Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Первичная изоляция, бактериологическое исследование и фенотипическая верификация суставных хондроцитов коленного сустава крысы

861 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69509

⸱

7 ноября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Longfu Hospital, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает выделение и культивирование первичных суставных хондроцитов коленного сустава крысы с использованием последовательного ферментативного пищеварения. Этот метод позволяет получить хондроциты с подтвержденными фенотипическими характеристиками, что обеспечивает исследователям надежный подход к исследованию хрящей.

Аннотация

Повреждение хряща в результате травмы, старения или воспалительных состояний остается серьезной клинической проблемой из-за изначально ограниченной регенеративной способности ткани. Хондроциты, являясь единственным клеточным компонентом хряща, отвечают за поддержание структуры и функции внеклеточного матрикса, что делает их необходимыми для понимания физиологии, патологии и регенерации хряща. В настоящем исследовании представлен всеобъемлющий и стандартизированный протокол выделения, культивирования и фенотипической верификации первичных суставных хондроцитов крыс из коленного сустава. В процедуре используются молодые подсосные крысы для обеспечения максимальной жизнеспособности клеток и используется последовательное ферментативное расщепление с трипсином и коллагеназой типа II для эффективной экстракции клеток. Фенотип хондроцитов верифицируется с помощью иммунофлюоресценции коллагена II типа, проточного цитометрического анализа и анализов стимуляции интерлейкина (IL)-1β для подтверждения клеточной идентичности и воспалительной реакции. Этот оптимизированный и воспроизводимый рабочий процесс позволяет создавать культуры хондроцитов высокой чистоты, пригодные для скрининга лекарственных препаратов, механистических исследований и применения тканевой инженерии, продвигая вперед исследования в области биологии хряща.

Введение

Хрящ — это специализированный тип соединительной ткани, который выполняет множество важнейших функций, включая обеспечение поддержки, амортизацию и поглощение ударов1. Он играет жизненно важную роль в поддержании структурной стабильности и обеспечении подвижности в скелетной системе 2,3. Механическая травма, дегенеративные изменения, воспаление или метаболические аномалии могут привести к повреждению хряща 4,5,6. Из-за присущего ему недостатка кровеносных сосудов и нервов в сочетании с ограниченной пролиферативной способностью хондроцитов восстановление хряща представляет собой серьезную проблему. Такие заболевания, как остеоартрит (вызванный дегенеративными изменениями и механической травмой) и ревматоидный артрит (вызванный аутоиммунными воспалительными реакциями), могут привести к необратимому повреждению хряща, значительно снижая качество жизни пациентов 7,8,9. Будучи исключительным типом клеток в хрящевой ткани, хондроциты отвечают за ключевые функции, такие как секреция и поддержание внеклеточного матрикса, поддержка развития скелета, участие в амортизации и восстановлении суставов, а также центральная регуляция роста хряща и метаболизма 10,11,12.

Хондроциты ограничены аваскулярными лакунами матрикса, что приводит к сильно ограниченной способности к их собственной пролиферации и восстановлению тканей13,14. Функциональное состояние хондроцитов непосредственно определяет здоровье хрящевой ткани15. Дисфункция хондроцитов, вызванная старением, воспалением, травмой или генетическими факторами, приводит к снижению синтеза матрикса и усилению деградации16,17. Этот патологический процесс приводит к дегенерации хряща (например, при остеоартрите), что приводит к нарушению его основных функций поддержки, амортизации и смазки. Ограниченная регенеративная способность хряща является основной причиной значительных трудностей в его восстановлении и представляет собой ключевую область исследований в современной ортопедии и регенеративной медицине. Современные исследования хряща стали основным направлением в этой области, с лекарственными вмешательствами, тканевой инженерией и генной терапией, требующими выделения хондроцитов для исследований in vitro 18,19,20,21,22,23,24,25. Следовательно, выделение и идентификация хондроцитов представляет собой критический шаг во многих экспериментальных подходах. В то время как иммортализированные хондроцитоподобные клеточные линии, такие как SW1353, используются в качестве удобных суррогатов в некоторых исследованиях, им не хватает экспрессии критических фенотипических маркеров, в первую очередь коллагена II типа, который необходим для аутентичной функции хондроцитови формирования матрикса. Таким образом, первичные хондроциты остаются золотым стандартом для исследований, требующих физиологической значимости. По сравнению с ранее опубликованными протоколами, требующими нескольких комбинаций ферментов или обширных механических манипуляций, упрощенный подход к ферментативному расщеплению снижает сложность и время обработки по сравнению с методами, требующими нескольких комбинаций ферментов или обширных механических манипуляций. Кроме того, включение комплексных этапов валидации обеспечивает последовательную идентификацию функциональных хондроцитов и повышает воспроизводимость в экспериментах и лабораториях.

Хондроциты характеризуются секрецией коллагена II типа, в то время как при стимуляции воспалительными факторами они активно синтезируют и высвобождают матриксные металлопротеиназы (ММП)27. Таким образом, после выделения хондроцитов клетки были идентифицированы с помощью иммунофлюоресценции коллагена II типа, а чистота хондроцитов была оценена с помощью проточной цитометрии. И стимулировали интерлейкином (IL)-1β для подтверждения характерного для них синтеза и секреции матриксных металлопротеиназ. В этом исследовании описывается процесс выделения хондроцитов и их характеристик у неонатальных мышей, что закладывает основу для последующих экспериментов, связанных с хондроцитами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Использование животных в данном исследовании было одобрено экспериментальным комитетом по уходу за животными и этике благополучия Китайско-японской больницы дружбы (No zryhyy21-21-05-16). Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Подопытные животные и подготовительные работы

ПРИМЕЧАНИЕ: Хрящи из суставов крыс, кроликов и людей после тотального эндопротезирования коленного сустава могут быть использованы для выделения хондроцитов. Однако, из-за их более высокой жизнеспособности, в этом исследовании для экстракции хондроцитов использовались молочные крысы.

  1. Транспортировка молочных крыс из экспериментального животноводческого хозяйства в лабораторию с помощью специализированных контейнеров для переноса.
  2. Усыпляйте молочных крыс путем удушенияCO2 (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами) и промывайте поверхности их тела стерильным раствором.
  3. Погрузите усыпленных молочных крыс в 75% этанол на 10 минут для дезинфекции поверхностных загрязнений.
  4. Перенесите продезинфицированных молочных крыс в шкаф биобезопасности и поместите их в стерильные чашки Петри.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательная очистка поверхности и погружение в этанол молочных крыс являются критически важными мерами для предотвращения бактериального или грибкового загрязнения, которое может негативно повлиять на последующие эксперименты.

2. Выделение суставной хрящевой ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Неонатальный хрящ выглядит как полупрозрачный, голубовато-белый слой, покрывающий костный эпифиз. На этом этапе необходимо соблюдать строгие методы асептики, чтобы избежать загрязнения, которое может поставить под угрозу последующие эксперименты.

  1. Изолируйте коленный сустав крысы с помощью скальпеля и офтальмологических ножниц, затем удалите вышележащую ткань кожи.
  2. Перенесите рассеченный коленный сустав в новую стерильную чашку Петри и замените скальпелем и офтальмологические ножницы.
  3. Соберите суставной хрящ из коленного сустава с помощью скальпеля, затем тщательно обрежьте окружающую соединительную ткань офтальмологическими ножницами.

3. Переваривание хрящевой ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте трипсин для переваривания соединительных тканей, окружающих хрящ, а затем добавьте 0,2% коллагеназу II для переваривания хрящевого матрикса.

  1. Заготовленный хрящ добавить в 3 объема 0,25% трипсина и инкубировать в термостате при температуре 37 °C с перемешиванием в течение 30 минут.
  2. Прекратите пищеварение, добавив PBS, содержащий 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Удалите прилипшие ткани из хряща с помощью офтальмологических ножниц. Центрифугируйте (4 °C, 500 × г, 5 мин) и выбросьте надосадочную жидкость.
  3. Ресуспендируйте хрящевую ткань в PBS, центрифуге (4 °C, 500 × г, 5 мин) и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг стирки 3 раза.
  4. Добавьте 0,2% коллагеназы II в обработанную хрящевую ткань и разварите в термостате при температуре 37 °C с перемешиванием в течение 4 ч.

4. Выделение и бактериологическое исследование хондроцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны выполняться в стерильных условиях в шкафу биобезопасности. Стерильные перчатки следует надевать во время механической диссоциации хрящевой ткани с помощью поршня шприца на сетчатый фильтр для предотвращения экспериментального загрязнения. В стандартных условиях культивирования первичным хондроцитам обычно требуется примерно 2-3 дня, чтобы достичь 80%-90% слияния для первого пассажа.

  1. Поместите клеточное ситечко размером 200 мкм над стерильной чашкой для культивирования и отфильтруйте переваренную хрящевую суспензию через сетку.
  2. Измельчите остатки хрящевой ткани на ситечке с помощью стерильного поршня шприца, затем промойте ситечко полной средой DMEM.
  3. Соберите все фильтраты, центрифугируйте (4 °C, 500 × г, 5 мин) и выбросьте надосадочную жидкость.
  4. Повторно суспендируйте гранулу в PBS, центрифуге (4 °C, 500 × г, 5 мин) и выбросьте надосадочную жидкость.
  5. Ресуспендируйте клетки в полной среде DMEM и перенесите в колбу для культуры T25.
  6. Инкубируйте колбу во влажном инкубаторе (37 °C, 5%CO2).
  7. Пассаж клеток в этом месте слияния с использованием трипсина-ЭДТА и субкультуры в соотношении 1:2.

5. Иммунофлуоресцентное окрашивание коллагеном II типа для идентификации хондроцитов

Примечание: Адгезивные хондроциты характеризуются веретенообразной и полигональной морфологией. Все анализы биомаркеров, представленные в этом исследовании, были проведены с использованием клеток в Passage 2. Хондроциты в пассаже 3 начинают проявлять более выраженную дедифференцировку, характеризующуюся сдвигом в сторону веретенообразной, фибробластоподобной морфологии и замедлением скорости пролиферации. Это фенотипическое изменение становится более очевидным после отрывка 4. К 6 пассажу подавляющее большинство клеток принимают удлиненную, похожую на фибробласты форму. Разведения антител определяли на основании рекомендации производителя и валидировали в ходе наших предварительных экспериментов для обеспечения оптимальной специфичности и интенсивности сигнала.

  1. Посев хондроцитов в 24-луночный планшет и культивирование в течение 24 ч для обеспечения клеточной адгезии.
  2. Выбросьте питательную среду и промойте клетки 3 раза PBS (добавьте PBS в каждую лунку, выдержите 5 минут, затем аспирируйте).
  3. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом на 10 минут, затем 3 раза промыть PBS.
  4. Пермеабилизируйте клетки 0,3% Triton X-100 (приготовленным в PBS) в течение 10 минут.
  5. Промыть клетки 3 раза PBS, затем заблокировать блокирующим раствором без животных (150 мкл/лунка, разбавленный 5× в PBS) при комнатной температуре в течение 1 ч.
  6. Удалите блокирующий раствор и инкубируйте с первичным антителом (анти-Col II, разведение 1:200) в течение ночи при 4 °C.
  7. Извлеките первичное антитело и промойте клетки 3 раза PBS.
  8. Добавьте Alexa Fluor 488-конъюгированное вторичное антитело IgG к кроликам (разведение 1:50) и инкубируйте при 37 °C в течение 1,5 ч в темноте.
  9. Удалите вторичное антитело и промойте клетки 3 раза PBS.
  10. Закрепить с помощью DAPI-содержащего антифейдерного медиума и высушить в темноте в течение 10 минут.
  11. Наблюдайте и захватывайте изображения с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.

6. Проточный цитометрический анализ чистоты хондроцитов

Хондроциты характеризуются своей способностью синтезировать и выделять коллаген II типа, который служит определяющим маркером для идентификации. Клеточная линия хондросаркомы SW1353, хотя и проявляет некоторые хондроцитарные характеристики, не обладает способностью к секреции коллагена II типа и, таким образом, служит отрицательным контролем в этом эксперименте.

  1. Расщепляйте хондроциты и клетки SW1353 с использованием трипсина, свободного от ЭДТА.
  2. Нейтрализуйте пищеварение с помощью полной среды DMEM и ресуспендируйте клетки в PBS.
  3. Инкубируйте клетки с раствором фиксации/пермеабилизации в течение 15 минут, затем добавьте 1 мл промывочного буфера.
  4. Центрифуга (500 × г, 5 мин), выбросьте надосадочную жидкость и инкубируйте со 100 мкл антител к коллагену II типа (разведение 1:100) в течение 15 мин в защищенном от света месте, с последующим добавлением 1 мл промывочного буфера.
  5. Центрифугируйте (500 × г, 5 мин), выбросьте надосадочную жидкость и инкубируйте с конъюгированным с Alexa Fluor 488-конъюгированным вторичным антителом IgG против кролика в течение 30 мин в защищенном от света месте, затем добавьте 1 мл промывочного буфера.
  6. Центрифуга (500 × г, 5 мин), отбраковка надосадочной жидкости, ресуспендирование каждого образца в промывочный буфер объемом 200 мкл и анализ с помощью проточной цитометрии.

7. IL-1β стимуляция хондроцитов

Примечание: Продукция матриксных металлопротеиназ (ММП) в ответ на стимуляцию IL-1β является отличительной чертой хондроцитов. Таким образом, в данном исследовании используется стимуляция IL-1β для подтверждения этой фенотипической характеристики в изолированных хондроцитах.

  1. Расщепляют хондроциты из культуральных колб и ресуспендируют в полной среде DMEM.
  2. Подсчитайте количество клеток и отрегулируйте концентрацию до 5 ×10 5 клеток/мл с помощью полного DMEM.
  3. Затравочные клетки помещают в 6-луночный планшет (всего 24 лунки), из которых 12 лунок обозначаются как контрольная группа заготовки, а 12 лунок — как группа стимуляции IL-1β.
  4. Инкубировать планшет в инкубаторе для клеточных культур в течение 12 ч.
  5. Добавьте 10 нг/мл IL-1β в группу стимуляции после полной адгезии клеток.
  6. Соберите надосадочную жидкость клеточных культур через 24 ч для анализа иммуноферментного анализа (ИФА).
  7. Дважды промойте клетки PBS.
  8. Lyse 6 контрольных скважин и 6 IL-1β-стимулированных скважин с буфером RIPA для последующего вестерн-блоттинга.
  9. Экстрагируйте РНК из 6 контрольных лунок и 6 IL-1β-стимулированных лунок с помощью TRIzol для количественного ПЦР-анализа.

8. Количественный анализ ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты, связанные с РНК, проводились с использованием расходных материалов, обработанных DEPC. Вкратце, пробирки и наконечники замачивали в 0,1% DEPC в течение 12 часов, автоклавировали (121 °C, 20 минут) для инактивации как РНКазы, так и остаточных DEPC, и сушили в духовке перед использованием.

  1. Добавьте 1 мл тризола в клеточную гранулу и гомогенизируйте с помощью гомогенизатора. Выдерживать при комнатной температуре в течение 5 минут.
  2. Добавьте 0,2 мл хлороформа и энергично ворксируйте в течение 30 с. Выдерживать при комнатной температуре в течение 3 минут.
  3. Центрифуга при 4 °C, 12 000 × г в течение 15 мин. Перенесите бесцветную водную фазу в новую микроцентрифужную пробирку и добавьте равное количество изопропанола.
  4. Хорошо перемешать и выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут. Центрифуга при 4 °C, 12 000 × г в течение 10 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и сохраните гранулу РНК.
  5. Добавьте 1 мл предварительно охлажденного 75% этанола в гранулу РНК. Тщательно перемешайте и центрифугируйте при 4 °C, 12 000 × г в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и сохраните гранулу РНК.
  6. Высушите гранулу РНК на воздухе в шкафу биобезопасности. Растворите РНК в 20 мкл воды, не содержащей РНКазы.
  7. Измерьте концентрацию и качество РНК с помощью спектрофотометра Nanodrop.
  8. Выполните обратную транскрибацию всей РНК в кДНК с помощью набора для обратной транскрипции.
  9. Приготовьте реакционную смесь, содержащую 1 г общей РНК, 4 мкл раствора хлорида магния, 2 мкл смеси dNTP, 0,5 мкл ингибитора РНКазы, 0,6 мкл обратной транскриптазы AMV, 1 мкл случайных праймеров и воду, не содержащую РНКазы, для доведения конечного объема до 20 мкл.
  10. Инкубируйте реакцию при 42 °C в течение 15 минут, а затем при 95 °C в течение 5 минут. Охладите до 4 °C в течение 5 минут, затем разбавьте кДНК водой, не содержащей РНКазы.
  11. Приготовьте реакционную смесь для ПЦР, содержащую 2 мкл кДНК, 10 мкл SYBR Green Real-time PCR Master Mix, прямые и обратные праймеры (табл. 1) в конечной концентрации 0,2 мкмоль/л каждый и воду, не содержащую РНКазы, до конечного объема 20 мкл.
  12. Установите следующие условия ПЦР: предварительная денатурация при 95 °C в течение 1 мин, затем 40 циклов при 95 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 15 с и 72 °C в течение 45 с. Сбор данных флуоресценции на этапе расширения до 72 °C.
  13. После реакции запишите значения CT для каждого образца и внутренний эталон. Рассчитайте относительные уровни экспрессии генов-мишеней с помощью метода 2-ΔΔCT.

9. ИФА анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед применением приготовьте рабочий раствор биотинилированного антитела и рабочий раствор фермента конъюгата.

  1. Достаньте набор ИФА из холодильника за 30 минут до начала и дайте ему сбалансироваться до комнатной температуры.
  2. Приготовьте все необходимые растворы в соответствии с инструкцией набора.
  3. Добавьте 100 мкл образцов или стандартных растворов (с различными концентрациями) в предназначенные лунки (нулевые лунки содержат только буфер для разбавления стандарта/образца). Запечатать пластину клейкой пленкой и выдерживать при температуре 37 °C в течение 90 мин (исключая пустые контрольные лунки).
  4. Слейте жидкость и промойте каждую лунку промывочным буфером объемом 350 μл. Выдержите в течение 30 с, слейте жидкость и промокните насухо на плотной впитывающей бумаге. Повторите стирку 4 раза.
  5. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора биотинилированного антитела. Закройте планшет и инкубируйте при 37 °C в течение 60 мин (исключая пустые контрольные лунки).
  6. Слейте жидкость и промойте каждую лунку 4 раза, как описано в шаге 4.
  7. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора ферментного конъюгата. Закройте планшет и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 30 минут (исключая пустые контрольные лунки).
  8. Слейте жидкость и промойте каждую лунку 4 раза, как описано в шаге 4.
  9. Добавьте по 100 мкл раствора субстрата в каждую лунку. Беречь от света и выдерживать при температуре 37 °C в течение 15 минут.
  10. Добавьте 100 μL раствора остановки в каждую лунку, тщательно перемешайте и немедленно измерьте оптическую плотность (OD) на длине волны 450 нм.
  11. Сгенерируйте стандартную кривую с помощью программного обеспечения CurveExpert и рассчитайте концентрацию образца.

10. Вестерн-блоттинг

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед экспериментом приготовьте буфер для электрофореза, буфер для переноса, TBST, 5% обезжиренного молока и заранее разрежьте мембрану из ПВДФ до соответствующего размера. Затем захватите хемилюминесцентные сигналы с помощью системы хемилюминесцентной визуализации. Установите прибор в автоматический или ручной режим градиентной экспозиции, который обычно находится в диапазоне от 10 с до 5 минут, чтобы обеспечить захват сигналов в линейном динамическом диапазоне и избежать насыщения пикселей. После захвата сигнала выберите изображение экспозиции, на котором целевые полосы четкие, а фон низкий, для последующего количественного анализа.

  1. Готовят буфер для лизиса RIPA (содержащий 1% PMSF и 1% ингибитор фосфатазы) и добавляют буфер для лизиса RIPA в соотношении 250 мкл на лунку 6-луночного планшета.
  2. Лизировать клетки с помощью ультразвукового разрушителя (3 цикла по 7-10 с) и инкубировать на льду в течение 30 мин.
  3. Центрифугируйте лизат при 4 °C, 12 000 × г в течение 10 минут, затем соберите надосадочную жидкость для количественного определения белка.
  4. Определите концентрацию белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (БЦА).
  5. Отрегулируйте концентрацию белка до того же уровня с помощью буфера для лизиса RIPA.
  6. Добавьте 5× Loading Buffer к сэмплам в соотношении 4:1 (sample:buffer).
  7. Прокипятите образцы в течение 10 минут, затем центрифугируйте при 4 °C, 12 000 × г в течение 10 минут и соберите надосадочную жидкость для электрофореза.
  8. Соберите гель SDS-PAGE в камере электрофореза и заполните буфером для электрофореза до тех пор, пока гребень не будет погружен в воду.
  9. Снимите гребень, загрузите образцы в лунки и добавьте белковую лестницу к контрольным дорожкам.
  10. Запустите электрофорез до тех пор, пока бромфенольный синий краситель не достигнет дна геля, затем разберите аппарат и извлеките гель.
  11. Соберите «бутерброд» для переноса и выполните влажный перенос при постоянном напряжении.
  12. Закройте мембрану PVDF 5% обезжиренным молоком в TBST на 1 ч при комнатной температуре.
  13. Инкубировать с разведенным первичным антителом в течение ночи при 4 °C.
  14. Восстановите первичное антитело и промойте мембрану TBST (5 × 5 минут).
  15. Инкубировать с HRP-конъюгированными вторичными антителами в течение 90 минут при комнатной температуре.
  16. Восстановите вторичное антитело и промойте мембрану TBST (5 × 5 минут).
  17. Приготовьте раствор субстрата ECL и храните его в защищенном от света месте.
  18. Нанесите подложку ECL на мембрану и захватите хемилюминесцентные сигналы с помощью системы визуализации с градиентным экспонированием.
  19. Анализируйте интенсивность полос с помощью программного обеспечения ImageJ и рассчитывайте относительные уровни экспрессии белка для дальнейшего анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Иммунофлуоресцентное окрашивание коллагена II типа показало, что выделенные хондроциты были сильно положительными (рис. 1А). Проточный цитометрический анализ также показал, что более 98% клеток были положительными на коллаген II типа (Рисунок 1B), в то время как отрицательные контрольные клетки SW1353 были отрицательными (Рисунок 1C). После стимуляции 10 нг/мл IL-1β в течение 24 ч вестерн-блоттинг продемонстрировал заметное повышени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный здесь протокол предлагает несколько ключевых преимуществ для выделения и культивирования первичных суставных хондроцитов крыс. Использование молочных крыс имеет решающее значение для достижения оптимального выхода клеток и жизнеспособности, так как хрящи молодых животных содержат больше пролиферативных хондроцитов и меньше минерализованного матрикса по сравнению с хрящами взрослых животных. Такой возрастной отбор значительно повышает эффективность ферментативного переваривания ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не сообщают об отсутствии конфликта интересов в данной работе.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным финансированием клинических исследований больницы высокого уровня и Инициативой элитных медицинских специалистов Больницы китайско-японской дружбы (NO. ZRJY2025-QM05).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4% параформальдегидSolarbioP1110
5 и раз; Загрузочный буферSolarbioP1040
Alexa Fluor 488-конъюгированный антикроличий IgGЧжуншань Цзинцяо БиотехнологияZF-0511
Решение для блокировки без животныхТехнология клеточной сигнализации15019
Анти-коллаген II антителаAbcamAB34712
Набор для анализа белков на основе бицинхониновой кислоты (BCA)SolarbioPC0020
Коллагеназа IIYeasen Biotechnology40508ES60
Флуоресцентная монтажная среда с DAPIЧжуншань Цзинцяо БиотехнологияZLI-9556
Модифицированный Eagle Medium от DulbeccoSolarbio11995
Сыворотка плода крупного рогатого скота (FBS)SolarbioS9010
IgG с конъюгированной козой пероксидазой хрена (HRP)Чжуншань Цзинцяо БиотехнологияZB-2301
IL-1 и бета;peprotech400-01B
MMP13 Rabbit mAbABclonalA11148
MMP3 Rabbit mAbABclonalA11418
Обезжиренное сухое молокоSolarbioD3840
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)SolarbioP1020
Мембрана PVDFТермо Фишер Сайентифик88518
Набор ELISA для крысы MMP-13NouvsNBP3-06931
Набор ELISA для Rat MMP-3NouvsNBP3-06894
Набор обратной транскрипцииPromegaA3500
RIPA Lysis BufferSolarbioR0010
Вода без РНазыSolarbioR1600
SDS-PAGE GelЭпизимPG112
SYBR Green Мастер-микс ПЦР в реальном времениТойобоQPK-201
Triton X-100SolarbioT8200
ТРИзолSolarbio15596026
ТрипсинSolarbioT1320
Сверхчувствительный набор для подкладки для хемилюминесценции ECLNCM BiotechP10300
β-Actin Rabbit mAbABclonalAC026

Ссылки

  1. Min, Q., et al. Strong and elastic chitosan/silk fibroin hydrogels incorporated with growth-factor-loaded microspheres for cartilage tissue engineering. Biomimetics (Basel). 7 (2), 41(2022).
  2. Kloppenburg, M., Namane, M., Cicuttini, F. Osteoarthritis. Lancet. 405 (10472), 71-85 (2025).
  3. Barisón, M. J., et al. Functionalized hydrogels for cartilage repair: The value of secretome-instructive signaling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6010(2022).
  4. Han, Y., et al. High-precision, gelatin-based, hybrid, bilayer scaffolds using melt electro-writing to repair cartilage injury. Bioact Mater. 6 (7), 2173-2186 (2021).
  5. Molnar, V., et al. Cytokines and chemokines involved in osteoarthritis pathogenesis. Int J Mol Sci. 22 (17), 9208(2021).
  6. Zhang, H., et al. Mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development through downregulating FBXW7. Ann Rheum Dis. 81 (5), 676-686 (2022).
  7. Ouyang, Z., et al. Cartilage-related collagens in osteoarthritis and rheumatoid arthritis: From pathogenesis to therapeutics. Int J Mol Sci. 24 (12), 9841(2023).
  8. Mueller, A. L., et al. Recent advances in understanding the pathogenesis of rheumatoid arthritis: new treatment strategies. Cells. 10 (11), 3017(2021).
  9. Cao, F., et al. Trends and cross-country inequalities in the global burden of osteoarthritis, 1990-2019: A population-based study. Ageing Res Rev. 99, 102382(2024).
  10. Wu, X., Fan, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. The metabolic landscape in osteoarthritis. Aging Dis. 13 (4), 1166-1182 (2022).
  11. Deng, H., et al. Altered expression of the Hedgehog pathway proteins BMP2, BMP4, SHH, and IHH involved in knee cartilage damage of patients with osteoarthritis and Kashin-Beck disease. Cartilage. 13 (1), 19476035221087706(2022).
  12. Hui, L., et al. Effects of androgen receptor overexpression on chondrogenic ability of rabbit articular chondrocytes. Tissue Eng Regen Med. 18 (4), 641-650 (2021).
  13. Drevet, S., Favier, B., Lardy, B., Gavazzi, G., Brun, E. New imaging tools for mouse models of osteoarthritis. Geroscience. 44 (2), 639-650 (2022).
  14. Wu, S., Guo, W., Li, R., Zhang, X., Qu, W. Progress of platelet derivatives for cartilage tissue engineering. Front Bioeng Biotechnol. 10, 907356(2022).
  15. Zhang, Y., et al. DL-3-N-butylphthalide promotes cartilage extracellular matrix synthesis and inhibits osteoarthritis development by regulating FoxO3a. Oxid Med Cell Longev. 2022, 9468040(2022).
  16. Krych, A. J., Saris, D. B. F., Stuart, M. J., Hacken, B. Cartilage injury in the knee: assessment and treatment options. J Am Acad Orthop Surg. 28 (22), 914-922 (2020).
  17. Muthu, S., et al. Failure of cartilage regeneration: emerging hypotheses and related therapeutic strategies. Nat Rev Rheumatol. 19 (7), 403-416 (2023).
  18. Morici, L., Allémann, E., Rodríguez-Nogales, C., Jordan, O. Cartilage-targeted drug nanocarriers for osteoarthritis therapy. Int J Pharm. 666, 124843(2024).
  19. Urlić, I., Ivković, A. Cell sources for cartilage repair-biological and clinical perspective. Cells. 10 (9), 2496(2021).
  20. Chen, G. Y., et al. Integrating network pharmacology and experimental validation to explore the key mechanism of Gubitong recipein the treatment of osteoarthritis. Comput Math Methods Med. 2022, 7858925(2022).
  21. Bai, L., et al. Engineering bone/cartilage organoids: Strategy, progress, and application. Bone Res. 12 (1), 66(2024).
  22. Dönges, L., et al. Engineered human osteoarthritic cartilage organoids. Biomaterials. 308, 122549(2024).
  23. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae treat osteoarthritis by inhibiting arachidonic acid metabolites through AMPK/NFκB pathway. J Inflamm Res. 16, 4123-4140 (2023).
  24. Barisón, M. J., et al. Functionalized hydrogels for cartilage repair: the value of secretome-instructive signaling. Int J Mol Sci. 23 (11), 6010(2022).
  25. Yu, L., et al. Hyaline cartilage differentiation of fibroblasts in regeneration and regenerative medicine. Development. 149 (2), dev200249(2022).
  26. Gebauer, M., et al. Comparison of the chondrosarcoma cell line SW1353 with primary human adult articular chondrocytes with regard to their gene expression profile and reactivity to IL-1β. Osteoarthritis Cartilage. 13 (8), 697-708 (2005).
  27. Yan, W., et al. Chondrocyte-targeted delivery system of Sortase A-engineered extracellular vesicles silencing MMP13 for osteoarthritis therapy. Adv Healthc Mater. 13 (16), e2303510(2024).
  28. Goldring, M. B. Chondrogenesis, chondrocyte differentiation, and articular cartilage metabolism in health and osteoarthritis. Ther Adv Musculoskelet Dis. 4 (4), 269-285 (2012).
  29. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Des Devel Ther. 16, 1743-1766 (2022).
  30. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae treat osteoarthritis by inhibiting arachidonic acid metabolites through AMPK/NFκB pathway. J Inflamm Res. 16, 4123-4140 (2023).
  31. Dou, Y., Fang, Y., Zhao, C., Fu, W., Jiang, D. Editorial: Bioengineering and translational research for bone and joint diseases. Front Bioeng Biotechnol. 10, 969416(2022).
  32. Ye, K., et al. Bioengineering of articular cartilage: Past, present and future. Regen Med. 8 (3), 333-349 (2013).
  33. Chen, P., et al. Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration. Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

IIII
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.