Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Культура яичников новорождённых мышей и количественная оценка фолликулов целого маунта: эффективный подход in vitro для изучения регуляции первичных фолликулов

690 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69498

⸱

19 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology, and Women's Health, University of Missouri School of Medicine, 2Division of Biological Sciences, University of Missouri

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании представлены протоколы культивирования постнатальных мышиных яичников на мембранных вставках и для количественной оценки фолликулов целого расположения в целом яичнике. Результаты показали, что техническое обращение при культуре яичников значительно влияет на количество первичных фолликулов, что подчёркивает важность поддержания последовательности для минимизации небиологических вариаций.

Аннотация

У самок млекопитающих первичные фолликулы формируются во время развития плода и служат единственным источником поддержания функции взрослых яичников. Механизмы, лежащие в основе того, как первичные фолликулы собираются, сохраняют состояние покоя, активируются для развития фолликулов и подвергаются клеточной гибели, важны для понимания физиологии и патологических состояний яичников. В данном исследовании представлен протокол культивирования послеродовых мышиных яичников на мембранных вставках — подход, позволяющий проводить культуру и фармацевтическую обработку целых яичников в течение до 10 дней, в зависимости от стадии развития яичника. Изменения условий культуры можно достичь путём переноса вставок с посвящёнными яичниками между колодцями на пластине, тем самым избегая физического вмешательства в ткани во время культуры. P5-яичники были выделены и культивированы на вставке диаметром 12 мм в пластине с 24 лунками, например. Каждый яичник разделялся в каплю среды DMEM/F12, дополненной 10% FBS, 3 мг/мл BSA, 10 мМЕ/мл ФСГ и антибиотик-антимикотик, и мягко стабилизировался на мембранной вставке. Формат менялся каждые два дня, а культура поддерживалась в общей сложности пять дней. После посева яичники фиксировались в 4% параформальдегиде в течение 2 часов и обработаны для окрашивания цельным антителом маркера яйцеклетки DDX4. Фолликулы были стадированы и количественно измерены на основе размера яйцеклетки и ядерной морфологии соматических фолликулов. Результаты показали, что количество первичных фолликулов в каждом яичнике значительно зависело от правильного расположения тканей на мембранной вставке. Кроме того, различия в количестве яичников на каждой вставке могут вызвать небиологические вариации, и их следует избегать.

Введение

Оогенез — это сильно регулируемый и сложный процесс, приводящий к образованию зрелых яйцеклетки. У млекопитающих оогенез начинается в плодовых яичниках, где первичные герминальные клетки (ПГК) дифференцируются в первичные яйцеклетки. Каждый первичный яйцеклетка окружён слоем плоских прегранулезных клеток, образующих первичный фолликул. Большинство этих первичных фолликулов после формирования переходят в состояние покоя, служа яичниковымрезервом 1,2,3. Во взрослом яичнике периодическая активация первичных фолликулов для развития фолликулов, известная как фолликулогенез, необходима для поддержания выработки зрелых яйцеклетки и стероидных гормонов яичников 4,5. При отсутствии сигналов активации первичные фолликулы человека могут оставаться в состоянии покоя до 50 лет. Длительная покоя может способствовать снижению качества яйцеклетки, а также увеличению скорости потери первичных фолликулов в стареющихяичниках 6. Механизмы, лежащие в основе того, как определённый пул фолликулов активируется, в то время как другие остаются в состоянии покоя и периодически гибели клеток, остаются открытыми.

Процесс оогенеза очень консервативен у млекопитающих, что делает мышей идеальной моделью для изучения оогенеза7 у млекопитающих. У мышей формирование первичных фолликулов завершается к 4-му дню после рождения (P4). Небольшая часть первичных фолликулов развивается сразу после формирования. Во время развития фолликула яйцеклетка увеличивается в размере за счёт усиленного органогенеза и синтеза мРНК ибелка 4. Плоские гранулезные клетки переходят в кубоидальные гранулезные клетки и становятся пролиферативными8. Эти развивающиеся фолликулы развиваются до овуляционной стадии примерно на 21-й день, когда самки мышей достигают полового созревания. Эта фаза развития фолликуляров в постнатальных яичниках обычно называется «фолликулогенезом первой волны». Поскольку фолликулогенез первой волны тесно отражает процесс формирования фолликулов, послеродовые яичники мышей служат идеальной моделью для изучения регуляции первичных фолликулов и фолликулогенезаяичников 9.

Классификация фолликулов яичников в первую очередь основана на ядерной морфологии соматических клеток фолликулов и размере яйцеклетки. В мышиных яичниках спящий первичный фолликул определяется одним слоем плоских прегранулезных клеток, которые охватывают первичную яйцеклетку диаметром примерно 20 мкм. Развивающиеся фолликулы можно разделить на первичные, вторичные, третичные и антральные фолликулы. Первичный фолликул содержит ооцит диаметром обычно более 25 мкм и окружён одним слоем кубоидальных гранулезных клеток (дополнительный рисунок 1). Вторичный фолликул состоит из двух слоёв гранулезных клеток, тогда как третичный фолликул состоит из трёх и более слоёв гранулезных клеток. Антральный фолликул крупнее третичного фолликула, содержит несколько слоёв гранулезных клеток и имеет полость, заполненную жидкостью, известную как антрум. По мере развития фолликулов яйцеклетка увеличивается, достигая примерно 80 мкм к моменту овуляции. Кроме того, развивающиеся фолликулы окружены несколькими слоями тонких клеток теки, которые расположены вне гранулезныхклеток 10,11,12.

Относительно небольшой размер постнатальных яичников у мышей делает целую культуру яичников практичным подходом для исследований. Этот метод эффективно позволяет изучать развитие яичников и фолликулов внутри целостного яичника, сохраняя физические и физиологические микросреды, минимизируя помехи со стороны окружающихтканей 12. Такой подход позволяет проводить эксперименты, которые было бы сложно проводить в in vivo моделях. Примеры включают живую визуализацию развития яичников, контролируемое по времени многопрепаратное лечение и анализ секреторной активности яичников с помощью профилирования белков культурных сред 13,14. Кроме того, этот подход можно применить для изучения эффекта секреторных факторов без прямого взаимодействия клетки с клетками посредством экспериментов с совместной культурировкой. В этих экспериментах различные типы тканей могут быть размещены на отдельных мембранных вставках в общейсреде 15. Кроме того, использование условных генно-нокаутных яичников мышей in vitro может помочь выявить ключевые механизмы, связанные с активацией и ростом первичных фолликулов.

В этой статье мы представляем методы культивирования послеродовых яичников мышей с помощью мембранных вставок и для количественной оценки целого фолликула в целом яичнике (рисунок 1). Описанные здесь методы включают: 1) диссекция новорождённых мышиных яичников, 2) культуру неонатальных мышиных яичников, 3) изменение среды во время культуры, 4) фиксацию тканей и окрашивание антител по всему монтированию, а также 5) визуализацию тканей и количественное определение фолликулов. Кроме того, в этом исследовании использовался доксорубицин для экспериментального стимулирования потери первичного фолликула, предоставив модель для изучения механизмов, лежащих в основе истощения яичникового резерва. Результаты показали, что количество яичников на одну вставку и их расположение внутри вставка во время культуры влияют на количество первичных фолликулов. Это подчёркивает важность поддержания единой системы культуры для предотвращения небиологических изменений в экспериментальных результатах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Самцы мышей CD-1 содержались вместе в соотношении 1:1 как пары для размножения. Дата рождения новых щенков была обозначена как постнатальный день 0. Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Миссури (номер протокола: 36647).

1. Реагенты и культурные медиа

  1. Все реагенты, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов. Подготовьте все материалы и материалы до посева яичников.
  2. Культурные среды: Получите ~5 мл среды DMEM/F-12 с добавлением 3 мг/мл бычьего сыворотного альбумина (BSA), 10% плодовой сыворотки (FBS) и 10 мМЕ/мл фолликулярно-стимулирующего гормона (FSH).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Материал должен быть свежеприготовлен путём добавления запасов BSA (30 мг/мл), FBS и FSH (10 IU/mL) в медиа DMEM/F-12. Уравновесить среду в чашке Петри примерно 30 минут в инкубаторе с 5%CO2 при 37 °C. Храните бульоны при -20 °C и размораживайте непосредственно перед использованием. Аликвот запасается в правильных объёмах, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания запасов.

2. Культура яичников

  1. Усыпить самок мышей P5 путём обезглавливания. Удалите яичники и прикрепленную ткань бурсы хирургическими ножницами и щипцами. Поместите яичники в чашку Петри диаметром 60 мм с предварительно охлаждённым физиологическим раствором Dulbecco с фосфатным буфером (DPBS), содержащим антибиотики-антимикоты (рисунок 2A,B).
  2. С помощью пары инсулиновых шприцев (1 мл) рассекают и удаляют ткань бурсы из яичника под стереоскопом (рисунок 2C,D). Переместите яичники с помощью пипетки объемом 1 мл в чашку Петри диаметром 30 мм, содержащую 3 мл культурного материала, и поместите блюдо в инкубатор с CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте тыкать или сжимать яичники. Сделайте чистые и равномерные разрезы через бурсу яичника с помощью инсулиновых шприцев для освобождения яичника. Заранее наполните кончик пипетки примерно 50 мкл среды, разместите кончик пипетки рядом с завязью и введите его в кончик для переноса.
  3. Под ламинарным капюшоном подготовьте пластину, поместив в каждую скважину 400 мкл среды и вставку (рисунок 2E, E'). Среда находится снаружи вставки, и мембрана вставка становится непрозрачной после пропитки средой.
  4. Для посева с 24-часовой обработкой Dox подготовьте среду с концентрацией 0,1 мг/мл свеже, разбавляя запас Dox (10 мг/мл) средой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Медиа, содержащие Dox, должно быть утилизировано надлежащим образом в соответствии с руководящими принципами институциональных комитетов по биобезопасности и охране окружающей среды.
  5. Под стереоскопом можно перенести до трёх яичников в вставку с помощью пипетки объёмом 1 мл (рисунок 2F,G). Минимизируйте количество носителя, передающегося в вставку, и сразу же удаляйте излишки после переноса. После аккуратного размещения яичников в вставку используйте пипетку объемом 200 мкл, чтобы перенести примерно 200 мкл среды из колодцы в вставку, убедитесь, что мембрана полностью покрыта средой. Перенесите среду обратно в колодец и центрируйте яичники на мембране. Заполните кончик пипетки культурным материалом, чтобы яичник не попал в кончик при центрировании. Убедитесь, что между яичниками остаётся достаточное пространство и чтобы они стабилизировались на мембранной вставке (рисунок 2H), а не оставались подвешенными в среде (рисунок 2I). Будьте осторожны, чтобы не колоть яичники и мембрану.
  6. В пятидневной культуре меняйте среду каждые два дня, удаляя 200 мкл (половину от общего объёма) из скважины и добавляя 200 мкл свежего культурного материала обратно в колодец (рисунок 2J).
  7. Для посева с 24-часовой медикаментозной обработкой переместите вставку с яичниками в новую скважину с 400 мкл свежей культурной среды после первых 24 часов, выполняя следующие шаги:
    1. Удалите вставку с яичниками из колодца с помощью щипцов.
    2. Прополосните низ вставки ненадолго, погрузив его в чашу диаметром 60 мм с свежей культурой.
    3. Аккуратно постучите по нижней части вставки по пустой тарелке диаметром 60 мм, чтобы удалить лишний материал с вставки. Вставьте вставку в колодец с помощью свежих культурных материалов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите лишние материалы из вставка, чтобы яичники стабилизировались на мембране сразу после смены среды или переноса вставки.

3. Фиксация и целостное иммунокрашивание

  1. Чтобы исправить посялённые яичники, снимите вставку с пластины с помощью щипцов и поместите её в чашку Петри диаметром 60 мм, содержащую 5 мл DPBS. Перенесите примерно 100 мкл DPBS рядом с яичниками и подвесьте их с помощью пипетки объемом 1 мл.
  2. С помощью пипетки объемом 1 мл переместите яичники из вставка в трубку Эппендорфа объёмом 1,5 мл. Удалите DPBS из трубки и добавьте 500 мкл 4% параформальдегида. Фиксируйте яичники при 4°C на 2 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конец кончика пипетки может потребоваться подрезать шире, чтобы не повредить ткани, если яичники слишком большие для прохождения через них.
  3. Промыйте фиксированные яичники в 1 млPBST 2 (PBS, 0,1% Tween [v/v], 0,5% Triton [v/v]) не менее трёх раз, по 1 час на вращающемся шейкере. Рекомендуется оставлять ткани вPBST 2 на ночь (12-16 часов) при 4 °C для усиления проникновения антител.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть точкой остановки; ткани могут храниться вPBST 2 до трёх дней до инкубации первичных антител.
  4. Инкубировать яичники с помощью антимертовой коробки геликазы 4 (DDX4) в 100 мкл буфера разбавления антител (1% BSA [с в/в], 10% сыворотки Donkey [v/v], 0,1 млн глицина, 0,1% Tween и 0,5% тритона в PBS) при разбавлении 1/400 (2,3 мкг/мл) при 4 °C в течение 12-16 часов.
  5. На следующий день удалите первичное антитело и добавьте 1 млPBST 2 в пробирку. Стирайте салфетки как минимум три раза, по 1 час каждую на вращающейся шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть точкой остановки; ткани могут оставаться вPBST 2 до трёх дней после инкубации первичных антител.
  6. Разбавить вторичный антитело-осиный анти-кроличий AF488 при разбавлении 1/500 (1,5 мкг/мл) вPBST 2. Инкубировать ткань с не менее 100 мкл разбавленного вторичного антитела при 4 °C в течение 12–16 часов.
  7. На следующий день тщательно промой салфетки в PBST 2 как минимум три раза, по 1 час на вращающемся шейкере. Рекомендуется промывать салфетки до 8 часов, чтобы уменьшить фон. Обязательно накройте трубки фольгой, чтобы защитить их от света при этом этапе.
  8. УдалитеPBST 2 и добавьте 100 мкл DAPI с разбавлением 1/1000 (1 мкг/мл) в PBS в пробирку. Инкубировать ткани в DAPI в течение 30 минут при комнатной температуре.
  9. Промыйте яичники вPBST 2 один раз в течение 30 минут и закрепите их на микроскопическом стекле с прокладкой. Перенесите яичники в центр прокладки с помощью пипетки объемом 1 мл и удалите излишкиPBST 2. Добавьте около 5 мкл монтажной среды антифейда и поставьте микроскопическое стекло на верхнюю часть прокладки. Запечатайте края прокладки прозрачным лаком для ногтей для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед съёмкой слайдов убедитесь, что лак для ногтей полностью сухой и что на внешней стороне накладки нет крепящего материала. Эти реагенты могут повреждать объективы микроскопа. Кроме того, избегайте использования избыточных монтажных материалов, так как яичники должны оставаться неподвижными во время визуализации.
  10. Снимите яичники с помощью конфокального микроскопа при увеличении в 10 раз и размером Z-шага 10 мкм. Настройте настройки и используйте Z-компенсацию (усиление возбуждения) для изображения всего яичника. Это можно сделать с помощью следующих шагов:
    1. Регулируйте мощность возбуждения и усиление детектора, отслеживая насыщение сигнала с помощью гистограммы, так как оно может варьироваться между тканями. Начинайте с низкой мощности лазера и постепенно увеличивайте мощность по мере необходимости.
    2. Для изображения более глубоких областей включите Z-компенсацию для детектора усиления, так как интенсивность сигнала может снижаться с глубиной. Используйте среднюю частоту кадра не менее 10 и включите двунаправленное X-сканирование со скоростью 600 Гц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При таких настройках изображение не должно превышать 10 минут на яичник (~200 мкм). Целостное иммунофлуоресцентное окрашивание яичников анти-DDX4 обычно является надёжным и редко фотоотбеливающимся.

4. Количественная оценка фолликулов

  1. Чтобы количественно оценить фолликулы в каждом яичнике, откройте изображения с помощью программного обеспечения ImageJ. При открытии убедитесь, что цветовой режим выбран как цветной , а разделённые каналы отмечены в поле разделения на отдельные окна. Выберите интересующее изображение, затем используйте инструмент изображения/трансформации/вращения , чтобы разместить яичник симметрично на изображении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения, полученные с помощью confocal, можно просматривать и анализировать в 3D с помощью программного обеспечения Imaris (рисунок 3A,B) или программного обеспеченияImageJ 16.
  2. Используйте инструмент анализ/инструменты/сетка , чтобы разделить яичник на сетки (рисунок 3C, C').
  3. Используйте инструмент плагинов/анализ/счётчик ячеек, чтобы отметить все сетки, покрывающие яичник (рисунок 3D, D', сетки отмечены 4). Из этих сеток отметьте каждую вторую сетку в каждой строке для количественной оценки фолликулов (рисунок 3E,E', сетки отмечены 8). Сетки на краях яичника, содержащие менее 10 яйцеклетки, не включаются для количественной оценки фолликулов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инициализируйте счётчик ячеек и выберите типы счётчиков , которые считаете легко читаемыми.
  4. Яйцеклетки можно идентифицировать по наличию DDX4-положительной кольцеобразной структуры вокруг ядра, положительного на DAPI. Первичные фолликулы имеют яйцеклетки диаметром примерно 20 мкм, окружённые плоскими соматическими клетками. Развивающиеся фолликулы имеют яйцеклетки диаметром более 25 мкм и окружённые одним или несколькими слоями кубоидальных гранулезных клеток (дополнительный рисунок 1).
  5. Посчитайте первичные фолликулы в каждой отмеченной сетке (как показано на рисунке 3E,E' с счетчиком типа 8). Пройдитесь по фолликулам, используя оптические срезы/стопки в сетке, и отметьте их с помощью инструмента счёта клеток соответственно. Убедитесь, что не дважды подсчитывайте первичные фолликулы на двух последовательных оптических участках/стеках. Подсчитайте развивающиеся фолликулы во всех сетках, отмеченных счетчиком типа 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте опцию увеличения , чтобы помочь визуализировать и подсчитать яйцеклетки в стеках.
  6. Вычислим количество первичных фолликулов во всём яичнике (nf), умножив среднее количество первичных фолликулов на сетку (nfgrid) на количество сеток, охватывающих яичник (ngrids). nf = сетка nf × ngrids.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Были проведены статистические анализы, а графики созданы с помощью программного обеспечения Prism 10.2.0 (GraphPad Software, версия 10, Inc., CA). Различия между группами оценивались с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA), за которым последовал тест множественного сравнения Тьюки. Статистическая значимость рассматривалась при p < 0,05. Данные представлены как среднее ± стандартной ошибке (SE).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этой статье мы демонстрируем методы неонатальной культуры яичников, окрашивания антителами с целым креплением, конфокальной визуализации и количественной оценки фолликулов, чтобы оценить, влияет ли количество и положение яичников в вставке во время культуры на экспериментальный результат, в частности, на количество фолликулов в яичнике. Мы посетивировали яичники с помощью следующих схем: один, два или три яичника на вставку для стабилизированной культуры и три яичника на вставку для плавающей культуры. Яичники были пос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании мы продемонстрировали методы культуры яичников у новорождённых мышей и количественной оценки фолликулов целых яичников. Культурный подход может поддерживать первичные и ранние развивающиеся фолликулы in vitro. Метод количественной оценки фолликулов с целым монтажом требует минимальной обработки тканей, что экономит время и сохраняет целостность тканей, обеспечивая точную количественную оценку фолликулов.

Количество первичных фолликулов, наб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером награды No R35GM158131. EADM поддерживался Фондом Лалор. Авторы с благодарностью выражают признательность Университету Миссури Advanced Light Microscopy Core за их поддержку и помощь в этой работе

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24-колодцевые клеточные культивные пластиныFisher scientific 09-761-146 
Alexa Fluor 488 Анти-Кролик ОслаЛаборатории иммунных исследований Джексона711-546-152
Анти-Анти (100X)Gibco15240-062
Бычий сывороточный альбуминСигма-ОлдричA1470-25G
CD-1 IGS MouseCharles River Laboratories 022Мыши
Вставки для клеточной культурыМиллипорPICM01250
Инсулиновый шприц Comfort Point с иглой 1 куб.см 28G x 1/2Exel26027
DAPIThermo Scientific62248
DDX4 Rabbit mAbAbcamAB13840
DMEM/F12 (1:1) (1 раз)Gibco11320-033
Доксорубицин гидрохлорид Сигма-ОлдричPHR1789
DPBS (1 раз)Gibco14190-144
Сыворотка плода для быкаСигма-ОлдричF0926-500ML
Fiji-ImageJNIH, США (https://imagej.net/ij/)ImageJ 1.52p
Миксеры Fisherbrand Nutating — переменная скоростьFisher scientific 88-861-043Шейкер
Фолликулостимулирующий гормонСигма-ОлдричF4021-10UG
Forma Steri-Cycle i160Термонауки и торговле;i160CO2-инкубатор
ГлицинFisher scientific BP381-500
Imaris Oxford Instruments (https://imaris.oxinst.com/)Imaris 10.2
Leica TCS SP8Leica MicrosystemsСН 8100001409Конфокал
Обычная ослиная сывороткаЛаборатории иммунных исследований Джексона017-000-121
Olympus SZ61Микроскопы OlympusSZ61Стереоскоп
Параформальдегид Fisher scientific 15714
Проставка для изображения SecureSealGrace Bio-Labs654002
Triton X-100Сигма-ОлдричX100-500ML
TWEEN 20Сигма-ОлдричP1379-500ML
VECTASHIELD Антифейд Медиум КрепленияVector LaboratoriesH-1000

Ссылки

  1. Pepling, M. E. From primordial germ cell to primordial follicle: Mammalian female germ cell development. Genesis. 44 (12), 622-632 (2006).
  2. Ikami, K., Nuzhat, N., Lei, L. Organelle transport during mouse oocyte differentiation in germline cysts. Curr Opin Cell Biol. 44, 14-19 (2017).
  3. Pepling, M. E. Follicular assembly: Mechanisms of action. Reproduction. 143 (2), 139-149 (2012).
  4. Lintern-Moore, S., Moore, G. P. The initiation of follicle and oocyte growth in the mouse ovary. Biol Reprod. 20 (4), 773-778 (1979).
  5. Picton, H. M. Activation of follicle development: The primordial follicle. Theriogenology. 55 (6), 1193-1210 (2001).
  6. Smitz, J. E., Cortvrindt, R. G. The earliest stages of folliculogenesis in vitro. Reproduction. 123 (2), 185-202 (2002).
  7. Jagarlamudi, K., Rajkovic, A. Oogenesis: Transcriptional regulators and mouse models. Mol Cell Endocrinol. 356 (1-2), 31-39 (2012).
  8. Binelli, M., Murphy, B. D. Coordinated regulation of follicle development by germ and somatic cells. Reprod Fertil Dev. 22 (1), 1-12 (2010).
  9. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).
  10. Bristol-Gould, S. K., et al. Postnatal regulation of germ cells by activin: The establishment of the initial follicle pool. Dev Biol. 298 (1), 132-148 (2006).
  11. Pedersen, T., Peters, H. Proposal for a classification of oocytes and follicles in the mouse ovary. J Reprod Fertil. 17 (3), 555-557 (1968).
  12. Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biol Reprod. 54 (1), 197-207 (1996).
  13. Levy, E. W., Leite, I., Joyce, B. W., Shvartsman, S. Y., Posfai, E. A tug-of-war between germ cell motility and intercellular bridges controls germline cyst formation in mice. Curr Biol. 34 (24), 5728-5738 (2024).
  14. Nagamatsu, G., Shimamoto, S., Hamazaki, N., Nishimura, Y., Hayashi, K. Mechanical stress accompanied with nuclear rotation is involved in the dormant state of mouse oocytes. Sci Adv. 5 (6), eaav9960(2019).
  15. Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reprod Toxicol. 49, 117-135 (2014).
  16. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  17. Bristol-Gould, S. K., et al. Fate of the initial follicle pool: Empirical and mathematical evidence supporting its sufficiency for adult fertility. Dev Biol. 298 (1), 149-154 (2006).
  18. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  19. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  20. Sonigo, C., et al. High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach. Sci Rep. 8 (1), 13499(2018).
  21. Sarma, U. C., Winship, A. L., Hutt, K. J. Comparison of methods for quantifying primordial follicles in the mouse ovary. J Ovarian Res. 13 (1), 121(2020).
  22. Murphy, K., Carvajal, L., Medico, L., Pepling, M. Expression of Stat3 in germ cells of developing and adult mouse ovaries and testes. Gene Expr Patterns. 5 (4), 475-482 (2005).
  23. Luan, Y., Yu, S. Y., Abazarikia, A., Dong, R., Kim, S. Y. TAp63 determines the fate of oocytes against DNA damage. Sci Adv. 8 (51), eade1846(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Культивирование новорожденных яичниковколичественный анализ целых образцовстадирование фолликуловмаркер ооцитов DDX4культивирование на мембранных вставкахфизиология яичниковактивация фолликулов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.