Reznikov, N., Almany-Magal, R., Shahar, R., Weiner, S. Three-dimensional imaging of collagen fibril organization in rat circumferential lamellar bone using a dual beam electron microscope reveals ordered and disordered sub-lamellar structures. Bone. 52 (2), 676-683 (2013).
  15. Reznikov, N., Bilton, M., Lari, L., Stevens, M. M., Kröger, R. Fractal-like hierarchical organization of bone begins at the nanoscale. Science. 360 (6388), 2189(2018).
  16. Grandfield, K., Vuong, V., Schwarcz, H. P. Ultrastructure of Bone: Hierarchical Features from Nanometer to Micrometer Scale Revealed in Focused Ion Beam Sections in the TEM. Calcified Tissue Int. 103 (6), 606-616 (2018).
  17. Micheletti, C., et al. mineral organization at the mesoscale: A review of mineral ellipsoids in bone and at bone interfaces. Acta Biomater. 142, 1-13 (2022).
  18. Micheletti, C., Shah, F. A. Bone hierarchical organization through the lens of materials science: Present opportunities and future challenges. Bone Rep. 22, (2024).
  19. Shah, F. A., Ruscsák, K., Palmquist, A. 50 years of scanning electron microscopy of bone-a comprehensive overview of the important discoveries made and insights gained into bone material properties in health, disease, and taphonomy. Bone Res. 7 (1), (2019).
  20. Georgiadis, M., Müller, R., Schneider, P. Techniques to assess bone ultrastructure organization: Orientation and arrangement of mineralized collagen fibrils. J Royal Soc Interface. 13 (119), (2016).
  21. Martinez-Zelaya, V. R., Archilha, N. L., Calasans-Maia, M., Farina, M., Rossi, A. M. Trabecular architecture during the healing process of a tibial diaphysis defect. Acta Biomater. 120, 181-193 (2021).
  22. Keklikoglou, K., et al. Micro-computed tomography for natural history specimens: a handbook of best practice protocols. Eur J Taxonomy. (522), (2019).
  23. Peddie, C. J., et al. Volume electron microscopy. Nat Rev Meth Primers. 2 (1), 51(2022).
  24. Costa De-Moraes, S. L., et al. Histomorphometric and microtomographic evaluation of hydroxyapatite coated implants and L-PRF in over drilled bone sites in sheep. Sci Rep. 15 (1), 14761(2025).
  25. Liu, Y., Xie, D., Zhou, R., Zhang, Y. 3D X-ray micro-computed tomography imaging for the microarchitecture evaluation of porous metallic implants and scaffolds. Micron. 142, (2021).
  26. Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. Assessment of Bone Fracture Healing Using Micro-Computed Tomography. J Vis Exp. (190), e64262(2022).
  27. Ramezanzadehkoldeh, M., Skallerud, B. H. MicroCT-based finite element models as a tool for virtual testing of cortical bone. Med Eng Physics. 46, 12-20 (2017).
  28. Shefelbine, S. J., et al. Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis. Bone. 36 (3), 480-488 (2005).
  29. O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).
  30. Morgan, E. F., et al. Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical. Bone. 44 (2), 335-344 (2009).
  31. Reznikov, N., et al. Inter-trabecular angle: A parameter of trabecular bone architecture in the human proximal femur that reveals underlying topological motifs. Acta Biomater. 44, 65-72 (2016).
  32. Zaborowska, M., Shah, F. A., Trobos, M., Palmquist, A. Retrieval, sample processing, and analyses of bone-anchored implants. Bone Repair Biomater Regenerat Clin Appl Second Edition. , 447-466 (2018).
  33. Thorfve, A., Palmquist, A., Grandfield, K. Three-dimensional analytical techniques for evaluation of osseointegrated titanium implants. Mater Sci Technol. 31 (2), 174-179 (2015).
  34. Mastrogiacomo, M., Campi, G., Cancedda, R., Cedola, A. Synchrotron radiation techniques boost the research in bone tissue engineering. Acta Biomater. 89, 33-46 (2019).
  35. Raguin, E., Rechav, K., Shahar, R., Weiner, S. Focused ion beam-SEM 3D analysis of mineralized osteonal bone: lamellae and cement sheath structures. Acta Biomater. 121, 497-513 (2021).
  36. McMahon, G., Malis, T. Ultramicrotomy of nanocrystalline materials. Microscopy Res Tech. 31 (4), 267-274 (1995).
  37. Bassim, N. D., et al. Minimizing damage during FIB sample preparation of soft materials. J Microsc. 245 (3), 288-301 (2012).
  38. Witzke, K., et al. Comparative Sample Preparation Using Focused Ion Beam and Ultramicrotomy of Human Dental Enamel and Dentine for Multimicroscopic Imaging at Micro- and Nanoscale. Materials. 15 (9), 3084(2022).
  39. Carter, J. L. W., Karakulak Uz, T., Ibrahim, B., Pigott, J. S., Gordon, J. V. A comparison of energy dispersive spectroscopy in transmission scanning electron microscopy with scanning transmission electron microscopy. Ultramicroscopy. 270, 114106(2025).
  40. Grandfield, K., McNally, E. A., Palmquist, A., Botton, G. A., Thomsen, P., Engqvist, H. Visualizing biointerfaces in three dimensions: electron tomography of the bone-hydroxyapatite interface. J Royal Soc Interface. 7 (51), 1497-1501 (2010).
  41. Grandfield, K., Palmquist, A., Engqvist, H. Three-dimensional structure of laser-modified Ti6Al4V and bone interface revealed with STEM tomography. Ultramicroscopy. 127, 48-52 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Мультимодальный подход к оценке регенерации костей и работы каркасов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.