Модульный рабочий процесс для количественного, структурного и функционального анализа биопленок Leptospira

Summary

Этот протокол обеспечивает модульный BSL-2 рабочий процесс, сочетающий анализы кристалл-фиолетовой биомассы, фазово-контрастную кинетику с таймлапсом, конфокальное 3D/матричное картирование, ультраструктуру SEM и модуль инфекции хомяков in vivo для культивации, количественной оценки, характеристики и изучения функциональной роли Leptospira biofilma, что позволяет стандартизировать оценку мутантов и антибиопленочные вмешательства в лабораториях.

Abstract

Здесь мы представляем интегрированный набор протоколов для культивации, количественного мониторинга, структурной и функциональной характеристики биопленок Leptospira spp. с течением времени. Этот рабочий процесс сочетает анализы кристаллического фиолетового микротитра для измерения биомассы биопленки в нескольких временных точках, с временно разрешенным методом фракционирования, который различает прикреплённые (биопленки) и неприкреплённые (жидкофазные) популяции бактерий, фазово-контрастную визуализацию с таймлапсом для неразрушающего кинетического наблюдения, конфокальную лазерно-сканирующую микроскопию для получения полных 3D-реконструкций с помощью матричных зондов и сканирующей электронную микроскопию с мембранной поддержкой для ультраструктурного анализа. Параллельно мы подробно описываем стандартизированную процедуру сбора целостных биопленочных агрегатов и их подготовки к интрабрюшинеальной инъекции в восприимчивую модель золотого сирийского хомяка, что позволяет напрямую оценивать вирулентность, ассоциированную с биопленкой , in vivo вместе с согласованными планктонными контролями.

Оптимизированный для патогенного штамма Leptospira interrogans Manilae L495, каждый модуль легко переносится в другие виды Leptospira и мутантные библиотеки для сравнения способности к формированию биопленок. Вместе эти координированные модули обеспечивают прочную основу для скрининга стратегий антибиопленок, изучения генетических детерминантов и прояснения вклада биопленок в персистентность и патогенез лептоспиры .

Introduction

Биопленки — это структурированные микробные сообщества, в которых клетки встроены в самосекретируемую внеклеточную полимерную матрицу (EPS), состоящую из полисахарид, белков, нуклеиновых кислот и^{липидов 1}. Эта матрица обеспечивает механическую стабильность, опосредует адгезию к поверхностям и повышает выживание микробов, обеспечивая устойчивость к стрессам окружающей среды, таким как высыхание, окислительный стресс и^{антимикробные вещества 2,3}. У патогенных бактерий биопленки способствуют персистенции, уклонению от иммунитета и хронической^{инфекции 4,5}.

По сравнению с планктонными клетками, которые свободно плавают и метаболически более однородны, клетки, связанные с биопленкой, демонстрируют изменённую экспрессию генов, темпы роста и метаболическую^{активность 6}. Эти различия обеспечивают повышенную толерантность к экологическим проблемам, антибиотикам и защитным механизмам хозяина, одновременно позволяя координировать поведение, такое как кворумное чувство, удержание питательных веществ и пространственная^{организация 7,8}.

Образование биопленки было широко изучено у модельных организмов, таких как Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Vibrio cholerae, которые вместе сформировали наше понимание генетических, структурных и физиологических основ образа жизни в биопленке. Исследования на Pseudomonas показали, что экзополисахариды и кворум-сенсинг работают вместе для формирования сложных трёхмерных биоплёночных архитектур ^9,10. Исследования стафилококка подчеркнули роль поверхностных белков и внеклеточной ДНК в улучшении когезии биопленки и толерантности к^{антибиотикам 11,12}. Исследования видов Vibrio дополнительно подчеркнули удивительное разнообразие морфологий биопленок и их экологическое значение в водных средах¹³. В совокупности эти системы обеспечили прочную концептуальную и методологическую основу для исследований биопленок, усиленную стандартизированными^{протоколами 14} и критическими оценками существующих^{методов 15,16}, которые вместе подчёркивают необходимость гармонизированных подходов при изучении образования биопленок у менее изученных бактерий, таких как Leptospira.

Представители рода спирохет Leptospira, вызывающие лептоспироз, долгое время считались преимущественно планктонными. Недавние исследования экспериментально показали устойчивое образование биопленок у нескольких^{видов 17}. В то время как некоторые исследования предполагают формирование биоплёнки в контекстах окружающей^{среды 18} и связанного^{с хозяином 19}, другие экспериментально продемонстрировали способность лептоспиров образовывать биопленку в почечных канальцах Rattus norvegicus²⁰ и стекловидном гуморе^{лошадей 21}, а также обнаружение лептоспиральных видов внутри экологических биопленок^22,23. Расшифровка условий и механизмов, управляющих биопленками Leptospira, поэтому крайне важна для понимания передачи окружающей среды, устойчивости резервуаров и патогенеза заболеваний^24,25.

Существующие биоплёночные анализы Leptospira фрагментированы и варьируются от качественных микроскопических^{наблюдений 17,26} до конечных колориметрических или кристаллических фиолетовых^{окрасок 27,28}. Хотя эти исследования дали ценные сведения о формировании биопленки, им часто не хватает ни кинетического разрешения, необходимого для мониторинга созревания и распространения биопленки в реальном времени, так и ультраструктурного контекста, предоставляемого конфокальной или электронной микроскопией. Непрерывный мониторинг и 3D-структурный анализ считаются необходимыми для отражения динамической природы формирования и распространения^{биопленки 14,15}. Эти ограничения затрудняют сопоставимость между исследованиями и ограничивают систематическую оценку факторов или вмешательств, влияющих на формирование и распространение биопленки, подчёркивая необходимость стандартизированного многопоказательного рабочего процесса, который охватывает как структурную, так и функциональнуюдинамику лептоспирных биопленок в воспроизводимой и комплексной форме.

Чтобы устранить эти пробелы, мы разработали интегрированный модульный рабочий процесс, объединяющий шесть дополнительных показаний, взятых из одной культурной серии. Во-первых, высокопроизводительный микротитровый анализ CV количественно оценивает прикреплённую биомассу в нескольких временных точках. Во-вторых, временно-разрешённый анализ фракционирования в пластинах с 96 лунками разделяет общие, жидкофазные (не прикреплённые или частично отделенные) популяции с помощью OD₄₀₀ для отслеживания их эволюции во время формирования и распространения. Термин «жидкая фаза» используется здесь для обозначения как планктонических, так и отделённых клеток, признавая динамический континуум между свободно живущими и поверхностно-ассоциированными^{фенотипами 29,30}. В-третьих, фазово-контрастная визуализация с таймлапсом обеспечивает неразрушительную кинетику адгезии, агрегированной подвижности и слияния. В-четвёртых, конфокальная лазерно-сканирующая микроскопия (CLSM) даёт полные 3D-реконструкции с показаниями живых/мёртвых и матричных зондов, что обеспечивает жизнеспособность и матричное картирование, зависящее от глубины. В-пятых, сканирующея электронная микроскопия (SEM), поддерживаемая мембраной или покрытием, разрешает внеклеточную архитектуру и базально-апикальную полярность с высоким разрешением. Кроме того, был включён модуль in vivo для оценки вирулентности с использованием внутрибрюшной инъекции биопленочных агрегатов в восприимчивую модель золотого сирийского хомяка — чувствительную и хорошо зарекомендовавшую себя модель лептоспироза 31,32,33. Этот подход связывает фенотипы биопленок с патогенным потенциалом, предоставляя функциональный контекст, дополняющий анализ in vitro.

По сравнению с одномодальными подходами, эта платформа обладает рядом преимуществ: (i) синхронизированные количественные (CV и фракционированный OD) и структурные (CLSM/SEM) показания; (ii) неразрушительный кинетический мониторинг ранней адгезии, роста, созревания и распространения; (iii) 3D-жизнеспособность и характеристика матрицы с использованием целевых зондов; (iv) ультраструктурная визуализация архитектуры внеклеточной матрицы; и (v) прямую функциональную оценку вирулентности, ассоциированной с биопленкой, по сравнению с планктонной вирулентностью в модели восприимчивого хомяка, каждая из которых может быть достижима с использованием стандартной инфраструктуры BSL-2. Используя многоколодочные форматы и съемные стеклянные или поликарбонатные подложки, рабочий процесс поддерживает воспроизведение экранов с переменными окружающей среды, антимикробных соединений или мутантных библиотек, сохраняя при этом стерильность, пропускную способность и кросс-валидацию между модулями.

Лаборатории, специализирующиеся на экологии, устойчивости, взаимодействии хозяина и патогена или открытии антибиопленок, могут внедрять отдельные модули или полный конвейер. Требуемые ресурсы ограничены считывателем пластин, инвертированным микроскопом с контролем окружающей среды для таймлапса, доступом к конфокальному микроскопу и оборудованию SEM, а также стандартными помещениями для животных для модели хомяков, что позволяет широко применять и воспроизводить сравнения между исследованиями.

Protocol

Этическое заявление:
Это исследование было одобрено Комитетом по уходу и использованию животных Института Пастера Новой Каледонии и проведено в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по уходу и использованию животных Института Пастера Парижа, а также Европейской рекомендацией 2007/526/EC. Регистрационный номер эксперимента на животных: IPNC-2018-ARE-001

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры с живыми культурами Leptospira должны проводиться в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL-2) в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности. Все манипуляции с культурами должны проводиться под биологическим защитным шкафом для обеспечения безопасности оператора и предотвращения загрязнения окружающей среды.

Штамм Leptospira interrogans serovar Manilae L495, использованный в этом исследовании, изначально был получен из коллекции Института Пастера (Париж, Франция) и хранится в Институте Пастера Новой Каледонии. Для сохранения вирулентности штамм периодически повторно изолируют из заражённых хомяков. Во всех экспериментах in vitro культуры не поддерживались дальше шести субкультур после восстановления от животного хозяина.

Все процедуры с животными должны выполняться в соответствии с институциональными рекомендациями и одобрены соответствующими комитетами по уходу и использованию животных. Эксперименты должны соответствовать европейским нормам по благополучию животных (Директива ЕС 2010/63) и рекомендациям Службы общественного здравоохранения, обеспечивая оправдание и этическое регулирование использования животных.

1. Подготовка бактериального инокулума

1. Выращивать клетки Leptospira spp. при 30 °C в среде^{EMJH 34} в аэробных условиях и без встряхивания в стеклянных трубках с плоским дном, винтовыми крышками, пока культура не достигнет средней фазы логарифма. В таких условиях штам L495 L. interrogans serovar Manilae, низкопроходящий штамм, регулярно поддерживаемый in vivo у хомяков, обычно достигает нужной плотности клеток в течение 3-5 дней. Убедитесь, что в культурах уровень дозы передозировки составляет 0,2-0,4 при 405 нм (2–5 x 10⁸ клеток/мл) до разбавления в свежей среде EMJH, а также проверьте подвижность и отсутствие скопления с помощью тёмнополевой микроскопии при 20-кратном увеличении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: EMJH обладает внутренней поглощением. Опустите спектрофотометр стерильным EMJH и вычтите это значение из всех показаний. Инокулюм можно стандартизовать либо путём измерения оптической плотности, либо прямого подсчёта ячеек с помощью камеры Петрова-Хауссера. Разбавление 1:100 проверенной культуры среднего логарифма обычно даёт_{OD 405} = 0,02 (≈ 1 x^{10 6} клеток/мл). Аккуратно смешивать инверсией; Не вихрь.
2. Исследуйте 10 мкл аликвот при тёмнополевой микроскопии при увеличении 20 раз. Убедитесь≥ что 90% клеток высокоподвижны и не отсутствуют видимые сгустки. Разведите подтверждённую среднюю каротажную культуру 1:100 в свежем EMJH для получения OD₄₀₅ = 0,02 (≈ 1 x 10⁶ клеток/мл). Аккуратно смешивать инверсией; Не вихрь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один рабочий инокулям поддерживает все нижние анализы, описанные в этом протоколе (рисунок 1). Подготовьте 36 мл для посева пластины на 24 лунки (1 мл/скважину) или 20 мл для посева пластины на 96 лунок (200 мкл/скважины). Регулируйте объём под количество требуемых пластин.

Рисунок 1. Глобальный рабочий процесс анализа биопленки Leptospira . Экспоненциально растущие культуры Leptospira сначала оцениваются на рост и стандартизируются по оптической плотности. Затем культуры распределяются по пластинам с стеклом или мембраной, микроскопическим микротарелкам или пластинам с 96 ямеками. Рабочий процесс включает семь модулей: (1) подготовка инокуля; (2) окрашивание кристаллическим фиолетом для количественной оценки биомассы; (3) ультраструктурная визуализация с помощью SEM; (4) динамический мониторинг биопленок с помощью фазово-контрастной микроскопии с таймлапсом; (5) 3D-визуализация с помощью CLSM с живым/мёртвым окрашиванием; (6) временное количественное определение прикреплённых и неприкреплённых фракций при формировании биопленки с помощью оптической плотности; и (7) исследование функциональной роли биопленки во время заражения у сирийских хомяков. Этот интегрированный подход позволяет мультимодально анализировать развитие, структуру и патогенность биопленки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

2. Crystal Violet — количественное определение биопленок на покрытиях или мембранах

1. Внутри биозащитного капюшона BSL2 используйте стерильные щипцы, чтобы уложить одну стерильную стеклянную накладку диаметром 12 мм или одну 0,1 мкм стерильную гидрофильную поликарбонатную мембрану плоско на дне каждой скважины в стерильную пластину на 24 лунки с крышкой. Предварительно замочите мембрану/стеклянную капку на 2 часа при 30 °C с 1 мл стерильного EMJH.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это не обязательно, предварительное замачивание субстрата в EMJH улучшает увлажнение и немного усиливает склеивание бактерий.
2. Удалите раствор для замачивания и добавьте 1,5 мл разбавленной бактериальной суспензии (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ клеток/мл) в каждую скважину. Убедитесь, что накладка или мембрана прочно расположены внизу.
3. Инкубировать пластину при 30 °C в статических условиях во влажной атмосфере, поддерживая установку водой в инкубатор, чтобы предотвратить испарение культурной среды. Для медленнорастущих штаммов рекомендуется инкубация продолжительностью 3 недели, чтобы обеспечить формирование зрелой, прилипшей биопленки.
4. В нужное время аккуратно удалять как можно больше посевной среды из каждой скважины, не нарушая биопленку. Аккуратно промыйте каждую ямочку 1 мл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), чтобы удалить остатки неприлипающих клеток, при этом удерживая накладку плоским на дно колодца, чтобы избежать отделения хрупких биопленочных клеток. В таких условиях рост биопленки преимущественно происходит на верхней поверхности покровного скольжения, с минимальным ростом на нижней стороне, поэтому промывка без подъёма достаточно для обогащения клеток, прикреплённых к поверхности, для следующего анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Биопленки на данном этапе чрезвычайно хрупкие и могут быть легко аспирированы по ошибке. Пипетирование следует проводить медленно и точно вдоль стенки скважины, чтобы не нарушать биопленку.
5. Фиксируйте образцы биопленки, добавив 1 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS при 37 °C в течение 30 минут. Снимите фиксатор и аккуратно прополосните дважды 1 мл PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для фиксации раствор формальдегида 4% был свежеприготовлен (16% запас без метанола, разбавленный 1:4 в PBS) и выбрасывался после использования, поскольку полимеризация в параформальдегид снижает активность сшивания.
6. Добавьте в каждую скважину 1 мл раствора 0,1% (с в/в) кристаллической фиолетовой (CV) и инкубируете при комнатной температуре в течение 15 минут, обеспечивая полное покрытие мембраны или накладного слоя.
7. Сбросьте краситель и дважды прополосните 1 мл PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллическая фиолетовая и параформальдегид (PFA) токсичны и могут раздражать кожу и глаза. Всегда носите перчатки и аккуратно обращайтесь с обоими химикатами, желательно в вытяжной вытяжке. Утилизировать отходы в специально отведённые контейнеры для опасных красителей или химических отходов в соответствии с институциональными нормами безопасности.
8. Наклоните пластину и спустите остаточную жидкость. Сушите колодцы на воздухе при комнатной температуре, пока субстрат не станет полностью сухим (≥ 4 часа, желательно на ночь).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе на поверхности покрытия или мембраны могут быть видны точечные или сетчатые структуры (рисунок 2A).
9. Добавьте в каждую скважину буфер элюции 500 мкл (50% этанола, 50% ледниковой уксусной кислоты (объём/объём)). Инкубировать тарелку 15 минут. Пипетте вверх и вниз, чтобы полностью растворить кристаллическую фиолетовую ткань, привязанную к биопленке.
10. Перенесите по 200 мкл каждого образца в оптически чистую 96-луйную микропластину и измерите поглощение на 570 нм. Вычтите заготовку только на подложке, обработанную неинокуляционной оболочкой или мембраной через фиксацию, CV-окрашивание, промывку и элюцию, чтобы удалить внутреннее связывание/фон. Запишите среднее ± стандартное отклонение как минимум для трёх технических повторений. Разбавлять образцы с помощью буфера элюирования, если поглощение превышает линейный диапазон спектрофотометра.

3. Визуализация биопленки с использованием сканирующей электронной микроскопии (SEM)

1. Внутри биозащитного капюшона BSL2 используйте стерильные щипцы, чтобы уложить одну стерильную стеклянную накладку диаметром 12 мм или одну 0,1 мкм стерильную гидрофильную поликарбонатную мембрану плоско на дне каждой скважины в стерильную пластину на 24 лунки с крышкой. Предварительно замочите мембрану/стеклянную капку на 2 часа при 30 °C с 1 мл стерильного EMJH.
2. Удалите раствор для замачивания и добавьте 1,5 мл разбавленной бактериальной суспензии (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ клеток/мл) в каждую скважину. Убедитесь, что накладка или мембрана прочно расположены внизу.
3. Инкубировать пластину при 30 °C в статических условиях в инкубаторе с контролем влажности, чтобы предотвратить испарение культурной среды. Для медленнорастущих штаммов рекомендуется инкубация в течение 3 недель для формирования зрелой, прилипшей биопленки
4. В нужное время аккуратно удалять как можно больше посевной среды из каждой скважины, не нарушая биопленку.
5. Затем аккуратно промывайте каждую ячейку 1 мл стерильного PBS, чтобы удалить остатки неприлипающих клеток, удерживая накладку плоским на дно колодца, чтобы избежать отделения хрупких биопленочных клеток. В таких условиях рост биопленки преимущественно происходит на верхней поверхности покровного скольжения, с минимальным ростом на нижней стороне, поэтому промывка без подъёма достаточно для обогащения клеток, прикреплённых к поверхности, для следующего анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Биопленки на данном этапе чрезвычайно хрупкие и могут быть легко аспирированы по ошибке. Пипетирование следует проводить медленно и точно вдоль стенки скважины, чтобы не нарушать биопленку.
6. Добавьте раствор 4% параформальдегида (PFA) и 1% глутаральдегида в буфере натрия какодилата (0,2 м, pH 7,4) непосредственно в колодец для фиксации биопленки.
7. Инкубировать 30 минут при 37 °C, затем снять фиксатор и дважды прополоснуть накладку или мембрану PBS. Такой подход сохраняет поверхностно прикреплённую биопленку и минимизирует отслоение, поскольку большая часть роста биопленки происходит на верхней поверхности покрытия в наших условиях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для фиксации раствор 4% формальдегида и 1% глутаральдегида был свежеприготовлен (16% бульон без метанола, разбавленный 1:4 в буфере натрия какодилата) и выбрасывался после использования, поскольку полимеризация в параформальдегид снижает активность перекрестного сшивания.
8. Погрузите субстрат в 1% тетроксид осмия (OsO₄), разбавленный в PBS, на 1 час для усиления контраста SEM. Прополосните дважды PBS.
9. Обезвоживайте образцы, погружая их последовательно в серию градированных этанолов с возрастающей концентрацией: 25%, 50%, 70%, 90% и 100% (v/v), каждая по 10 минут.
10. Добавьте 500 мкл гексаметилдисилазана и инкубируем 5 минут, затем заменяйте свежим HMDS и инкубируем ещё 5 минут. Удалите излишки HMDS и дайте образцу полностью высохнуть на воздухе под вытяжкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Глутаральдегид, ПФА, натрий какодилат, тетроксид осмия и гексаметилдисилазан токсичны и должны использоваться под химическим вытяжкой с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
11. Засохшие образцы закрепляют на заготовках SEM с помощью двусторонней проводящей углеродной ленты. Нанесите образцы тонким слоем (~10 нм) золота или платины, обеспечивая достаточный контраст электронов для визуализации SEM. Это позволяет визуализировать архитектуру биопленки с высоким разрешением, включая контакты между клетками, морфологию внеклеточного матрикса, плотность и гетерогенность, без необходимости дополнительных красителей или окрашиваний.
12. Загрузите заглушки в SEM с помощью соответствующего держателя для образца. По возможности эвакуировать камеру на ночь для улучшения качества изображения, затем получить изображения вторичных электронов при напряжении 5–15 кВ и соответствующие увеличения для выявления ультраструктуры биопленки (рисунок 2).

4. Фазово-контрастная визуализация растущей биопленки с таймлапсом

1. Пипетта 500 мкл рабочего инокулюма (_{OD 405} = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ элементов/мл; см. раздел 1) в стерильную чашу Hi-Q4 с стеклянным дном 35 мм, оснащённую плоско-параллельной крышкой для устранения искажений мениска. Избегайте появления пузырьков и немедленно закройте блюдо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чашка Hi-Q4 с стеклянным дном 35 мм содержит 4 отдельных зоны посевов, которые можно использовать для одновременного съёмки 4 различных состояний. Один компартмент выделяется стерильной среде EMJH в качестве отрицательного контроля, а три других — для технических репликий или других штаммов/мутантов.
2. Поставьте тарелку на экологическую площадку перевёрнутого микроскопа с фазово-контрастной оптикой, моторизованным фокусировочным приводом (Biostation IMQ) и увлажнённым корпусом, установленным на 30 °C и 95% относительной влажности. Эти состояния помогают минимизировать испарение при длительном обследовании (до 8 дней).
3. Запустите приложение BioStation IMQ, а в основном интерфейсе откройте окно New Time-lapse Setting , чтобы получить доступ к панели конфигурации. Перед началом эксперимента проверьте параметры окружающей среды на дисплее состояния, убедившись, что индикаторы температуры камеры и воды показывают стабильность для предотвращения смещения кадра во время захвата.
4. На экране New Time-lapse Setting выберите вкладку Live и настройте параметры изображения в панели Observation Condition, выбрав Phase Contrast (Ph) в качестве фильтра и установив увеличение на 20 X.
5. В режиме ручного режима регулируйте интенсивность света и время экспозиции , чтобы оптимизировать контраст и избежать насыщения. Проверьте это с помощью кнопки Saturation Check . Определите четыре точки присоединения, соответствующие центрам четырёх отсеков.
6. Позиционируйте ступень последовательно над каждым отсеком с помощью Jog Dial или кликнув прямо внутри Live Observation Image Display.
7. Уточните фокус с помощью кнопок фокусировки и записывайте каждую позицию, нажав кнопку таймлапса регистрации точки эксперимента . Зарегистрированные очки отображаются в виде пронумерованных синих рамок на Дисплее проверки точки наблюдения и подтверждаются во вкладке Баллов.
8. Запрограммируйте график приобретений, открыв вкладку «Время » и нажав « Новое », чтобы открыть диалоговое окно таймлапса , где цикл приобретения установлен на 30 минут , а общее время — на 7 дней.
9. После нажатия «Применить» программа автоматически вычисляет количество раундов приобретения. Активируйте автофокус, кликнув правой кнопкой мыши по строке заголовков, выбрав Настройки и включив режим автофокуса , чтобы обеспечить перефокусировку на каждом этапе. Проверьте согласованность настроек экспозиции, усиления и интенсивности света во всех точках, затем сохраните всю конфигурацию с помощью кнопки «Сохранить ».
10. Начните приобретение, нажав Start Time-lapse. Программное обеспечение автоматически переключается на таймлапс-изображения, что позволяет непрерывно отслеживать ход захвата и стабильность камеры на протяжении 7-дневного эксперимента. Все изображения автоматически сохраняются в формате TIFF внутри папки эксперимента, созданной программным обеспечением.
11. Обрабатывайте и количественно оценивайте серию изображений, импортируя стеки изображений в FIJI (рисунок 3A, B, C).
12. Откройте стеки изображений, соответствующие каждой позиции, через File > Import > Image Sequence, убедившись, что кадры загружаются в хронологическом порядке.
13. Преобразуйте выровненные стеки в 8-битные оттенки серого с помощью Image > Type > 8-бит для стандартизации интенсивности пикселей.
14. Примените пороговое изменение с помощью Image > Adjust > Threshold для выделения областей бактериальной биопленки. Примените согласованные пороговые настройки для всех кадров, выбрав Применить, затем сохраните результат в виде бинарной маски с помощью Process > Binary > Make Binary.
15. Выполните количественную оценку с помощью Анализировать > анализировать частицы, записывая такие параметры, как площадь, процентная площадь и средняя интенсивность.
16. Экспортируйте результаты каждого кадра автоматически в таблицу через окно Results (File > Save As > .csv) для кинетического анализа. Выражайте все измерения как долю площади поля, покрытой биопленкой (поверхностное покрытие).

5. Визуализация биопленки с использованием конфокальной сканирующей лазерной микроскопии (CLSM)

1. Инокуляция 1,5 мл рабочего инокулума (_{OD 405} = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ клеток/мл; см. раздел 1) в стерильную чашу с стеклянным дном диаметром 35 мм. Инкубировать статически в увлажнённом контейнере с резервуаром воды в инкубаторе при 30 °C до достижения желаемой стадии развития (до 21 дня).
2. В выбранное время аккуратно вдувайте среду медленно вдоль стенки посуды, не нарушая биопленку. Прополосните один раз 2 мл стерильного PBS, чтобы удалить планктонные клетки, соблюдая крайнюю осторожность, чтобы не отслоить и не повредить биопленку.
3. Подготовьте растворы для окрашивания, требующие инкубации с помощью нефиксированных (живых) биопленок (выполняйте до фиксации).
   1. Для окрашивания живой/мёртой краской добавьте 3 мкл SYTO9 зелёной флуоресцентной нуклеиновой кислоты (1,67 мМ) и 3 мкл йодида пропидия (18,3 мМ) до 10 мл PBS для получения раствора для окрашивания. Добавьте 200 мкл раствора для окрашивания непосредственно на биопленку, образующую бактерии, затем инкубировать 30 минут при комнатной температуре в темноте и прополоснуть один раз в PBS.
   2. Живой трассер также может использоваться для окрашивания клеток до фиксации. Инкубировать живые клетки с помощью 10 мкм cfda/se трассера в течение 30 минут. Альтернативно, можно использовать маркировку мембран FM4-64 при концентрации 5 мкг/мл. Прополоскайте один раз в PBS.
4. Исправьте биопленку, добавив 2 мл раствора параформальдегидов 4% в PBS и инкубировать 30 минут при 37 °C. Снимите фиксационное средство и дважды смойте PBS.
5. Добавьте каплю монтажного материала против фейда, чтобы покрыть биопленку и избежать пузырей.
6. Получите Z-стеки на инвертированном конфокальном микроскопе, оснащённом настраиваемым лазером белого света (WLL) и масляным погружательным объективом HC PL APO CS2 63×/1.4 NA. Для CFDA/SE установите возбуждение на 488 нм и собирайте излучение от 500 до 550 нм, используя отверстие 1 единицы Эйри (AU). Для FM4-64 установите возбуждение на 561 нм и фиксируйте излучение между 630 и 700 нм, также с помощью 1 а.е.
7. Получите Z-стеки с интервалом 0,5–1,0 мкм по всей толщине биопленки. Регулируйте мощность лазера и усиление детектора, чтобы максимизировать динамический диапазон, избегая насыщения (<1% насыщенных пикселей).
8. Используйте линейное усреднение (2-4×) для улучшения отношения сигнал/шум и поддерживайте все параметры изображения (мощность лазера, ширина пропускания детектора, размер отверстия, скорость сканирования) постоянными по всей проботе.
9. Сохраняйте стеки изображений в виде 12-битных файлов и экспортируйте их в формате .lif для количественного анализа в FIJI (ImageJ).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед снимком убедитесь, что настройки микроскопа (например, мощность лазера, усиление детектора, размер отверстия) стандартизированы с использованием контрольных образцов, окрашенных такими же красителями. Этот этап калибровки необходим для минимизации вариативности между приобретениями и обеспечения надёжного сравнения между экспериментами.
10. Обрабатывайте и количественно оценивайте стеки конфокальных изображений с помощью FIJI, оснащённого плагином COMSTAT (или аналогичным программным обеспечением для 3D-анализа)¹⁰. Измеряйте биообъём, среднюю и максимальную толщину, покрытие поверхности и соотношения живых/мёртвых (или другие заранее заданные метрики). Экспортировать репрезентативные ортогональные виды и проекции максимальной интенсивности для иллюстрации (рисунок 3D, E).

6. Количественная оценка прикреплённых и неприкреплённых фракций во время формирования биопленки в 96-луночных микротитрах

1. Инокуляция 200 мкл рабочего инокулюма (_{OD 405} = 0,02 ≈ 1 x^{10 6} клеток/мл; см. раздел 1) в колодцы пластины с 96 лунками. Инкубировать статически при 30 °C до желаемого времени (3, 5, 7, 10, 12, 14, 17 или 21 дней).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эффекты по границе и испарение часто встречаются при использовании пластин с 96 колодцами, особенно если инкубатор не контролирует влажность. Чтобы минимизировать эти эффекты, добавьте 200 мкл стерильной дистиллированной воды во все периферийные скважины. Кроме того, пластины помещались в увлажнённый ящик с резервуаром для воды, который затем размещался внутри инкубатора для дальнейшего снижения испарения и поддержания стабильной влажности в колодцах.
2. В каждый момент времени подготовьте три типа образцов:
   1. Полная суспензия — гомогенизуйте всё содержимое одной скважины, содержащей биопленку, аккуратно поднимая и опускаясь несколько раз, чтобы избежать образования пузырьков. Эта фракция отражает всю популяцию бактерий, включая как не прикреплённые лептоспиры, так и те, что находятся в полуадгезентной биопленке. Этот этап гомогенизации помогает рассеивать клеточные агрегаты, которые могут мешать последующим измерениям поглощения.
   2. Жидкая фаза — из второй скважины аккуратно удалять 180 мкл супернатанта, не нарушая слой биопленки. Переложите в пустую яме и добавьте 20 мкл свежей среды EMJH. Аккуратно поднимайтесь и опускайте несколько раз, чтобы рассеять ячеточные агрегаты. Эта фракция представляет собой неприкреплённые клетки, присутствующие в жидкой фазе, которые могут включать как свободно взвешенные лептоспиры, так и отдельные биопленочные агрегаты.
   3. Биопленка — в той же яме, что используется для шага 2.2, повторно подвесьте оставшуюся биопленку, добавив 180 мкл свежей среды EMJH и аккуратно подняв и опуская несколько раз. Эта фракция соответствует лептоспирам внутри биопленки.
3. Измерьте поглощение каждой суспензии при 405 нм с помощью спектрофотометра после того, как убедитесь, что каждая яма полностью гомогенирована, и нанесите значения для создания репрезентативного графика (рисунок 4A).

7. Исследование функциональной роли биопленки во время инфекции хозяина

1. Инокуляция 200 мкл рабочего инокулюма (_{OD 405} = 0,02 ≈ 1 x^{10 6} клеток/мл; см. раздел 1) в колодцы пластины с 96 лунками. Инкубировать статически при 30 °C до достижения желаемой стадии развития (до 21 дня).
2. Для определения концентрации инокулума выделяйте специальные скважины для «биопленкового контроля», которые будут использоваться только для мониторинга роста, а не для инъекций животных. Когда биопленка станет макроскопически видимой, аккуратно удалите 180 мкл супернатанта из одной контрольной ямы, не нарушая биопленку. Замените 180 мкл свежей среды EMJH, аккуратно суспензируйте биопленочные агрегаты без образования пузырей и измеряйте_{OD 405} для оценки концентрации бактерий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В принципе, промывка колодцев до количественной оценки может помочь удалить неприлипающие клетки. Однако, поскольку биопленки Leptospira демонстрируют слабую адгезию в пластинах с 96 лунами, промывка приведёт к неконтролируемой потере материала биопленки. По этой причине этап повторного подвески был выполнен без предварительной промывки для обеспечения воспроизводимости между скважинами и стабильной концентрации бактерий.
   Контрольные колодцы для биопленки обычно содержат ~2 x 10⁸ лептоспиров, которые были выбраны в качестве стандартного инокуля для экспериментов с инфекциями хомяков. Эта концентрация также определяет целевое количество планктонных лептоспир, используемых в качестве контрольных элементов. При включении планктонные контроли готовятся путём свежего субкультурирования Leptospira в среде EMJH при встряхивании при 30 °C в течение 5 дней, что соответствует средне- или поздней экспоненциальной фазе роста, которая даёт схожую плотность клеток.
3. Для инокуляции животных используйте отдельные колодцы с биопленкой (не контрольные). Аккуратно удалите 180 мкл супернатанта из скважин, чтобы устранить большинство жидких лептоспиров.
4. Оставшиеся 20 мкл, содержащие биопленочные агрегаты, собирайте с помощью наконечника пипетки объёмом 200 мкл, чтобы не нарушать структуру.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Биопленка хрупкая. Убедитесь, что агрегаты видны до и после сбора. Подготовьте дополнительные колодцы на случай, если потребуется повторение.
5. Переложите агрегаты в шприц, предварительно наполненный 300 мкл свежей среды EMJH. Дайте агрегатам оседать под действием силы тяжести.
6. Прикрепите иглу на 21 G и аккуратно выведите избыток EMJH до достижения конечного объёма 200 мкл. Убедитесь, что не осталось пузырьков воздуха и чтобы биопленочные агрегаты оставались видимыми.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидание стабилизации агрегатов минимизирует убытки при корректировке объема. Перед использованием in vivo убедитесь, что заполнители остаются целыми после прохождения через иглу весом 21 G (рисунок 4C, D).
7. Проведите внутрибрюшинную инъекцию 2 x 10⁸ лептоспиров в среде EMJH объёмом 200 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 7-8 недельных золотистых сирийских хомяков (обоих полов), содержащихся в стандартных условиях проживания. Для отрицательных контролей вводите только 200 мкл EMJH среды (по одному животному на каждую реплику).
8. Проводите наблюдение за животными два раза в день до 21 дня на наличие клинических признаков лептоспироза (взъерошённая шерсть, простание и снижение реакции на стимуляцию). Немедленно усыпить с помощью вдыхания углекислого газа, если наблюдается страдание, и записывать время эвтаназии как время смерти.
9. На 21-й день усыпьте всех выживших животных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите три независимых биологических репликации с культурами, подготовленными в разные даты. Каждая реплика включает по два животных на каждое состояние и одно животное с отрицательным контролем.

Results

При правильной подготовке инокулума культуры переходят в среднюю логическую фазу в течение 3-5 дней и демонстрируют значения_{OD 405} ~ 0,2-0,4 с яркими, сильно подвижными полями под тёмнополевой микроскопией (≥ 90% подвижных клеток) и отсутствием видимых сгустков. Неоптимальные препараты проявляются как медленные бактерии и гетерогенная подвижность по всей области; Такие культуры часто дают слабые биопленки и должны быть выброшены. На практике подтверждение подвижности и OD рядом перед посевом минимизирует количество неудачных попыток. Установление таких элементов контроля качества на стадии инокуля является лучшим предиктором успеха в последующих приложениях. Хотя методология была оптимизирована для L. interrogans serovar Manilae L495, те же процедуры применялись и к штамму Leptospira biflexa Patoc для демонстрации межвидовой применимости. L. biflexa , как правило, образует менее цельные и более тонкие биопленки по сравнению с L. interrogans, однако характерная последовательность развития и структурные особенности остаются обнаруживаемыми при соответствующей корректировке параметров. Включение обоих видов подчёркивает адаптивность рабочего процесса как к патогенным, так и к сапрофитным Leptospira .

После 21 дня статической инкубации при 30 °C в увлажнённой камере (или в соответствующей длительности для используемого вида Leptospira ) биопленки становятся видимы невооружённым глазом как на стеклянных слоях покрытия, так и на гидрофильных поликарбонатных мембранах. Успешный рост формирует характерные структуры CV через 2-3 недели, такие как точечные, ветвящиеся или сетчатые следы, прикреплённые к поверхности (рисунок 2A).

В типичном забеге дикий тип L. interrogans Manilae L495 достигает ~ 50% поверхностного покрытия к третьей неделе, тогда как плато мутантов с низким содержанием биопленки около ~ 20% и фенотипы с высоким содержанием биопленки приближаются к ~ 70-80%, что устанавливает практический динамический диапазон для скрининга. Степень образования биопленки также может варьироваться в зависимости от вида и штамма Leptospira ; например, штамм L. biflexa Patoc быстрее развивает видимые биопленки, при этом предыдущие исследования считали структуры уже через 120 часов после инокуляции зрелыми^{биопленками 35}.

Кристаллическая фиолетовая окрашивание обеспечивает надёжный и воспроизводимый метод количественной оценки биопленочной биомассы. В хорошо развитых биопленках окрашивание приводит к насыщенному фиолетовому окрашиванию, локализованному в области покрова или мембраны, что указывает на высокий уровень прикреплённой биомассы (рисунок 2A). Визуальные сигналы во время этапов окрашивания и растворения также служат полезными индикаторами успешности протокола. Например, неравномерное распределение CV или бледное окрашивание могут быть вызваны недосевом, испарением или агрессивной промывкой, которая отслоивает ранние биопленки.

Показатели поглощения при 570 нм отражают количество удерживаемой окрашительной среды, а значит, и относительную плотность биопленки (рисунок 2B). В репрезентативных экспериментах культуры L. interrogans , выращенные в оптимальных условиях, демонстрируют последовательные и воспроизводимые показатели OD₅₇₀ между репликатам, отражая стабильное формирование биопленки. В отличие от этого, при чрезмерном пипетировании образцов при изменениях среды наблюдаются большие вариации между репликами, что указывает на плохую адгезию или частичное отслоение биопленки. Такая вариабельность следует рассматривать как признак технических проблем, а затронутые образцы следует исключить или тщательно пересмотреть протокол. Примечательно, что L. biflexa Patoc при схожих условиях образует более обширные биопленки как на стеклянных покрытиях, так и на поликарбонатных мембранах, что отражается в более высоких значениях поглощения CV, демонстрируя адаптивность и эффективность протокола для всех видов Leptospira .

Успешная подготовка SEM позволяет выявить внеклеточные матриксовые отложения уже на 3-й день, за которыми следует ярко поляризованная архитектура в зрелых биопленках: шероховатая, каналированная базальная поверхность (часто с > 5 мкм каналами), закрепляющая пористую внутреннюю структуру, и более гладкую верхушечную грань, где спирохеты переплетаются плотной матрицей (рисунок 2C, D, E, F). Поля с высоким увеличением часто захватывают ветвлёкшиеся внеклеточные филаменты и иногда грибоподобные выступы; особенности, соответствующие динамике слияния, наблюдаемой таймлапсом (Дополнительное видео 1). В неоптимальных препаратах могут наблюдаться сжатые матрицы, зарядка и неясные контуры клеток, обычно отражающие недостаточную постфиксацию, недостаточное проводящее покрытие или плохое высыхание. Когда базально-апикальная полярность и повсеместные каналы очевидны, показатели SEM тесно совпадают с конфокальными оценками толщины и пористости, подтверждая успешное выполнение как подготовки, так и визуализации.

В эффективных таймлапс-сериях изолированные пункты появляются в течение 24–72 часов и постепенно сливаются в более крупные агрегаты, которые перемещаются по поверхности до того, как ограничение пространства замедляет их движение (рисунок 3A, B, C). Количественная сегментация приводит к монотонному увеличению общей покрытой площади, тогда как количество агрегатов увеличивается, достигает пика, а затем снижается, поскольку столкновения и слияния доминируют между ~12 и 216 ч. Эти кинетики (площадь вверх, количество агрегатов вниз) указывают на активное накопление, а не на простое осадкоотделение. Неудачные или почти неудачные забеги не имеют ранних пунктов, показывают плоские кривые площади со временем или сталкиваются с дрейфом фокуса, связанным с нестабильной температурой и влажностью. Поддержание стабилизированной температуры 30 °C с влажностью 95% и использование автофокуса в каждой точке обычно восстанавливает чёткие траектории, подходящие для сравнения мутантов или методов лечения.

Репрезентативные Z-стеки из зрелых биопленок имеют пенообразную, многослойную архитектуру, обычно превышающую 50 мкм толщиной, при этом большинство клеток окрашивают живыми (SYTO 9-положительные), а центральные пустоты иногда свидетельствуют о коллективных перестановках в процессе роста (рисунок 3D). Матричные зонды могут использоваться для изучения состава матрицы: WGA выделяет полисахаридные эпитопы, BOBO-3 маркирует обильное количество внеклеточной ДНК, а белко-селективные окрашивания дают мало внешнего сигнала, ассоциированного с клетками (рисунок 3E). Неоптимальные результаты включают тонкие или прерывистые стеки, доминируемые йодидом провидия, сильное фотоотбеливание или непоследовательные настройки усиления, каждое из которых подрывает количественную сопоставимость. Интерпретация толщины, биообъёма и соотношений живых/мёртвых вместе (при сохранении мощности лазера, усиления детектора и постоянной точки отверстия в зависимости от условий) подтверждает статус созревания и поддерживает прямые сравнения с ультраструктурой SEM и биомассой CV.

Процесс образования биопленки у Leptospira обычно проходит через отдельные фазы, хотя точные сроки и значения могут различаться в зависимости от вида или штамма. Используя штамм L. interrogans Manilae L495 в качестве ориентира, ожидаемая прогрессия в течение 21 дня включает начальную фазу (дни 0-3), когда бактерии остаются преимущественно планктонными с минимальным количеством биопленки (рисунок 4A). За ней следует экспоненциальная фаза роста (3-7 дней), в течение которой как планктонные, так и биопленочные бактерии увеличиваются, достигая примерно 9 x 10⁸ клеток/мл, сопровождаясь образованием и расширением биопленочных агрегатов. Между 7 и 12 днями количество планктонных бактерий значительно снижается, в то время как клетки, ассоциированные с биопленкой, достигают пика, составляя примерно 80% населения. Наконец, во время фазы созревания (12–21 дней) количество бактерий в биопленке уменьшается без увеличения планктонных клеток, однако размер и сложность биопленки продолжают расти. Наблюдение этой последовательности изменений показывает, что протокол эффективно фиксирует динамическое развитие и созревание биопленок Leptospira .

При правильном проведении протокол заражения использует инокулу, содержащую ~2 x 10⁸ лептоспиров в 200 мкл EMJH, полученную из хорошо определённых планктонных (5-дневных) или биопленочных (21-дневных) культур. Хотя эти два типа культур представляют собой разные физиологические состояния, это различие является намеренным, поскольку цель эксперимента — выяснить, сохраняют ли биопленки Leptospira — характеризующиеся снижением метаболической активности и структурной дифференциацией — способны инициировать инфекцию. Этот контраст подтверждается транскриптомическими исследованиями, показывающими значительные сдвиги экспрессии генов между планктонной и биопленкой Leptospira^35,36. Заполнители биопленки тщательно собираются для сохранения их структуры и сохранения целости после прохождения через иглу весом 21 G, что подтверждается до инъекции (рисунок 4C, D). После инъекции внутрибрюшинной инъекции у золотистых сирийских хомяков обычно проявляются клинические признаки лептоспироза в течение 3–5 дней (например, вялость, взъерошённая шерсть, поклонение). Отрицательные контрольные препараты, введенные только средой EMJH, не показывают признаков заболевания. Прогрессирование и тяжесть клинических признаков, а также время эвтаназии варьируются в зависимости от инокулума: планктонные бактерии часто вызывают более ранние и острые симптомы, тогда как агрегаты, полученные из биопленки, могут вызывать задержку, но стойкую инфекцию (рисунок 4B). Мониторинг два раза в день до 21 дня позволяет зафиксировать полный ход болезни.

Рисунок 2. Кристаллическое фиолетовое окрашивание, количественная оценка и ультраструктурная визуализация биопленок Leptospira . (A) Кристально-фиолетовое (CV) окрашивание биопленок, выращенных на разных субстратах. CV-окрашивание позволяет визуализировать архитектуру биопленки и начальные паттерны крепления для различных видов и субстратов. i. L. Допрос о поликарбонатном фильтре; ii. L. biflexa на поликарбонатном фильтре; iii. Л. допросчики о стеклянном обложке; iv. L. biflexa на стеклянном покрытии. (B) Пример количественного образования биопленки, оцениваемого по поглощению CV (OD570 нм ) со временем для L. interrogans и L. biflexa. Этот кинетический показатель фиксирует как раннее склеивание, так и динамику накопления биомассы, подчёркивая различия в росте биопленки между патогенными и сапрофитными видами. Эта цифра была изменена с²⁷. (C-E) Сканирующая электронная микроскопия (SEM) биопленок L. interrogans : (c) биопленка трёхдневной давности, показывающая раннее формирование микроколоний и первоначальное внеклеточное отложение матрикса; (d) биопленка возрастом 14 дней, демонстрирующая зрелую архитектуру с обширной матричной и трёхмерной организацией; (e-f) Биопленка трёхнедельной давности, иллюстрирующей структурную консолидацию и созревание матрицы на длительном культурировании. Это сочетание CV-окрашивания, количественных измерений OD и SEM-визуализации даёт всесторонний обзор развития биопленки — от раннего прикрепления до зрелой ультраструктурной организации, позволяя напрямую сравнивать между видами и периодами культур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Визуализация образования биопленки Leptospira . Изображения фазового контраста, полученные с помощью BioStation, показывают проявление биопленки на (A) 48 ч, (B) 96 ч и (C) 144 часа. (D) CLSM-реконструкция биопленки Leptospira , демонстрирующая полный биообъём с ортогональными срезами для 3D-визуализации. (E) Конфокальное окрашивание зрелой биопленки с использованием DAPI (зелёный) и WGA (красный), подчёркивает бактериальные клетки и компоненты внеклеточного матрикса. Эта цифра была изменена с³⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Временно-разрешённая количественная оценка фракций планктонной и биопленки и функциональная оценка биопленок Leptospira . (A) Кинетика образования биопленки, измеряемая поглощением на 405 нм. Для каждой временной точки брались показания из общей ямы, биопленки и супернатанта, содержащего планктонные лептоспиры, что позволяло различать прикреплённые и свободно плавающие бактерии. (B) Примеры кривой выживаемости хомяков, введённых биопленковыми агрегатами, планктонными лептоспирами или контролем EMJH. Животные, введенные в биопленку, демонстрируют сниженную вирулентность, некоторые выживают 21 день, тогда как планктонные лептоспиры вызывают быструю смертность. (C-D) Предварительное подтверждение целостности биопленки: заполнители видны в шприце до инъекции (C) и остаются целыми после прохождения через иглу 21 G (D, белые стрелки), что подтверждает, что структура биопленки сохраняется при обращении. Эта цифра была изменена с³⁶. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Этот протокол представляет собой модульный и интегративный рабочий процесс для изучения биопленок Leptospira, с интеграцией количественной биомассы (кристаллическая фиолетовая)^9,27, динамики (фазовый контраст с таймлапсом), трёхмерного состава (конфокальная лазерно-сканирующая микроскопия с целевыми зондами)³⁸, ультраструктуры (сканирующая электронная микроскопия) и функциональной оценки (инфекция хомяками). Используя одни и те же серии культур в разных модулях, эффекты пакетов минимизируются, а внутриэкспериментальная кросс-валидация становится возможной, что особенно важно для медленнорастущих и хрупких спирохет. Каждый модуль дополняет осталую: CV количественно определяет «сколько», таймлапс показывает «скорость», CLSM раскрывает «что внутри», SEM определяет «как он построен», а in vivo тестирование предоставляет «доказательство работы». Включение L. biflexa демонстрирует адаптивность между видами, подчёркивая более быстрое и плотное формирование биопленки и подчёркивая методологическую^{гибкость 35}.

Успех каждого модуля зависит от качества инокулума и его физиологического состояния. Планктонные культуры среднего каротажа (3–5 дней), высокоподвижные и свободные от заполнителей, обеспечивают воспроизводимое склеивание и образование биопленки. Для обеспечения устойчивого образования и воспроизводимости биопленки следует использовать только изоляты с низким проходом.

CV-анализ закрепляет рабочий процесс благодаря скорости, масштабируемости и пропускной способности ^9,27. Он позволяет быстро отбирать мутантов, среду или антибиопленочные соединения. Однако, поскольку биопленки Leptospira хрупки и неоднородны, необходимы мягкая обработка и валидация репликации. CV не может отличить компактные и пористые архитектуры или обнаружить матричный состав — отсюда и роль экранирующего элемента для более глубоких структурных анализов.

Таймлапс-съёмка преодолевает этот разрыв, раскрывая кинетику биопленки в реальном времени. Он фиксирует возникновение, слияние и иммобилизацию подвижных агрегатов, обнажая временные явления, которые конечные анализы пропускают. Устойчивость окружающей среды (температура, влажность, автофокус) критически важна. Эти записи показали, что даже когда биомасса CV кажется стабильной, динамика может расходиться — что указывает на структурные перестройки или потерю жизнеспособности в более глубоких слоях.

CLSM предоставляет объемную и химическую информацию без артефактов^{обезвоживания 39}. Окрашивание живых/мёртвых выявляет градиенты жизнеспособности клеток внутри биопленки, что соответствует сообщениям о ограниченной диффузии кислорода и метаболической^{стратификации 6,40}. Лектины и нуклеиновые кислотные красители обнажают обильное количество внеклеточной ДНК и специфических гликановых мотивов, что позволяет количественно оценивать и характеризуть компоненты^{матрицы 41,42}. Данные CLSM часто выявляют внутренние пустоты, повторяя коллективные перестановки, наблюдаемые в^{таймлапсе 38}. Тем не менее, ограничения включают специфичность зонда, фотоотбеливание и дифракционно ограниченное осевое разрешение; Поэтому настройки микроскопа и характеристики краски должны быть стандартизированы и протестированы заранее, чтобы обеспечить надёжные, сопоставимые результаты в экспериментах.

SEM предлагает дополнительное ультраструктурное разрешение⁴³. На ранних стадиях он разрешает зарождающиеся агрегаты; При созревании (≈ 15–21 день) он проявляет поляризованную архитектуру: шероховатый, канализированный базальный слой для якорного стояния и обмена, а также более гладкая поверхность, богатая апикальной^{матрицей 37}. Аккуратная фиксация, сушка HMDS и корреляция с конфокальными данными смягчают артефакты, вызванные обезвоживанием или^{коллапсом.}

Вместе эти четыре модуля обеспечивают внутреннюю перекрестную валидацию: при сходянии CV, CLSM и SEM выводы становятся надёжными; Когда они расходятся, сами расхождения являются информативными — например, выявляя, например, увеличение биомассы при снижении жизнеспособности или неизменную биомассу с изменённым составом матрицы.

Сохраняется несколько внутренних ограничений. Биопленки Leptospira гетерогенны и деликатны, что делает их чувствительными к обращению и обезвоживанию. CV интегрирует полную биомассу, но не^{жизнеспособность 16}; CLSM не может превышать^{оптические пределы 38}; Риски создания артефактов подготовки СЭМ. Смертность в более глубоких слоях ожидается из-за градиентов^{кислорода 6}, но это смещение систематично и сопоставимо в разных условиях. Созревание биопленки достигает плато примерно через 15–21 день, что связано с транскрипционными сигнатурами ограничения питательных^{веществ 36}. Поздние этапы остаются плохо охарактеризованными.

In vivo анализы дают функциональный контекст. Инъекции агрегатов внутрибрюшно проверяют, отличаются ли клетки, полученные из биопленки по вирулентности или персистенции от планктонных аналогов. Хотя внутрибрюшинная инокуляция не является естественным путём, она предлагает контролируемую сравнительную^{модель 36}. Совокупная гетерогенность вносит некоторую дисперсию, но стабильное обращение и совпадающий размер инокуля это уменьшают. Важно, что признаки устойчивости биопленки (например, стрессоустойчивость, опосредованная ЭКМ) не обязательно приводят к усилению острой вирулентности, что подчёркивает экологическую, а не патогенную роль формирования^{биоплёнки 24}.

Модульная конструкция обеспечивает масштабируемое использование. Для быстрого отбора достаточно CV и таймлапс. Для механистического понимания CLSM и SEM добавляют композиционное и архитектурное разрешение. Модули могут интегрировать ферментативные или химические возмущения (ДНазу, гликозидазу), альтернативные зонды для гликанов или нуклеиновых кислот, а также микрофлюидные системы для тестирования реакций потока. Тот же инокулюм может питать транскриптомические или протеомные анализы, напрямую связывая фенотип биопленки с регуляцией (например, сигнализация c-di-GMP, ответ на голодание). Эта система также включает скрининг мутантов, тесты на возмущения окружающей среды и оценку антибиопленок или антивирусных соединений.

Этот интегрированный рабочий процесс преобразует изолированные наблюдения в целостное многомерное понимание биопленок Leptospira. Объединяя пропускную способность (CV), динамику (таймлапс), химию и глубину (CLSM), а также ультраструктуру (SEM), подход точно отражает мобильную, пористую и поляризованную природу сообществ Leptospira. Расширяя более ранние исследования^на 17,35,36, оно демонстрирует, что скоординированные, модульные эксперименты выявляют явления, невидимые для однометодных исследований — такие как рост биомассы при снижении жизнеспособности или дивергентная кинетика между видами. В конечном итоге этот подход поддерживает сравнительные, воспроизводимые и функционально релевантные анализы между видами, мутантами и условиями, создавая основу для механистической микробиологии, экологической устойчивости и разработки стратегий антибиопленки.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 и микро; M-стерильная гидрофильная поликарбонатная мембрана	it4ip	1000M25/861N101/13
12 мм стерильный стеклянный накладной слой	SPL	330164
16% параформальдегид (PFA)	Thermo Scientific	28908
Игла 21G	BD Medical	304432
24-ячественная микропластина	NUNC	143982
Чаша с стеклянным дном 35 мм	Ибиди	81218-200
Антенна Hi-Q4 с стеклянным дном 35 мм	Ибиди	81156
96-ячественная микропластина	NEST	701001
Средний монтаж Antifade	Biorad	29410
Углеродное покрытие	Leica Microsystem	Em ACE600
CFDA/SE трассер	Биолегенда	423801
Проводящий карбонный клей	Наука об электронной микроскопии	77816
Кристальная фиолетовая (CV)	Sigma	C3886
Тёмнопольный микроскоп	Leica Microsystem	11888846	Leica DM4000 B оснащён тёмным конденсатором Fiel (cat n° 11505142)
Этанол	VWR Chemicals	83813.36
FM4-64	Инвитроген	T3166
Ледниковая уксусная кислота	Supelco	1.00063
Глутаральдегидный раствор	Сигма-Олдрич	G5882
Гексаметилдисилазан	Acros Organics	120581000
Инкубатор	Меммерт	IN30
Инвертированный конфокальный микроскоп	Leica Microsystem	Leica DMI6000 TCS SP8 X	Конфокальный микроскоп SP8
Инвертированный микроскоп с фазово-контрастной оптикой	Nikon	CELL-S2	BioStation IM-Q
Leptospira Medium Base EMJH	Бектон Дикинсон	BD  279410	Среда EMJH для Leptospira
Тетроксид осмия (OsO4)	Sigma	BCCG9181
Йодид пропидия	Биотиум	40017
Сканирующий электронный микроскоп	JEOL	JSM-IT300
Натрий какодилат буфер	Thermo Scientific Chemicals	15453149
Спектрофотометр Varioskan Lux	Thermo Scientific	VLBL00GD0
Физиологический раствор с буфером на фосфатах	Biosolve	0016232301BS
Шприц (1 мл)	Чирана	CH03002L
SYTO9 зелёная флуоресцентная окраска нуклеиновой кислоты	Инвитроген	S34854