Методическая статья

Одиночные пробеги стресс-тестов на мито и гликолиза с использованием адгерентных или неадгезирующих клеток

202 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69504

⸱

22 мая 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Cancer Biology, Neuroscience and Pharmacology, School of Medicine, Meharry Medical College, 2Department of Biomedical Sciences, School of Graduate Studies, Meharry Medical College, 3Host-Tumor Interactions Research Program, Vanderbilt-Ingram Comprehensive Cancer Center, Vanderbilt University School of Medicine, 4Vanderbilt Institute for Infection, Immunology and Inflammation, Vanderbilt University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании представлены оптимизированные протоколы для проведения метаболического анализа в реальном времени стресс-тестов Mito и гликолиза одновременно на одной пластине. Процедуры адаптированы как для адгерентных (BMDM), так и для неадгезентных (лимфоцитов) клеток, что позволяет точную, воспроизводимую и параллельную оценку митохондриальной и гликолитической функции интересующих клеток.

Аннотация

Метаболический анализ в реальном времени обеспечивает измерения митохондриального дыхания и гликолиза без меток, позволяя исследователям связывать клеточный энергетический метаболизм с механизмами заболеваний и терапевтическими реакциями в различных областях. При сравнении энергетического обмена между разными мышами, животными, людьми или клетками при различных методах обработки крайне важно проводить измерения за один запуск, чтобы обеспечить точные и надёжные результаты. Кроме того, при проектировании экспериментов необходимо учитывать тип анализируемых клеток, например, являются ли они приклеенными, как макрофаги, полученные из костного мозга (BMDM), или неадгезивными, как лимфоциты. Поэтому был разработан протокол, позволяющий одновременно проводить стресс-тесты на мито и гликолиз на одной пластине, несмотря на то, что анализы требуют отдельных инъекций лекарств и аналитических программ. Отдельные протоколы обработки были оптимизированы для анализа как высоко адгерентных клеток (например, BMDM), так и неадгезентных «плавающих» клеток (например, Т-клеток и других лимфоцитов). Здесь представлены подробные протоколы для эффективного и воспроизводимого проведения этих анализов.

Введение

Анализатор Seahorse XF — уникальный прибор, позволяющий в реальном времени измерять митохондриальное дыхание и гликолиз у многих типов клеток. Одновременно количественно оценивая скорость потребления кислорода (OCR) и скорость внеклеточного закисления (ECAR), эта технология позволяет точно рассекать биоэнергетические пути в физиологических или стрессовых условиях. Его универсальность сделала его незаменимым в различных областях исследований, включая рак1,нейронауку 2, иммунологию3,старение 3, 4, 5 и открытиелекарств 6, где метаболическое перепрограммирование является отличительной чертой прогрессирования заболевания и терапевтического ответа. Связывая функциональную биоэнергетику с клеточнымифенотипами 7,8, анализ предоставляет мощную платформу для выявления механизмов, выявления метаболических уязвимостей и оценки эффектов генетических или фармакологических вмешательств.

Во многих дисциплинах сравнивать непосредственное воздействие лекарств, малых молекул, цитокинов или природных соединений на клеточный метаболизм лучше всего проводить при одинаковых экспериментальных условиях, одной пластине, времени инкубации, параметрах окружающей среды и времени суток. Таким образом, этот подход заключается в том, чтобы пластинчатые клетки с разными методами обработки или генетическим фоном были на одной пластине и одновременно анализировать несколько метаболических параметров. Эта стратегия обеспечивает максимально точное сравнение изменений, связанных с лекарствами или генетикой, в метаболизме энергии клеток.

Многие типы клеток ведут себя по-разному в культуре. Лимфоциты остаются в суспензии и никогда не прикрепляются кпластине 9, макрофаги крепко прилипают к переносу, что затрудняет их перенос, а раковые клетки быстро размножаются, но с разной скоростью в зависимости от линии. Эти различия создают трудности для метаболического анализа в реальном времени; поэтому каждый тип клетки в эксперименте требует индивидуального протокола.

В этой статье представлены пошаговые протоколы проведения этих анализов с использованием метаболического анализа в реальном времени, обеспечивая эффективность и воспроизводимость. Эти протоколы могут применяться ко всем версиям анализаторов, доступных на рынке.

Протокол

За мышами уходили в соответствии с процедурами, изложенными в протоколе Национального института здоровья и Комитета по уходу и использованию животных (IACUC) в Медицинском колледже Мехарри. Это учреждение аккредитовано Ассоциацией по оценке и аккредитации Laboratory Animal Care International и соответствует Политике Службы общественного здравоохранения по лечению и использованию лабораторных животных в условиях, свободных от патогенов. Детали реактивов и используемого оборудования приведены в Таблице материалов.

1. Оптимизация для плотности ячеек

ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый тип клеток обладает уникальными метаболическими характеристиками и значительными вариациями размеров. Оба фактора критически важны для определения подходящего количества ячеек для загрузки на скважину для получения оптимальных результатов. Перед проведением первоначального экспериментального анализа подготовьте и проведите тестовую пластину с выбранными интересующими ячейками, покрытыми с разной плотностью.

  1. Для клеток (например, раковых клеток) проверьте плотность посева в диапазоне от 20 000 до 100 000 клеток на колодцу. Для высокометаболических и/или крупных клеток (например, раковых клеток человека или фибробластов) оптимизация плотности начинается с 10 000 клеток или меньше на одну скважину.
  2. Для неадгезентных клеток (например, лимфоцитов) оптимизируйте плотность посева в диапазоне от 100 000 до 500 000 клеток на колодцу. Для всех типов ячеек стремитесь к единообразному монослою с одной ячейкой для достижения оптимальных результатов (см. рисунок 1 , например, расположение пластин образцов).
  3. Проведите тест Mito Stress (как указано ниже). Данные этого предварительного анализа могут быть использованы для определения оптимальной плотности ячеек основного эксперимента. Выберите плотность, которая показывает наибольшую разницу между условиями анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол не применяется к анализу 3D-образцов (например, клеточных сфероидов, органоидов). Однако его можно модифицировать с учётом толщины образца и неравномерной поверхности.

2. Подготовка к анализу

  1. За день до запуска анализа аккуратно поднимите сенсорный картридж из утилитарной пластины и добавьте 200 мкл воды без РНКаз/ДНКазы в каждую скважину полезной пластины и опустите сенсорный картридж в утилитарную пластину, пока датчики не будут полностью погружены в воду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень воды должен быть достаточно высоким, чтобы датчики были полностью погружены в воду на ночь, так как флюорофоры картриджа датчика не будут работать без достаточной гидратации. Если использовать XF Hydrobooster для гидратации картриджа, картридж можно сразу поместить в раствор калибра, исключив этап гидратации воды.
  2. Поместите гидратированный картридж сенсора/утилитарную пластину в инкубатор с температурой 37 °C безCO2 на ночь. Чтобы предотвратить испарение с тарелки, также поместите в инкубатор контейнер с двойной дистиллированной водой.
  3. В день анализа извлеките сенсорный картридж/утилитную пластину из инкубатора безCO 2 и аккуратно выньте датчик из утилитической пластины, положив картридж вверх на стол.
  4. Сбросьте воду с утилитарной плиты, вытряхните все капли и добавьте 200 мкл раствора XF Calibrant в каждую скважину.
  5. Аккуратно положите картридж датчика обратно в утилитарную пластину, чтобы датчики полностью погрузились в раствор калибра, и поместите его обратно в инкубатор с температурой 37 °CCO2 без CO.

3. Подготовка пробиральных материалов

  1. Подготовка медиа для Mito Stress:
    1. В трубке объёмом 50 мл добавьте следующее к 45 мл среды XF RPMI: 500 мкл пирувата натрия 100x (конечная концентрация: 1 мМ), 500 мкл 100x L-глутамина (конечная концентрация: 2 мМ) и 550 мкл раствора глюкозы 45% (конечная концентрация: 25 мМ)
  2. Отрегулируйте pH до 7,4. Добавьте XF RPMI medium до итогового объёма 50 мл. Перед использованием храните подготовленную смесь в водяной бане при температуре 37 °C или в сухой ванне.
  3. Подготовка среды с анализом гликолиза:
    1. В трубке на 50 мл добавьте 250 мкл 100x L-глутамина к 45 мл XF RPMI-среды.
  4. Отрегулируйте pH до 7,4, затем добавьте средний объём XF RPMI до конечного объёма 50 мл. Поместите подготовленный материал в воду при температуре 37 °C или сухой ванне перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: pH среды для анализа на митостресс и гликолиз необходимо скорректировать до 7,4 после добавления добавок, изменяющих pH, так как даже небольшие отклонения могут существенно повлиять на результаты анализа.

4. Промывка ячеек и смена среды перед анализом

ПРИМЕЧАНИЕ: Этап промывания микропластин XFe96/XF Pro Cell Culture будет варьироваться в зависимости от того, используются ли они с адгерентными или неадгезентными типами клеток. Пожалуйста, обратитесь к шагу 9 «Адгерентные (раковые клетки, первичные клетки BMDM) и неадгезентные клетки (Т-клетки и другие лимфоциты), чтобы определить лучший метод промывания для используемого типа клеток.

  1. Удаляйте 160–180 мкл ростовой среды из каждой скважины с помощью мультипипеттора, работая по одной строке/колонке за раз, чтобы предотвратить высыхание ячеек. Избегайте касаться дна колодцев.
  2. С помощью одноконцевого пипетмана удаляйте оставшиеся 20–30 мкл из колодцев, избегая касания клеточного слоя на дне.
  3. Добавьте в каждую скважину 180 мкл гликолиза или мито-стрессовой анализной среды (см. шаг 3), следуя схеме на рисунке 1. Чтобы не нарушать слой клеток, аккуратно размещайте среду вдоль боковой стенки каждой скважины, пока все колодцы не заполнятся. Оба анализа находятся в одной пластине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скважины, не содержащие клетки и контролирующие скважины, также должны быть заполнены пробирными средами.
  4. Поместите микропластину в инкубатор с температурой 37 °C безCO2 на 40–45 минут до начала анализа и начните готовить препараты.

5. Подготовка лекарств и заряжание патрона

ВНИМАНИЕ: Некоторые препараты (FCCP, антимицин А/Ротенон, олигомицин) опасны и требуют осторожного обращения. Необходимы соответствующие меры для защиты персонала; к ним относятся использование перчаток и других средств индивидуальной защиты (СИЗ), а также утилизация материалов в одобренный учреждением контейнер или контейнер для химических отходов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация FCCP/олигомицина зависит от типа клеток и до анализа эмпирически титрируется при работе с особенно чувствительными клетками. Конечные концентрации для лекарств могут варьироваться в зависимости от типа клеток. Готовьте препараты и анализные материалы свежими в день употребления. Не замораживайте и не используйте повторно. Подготовка препарата может быть завершена в течение этих 45 минут для достижения оптимальных результатов.

  1. Используя предварительно подогретый средой мито-стресса и гликолиза из шага 3, разведите соединения согласно Таблице 1 и/или Таблице 2 до концентраций, соответствующих каждому типу клеток. Подготовьте каждое соединение в отдельной трубке объёмом 15 мл (если использовать все шесть соединений, потребуется шесть трубок).
  2. Снимите картридж датчика/утилитарную пластину из инкубатора 37 °C CO2-less и снимите крышку, аккуратно разместите направляющую XF, прилагаемую к комплекту, а направляющую XF, соответствующую порту форсунки (Guide A для порта A), надёжно над верхней частью картриджа датчика (см. рисунок 2).
  3. Используя многоканальный пипеттор и реагентный резервуар для каждого препарата, постепенно добавляйте необходимый объём в соответствующий порт (см. Таблицу 1 и Таблицу 2 для объёма). Держите пипеттор строго вертикально при загрузке препаратов (см. рисунок 2).
  4. Замените или используйте повторно после тщательного промывания и сушки направляющей для загрузки по необходимости для каждого порта (порты A, B, C и D) и выбрасывайте наконечники пипетки после каждой загрузки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечники пипетки должны плотно входить в направляющий порт, но не слишком плотно, так как наконечники пипетки могут застрять в направляющем! Рекомендуется протестировать наконечники пипетки/пипетку, используемые на направляющих, перед загрузкой соединений, чтобы избежать неправильной загрузки образцов.
  5. После загрузки всех составов в соответствующие порты снимите направляющий, визуально убедитесь, что все порты заполнены, и закрепите картридж крышкой. Препараты должны соответствовать анализу в каждой части одной пластины (рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые конечные концентрации колодцев для стресса Мито: 1 мкм олигомицина, 1 мкм FCCP и 0,5 мкм ротенона/антимицина; для гликолиза — 10 мМ глюкозы, 1 мкм олигомицина и 50 мМ 2-ДГ.

6. Настройка анализатора Seahorse XFe96

  1. Включите анализатор и откройте программное обеспечение WAVE (см. рисунок 3).
  2. Выберите XF Стресс-тест Мито.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании соответствующих анализных средств и соединений анализатор может одновременно проводить как митохондриальные, так и гликолизные тесты на одной пластине с помощью XF Mito Stress Test.
  3. Выберите количество «Групп» в зависимости от настройки пластин и обозначьте каждую группу. Перейдите к следующей вкладке, чтобы назначить скважины для карты плит (см. рисунок 3). Оба анализа проводятся в одной и той же пластине.
  4. Выделяйте скважины для каждой группы в зависимости от того, как загружена пластина.
  5. Корректируйте программу в соответствии с типом клетки и экспериментальной целью. Например, если в установке есть предактивированная группа перед анализом или во время запуска добавляется активатор, удлините время инкубации в каждом цикле, чтобы обеспечить активацию.
  6. Выберите следующую вкладку «Запустить анализ» и заполните информацию по мере необходимости, чтобы сохранить файл данных.
  7. Загрузите предварительно гидратированный картридж лекарствами (начиная с шага 5) в машину по назначению для инициализации. Этап инициализации покажет, правильно ли датчики гидратированы и работают.
  8. Начинайте анализ, загружайте и разгружайте пластины в соответствии с подсказками во время программы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При загрузке картриджа или микропластины в анализатор убедитесь, что все крышки сняты! В то время как некоторые модели анализаторов имеют функцию безопасности, позволяющую распознавать крышки, ранние модели их нет. Это может повредить машину, если крышка цела во время прохождения пластины.

7. Методы нормализации: (SRB) и подсчёт ядра (окрашивание и визуализация по DAPI)

ВНИМАНИЕ: Некоторые реагенты в наборе для анализа SRB коррозийны и могут обжигать при контакте с кожей. DAPI может вызвать аллергическую кожную реакцию. Рекомендуется использовать перчатки и другие средства индивидуальной защиты, а также утилизировать материалы в одобренный учреждением контейнер или контейнер для химических отходов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте метод нормализации на основе характеристик и предварительной обработки анализируемых клеток. Оба метода подходят для сравнения клеток с разными темпами пролиферации, поскольку оба способа учитывают такие вариации. Однако если медикаментозное лечение вызывает старение, останавливает пролиферацию и увеличивает размер клеток, окрашивание DAPI является предпочтительным подходом к нормализации. DAPI может быть неподходящим для типов клеток, где ядерное окрашивание трудно визуализировать (например, адипоциты, эритроциты) или клетки могут быть многоядерными (например, паренхимальные гепатоциты, миоциты).

  1. Для нормализации клеток с помощью SRB-анализа (Sulfohodamine B Cell Cytoxicity Assay Kit) после метаболического анализа в реальном времени вынимите пластину из аппарата и добавьте 1/4 объёма среды (например, 50 мкл в 200 мкл культурной среды) фиксационного раствора в каждую скважину.
    1. Инкубировать при комнатной температуре 1 час или ночью при 4 °C.
    2. Удалите раствор и аккуратно промыйте колодцы три раза 200 мкл воды без РНаз/ДНаз, стараясь не нарушать клеточный слой. Для краткосрочного хранения (при необходимости) замените окончательную промывку на PBS и храните при 4 °C.
    3. Для немедленной нормализации с помощью SRB-анализа удалите раствор для промывки и дайте пластине полностью высохнуть на воздухе при комнатной температуре.
    4. Добавьте 25 мкл раствора SRB в каждую скважину и окрашивайте 15 минут при комнатной температуре в темноте или оберните пластину алюминиевой фольгой в период инкубации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор SRB является светочувствительным, и эта часть эксперимента должна проводиться в области с низкой освещённостью.
    5. Удалите раствор для окрашивания и добавьте 100 мкл раствора для стирки 1x для промывания каждой колодцы 2–3 раза.
    6. Стирайте как можно быстрее, чтобы избежать отбеливания, и максимально удаляйте растворы вакуумным вакуумом.
    7. Добавьте 100 мкл раствора 1x раствора в каждую скважину и поставьте пластину на шейкер на 10 минут при комнатной температуре.
    8. Измерьте оптическую плотность (O.D.) на 565 нм на считывателе пластин, чтобы определить плотность колодици на основе насыщенности цвета (см. рисунок 3 для визуального ориентира).
    9. Экспортируйте данные O.D. значений в файл Excel. Эта таблица будет вставлена в программное обеспечение WAVE для нормализации (шаг 8).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдается интенсивный цвет (> O.D. 3.5) из-за перегрузки ячеек, может быть использована субоптимальная длина волны (например, 490–530 нм) для снижения показаний обратно в линейный диапазон прибора. Корректируйте фон, вычитая дозу контроля, содержащего только культурную среду (фоновую контрольную скважину), из всех показаний образцов.
  2. Для окрашивания DAPI разведите стандартный раствор DAPI до 300 нМ в 1x PBS.
    1. Промыйте каждую ячейку пластины 3 раза аккуратно с помощью 200 мкл 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть неприлипающие элементы, центрифугуйте пластину при 200 x g в течение 3 минут без тормоза, чтобы после каждого шага промывки ячейки подвешены на дне каждой колодца.
    2. Фиксируйте ячейки в 2%–4% PFA, разбавленных в 1x PBS в течение 10–15 минут при комнатной температуре.
    3. Промыйте каждую ячейку пластины 3 раза аккуратно с помощью 200 мкл 1x PBS.
    4. Добавьте примерно 150 мкл этого разбавлённого раствора DAPI для окрашивания в каждую яму, убедившись, что клетки полностью покрыты каждой ямочкой.
    5. Инкубировать 1–5 минут при комнатной температуре в слабо освещённом месте (или накрывать пластину алюминиевой фольгой).
    6. Удалите раствор DAPI с окрашиванием из каждой колодцы.
    7. Промыйте каждую ячейку пластины 3 раза аккуратно с помощью 200 мкл 1x PBS.
    8. Удалите оставшиеся PBS.
    9. Снимите клетки при любом возбуждении/излучении в диапазоне 358–461 нм или под любой настройкой фильтра DAPI на микроскопе.
    10. Экспортируйте данные о значениях выбросов в файл Excel. Эта таблица будет вставлена в программное обеспечение WAVE для нормализации (шаг 8).

8. Анализ и нормализация данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа данных можно использовать программное обеспечение «Wave» или другое программное обеспечение. Предоставленный протокол применим к программному обеспечению Wave.

  1. Откройте результаты анализа в Wave (см. рисунок 3). Нормализация выполняется с использованием значений, полученных из файла Excel, сгенерированного считывателем микропластин после окрашивания SRB (шаг 7).
  2. Нажмите «Нормализировать».
  3. В открытом окне выберите «выбрать все», затем «вставить», чтобы вставить данные, скопированные из таблицы Excel, сгенерированной на этапе нормализации. Нажмите «Подать заявку». Эта процедура автоматически нормализовала все экспериментальные данные.
  4. Чтобы сгенерировать отчёт, нажмите «Export to», в панели, открывающейся справа, выберите «XF Cell Mito Stress Test Report Generator». Сохраните сгенерированный файл. Во время анализа выберите только скважины, назначенные для испытания Мито (см. рисунок 3).
  5. Чтобы сгенерировать отчёт, нажмите «Экспортировать», в панели, которая открывается справа, выберите «XF Cell Glycolysis Stress Test» Report Generator. Сохраните сгенерированный файл. Во время анализа выберите только те скважины, назначенные для теста на гликолиз (см. рисунок 3).

9. Адгерентные и неадгезентные клетки

ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные и неадгезентные клетки различаются по росту, прикреплению к поверхности и требованиям к обращению. Клеечные клетки (например, раковые клетки, BMDM) прикрепляются к поверхности культуры, поэтому покрытие и промывка не требуют особых мер предосторожности. Неадгезирующие клетки (например, Т-клетки, другие лимфоциты) остаются в суспензии и требуют различных методов центрифуга, реанимации и покрытия. Понимание этих различий крайне важно для точного посева клеток, обработки препаратов и согласованности анализа.

  1. Убедитесь, что все клетки, используемые для эксперимента, культивированы в выбранной среде и сосуде непосредственно перед проведением анализа, а затем перенесите их на микропластину для проведения анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя среда XF RPMI рекомендуется для типов клеток, описанных в этом протоколе, для других типов клеток проконсультируйтесь с производителем, чтобы убедиться, что используется соответствующая среда.
  2. Для клеток с адгерентными клетками (раковые клетки, клетки BMDM) за 4–5 часов до анализа засеять клетки в микропластину XFe96/XF Pro Cell Culture с оптимальной плотностью клетки (см. шаг 1) в объёме среды 200 мкл и поместить в инкубатор при температуре 37 °CCO2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: клетки BMDM можно покрыть до 24 часов до анализа, так как они не размножаются и сохраняют ту же плотность клеток. Для быстрорастущих клеток, таких как раковые линии, рекомендуется покрывать их в день анализа, если дополнительное лечение не требуется, и анализировать их сразу после присоединения клеток, чтобы предотвратить дальнейший рост. Если такая конструкция невозможна, необходим этап нормализации до количества/колодцы белка или числа ядер/ядер.
  3. Убедитесь, что угловые ямы для каждых четырёх углов микропластины свободны от клеток, но заполнены средой, так как это измеряется как пустые контрольные ямы.
  4. После 3–5 часов инкубации наблюдайте за микропластинкой, чтобы убедиться, что клетки прикреплены к ней на равномерном уровне на дне каждой ямы.
  5. Если ячейки ещё не подключены, пластину можно поместитьв инкубатор CO 2 при температуре 37 °C на дополнительное время, пока клетки полностью не присоединятся.
  6. Далее подготовьте микропластину с приклеенными элементами для мытья, как указано в шаге 4, чтобы приступить к анализу.
  7. Для неадгезирующих клеток (Т-клеток и других лимфоцитов) покройте микропластину поли-D-лизином перед добавлением клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя в этом протоколе рекомендуется покрытие с поли-D-лизином, в зависимости от типа клетки другое покрытие (например, коллаген, фибронектин, желатин) может быть более подходящим. Если используете альтернативное покрытие, пожалуйста, следуйте инструкциям производителя.
  8. Для покрытия микропластины подготовьте 2,5 мл раствора поли-D-лизина 20 мкг/мл (50-кратное разбавление 1 мг/1 мл водного раствора) в 0,1 м натрия бикарбоната, pH 8,0 (бикарбонат обеспечивает оптимальный pH для адсорбции клея). Этот этап можно выполнить до проведения анализа или в день проведения.
  9. Нанесите 25 мкл раствора в каждую яме пластины и инкубируете на верстаке или на пороге при комнатной температуре 20–30 минут.
  10. Аспирировать или пипетить оставшийся раствор и промыть каждую скважину дважды, используя 200 мкл воды, свободной от РНК/ДНК.
  11. Подождите, пока колодцы высохнут (1–2 часа), прежде чем сеять клетки на микропластине.
  12. Далее подготовьте микропластину с неприлипающими элементами для этапа промывки, центрифугая пластину при 200 x g в течение 3 минут без тормоза, чтобы ячейки подвешены на дне каждой скважины.
  13. Перейдите к шагу 4 и продолжите оставшуюся часть анализа, как указано в шагах 5–7.

Результаты

Этот комбинированный протокол был разработан для проведения обоих анализов на одной пластине. Например, этот метод был использован для выяснения перекрёстной сигнализации mGluR1−TCR по метаболической компетентности CD8+ Т-клеток во времяактивации 10. Это было сделано для оценки влияния ингибитора mGluR1 на переход к гликолизу и изменения митохондриального дыхания — процессов, необходимых для оптимального функционирования Т-клеток, при минимализации количества используемых Т-клеток в каждом эксперименте. Та же однопластинчатая техника была эффективно применена и к другим типам клеток, таким как макрофаги, полученные из костного мозга (BMDM; Рисунок 4 и Рисунок 5), а также к неадгезирующим клеткам, таким как мононуклеарные периферические клетки крови человека (PMBC; Рисунок 3). Было показано, что блокада сигнализации mGluR1 на активированных CD8+ Т-клетках влияет на производство митохондриальной и немитохондриальной энергии. В отличие от этого, наивные клетки не показали значимых изменений в своих метаболических энергетических профилях (рисунок 6A,B). Стресс-тест Mito активированных CD8+ Т-клеток показал высокое базальное и максимальное дыхание, а также емкость дыхательных резервов (рисунок 6C). Т-клетки, обработанные CPCCOEt, неконкурентным антагонистом, блокирующим дальнейшие сигналы при связывании глутамата с mGluR1, имели снижение потребления кислорода (OCR), как и наивные клетки, и приводили к снижению выработки АТФ (рисунок 6C). Анализ гликолиза также показал, что только необработанные активированные CD8+ Т-клетки производили АТФ посредством гликолиза, а лечение CPCCOE демонстрировало метаболическую активность, сопоставимую с наивным заболеванием (рисунок 6D). Эти результаты подтверждают, что сигнализация mGluR1 необходима для правильной функции CD8⁺ Т-клеток при активации.

figure-results-1
Рисунок 1: Этот рисунок иллюстрирует обзор схемы пластин микропластины, включающий Мито-стресс и гликолизный анализ в одной пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Загрузка патрона для наркотиков. (A) Подробная карта датчиков и портов сзади и спереди патрона, с маркировкой, какой препарат должен быть загружен в какой порт. (B) Рекомендуемая ориентация направляющих сверху картриджа для загрузки соответствующих портов и рекомендуемое положение для использования многоканального пипеттора поверх направляющих. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Использование программы WAVE для запуска и анализа анализа. (A) Процесс создания программы включает выбор типа анализа, назначение групп, создание карты пластин и программирование портов для лекарств. (B) Порядок загрузки препаратов в соответствующие порты зависит от того, является ли образец мито-стрессом или гликолизам. (C) Крупный план окраски SRB на последнем этапе нормализации. (D) После нормализации данные пластины могут быть экспортированы отдельно в виде как гликолиза и мито-стресс-теста для одной и той же пластины. (E) Данные по Mito Stress можно выбрать, отредактировав текущий выбор только для образцов Mito Stress. (F) Данные для гликолиза можно отобрать, отредактировав текущий выбор только для образцов гликолиза. Примеры данных, использованные на этом рисунке, взяты из анализа мононуклеарных клеток периферической крови человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Одновременная работа Mito Stress на одной пластине. Макрофаги, полученные из костного мозга, полученные от 2-месячных мышей WT и Tusc2 KO, подвергались обоим типам анализа. Клетки либо оставались без обработки (фиктивно), либо стимулировались ЛПС (100 нг/мл) в течение 5 часов перед нанесением (30 000 клеток/скважины). Стресс-тесты мито и гликолиза проводились параллельно для точного сравнения, как показано на рисунке 1. (A) Профили стресса Mito для различных типов клеток (WT и KO) и условий (наивных и активных), сгенерированные с помощью программного обеспечения Wave. Нормализация проводилась с помощью окрашивания SRB, как описано на шаге 7. (B) Сравнительные столбчатые диаграммы параметров, анализируемых в каждом тесте. ∗p ≤ 0,05, ∗∗p ≤ 0,005, тест T для учеников. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: Одновременное выполнение гликолиза Стресс-тесты, проводимые на той же пластине. Макрофаги, полученные из костного мозга, полученные от 2-месячных мышей WT и Tusc2 KO, подвергались обоим типам анализа. Клетки либо оставались без обработки (фиктивно), либо стимулировались ЛПС (100 нг/мл) в течение 5 часов перед нанесением (30 000 клеток/скважины). Стресс-тесты мито и гликолиза проводились параллельно для точного сравнения, как показано на рисунке 1. (A) Профили стресса гликолиза для различных типов клеток (WT и KO) и условий (наивных и активных), генерируемые с помощью программного обеспечения Wave. Нормализация проводилась с помощью окрашивания SRB, как описано на шаге 7. (B) Сравнительные столбчатые диаграммы параметров, анализируемых в каждом тесте. ∗p ≤ 0,05, ∗∗p ≤ 0,005, тест T для учеников. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 6: Стресс-тесты на мито и гликолиз на одной пластине с использованием CD8⁺ Т-клеток, очищенных из мышиных спленоцитов. (A) Репрезентативные профили митохондриального стресс-теста, сравнивающие лекарственно-зависимые изменения скорости потребления кислорода (OCR) CD8+ Т-клеток, выполненные с наивными, активированными и активированными + mGluR1 ингибиторами Т-клеток. (B) Репрезентативные профили теста гликолиза, сравнивающие лекарственно-зависимые изменения в скорости внеклеточной кислотности (ECAR) CD8+ T-клеток, выполненные на наивных, активированных и активированных ингибиторах + mGluR1. (C) Столбчатые графики, показывающие количественные изменения различных параметров митохондриального дыхания CD8+ Т-клеток в наивных, активированных и активированных ингибиторах +GluR1. Бары обозначают среднее ± SEM (n = 4). (D) Гистограммы, показывающие количественные изменения различных параметров гликолиза в наивных, активированных и активированных + mGluR1 ингибиторах CD8+ Т. Бары представляют среднее ± SEM (n = 4). ∗p ≤ 0,05, ∗∗p ≤ 0,005, тест T-Student Test. Эта цифра адаптирована из Aquino et al.10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Финальная скважина (μM)Объём стокового раствора (мкл)Media Volume (uL)10x порт (μM)Добавленный объём в порт (мкл)
Олигомицин Порт А0.51502850520
1.545025501520
2.563018902520
Порт B FCCP0.12537.52962.51.2522
0.257529252.522
0.51502850522
130027001022
260024002022
Порт C Ротенон/Антимицин0.53002700524

Таблица 1: Составная подготовка для зарядки сенсорных патронов XFe96 для Mito Stress.

Финальный колодецОбъём стокового раствора (мкл)Объём медиа (мкл)10x портДобавленный объём в порт (мкл)
Порт А Глюкоза250 мМ100240020
Порт B олигомицин0,5 мкм15028505 uM22
1,5 мкм450255015 uM22
2,5 мкм630189025 мкМ22
Порт C 2-DG50 мМ30000500 мМ24

Таблица 2: Подготовка соединения для загрузки сенсорных картриджей XFe96 для гликолиза.

Обсуждение

Представленный здесь протокол позволяет точно и надёжно сравнивать два основных путей выработки энергии: окислительное фосфорилирование (производство митохондриального АТФ) и анаэробного гликолиза (производство АТФ вне митохондрий, не требующее кислорода), а также два разных стресс-теста за один запуск. Кроме того, экспериментальная конструкция учитывает тип анализируемых клеток, что позволяет более широкое понимание анализа клеточного метаболизма, минимизируя количество используемых образцов и реагентов.

Различия между стресс-тестами Mito и гликолиза, проводимыми на протоколах инструментов метаболического анализа в реальном времени, разработанных и продаваемых компанией Agilent, Inc., значительны. Эти два анализа требуют различных тестовых материалов, конкретных препаратов и различных программ инструментов. Стресс-тест Мито использует анализные среды, содержащие глюкозу, L-глутамин и пируват, тогда как тест на гликолиз использует безглюкозные среды, дополненные только L-глутамином. Анализы анализируются с использованием различных соединений: олигомицина → FCCP → антимицина A + ротенона для стресс-теста Мито, а также олигомицина → глюкозы → 2-DG для стресс-теста на гликолиз. В результате эти тесты обычно проводятся на отдельных пластинах в разное время, поскольку метаболический анализатор в реальном времени поддерживает только одну пластину одновременно.

Для устранения этих ограничений был разработан комбинированный протокол, позволяющий проводить оба теста на одной пластине с использованием установки Mito Stress Test из предыдущей статьи10. Приведены рекомендации по анализу различных типов клеток, включая иммунные клетки, раковые клетки, адгерентные клетки и суспензионные клетки. Эти рекомендации могут применяться как по отдельности, так и в комбинации, обеспечивая гибкость в зависимости от целей экспериментатора и доступных ресурсов.

Нормализация клеток с помощью SRB Assay или DAPI также обеспечивает большую гибкость при использовании нескольких типов клеток с разной скоростью роста/размером 9,11. Кроме того, поскольку для этой техники требуется только одна пластина для двух анализов, её можно комбинировать с различными типами образцов для измерения метаболических процессов.

Факторы, влияющие на успех метода: (1) оптимальное количество ячеек на скважину; (2) эффективное подключение элементов; и (3) тщательно заряжание патронов, поскольку два отдельных набора препаратов должны быть заряжены в отдельные секции патрона.

Научные и экспериментальные преимущества метода включают прямое сравнение в одном биологическом контексте. Использование одних и тех же клеток при одинаковых условиях культуры устраняет вариабельность между пластинами и проходами и позволяет более точно сравнивать митохондриальную и гликолитическую функции в одном образце. Он также включает интегрированный взгляд на клеточный метаболизм. Параллельное измерение как окислительного фосфорилирования (OXPHOS), так и гликолиза даёт комплексное представление о общем энергетическом метаболизме клетки и её гибкости в переключении между путями. Этот параллельный анализ также снижает биологическую вариабельность. Различия в плотности клеточной пластины, количестве проходов или условиях окружающей среды минимизированы, поскольку оба анализа проводятся на одной и той же популяции клеток, что повышает воспроизводимость. Проведение обоих тестов одновременно снижает вариативность от запуска до запуска, вызванную калибровкой картриджа датчика, изменениями температуры или подготовкой реагентов.

Технические преимущества этой техники включают повышение эффективности за счёт комбинирования анализов, что экономит время, реагенты и расходники для пластин, что делает её важной для крупномасштабных или высокопроизводительных исследований. Это позволяет снизить требования к выборке. Требуется только одна пластинка клеток, что выгодно при работе с ограниченным или редким первичными клетками (например, лимфоцитами, клетками, полученными из мозга). Лучшая нормализация между анализами достигается благодаря тому, что оба теста используют одну и ту же пластину, нормализацию (например, по содержанию белка или числу клеток), и они более последовательны и надёжны. Благодаря этой согласованности корреляция данных улучшается. Прямое сочетание митохондрийных и гликолитических параметров из одной и той же выборки способствует метаболическому профилированию и проведению статистического анализа.

Единственное известное ограничение этой техники заключается в том, что объединение двух протоколов на одной пластине уменьшает количество доступных реплицированных скважин. Рекомендуется ограничить количество условий на одну пластину, чтобы обеспечить не менее 8 повторений скважины на каждое состояние.

Раскрытие информации

Ни одного.

Благодарности

Это исследование было профинансировано Национальным институтом по вопросам здоровья меньшинств и неравенства в здравоохранении (NIMHD), грант номер 5U54MD007586-37, пилотный проект А. Ивановой; Грант NHGRI Diversity Center for Genome Research UG3HG013248, исследовательский проект 2, PI-Ivanova, а также часть поддержки была предоставлена компанией Genprex Inc.  Кроме того, эти исследования проводились в Core Facilities Медицинского колледжа Мехарри, которые получают поддержку от грантов NIH MD007586, CA163069 и S10RR025497.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Центрифугные трубки объемом 15 мл, упакованные с винтовой крышкой, стерильные, 500 трубок/блокGenesee Scientific21-408B
Пипетные наконечники Biologix-200 μ L Extended (Pack, Sterile)Biologix USASKU 21-0200
BioTek Synergy H1BIOSPX
Флуоресцентный микроскоп BZ-X700Кейенс
Corning  Резервуары для одноразовых реагентов Costar SterileФишер4873
D-(+)-раствор глюкозы 45% в H20SigmaG9769
DAPI, гидрохлориды и bbsp;Thermofisher ScientificD1306
Центрифуга Эппендорфа 5810 RЭппендорф
GenClone Фетальная сыворотка бычьей сыворотки инактивированаGenesee Scientific25-514H
L-глутамин 200 мМ (100x)Gibco25030-081
Olympus Plastics 22-284, микротрубки Olympus 1,7 мл, прозрачные, стерильный полипропилен, непроницаемый, Ster, 50/пакет, 250 трубок/единицаGenesee Scientific22-284
Olympus Plastics 28-108, конические центрифугные трубки объемом 50 мл, полипропиленовый объём, стерильные, 20 мешков по 25 трубок, 500 в единицуGenesee Scientific28-108
Параформальдегид с 16% раствором ЭМ классаНаука об электронной микроскопии15710
Поли-D-лизин гидробромид лиофилизированSigmaP6407
Водяная баня Precision 180Precision Scientific51221060
Инкубатор Precision Scientific GCA Model 26Thelco51221091
QBI 120-095-671 Смесь пенициллина/стрептомицина, смесь 100x Pen/Strep, 10 x 10 мл/единицаGenesee Scientific25-827
QBI PBS, 1 раз, без Ca, Mg, Фенол Красный, 0,1 мкм стерильно фильтрованногоGenesee Scientific25-507B
RPMI 1640, с L-глутаминомGenesee Scientific25-506
Seahorse XF RPMI средний, pH 7,4, 500 млAgilent103576-100
Анализатор Seahorse XFe96Agilent
Seahorse XFe96/XF Pro FluxPakAgilent103792-100включает 18 сенсорных картриджей XFe96/XF Pro, 18 микропластин XFe96/XF Pro Cell Culture, 1 бутылку Seahorse XF Calibrant Solution 500mL и 3 пары XF Loading Guides
Бикарбонат натрияSigmaS6014
Пируват натрия (100 мМ) 100XGibco11360-070
SRB assay (Sulfurhodamine B Assay Kit)Abcamab235935
VWR Signature Эргономичная Высокопроизводительная Многоканальная ПипеттораAvantor89079-956
Набор для стресс-теста XF Cell MitoAgilent103015-100
Набор для анализа гликолитической скорости XFAgilent103344-100

Ссылки

  1. Caines, J. K., Barnes, D. A., Berry, M. D. The use of Seahorse XF assays to interrogate real-time energy metabolism in cancer cell lines. Methods Mol Biol. 2508, 225-234 (2022).
  2. Marinangeli, C., Kluza, J., Marchetti, P., Buee, L., Vingtdeux, V. Study of ampk-regulated metabolic fluxes in neurons using the Seahorse XF Analyzer. Methods Mol Biol. 1732, 289-305 (2018).
  3. Tan, W. J. T., Santos-Sacchi, J., Tonello, J., Shanker, A., Ivanova, A. V. Pharmacological modulation of energy and metabolic pathways protects hearing in the fus1/tusc2 knockout model of mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Antioxidants (Basel). 12 (6), 1225(2023).
  4. Sure, V. N., et al. A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice. Geroscience. 40, 365-375 (2018).
  5. Hammoud, S., et al. Tubular CPT1a deletion minimally affects aging and chronic kidney injury. JCI Insight. 9 (6), e171961(2024).
  6. Wei, C., Heitmeier, M., Hruz, P. W., Shanmugam, M. Evaluating the efficacy of glut inhibitors using a Seahorse extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1713, 69-75 (2018).
  7. Zhu, Y., et al. The role of PKM2-mediated metabolic reprogramming in the osteogenic differentiation of BMSCs under diabetic periodontitis conditions. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 186(2025).
  8. Liu, J., Zhang, X., Fan, X. Liensinine reshapes the immune microenvironment and enhances immunotherapy by reprogramming metabolism through the AMPK-HIF-1α axis in hepatocellular carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 44 (1), 208(2025).
  9. Van Der Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113 (3), 3.16B.1-3.16B.14 (2016).
  10. Teresa P de Aquino, M., et al. Glutamate receptor–TCR signaling potentiates full CD8+ T cell activation and effector function in tumor immunity. iScience. 28 (10), 112772(2025).
  11. Hammoud, S., Kern, J., Mukherjee, S. Assays to enhance metabolic phenotyping in the kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 328 (4), 563-577 (2025).

Перепечатки и разрешения

Теги

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.