Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
* These authors contributed equally
Этот протокол описывает выделение и культивирование первичных суставных хондроцитов коленного сустава крысы с использованием последовательного ферментативного пищеварения. Этот метод позволяет получить хондроциты с подтвержденными фенотипическими характеристиками, что обеспечивает исследователям надежный подход к исследованию хрящей.
Повреждение хряща в результате травмы, старения или воспалительных состояний остается серьезной клинической проблемой из-за изначально ограниченной регенеративной способности ткани. Хондроциты, являясь единственным клеточным компонентом хряща, отвечают за поддержание структуры и функции внеклеточного матрикса, что делает их необходимыми для понимания физиологии, патологии и регенерации хряща. В настоящем исследовании представлен всеобъемлющий и стандартизированный протокол выделения, культивирования и фенотипической верификации первичных суставных хондроцитов крыс из коленного сустава. В процедуре используются молодые подсосные крысы для обеспечения максимальной жизнеспособности клеток и используется последовательное ферментативное расщепление с трипсином и коллагеназой типа II для эффективной экстракции клеток. Фенотип хондроцитов верифицируется с помощью иммунофлюоресценции коллагена II типа, проточного цитометрического анализа и анализов стимуляции интерлейкина (IL)-1β для подтверждения клеточной идентичности и воспалительной реакции. Этот оптимизированный и воспроизводимый рабочий процесс позволяет создавать культуры хондроцитов высокой чистоты, пригодные для скрининга лекарственных препаратов, механистических исследований и применения тканевой инженерии, продвигая вперед исследования в области биологии хряща.
Хрящ — это специализированный тип соединительной ткани, который выполняет множество важнейших функций, включая обеспечение поддержки, амортизацию и поглощение ударов1. Он играет жизненно важную роль в поддержании структурной стабильности и обеспечении подвижности в скелетной системе 2,3. Механическая травма, дегенеративные изменения, воспаление или метаболические аномалии могут привести к повреждению хряща 4,5,6. Из-за присущего ему недостатка кровеносных сосуд....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Использование животных в данном исследовании было одобрено экспериментальным комитетом по уходу за животными и этике благополучия Китайско-японской больницы дружбы (No zryhyy21-21-05-16). Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.
1. Подопытные животные и подготовительные работы
ПРИМЕЧАНИЕ: Хрящи из суставов крыс, кроликов и людей после тотального эндопротезирования коленного сустава могут быть использованы для выделения хондроцитов. Однако, из-за их более высокой жизнеспособности, в этом исследовании для экстракции хондро....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Иммунофлуоресцентное окрашивание коллагена II типа показало, что выделенные хондроциты были сильно положительными (рис. 1А). Проточный цитометрический анализ также показал, что более 98% клеток были положительными на коллаген II типа (Рисунок 1B), в то время как отрицательные контрольные клетки SW1353 были отрицательными (Рисунок 1C). После стимуляции 10 нг/мл IL-1β в течение 24 ч вестерн-блоттинг продемонстрировал заметное повышени.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Описанный здесь протокол предлагает несколько ключевых преимуществ для выделения и культивирования первичных суставных хондроцитов крыс. Использование молочных крыс имеет решающее значение для достижения оптимального выхода клеток и жизнеспособности, так как хрящи молодых животных содержат больше пролиферативных хондроцитов и меньше минерализованного матрикса по сравнению с хрящами взрослых животных. Такой возрастной отбор значительно повышает эффективность ферментативного переваривания .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы не сообщают об отсутствии конфликта интересов в данной работе.
Это исследование было поддержано Национальным финансированием клинических исследований больницы высокого уровня и Инициативой элитных медицинских специалистов Больницы китайско-японской дружбы (NO. ZRJY2025-QM05).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4% параформальдегид | Solarbio | P1110 | |
| 5 и раз; Загрузочный буфер | Solarbio | P1040 | |
| Alexa Fluor 488-конъюгированный антикроличий IgG | Чжуншань Цзинцяо Биотехнология | ZF-0511 | |
| Решение для блокировки без животных | Технология клеточной сигнализации | 15019 | |
| Анти-коллаген II антитела | Abcam | AB34712 | |
| Набор для анализа белков на основе бицинхониновой кислоты (BCA) | Solarbio | PC0020 | |
| Коллагеназа II | Yeasen Biotechnology | 40508ES60 | |
| Флуоресцентная монтажная среда с DAPI | Чжуншань Цзинцяо Биотехнология | ZLI-9556 | |
| Модифицированный Eagle Medium от Dulbecco | Solarbio | 11995 | |
| Сыворотка плода крупного рогатого скота (FBS) | Solarbio | S9010 | |
| IgG с конъюгированной козой пероксидазой хрена (HRP) | Чжуншань Цзинцяо Биотехнология | ZB-2301 | |
| IL-1 и бета; | peprotech | 400-01B | |
| MMP13 Rabbit mAb | ABclonal | A11148 | |
| MMP3 Rabbit mAb | ABclonal | A11418 | |
| Обезжиренное сухое молоко | Solarbio | D3840 | |
| Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) | Solarbio | P1020 | |
| Мембрана PVDF | Термо Фишер Сайентифик | 88518 | |
| Набор ELISA для крысы MMP-13 | Nouvs | NBP3-06931 | |
| Набор ELISA для Rat MMP-3 | Nouvs | NBP3-06894 | |
| Набор обратной транскрипции | Promega | A3500 | |
| RIPA Lysis Buffer | Solarbio | R0010 | |
| Вода без РНазы | Solarbio | R1600 | |
| SDS-PAGE Gel | Эпизим | PG112 | |
| SYBR Green Мастер-микс ПЦР в реальном времени | Тойобо | QPK-201 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 | |
| ТРИзол | Solarbio | 15596026 | |
| Трипсин | Solarbio | T1320 | |
| Сверхчувствительный набор для подкладки для хемилюминесценции ECL | NCM Biotech | P10300 | |
| β-Actin Rabbit mAb | ABclonal | AC026 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.