Методическая статья

Сверхразрешающая визуализация целой клетки с помощью DNA-PAINT на вращающемуся диске с оптическим перераспределением фотонов

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69531

⸱

6 января 2026 г.

 ,  ,  , 
1London Centre for Nanotechnology, University College London, 2Department of Chemistry, University College London

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает процедуру глубокой полноклеточной мономолекулярной локализационной микроскопии (SMLM) с использованием вращающегося дискового конфокального микроскопа с оптическим перераспределением фотонов, что позволяет осуществлять ДНК-PAINT визуализацию без необходимости индивидуальной оптики или сложного освещения.

Аннотация

Мономолекулярная локализационная микроскопия (SMLM) позволяет наномасштабно визуализировать клеточные структуры, но обычно ограничивается изображениями вблизи покрытия из-за ограничений полной внутренней флуоресценции (TIRF) и высоконаклонного и оптического листового освещения (HILO). Здесь представлен протокол, использующий вращающийся дисковый конфокальный микроскоп, оснащённый оптическим фотонным перераспределением (SDC-OPR) для выполнения SMLM в целых клетках. Этот метод позволяет проводить высокоточную мономолекулярную визуализацию по всему объёму клетки с использованием накопления точек ДНК для изображения в наномасштабной топографии (DNA-PAINT) без необходимости использования индивидуальной оптики или сложных схем освещения. Протокол предоставляет пошаговое руководство по настройке коммерчески доступного вращающегося дискового микроскопа (например, CSU-W1 SoRA) для SMLM-визуализации, включая параметры приобретения, оптимизированные для глубокой визуализации. Определены этапы подготовки образцов для маркировки внутриклеточных мишень с помощью ДНК-конъюгированных зондов для проведения ДНК-PAINT визуализации, включая стратегии многоцветной визуализации нескольких целей. После получения изображений следует локализация и реконструкция по одной молекуле с использованием стандартных программных пакетов. Также обсуждаются важные аспекты для минимизации фона, оптимизации бокового разрешения и обеспечения качества изображения на всей глубине клетки. Этот доступный протокол позволяет исследователям проводить глубокий целоклеточный SMLM с использованием стандартного конфокального оборудования, расширяя круг биологических вопросов, которые можно решить с помощью одномолекулярной визуализации за пределы близко-мембранных областей.

Введение

Одномолекулярная локализационная микроскопия (SMLM)1 — это семейство методов сверхразрешения, которые достигают наномасштабного разрешения путём временного разделения отделения отдельных флуорофоров и их высокой точности. Успешный SMLM требует высокого отношения сигнал/шум (SNR) для обнаружения отдельных молекулярных событий, что традиционно ограничивалось оптическими системами, обеспечивающими интенсивное, локализованное возбуждение. Наиболее распространённые конфигурации — это микроскопия с полным внутренним отражением (TIRF)2 и высоконаклонное ламинированное оптическое освещение (HILO) 3. TIRF снижает фоновую флуоресценцию, создавая эванесцентное поле, которое избирательно возбуждает флуорофоры в пределах нескольких нанометров от скольжения покрытия, тем самым подавляя освещение вне фокуса. Однако это ограничение делает TIRF непригодным для визуализации более глубоких биологических структур, таких как органеллы, проникающие во внеклеточный домен. Микроскопия HILO обеспечивает большую глубину проникновения, позволяя визуализировать несколько сотен нанометров над стеклянной подложкой. Это происходит за счёт уменьшения поля зрения (FOV)4 и неравномерного освещения с всё более высокими плоскостями, что ограничивает его применимость для крупных клеточных структур. В последнее время методы микроскопии с лёгким листовым листом (LSM), такие как решетчатый световойлист 5,6,7 и однообъективная микроскопия освещения с одной плоскостью (soSPIM)8, расширили SMLM на объемную и тканевую визуализацию. Формируя пучок возбуждения в тонкие, структурированные световые слои, LSM достигает оптического сечения с уменьшением фона и фототоксичности. SoSPIM фиксирует фокальные плоскости, ортогональные оси обнаружения, за одну экспозицию, обеспечивая быструю объемную съёмку с почти изотропным разрешением. Приложение soSPIM продемонстрировало 3D SMLM в целых клетках и мелких органеллах (глубина >20 мкм) с изотропным разрешением до 40 нм и с минимальным фоновым размытымфоном 9. Несмотря на свои преимущества, эти методы обычно требуют прозрачных образцов, специализированной оптики и сложного выравнивания, и остаются чувствительными к оптическим аберрациям и рассеянию в более толстых образцах.

Конфокальная микроскопия предлагает альтернативу, отбрасывая неразфокусированный свет с помощью отверстия перед детектором, в сочетании с зеркалами для сканирования луча10. Эта оптическая возможность секционирования позволяет проводить глубокие объемные изображения с высоким SNR. В частности, вращающаяся дисковая конфокальная (SDC) микроскопия сочетает скорость и широкоугольное обнаружение традиционной визуализации с возможностью секционирования систем точечного сканирования. В традиционном SDC это достигается за счёт включения вращающегося диска с параллельными отверстиями, часто в сочетании с выровненной микролинзовой решеткой. Микролинзы собирают значительную часть излучаемой флуоресценции и фокусируют её через отверстия, что снижает фоновый сигнал. Эта конфигурация обеспечивает быструю оптическую секционизацию без необходимости специализированной оптики или дополнительной подготовки к монтажу образцов, что делает её надёжным выбором, который легко реализуется и оптимизируется для глубокого объемного SMLM-сбораизображений 11.

В этом исследовании используется вращающийся дисковый конфокальный сканер CSU-W1, оснащённый оптическим фотонным переназначением (SDC-OPR). В отличие от стандартного SDC, SDC-OPR вводит вторую микролинзовую решетку, которая проецирует излучаемые фотоны на комплементарный узор12, чтобы минимизировать рассеяние и восстановить фотоны, которые иначе были бы отброшены. Такое перераспределение фотонов эффективно усиливает функцию точечного рассеяния (PSF), повышая боковое разрешение за пределы обычного SDC, при этом отвергая расфокусированныйсвет 13. В частности, микролинзовая решетка SDC-OPR перенаправляет фотоны вне оси к их ближайшим точкам происхождения, эффективно увеличивая зафиксированную яркость флуоресценции по сравнению со стандартным SDC. Кроме того, преимущества разрешения SDC-OPR можно усилить с помощью деконволюции изображения. Итеративные алгоритмы деконволюции вычислительно совершенствуют PSF, уменьшают фоновый режим и улучшают соотношение сигнал/фон без необходимости изменений в оптической конфигурации. Этот комбинированный подход обеспечивает значительное преимущество в точности локализации по сравнению со стандартным SDC для экспериментов по локализации одноймолекулы 14.

Здесь представлен надёжный и воспроизводимый протокол для одномолекулярной локализационной микроскопии с использованием вращающегося дискового конфокального микроскопа с оптическим перераспределением фотонов (SDC-OPR). Этот подход сочетает наноточную точность DNA-PAINT со скоростью, точностью зрения и глубины проникательства вращающихся дисков. DNA-PAINT, адаптация точечного накопления для наномасштабной топографии визуализации (PAINT)15, основана на временной гибридизации флуоресцентно маркированных «имиджерных» цепочек с комплементарными «стыковыми», закреплёнными к молекулярным мишеням. Эти обратимые события связывания генерируют стохастические флуоресцентные сигналы, которые можно точно локализировать, что позволяет осуществлять высокоразрешающую реконструкцию клеточной ультраструктуры. DNA-PAINT позволяет использовать высокостабильные флуорофоры, обеспечивает настраиваемую кинетику связывания для точного контроля условий визуализации и смягчает фотоотбеливание за счёт непрерывного пополнения цепочек флуоресцентногоимиджера 16.

Для обеспечения воспроизводимости и специфичности подход основан на индивидуальных конъюгатах ДНК-антитела, которые связывают стыковочные цепи с вторичными антителами. Представлены подробные этапы подготовки образцов, включая конъюгирование антитела и ДНК, для поддержки надёжных экспериментальных результатов. Протокол валидируется на хорошо охарактеризованных клеточных структурах, таких как ядерные поровые комплексы (NPC)17 и микротрубочки в фиксированных образцах, что служит ориентиром для оценки точности реконструкции. Вариации разрешения, количественно измеряемые точностью локализации как прокси, дополнительно оцениваются в зависимости от поля зрения и глубины изображения.

Кроме того, эффективность этого рабочего процесса для мультиплексированной визуализации демонстрируется с помощью стратегииExchange-PAINT 18 — стратегии, позволяющей последовательно визуализировать несколько целей с одним и тем же красителем и одним лазерным источником на основе DNA-PAINT. Рабочий процесс Exchange-PAINT применяется к многоцветной сверхразрешающей съёмке митохондрий, микротрубочек и NPC в одном образце.

В совокупности этот протокол предоставляет комплексные рекомендации и ключевые рекомендации по адаптивности по конъюгации антитела и ДНК, подготовке образцов, условиям визуализации и анализе данных, позволяя исследователям проводить воспроизводимые ДНК-PAINT изображения на SDC-OPR. Расширяя высокоразрешающую визуализацию за пределы ограничений глубины и точки зрения подходов на основе TIRF, этот метод расширяет применимость SMLM в широком спектре биологических контекстов.

Протокол

Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка буферов

  1. Подготовка буфера цитоскелета (CB):
    1. Приготовьте 10 мМ MES (pH 6,1) с 150 мМ NaCl, 5 мМ EGTA, 5 мМ D-глюкозы и 5 мМ MgCl2 в 1x фильтрованном растворе фосфатного буфера (PBS).
    2. Храните при 4 °C и фильтруйте перед использованием.
  2. Подготовка бульонной кислоты 40x с протокатехуиновой кислотой (PCA):
    1. Растворите 154 мг PCA в 10 мл дистиллированной фильтрованной воды.
    2. Отрегулируйте pH до 9.0 с NaOH.
    3. Нанесите аликвот и храните при -20°C максимум 6 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если какой-либо аликвот выглядит коричневым, выбросьте его, так как это указывает на окисление.
  3. 100x протокатехуат-3,4-диоксигеназная (PCD) подготовка:
    1. Приготовьте раствор 50% глицерина с 50 мМ KCl, 1 мМ EDTA и 100 мМ Tris буфера.
    2. Растворить 2,2 мг PCD в 3,4 мл раствора глицерина.
    3. Аликвот и хранить при -20 °C максимум 6 месяцев.
  4. 100x подготовка приклада Trolox:
    1. Растворить 50 мг тролокса (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота) в 215 мкл метаноле до тех пор, пока раствор не станет зелёным в химическом выхлопчике, используя соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
    2. Добавьте 1,6 мл дистиллированной, фильтрованной воды. Дайте раствору побелеть и начать затвердевать.
    3. Добавьте 175 мкл 1M NaOH 1M. Дайте раствору снова стать жидким.
    4. В объёмах 10 мкл продолжайте добавлять 1 M NaOH, пока раствор полностью не прояснится (около 40 мкл).
    5. Аликвот и хранить при -20 °C максимум 6 месяцев. Окончательный раствор выглядит желтоватым.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Финальный раствор с 100x имеет pH 11, но разбавление до 1x даёт pH 7-8.
  5. Buffer C+
    1. Приготовьте 1 мМ EDTA, 500 мМ NaCl и 0,02% раствора Tween-20 в 1x PBS.
    2. Регулируйте pH до 7.4 с помощью HCl и/или NaOH по мере необходимости.
    3. Опциональное дополнение к тролоксу: добавьте необходимые объёмы запасов PCA (40x), PCD (100x) и Trolox (100x) для 1x разбавления, оставьте раствор на равновесие в течение 1 часа при комнатной температуре (23 °C) перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте свежие блюда каждую неделю. Если используете Trolox, используйте его в течение 4 часов после смешивания.
  6. Буферы иммунного окрашивания (параформальдегид, ПФА, глицин и тритон):
    1. Для подготовки 4% PFA из ампулы 16% PFA объёмом 10 мл:
      1. Внутри химического вытяжки аккуратно откройте ампулу.
      2. Декантировать 10 мл 16% PFA в коническую центробежную трубку объёмом 50 мл.
      3. Проведите разбавление 1:4 в 1x PBS, чтобы получить 4% PFA, аккуратно добавляя ~30 мл 1x фильтрованного PBS к декантированному 16% PFA, чтобы итоговый объём составил ~40 мл.
      4. Аликвот в микроцентрифугные трубки объемом 1 мл и храните при -20 °C до необходимости.
    2. Для 60 мМ глицина в приготовлении PBS:
      1. Взвесить 225 мг глицина в коническую центробежную трубку объёмом 50 мл.
      2. Добавьте 50 мл 1x фильтрованного PBS.
      3. Вихрь до полного смешивания и фильтруй.
      4. Храните при 4 °C до необходимости.
    3. Для подготовки Triton X-100 с концентрацией 0,1%:
      1. Сначала подготовьте рабочий бульон из 10% Triton X-100, разбавляя 1 мл 100% Triton X-100 в 9 мл 1x фильтрованного PBS (конечный объём = 10 мл), используйте пипетку и медленно перемешивайте, чтобы предотвратить избыточное пузырение. Храните при 4 °C до необходимости.
      2. Из 10% рабочего запаса добавьте 0,1 мл 10% Triton X-100 до 9,9 мл 1x фильтрованного PBS для 0,1% готового запаса, снова медленно смешивайте. Храните при 4 °C до необходимости.

2. Конъюгация антитела и ДНК

  1. Концентрируйте антитело с помощью центробежного фильтра с ультрафильтрацией мощностью 100 кДа:
    1. Промыть ультрафильтрационный центробежный фильтр мощностью 100 кДа с 100 мкл 1x фильтрованного PBS в течение 30 минут при 14 000 x g, 4 °C.
    2. Добавьте 100 мкл антитела с 200 мкл 1x фильтрованного PBS к предварительно промытому центробежному фильтру мощностью 100 кДа, отварите 30 минут при 14 000 x g, 4°C. Убедитесь, что концентрация антител превышает 1,5 мг/мл после концентрации с ультрафильтрационным центробежным фильтром. При этом методе центробежный фильтр ультрафильтрации обычно концентрирует антитело в ~3 раза.
    3. Инвертируйте центробежный фильтр мощностью 100 кДа в чистую трубку, открутите 6 минут при 1000 x g, 4 °C. Это концентрированное антитело в ПБС.
    4. Измерьте объём концентрированного антитела (1 или 2 мкл) для вычисления новой концентрации и проведите спектры абсорбции UV-Vis с помощью микрообъёмного спектрофотометра UV-Vis. Установить фон на 1x PBS и сохранить спектры.
  2. Уменьшите тиолированную цепь стыковки ДНК:
    1. Растворите 7,7 мг предварительно взвешенного DTT в 100 мкл фильтрованной воды и переведите в свежую трубку.
    2. Добавьте 100 мкл 3 мМ EDTA в 1x PBS к исходной трубке DTT, вихрь и перенесите на ту же трубку, что и на шаге 2.2.1, получив 200 мкл 250 мМ DTT при 1.5 мМ EDTA в 1x PBS.
    3. Растворить тиолированную цепь стыковки ДНК в 1x отфильтрованной PBS для конечной концентрации 1 мМ. Запишите спектры UV-Vis раствора цепи стыковки ДНК (разбавленный до 10 мкм в 1x PBS) и сохраняйте его с помощью микрообъёмного спектрофотометра UV-Vis.
    4. Смешайте 13 мкл тиолированной ДНК (1 мм) с 30 мкл ДТТ (250 мм), встряхивайте 2 часа при комнатной температуре (23 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Любые оставшиеся неиспользованные сыпочные цепи ДНК храните в аликвотах 13 мкл при -20 °C для будущих реакций.
  3. Конъюгация антител к кросслинкеру:
    1. Растворить перекрёстный сшиватель малеймид-ПЭГ2-сукцинимидилэфира в DMSO до 10 мг/мл (23,5 мМ). Храните в аликвотах по 10 мкл при -20 °C до необходимости.
    2. Смешайте концентрированные антитела из шага 2.1 с 20-кратным молярным избытком кросслинкера. Инкубировать 90 минут, встряхивая, при 4 °C.
  4. Очистить фильтрацию антител-кросслинкер с помощью спин-десолевой колонки 7,0 кДа, содержащей смолу с исключением размера (отсечение молекулярной массы 7 кДа):
    1. Снимите нижнюю защитку колонны для десолизации 7,0 кДа и ослабьте крышку. Поместите его в микроцентрифугу с низким уровнем связывания белка. Центрифуга в течение 1 минуты при 1500 x g, 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отметьте наклон смолы после первого вращения. Для всех последующих применений колонки размещайте наклон, обращённый прямо наружу, на центрифугу. Наносите образцы и промывки в центр и избегайте контакта с смоляным слоем.
    2. Добавьте 300 мкл 1x фильтрованного PBS в колонку спин-десолевой колонки мощностью 7,0 кДа, ослабьте крышку, проведите центрифугу на 1 минуту при 1500 x g, 4 °C. Повторите ещё дважды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте колонку спин-десолизации 7.0 KDa с 300 мкл 1x PBS до готовности реакции антитела и сшивателя; Не допускайте высыхания колонны.
    3. Удалите последние 300 мкл промывки PBS, снова центрифугая на 1 минуту при 1500 г при 4 °C.
    4. Нанесите раствор антитела-сшивателя в центр смоляного слоя по каплею. Поместите колонку для осушивания соли 7,0 кДа в чистую трубку микроцентрифуга, центрифугуйте на 2 минуты при температуре 1500 x g, 4 °C. Продукт антитела-сшивающего теперь находится в пробирке микроцентрифуга; Держите на температуре 4 °C или на льду.
  5. Очистить смесь ДНК-ДТТ с помощью обезсоливающих спиновых колонок с помощью Sephadex G-25 (смола с исключением размера для очистки ДНК):
    1. Вихрь десоливающих спиновых колонн (очистка ДНК), чтобы смола равномерно распределялась. Снимите нижнюю крышку, ослабьте крышку и поставьте её в чистую трубку микроцентрифуга.
    2. Центрифуга очищает спин-колонки (очистка ДНК) при 735 x g в течение 1 минуты для удаления буфера хранения.
    3. Поместите спин-колонки для очистки ДНК для обезсоли в свежую микроцентрифугную трубку и медленно добавляйте смесь ДНК/ДТТ в центр смолы. Центрифугу при 735 x g в течение 2 минут. Очищенная, восстановленная ДНК теперь будет находиться в микроцентрифугной трубке.
  6. Комбинировать продукты ДНК и антитела-кросслинкера:
    1. Добавьте восстановленную ДНК в продукт антитела-кросслинкера при 10-кратном молярном превышении ДНК:антитела. После очистки смешайте очищенную ДНК с продуктом антитела-кросслинкера. Это предотвращает повторное связывание ДНК.
    2. Инкубировать на ночь, встряхивая, при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте ДНК и антитела поздно днём и очищайте их сразу на следующее утро. Длительное инкубирование ДНК и антител может привести к высокому соотношению ДНК:антитела.
  7. На следующее утро удалите избыточную ДНК с помощью центробежного фильтра с ультрафильтрацией мощностью 100 кДа:
    1. Промыйте ультрафильтрационный центробежный фильтр мощностью 100 кДа с 300 мкл 1x фильтрованного PBS в течение 30 минут при 14 000 x g, 4 °C.
    2. Добавьте смесь ДНК-антитела с 300 мкл 1x фильтрованного PBS в центробежный фильтр на 100 кДа ультрафильтрационного фильтра и отварите 30 минут при 14 000 x g, 4 °C.
    3. Инвертируйте ультрафильтрационный центрифужный фильтр в чистую трубку, вращите 6 минут при 1000 x g, 4 °C. Это концентрированный продукт в PBS.
    4. Разведите продукт до 100 мкл в 1x фильтрованном PBS.
    5. Запишите UV-Vis спектры продукта (1 или 2 мкл) с помощью микрообъёмного спектрофотометра UV-Vis с фоном 1x PBS и сохраняйте спектры.
    6. Измерьте конечную концентрацию и соотношение ДНК:антитела по спектрам. Наблюдайте сдвиг пика поглощения антитела с 280 нм на 260 нм из-за дополнительного поглощения ДНК. Используйте шаг 2.8 для определения концентрации и соотношения ДНК:антитела.
    7. Храните продукт в исходных условиях хранения используемого антитела. Если вы замерзаете, избегайте циклов заморозки и оттаивания.
  8. Рассчитайте соотношение ДНК:антитела по спектрам УФ-ВИС:
    1. По спектрам чистой ДНК (10 мкм в 1x PBS) измеряйте значения поглощения на 260 нм (Уравнение 1) и 280 нм (Уравнение 2). Разделим их на концентрацию ДНК (10 мкм), чтобы найти молярные коэффициенты поглощения ДНК (Уравнение 3 и Уравнение 4).
    2. Повторяйте, чтобы антитело нашло Уравнение 5 и Уравнение 6, не забывая делить на концентрацию антител, используемых для спектров.
    3. Из продуктовых спектров абсорбция на 260 нм и 280 нм зависит как от поглощения ДНК, так и от антитела:
      Уравнение 7
      Уравнение 8
      Где cDNA и cAb — это концентрации ДНК и антитела соответственно в конечном продукте. Решите эти уравнения одновременно, чтобы определить молярную концентрацию как ДНК, так и антитела внутри продукта. Вычислите соотношение ДНК к антителам, используя эти концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию антитела для первых спектров можно рассчитать, измерив объём антител, оставшийся после фильтрации, с ультрафильтрационной центробежной фильтрацией 100 кДа, и сравнив это с исходным объёмом (с известной концентрацией) использованного антитела.

3. Клеточная культура

  1. Клетки HeLa Kyoto mEGFP-Nup107.
    1. Приготовьте запас клеточной культурной среды — Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), дополненную 10% плодовой бычий сывороткой (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина (P/S), и храните при 4 °C. Предварительно разогрейте среду за 30 минут до использования в водяной бане при температуре 37 °C. В зависимости от условий труда рекомендуется использовать аликвот и фильтровать необходимое количество для предотвращения загрязнения.
    2. Семенные клетки в размере 2 x 105 клеток/мл в 7 мл предварительно нагретого дополнительного DMEM-медиа в термоколбах T25. Поместите колбы в подходящий инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 .
    3. Обеспечивайте проход каждые 48-72 часа, чтобы избежать переполнения.
      1. Возьмите термофлягу T25 с культурой слияния и аспирируйте среду из фляги.
      2. Пипетка 1 мл трипсина EDTA (TE), обеспечивая полное покрытие путём аккуратного наклона колбы. Инкубировать при 37 °C в течение 7 минут, чтобы клетка отделилась от колбы.
      3. Добавьте 2 мл дополнительного материала DMEM и тритурайте.
      4. Переместить суспензию клетки в коническую центробежную трубку объемом 15 мл с дополнительными 7 мл дополнительной среды DMEM.
      5. Центрифугуйте при 400 г в течение 5 минут. Тщательно проверяйте образование гранул внизу трубки, не нарушая её.
      6. Аспирируйте среду и реуспензуйте клеточную гранулу в дополненной среде DMEM.
      7. Семена 2 x 105 клеток/мл в новую колбу T25 с 7 мл предварительно нагретой среды. Инкубировать при 37 °C и 5%CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если не уверены в плотности клеток, можно использовать гемоцитометр для определения количества клеток. Рекомендуется начинать с ресуспензии на гранулах объемом 1 мл перед началом подсчёта.
  2. Ячейки U2OS CRISPR mEGFP-Nup96
    1. Подготовьте 10% FBS и 1% P/S, дополненные медиа McCoy 5A, согласно шагу 3.1.1.
    2. Семенные клетки в размере 2 x 105 клеток/мл в 7 мл дополнительной среды McCoy 5A в колбах T25. Инкубировать при 37 °C и 5%CO2.
    3. Проходите каждые 48 часов, чтобы рост культур был ниже 80% от слияния:
      1. Аспирируйте медиа из колбы и аккуратно промой прилипший посев 2 мл фильтрованного предварительно подогреного (37 °C) 1x PBS.
      2. Аспирируйте PBS и добавьте 2 мл аккутазы, медленно наклоняя колбу для полного покрытия, затем инкубируйте при 37 °C в течение 7 минут.
      3. Добавьте 2 мл дополнительного медиа McCoy 5A и тритурат.
      4. Добавьте 7 мл среды в суспензию ячейки и перенесите его в коническую центробежную трубку объёмом 15 мл или 50 мл для центрифуга. Центрифугуйте при температуре 400 г в течение 5 минут и проверьте образование гранул на дне трубки.
      5. Подвесьте клеточную гранулу в дополненном медиа McCoy 5A.
      6. Семена в 2 x 105 клеток/мл в новую колбу T25 с предварительно подогретой средой 7 мл. Инкубировать при 37 °C и 5%CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Разогрейте все растворы, добавленные в клетки, до 37 °C в водяной или бусинной ванне. Для Аккутазы нагревайте только 2 мл аликвот не более 5 минут, чтобы избежать разрушения.

4. Иммунокрашивание Nup96, митохондрий и микротрубочек

  1. Подготовка ячеек U2OS mEGFP-Nup96
    1. Следуя шагам, описанным в шаге 3.2, аспирируйте медиа из колбы T25 и аккуратно промывайте прилипшие клетки 2 мл 1x фильтрованного PBS.
    2. Аспирируйте PBS и добавьте 2 мл аккутазы, медленно наклоняйте колбу вверх и вниз и инкубуйте при 37 °C в течение 7 минут для стимулирования отслоения клеток.
    3. Добавьте 2 мл дополнительного медиа McCoy 5A и тритурат.
    4. Верхняя ячейка с 7 мл дополнительной среды McCoy 5A и переносит его в коническую центробежную трубку объемом 15 мл или 50 мл перед центрифугой при 400 x g в течение 5 минут. Снова проверьте образование гранул на дне трубки.
    5. Подвесьте клеточную гранулу в дополненном медиа McCoy 5A.
    6. Семенные клетки в размере 1 x 105 клеток/мл в 8-ядровых микрослайдах и инкубируют в инкубаторе клетки (37 °C, 5%CO2) на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Семенные клетки — за 24 часа до фиксации и процедур иммунного окрашивания, чтобы обеспечить присоединение.
  2. Иммунокрашивание клеток U2OS mEGFP-Nup96 для изображения Nup96
    1. После ночной инкубации замените медиа McCoy на 5A в 8-ядренных микрослайдах на 1x фильтрованный PBS. Быстро аспирируйте PBS и добавьте предварительно нагретый (37 °C) раствор фиксации PFA 4% в химический вытяжной вытяжка.
    2. Дайте ячейкам зафиксироваться на 30 минут при комнатной температуре (23 °C), желательно в химическом выхлопчике, прежде чем ПФА будет промыта и отходы выброшены. Все этапы теперь можно выполнять при комнатной температуре, если не указано иное.
    3. Удалите раствор фиксации PFA с 4% и помойте стекло 3 раза 3 минуты с помощью 1x PBS.
      ВНИМАНИЕ: Используйте PFA в капюшоне с химическими выпарителями, одновременно нося подходящие средства защитной защиты.
    4. После фиксации пропустите мембрану клетки, добавив 0,1% тритона X-100 в 1x раствор PBS. Дайте постоять 5 минут, затем промыйте 3 x 3 минуты с 60 мМ глицином в 1x PBS, чтобы закалить автофлуоресценцию остаточного PFA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор для проницаемости тритона чрезвычайно чувствительн к времени и может нарушить целостность структуры клетки, если оставить его слишком долго.
    5. Добавьте 5% BSA в 1x PBS на 1 час в темноте, чтобы блокировать клетки перед началом иммунного окрашивания.
    6. Приготовьте 20 нМ ДНК-конъюгированного анти-GFP наноне в блокирующем растворе (5% BSA в 1x PBS), чтобы предотвратить неспецифическое блокирование связывания. Инкубируйте стекло с смесью Nanone 1 час при комнатной температуре (23 °C), затем промывайте несвязанные ДНК-цепи 3 x 3 минуты с помощью 1x фильтрованного PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точка паузы: после фиксации, блокировки и добавления антител образцы можно хранить при 4 °C на ночь. Эта точка паузы включена в первую очередь из-за времени, необходимого для подготовки образца, а не из-за строгой необходимости протокола. Визуализация может быть проведена сразу после этих этапов, если это желательно.
  3. Иммунокрашивание клеток U2OS mEGFP-Nup96 для визуализации митохондрий и микротрубочек
    1. После ночной инкубации одновременно замените среду DMEM в 8-ядровых микрослайдах на 200 мкл 0,3% глутаральдегида и 0,25% тритона X-100 в буфере цитоскелета (CB) и оставите на 2 минуты для предварительной фиксации.
    2. Замените раствор префиксации на буфер цитоскелета (CB), дополненный 2% глутаральдегида. Дайте постоять 10 минут для фиксации клеток, затем промыйте стекло 3 x 3 минуты с 60 мМ глицином в PBS, как в шаге 4.2.4.
      ВНИМАНИЕ: Используйте глутаральдегид в капюшоне с химическими выпарениями, одновременно нося соответствующую СИЗ.
    3. Добавьте срезанную сперматозоидную ДНК лосося в 3% BSA в 1x PBS в течение 1 часа в темноте, чтобы блокировать клетки перед иммунной окрашиванием.
    4. Добавьте 5 мкг/мл ДНК-конъюгированного антитубулина (конъюгированного, как описано выше) для микротрубочной визуализации и/или антитела 1:200 TOM20 для визуализации митохондрий в 2% BSA в течение 2 часов при комнатной температуре (23 °C). Мойте 3 x 3 минуты с 1x PBS.
    5. Добавьте 25 нм ДНК-конъюгированного SDAB анти-кроличьего IgG и инкубировать 1 час при комнатной температуре (23 °C). Мойте 3 x 3 минуты с 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точка паузы: после фиксации, блокировки и добавления антител образцы можно хранить при 4 °C на ночь. Эта точка паузы включена в первую очередь из-за времени, необходимого для подготовки образца, а не из-за строгой необходимости протокола. Визуализация может быть проведена сразу после этих этапов, если это желательно.
  4. Подготовка клеток HeLa Kyoto mEGFP-Nup107
    1. Аспирируйте среду из колбы T25 клеток HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 и аккуратно промой колбу 2 мл 1x фильтрованного PBS.
    2. Аспирируйте PBS, добавьте 2 мл трипсин EDTA (TE), медленно наклоняйте колбу вверх и вниз, инкубуйте при 37 °C в течение 7 минут.
    3. Добавьте 2 мл дополнительного материала DMEM и тритурайте.
    4. Добавьте раствор клетки в коническую центробежную трубку объёмом 15 мл с дополнительными 7 мл дополнительной среды DMEM и центрифугу при 400 х г в течение 5 минут. Проверьте образование гранул внизу трубки.
    5. Суспензируйте клеточную гранулу в дополненной среде DMEM.
    6. Семенные клетки в размере 1 x 105 клеток/мл в 8-ячественных микрослайдах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Семенные клетки за 24 часа до проведения визуализации.
  5. Иммунокрашивание HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 для микротрубочек
    1. После ночной инкубации одновременно замените среду DMEM в 8-ядровых микрослайдах на 200 мкл 0,3% глутаральдегида и 0,25% тритона X-100 в буфере цитоскелета (CB) и оставите на 2 минуты для предварительной фиксации.
    2. Замените раствор предварительной фиксации на 2% глутаральдегида в CB и оставьте на 10 минут для фиксации клеток. Мойте 3 x 3 минуты с 60 мМ глицина в 1x PBS.
      ВНИМАНИЕ: Используйте глутаральдегид в капюшоне с химическими парами, одновременно нося соответствующие средства индивидуальной защиты.
    3. Добавьте 5% BSA в 1x PBS на 1 час в темноте, чтобы блокировать клетки перед началом иммунного окрашивания.
    4. Добавьте 5 мкг/мл ДНК-конъюгированного антитубулина (конъюгированного, как описано выше) для микротрубочки при 5% BSA в 1x PBS в течение 2 часов при комнатной температуре (23 °C). Мойте 3 x 3 минуты с 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точка паузы: после фиксации, блокировки и добавления антител образцы можно хранить при 4 °C на ночь. Эта точка паузы включена в первую очередь из-за времени, необходимого для подготовки образца, а не из-за строгой необходимости протокола. Визуализация может быть проведена сразу после этих этапов, если это желательно.
    5. ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с альтернативными антителами или клеточными линиями корректируйте коэффициенты разбавления для ДНК-связанного антитела или наноНоа согласно рекомендациям производителя.
  6. Подготовка к визуализации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап является общим для всех протоколов иммунного окрашивания.
    1. Добавьте наночастицы золота 90 нм, разбавленные 1:2 в деионизированной воде, непосредственно в каждую скважину, используя полный объём скважины. Инкубировать 5 минут, чтобы обеспечить дальнейшую коррекцию дрейфа во время визуализации. Промывайте колодцы 3 раза с 1x PBS.
    2. Для изображения Nup96 добавьте нужную нитку имиджера с буфером 1 нМ в C+ с дополнением 1x Trolox, 1x PCA и 1x PCD.
    3. Для Exchange-PAINT митохондрий и/или микротрубочок добавьте первую желаемую нитку имиджера на 1 нМ в буфере C+. После первого круга промывайте образец тщательно, но аккуратно, чтобы удалить все остаточные нити имиджера, не двигая образец. Обычно достаточно 5 стирок и 30 секунд ожидания между ними. Затем добавьте вторую нитку имиджера с 1 нМ в буфере C+ только для второго раунда визуализации.

5. Установка и параметры визуализации: микроскопия локализации одной молекулы

ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения, показанные в этом протоколе, были получены в микроскопическом центре LMCB в Университетском колледже Лондона, Великобритания, с использованием коммерчески доступного вращающегося дискового конфокального микроскопа, оснащённого камерой sCMOS и управляемых с помощью программного обеспечения NIS-Elements.

  1. Используйте вращающуюся дисковую конфокальную систему с мультифокальным возбуждением и камеру sCMOS.
  2. Запустите систему за 30 минут до съёмки: включите микроскоп, камеру и лазеры, затем запустите компьютер. Дождитесь, пока программное обеспечение NIS-Elements полностью загрузится.
  3. Выберите подходящий режим изображения в NIS-Elements: стандартный вращающийся диск с конфокальным разрешением или SDC-OPR SoRA с суперразрешением, перед установкой параметров получения.
  4. Выберите 60× масляный иммерсионный объектив Apo NA 1.49 для изображения SDC или SDC-OPR, чтобы максимально эффективно обнаруживать события с одной молекулой и улучшать постобработку.
  5. Выберите соответствующее увеличение (1×, 2,8× или 4×) исходя из объектива, настроек камеры и изучаемого образца. Соответственно скорректируйте блокировку камеры: 1× биннинг для 1× увеличения, 2× биннинг для 2,8× и 4× биннинг для 4×. Для этой конфигурации это соответствует эффективным размерам пикселей 108 нм для 1× (без биннинга) или 4× (4× биннинга), и 78 нм для 2,8× (2× биннинга). Для получения размеров пикселей, подходящих для SMLM, требуется бинирование, примерно соответствующее стандартному отклонению PSF (обычно 100–150 нм)19,20.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие увеличения (2,8× или 4×) увеличивают плотность мощности лазера, улучшая равномерность освещения. Это уменьшает поле зрения, поэтому биннинг должен корректироваться пропорционально (например, бинирование 2× для увеличения 2,8×; 4× бинирование для 4× увеличения) для сохранения размера пикселя.
  6. Установите время экспозиции для получения DNA-PAINT и синхронизируйте его со скоростью вращения вращающегося диска (регулируемой с панели CSU-W1). Убедитесь, что скорость вращения кратна времени экспозиции, или нажмите кнопку Sync, чтобы автоматически совпадать с максимально совместимыми оборотами. Проверьте экран на наличие полосатых артефактов, так как это указывает на несинхронизированные настройки. Для представленных здесь экспериментов использовалось время экспозиции 300 мс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость вращения SDC-блока, вращающихся и синхронизированных дисков SoRa с микролинзами, влияет на профиль возбуждения пучка, что влияет на среднее распределение плотности мощности по освещённой области. По этой причине может потребоваться более длинное время экспозиции, чем для TIRF-установок.
  7. Настройте длину волны лазера, мощность и колесо фильтра (NIS-Elements порекомендует подходящий фильтр). Длина волны лазера определяется спектром красителя имиджера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе использовался Cy3B, который оптимально возбуждается с помощью лазера с частотой 561 нм. Cy3B обеспечивает лучшее соотношение сигнал/фон для DNA-PAINT, что делает его предпочтительным выбором для этого применения.
  8. Регулировать мощность лазера через лазерную площадку (0%-100%). Для ДНК-PAINT визуализации установите лазер на максимальную мощность (100%). Для этой системы это соответствует 1,75 мВт (≈ 65 Вт/см 2) после объектива для увеличения 4×, 3 мВт (≈ 50 Вт/см2) для 2× и 5 мВт (≈ 15 Вт/см 2) для 1×.
    1. Для записи мощности после объектива используйте откалиброванный лазерный измеритель мощности и разместите датчик на ступени микроскопа как можно ближе к месту, где должна находиться плоскость образца. Старайтесь избегать контакта с объективом. Записывайте питание для каждой используемой конфигурации.
  9. Нанесите каплю погружного масла на чистый масляный объектив Apo NA 1.49 60×.
  10. Закрепите подготовленный образец (из шагов 4.2–4.5) на сцене с помощью ступеневого адаптера. Это важно для минимизации дрейфа при получении изображения и предотвращения перемещения при обмене буферами, особенно в многоцветных экспериментах.
  11. Переключитесь в режим яркого поля в выбранном методе изображения и сосредоточьтесь на стеклянной плоскости, используя наночастицы в качестве ориентира. Активируйте систему идеальной концентрации (PFS). PFS или аналогичная система для поддержания фокуса на протяжении всего времени приобретения имеют решающее значение, поскольку дрейф в осевом направлении не может быть исправлен постобработкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Nikon PFS поддерживает резкий фокус образца, постоянно контролируя и регулируя расстояние между фиксированной опорной плоскостью и фокальной плоскостью образца с помощью смещённой линзы и линейного CCD-детектора. Работая независимо от получения изображения, система корректирует дрейф фокуса в реальном времени (~миллисекунды).
  12. При активном PFS выберите интересующую плоскость изображения. Для клеток U2OS mEGFP-Nup96 или клеток HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 используйте сигнал 488 GFP от NPC, помеченных GFP, чтобы определить наиболее плоскую клетку и оптимальную фокальную плоскость. Используйте низкую мощность лазера (~10% от максимальной мощности лазера) на этом этапе, чтобы избежать фотоотбеливания.
  13. Определите название и путь сохранения эксперимента. Отметьте галочку Time , чтобы установить интервал, продолжительность и количество циклов. Для непрерывного приобретения установите интервал на No Delay и введите только количество циклов, соответствующее общему количеству кадров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что блок PFS внизу выбран, затем нажмите Run. Программное обеспечение автоматически предоставит приблизительную продолжительность эксперимента и сохраняет данные после его завершения. Чтобы остановить эксперимент до его завершения, нажмите Finish, чтобы сохранить текущий прогресс, или Abort, чтобы завершить эксперимент без сохранения.
  14. Для первого белка получите 17 000–20 000 кадров с временем интеграции 300 мс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию нити имиджера необходимо оптимизировать на этом этапе, чтобы сигналы отдельных молекул не перекрывались, при этом обеспечивая достаточные локализации для реконструкции. Этот процесс похож на типичный SMLM-набор, где концентрация имиджера корректируется для достижения достаточного количества событий для реконструкции при минимизации наложения. Оптимальная концентрация зависит от структуры, которая снимается. Например, сильно маркированные структуры, такие как микротрубочки, обычно требуют более низких концентраций имиджера (менее 1 нм).
  15. Аккуратно уберите буфер для следующего белка с помощью пипетки, стараясь не нарушать образец. Во время мониторинга образца через камеру микроскопа аккуратно добавьте 200 мкл буфера C+ без имиджера, чтобы промыть первый краситель.
  16. Повторяйте этот шаг, пока не будет обнаружено сигнал флуоресценции от первого раствора ДНК-имиджера (обычно 5 промывок).
  17. Добавьте второй раствор для имиджера и проверьте, что события с одной молекулой обнаружены снова.
  18. Получить 17 000–20 000 кадров с временем интеграции 300 мс для второго белка.
  19. Повторяйте шаги 5.14–5.18 для каждого дополнительного белка, подлежащего изображению.
  20. Для 3D-съёмки используйте z-стеки с расстоянием 0,5–1 мкм по всей высоте ячейки. Это было реализовано с помощью специального протоколаJOB 21 , разработанного для программного обеспечения для получения (элементы NIS), который записывает видео с заранее определённым количеством кадров на определённых позициях z , поддерживая PSF на протяжении всего времени сбора данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программный пакет вместе с подробными инструкциями пользователя представлен в протоколеJOB 21. Также включено полное описание JOB. Программное обеспечение под названием «MultiZ_DNAPaint.bin» можно скачать со вкладки «Материалы» издания. Чтобы запустить JOB, скачайте этот файл и импортируйте его в проводник NIS-Elements JOBS, следуя пошаговым инструкциям.

6. Обработка и анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения сначала обрабатывались с помощью деконволюции с помощью совместимого программного обеспечения, затем анализировали локализацию по одной молекуле с использованием программного обеспечения Picasso, разработанноголабораторией Юнгмана 16.

  1. Откройте стеки изображений ND2 в программном обеспечении NIS-Elements AR.
  2. Для 2D-изображений выберите 2D деконволюцию. Для 3D-изображений повторяйте эту процедуру для каждого отдельного z-стека.
  3. Выберите слепую деконволюцию, эффективную точку 0.01, и установить уровень шума на Noisy. Затем введите скорость возбуждения лазера и излучение — здесь 560 нм и 571 нм соответственно. Другие параметры автоматически получаются из метаданных ND2 для приблизительной оценки функции разброса точки исходного изображения (PSF).
  4. Укажите количество итераций (здесь — 12), выберите Создать новый документ и нажмите Deconvolve. Сохраняйте полученный файл после обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритм итеративно улучшает качество изображения, выполняя операции свёртки, которые уточняют PSF до достижения сходимости или заданного количества итераций. Рекомендуется визуальный осмотр деконвертированного изображения. Требуется регулировка количества итераций в зависимости от вычислительных ограничений и качества изображения.
  5. Загрузите деконпутированный стек изображений в модуль Picasso Localize.
  6. В строке меню выберите «Анализировать → параметры» и введите параметры, специфичные для камеры, согласно спецификациям производителя. Для камеры sCMOS, использованной в этом исследовании (Hamamatsu ORCA-Fusion BT): усиление электромагнитного напряжения: 1, базовое усилие: 100, чувствительность: 0,23 (коэффициент преобразования, электроны/счёт), квантовая эффективность: 0,95 (в зависимости от длины волны возбуждения).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Квантовая эффективность не используется с версии Picasso 0.6.0 и сохраняется только для обратной совместимости.
  7. Установить длину боковой стороны коробки на 7. Длина коробки определяется по формуле [6 × σPSF + 1], где σPSF — стандартное отклонение PSF. Эта оптимизация повышает точность локализации, улучшая разрешение восстановленного изображения.
  8. Выберите подходящий размер пикселя для конфигурации изображения, согласно шагу 5.5 раздела.
  9. Далее выберите подходящий Min. Net Gradient (например, ~1000, в зависимости от выборки) и включите в Preview визуализацию обнаруженных локализований. Проверьте результаты и корректируйте порог градиента по мере необходимости, чтобы минимизировать фоновые обнаружения и обеспечить точную локализацию.
  10. В строке меню выберите Analyze → Localize (Identify & Fit), чтобы начать идентификацию точек и подгонку во всех кадрах фильма. После конкурса этот процесс автоматически сохраняет файлы .hdf5 и .yaml.
    ПРИМЕЧАНИЕ: файл .hdf5 хранит позицию локализации каждой гауссовой посадки и дополнительные параметры. Файл .yaml сохраняет информацию о видео и процедуре анализа, а также может быть проверен с помощью текстового редактора.
  11. Загрузите файл .hdf5 в модуль Picasso Render, чтобы визуализировать восстановленную карту локализации и выполнить коррекцию дрейфа.
  12. В Picasso Render выберите Postprocess → Undrift от RCC. Введите сегментационное значение, начиная с 1000. После завершения появляется рассчитанный график дрейфа xy. Повторять процесс последовательно с более низкими значениями сегментации (например, 500, затем 250), наблюдая постепенное улучшение временного дрейфа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коррекция дрейфа также может выполняться с использованием наночастиц в качестве фидуциальных маркеров; однако при съёмке приподнятых плоскостей сигнал наночастиц может быть незаметен. В таких случаях применяется только коррекция дрейфа с избыточной перекрёстной корреляцией (RCC).
  13. Обязательно сохраните файл, исправленный дрейфом, выбрав File → Save Localizations перед закрытием окна Picasso Render.
  14. Загрузите корректированный дрейф файл с шага 6.13 в модуль Picasso Filter для дополнительных этапов постобработки, установив пороги для метрик качества локализации по одной молекулы, такие как: (i) Точность локализации (lpx, lpy); (ii) ширины PSF (sx, sy); (iii) Количество фотонов; и (iv) любые дополнительные критерии для удаления шума, выбросов или плохо разрешенных пятен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: lpx и lpy (точность локализации в x и y) оценивают неопределённость в локализованном положении пятна вдоль осей x и y и рассчитываются на основе нижней границы Крамера-Рао (CRLB).
  15. Для фильтрации одного свойства выберите соответствующий столбец в заголовке таблицы и выберите График → гистограмму в меню.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор двух столбцов выводит 2D-гистограмму.
  16. Чтобы отфильтровать по конкретному диапазону свойств, кликните и перетащите по нужной области внутри 1D или 2D гистограммы. Выбранный регион будет выглядеть затемненным зелёным цветом, а любые события локализации с значениями вне этого диапазона будут мгновенно исключены из списка локализации.
  17. Фильтруйте данные по фотонам, sx, sy, lpx и lpy, сохраняя только центральный диапазон распределения каждого параметра для сохранения наиболее надёжных локализаций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центральная часть распределения ширины PSF обычно составляет от 0,4 до 1,2 × пикселя. Исключать вторичные распределения, часто вызванные перекрывающимися сигналами или плохо разрешёнными пятнами.
  18. Сохраните отфильтрованные данные, выбрав Файл → Сохранить в меню.
  19. Повторите процесс с шагов 6.1 по 6.18 для всех видео, снятых для каждого решения с изображением изображения.
  20. Откройте отфильтрованный файл в модуле Picasso Render. Интенсивность в этом сверхразрешённом изображении отражает количество локализаций. Контраст можно изменить, выбрав View → Display Settings и изменив значение Max. density.
  21. Чтобы сохранить изображение с суперразрешением одного канала, выберите «Индивидуальная точность локализации» в разделе Blur. Шкала также может быть добавлена из раздела Scale bar.
  22. Для сохранения изображения супер-разрешения всех каналов откройте все обработанные .hdf5-файлы. Цвет каждого канала можно изменить, выбрав в меню View → Files .
  23. Выровняйте все каналы, выбирающие постобработку, → каналы Align.
  24. Выберите Файл → Экспорт полного изображения, чтобы сохранить .png изображение или Файл → Экспортировать текущий вид для определённого масштабирования изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте последовательные методы именования файлов и документации для воспроизводимости. Программное обеспечение Picasso автоматически добавляет суффикс к каждому сохранённому файлу. Метрики Cramer Rao Lower Bound и анализа на основе ближайших соседей (NeNA)22 можно извлечь, выбрав View → Show info из меню. NeNA количественно оценивает пространственное распределение локализованных флуорофоров, оценивая евклидово расстояние между соседними локализациями. В то время как CRLB предоставляет теоретическую нижнюю границу точности локализации на основе статистики фотонов и фоновых шумов, NeNA предлагает экспериментальную оценку точности локализации, полученную непосредственно из самого набора данных. По этой причине NeNA широко используется в SMLM как дополняющая мера к CRLB, поскольку она охватывает не только теоретические пределы, но и практические влияния, такие как коррекция дрейфа, ошибки подгонки и экспериментальная вариабельность. Метрика NeNA извлекается из модуля Picasso Render. CRLB подхода одной молекулы используется для определения точных значений локализации (σSMLM). Указанное значение — это среднее значение между σx и σy для всех локализаций, которые являются модовым значением распределения точности локализации в x и y соответственно.

Результаты

Для демонстрации сверхразрешённых возможностей системы SDC-OPR (рисунок 1A) её разрешение в плоскости было оценено путём проведения экспериментов с использованием ДНК-PAINT визуализации (рисунок 1B) на ядерных поровых комплексах (NPC), которые являются биологической эталоннойструктурой 17. На рисунке 1C показано репрезентативное изображение DNA-PAINT SDC-OPR нуклеопорина 96 (Nup96), помеченное мономерно-усиленным зелёным флуоресцентным белком (mEGFP) и маркированное ДНК-конъюгированными анти-GFP-нанотелами в клетках U2OS. Увеличенные панели показывают субструктуру NUP, а на рисунке 1D показаны парные белки Nup96 (обозначенные стрелками), соответствующие ожидаемой 8-кратной симметрии ядерных пор. На рисунке 1E евклидово расстояние между парами Nup96 измерялось путём их выравнивания и построения гистограммы поперечного сечения суммарного изображения (n = 16 пар). Анализ выявил разделение от пика до пика (13 ± 2) нм (рисунок 1E), что совпадает с результатами ЭМ-моделей, а также HILO и TIR23. Каждое пиковое отклонение показывало стандартное отклонение в 4 нм, что подтверждало высокую точность локализации (σSMLM = 3,3 нм, NeNA = 4,4 нм), достигнутую с помощью DNA-PAINT на SDC-OPR. Примечательно, что эта точность сохранялась на всей площади 53 × 53 мкм² FOV, что является исключительным для систем на основе конфокалов.

Для демонстрации возможности многоцветной визуализации Nup96, митохондрии и микротрубочки в клетках U2OS были промаркированы ДНК для получения с помощьюExchange-PAINT 18. Эта техника использует ортогональные цепочки ДНК-имиджера, конъюгированные с одним флюорофором, что позволяет возбуждать все цели одним и тем же лазерным источником (рисунок 2A). Вместо одновременного приема сигналов они разделены по последовательным раундам визуализации, что облегчает простую интеграцию в любую коммерческую систему SDC-OPR. На рисунке 2B показано Nup96 синим цветом с маркировкой анти-GFP нанотелом, митохондрии красным цветом с вторичным антителом против TOM20 и микротрубочки зелёным цветом с первичным антителом к α-тубулину. Примечательно, что выдающаяся точность локализации одной молекулы, достигнутая для одноцветной съёмки Nup96, была сохранена на всех мишенях в многоцелевом эксперименте, что дало значения точности локализации 3,9 нм для NPC, 4,0 нм для α-тубулина и 3,3 нм для митохондрий (панели 1, 2 и 3 на рисунках 2B ).

Для крупного FOV микротрубочки в клетках HeLa снимались с использованием различных увеличений, доступных в системе SDC-OPR, в сочетании с различными настройками бинирования камеры для поддержания размеров пикселей от 78 нм до 108 нм (рисунок 3). Рисунок 3A показывает цитоскелет микротрубочки 10 клеток HeLa, где цвета отражают точность локализации. При увеличении 1× средняя точность локализации заметно ниже по сравнению с более высокими увеличениями (рисунок 3B-D), при этом наблюдается большая вариативность. Это связано с снижением плотности мощности лазера по сравнению с большим полем зрения, где становится очевиден гауссов профиль освещения, что приводит к снижению точности к краям поля зрения. Тем не менее, достижение средней точности локализации 9,5 нм на обширных 211 × 211 мкм² FOV впечатляет для систем на основе конфокалов и позволяет высокоразрешающее исследование биологической гетерогенности.

Наконец, возможность визуализации целых клеток демонстрируется путем получения ДНК-PAINT-изображений микротрубочек в фиксированных HeLa-клетках с конфокальным объёмом толщиной ~500 нм и z-step 1 мкм с использованием максимального увеличения системы (4×, 53 × 53 мкм² FOV). На рисунке 4A представлены изображения реконструкции одной молекулы для каждой z-плоскости, а также соответствующая точность локализации и значения NeNA. Кроме того, на рисунке 4C представлена 3D-визуализация микротрубочковой сети в ячейке HeLa с помощью цвета. По мере увеличения глубины количество обнаруженных фотонов уменьшается из-за рассеяния и оптических аберраций, что снижает точность локализации как для точности локализации, полученной из нижней границы Крамер-Рао (CRLB) (рисунок 4A, справа), так и для тех, что рассчитываются с использованием метрики NeNA. Тем не менее, высокий уровень сбора фотонов, возможный системой SDC-OPR, позволяет σSMLM ≤ 10 нм для глубины изображения до 9 мкм с узкими распределениями. Действительно, двухстенные нитиобразные микротрубочки были чётко разрешены на различных глубинах: возле границы покров-клетка, в промежуточных осевых позициях и в верхней части клетки, с расстоянием от пика до пика от 30 до 40 нм (рисунок 4C), что соответствует сообщенымзначениям 24. Эти результаты подчёркивают способность SDC-OPR обеспечивать высокоразрешающую визуализацию на больших FOV и по всей высоте клеток.

Рисунок 1
Рисунок 1: Микроскопия локализации одной молекулы в плоскости различных образцов клеток и многоцветная сверхразрешённая визуализация. (A) Схема системы вращающегося диска с оптическим фотонным перераспределением (SDC-OPR), оснащённая микролинзовой решеткой, разработанной для максимального сбора фотонов. (B) Схема DNA-PAINT: флуоресцентно маркированные цепи ДНК, известные как имиджерные цепи, временно гибридизируются с комплементарными последовательностями ДНК (стыковными цепями), которые закреплены с антителом/наноу, нацеленным на интересующий белок. Эти кратковременные события связывания генерируют флуоресцентные сигналы, которые проявляются как стохастическое моргание. (C) Репрезентативное изображение ДНК-PAINT в системе SDC-OPR с использованием 4× увеличения NPC клеток U2OS. Высокоразрешающая способность демонстрируется в вставке, где отдельные NPC чётко разрешены. (D) ДНК-PAINT, усиленная SDC-OPR, позволяет визуализировать отдельные NPC, где белые стрелки подчёркивают характерные пары белков Nup96 внутри архитектуры пор. (E) Распределение измерений расстояний между димерами Nup96 (n=16 пар) в пределах отдельных NPC единиц симметрии. Эта цифра была изменена из Заза и др.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры. 

Рисунок 2
Рисунок 2: Exchange-PAINT для многоцветной съёмки с помощью микроскопа SDC-OPR. (A) Схема Exchange-PAINT трёх целей, изображенных последовательно. Три белковых мишени были маркированы либо антителами, функционализированными ДНК, фрагментами Fab или нанотелами. Нити имиджера Cy3B были снимены последовательно по типу с шагами промывания между кадрами. (B) Трёхцветная визуализация Exchange-PAINT клеток U2OS с использованием микроскопии SDC-OPR с увеличением 4×, показывающая микротрубочки (красные; маркированные ДНК-конъюгированным анти-α-тубулином), митохондрии (зелёный; TOM20-нанотела, направленные на ДНК), и NPC (синий; MEGFP-метированный Nup96 с анти-GFP-нанотелами). Шкала масштаба: 5 мкм. Область увеличения акцентирует внимание на повышенном разрешении, достигнутом в системе SDC-OPR, с акцентом на (1) митохондриях, (2) микротрубочках и (3) NUP. Бары масштаба = 1 мкм. Эта цифра была изменена из Заза и др.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Визуализация ДНК-PAINT в больших полях зрения на микроскопе SDC-OPR. Изображения микротрубочки ДНК-PAINT (маркировка анти-α-тубулинов), полученные при многократном увеличении: (A) 1× увеличение и 1 биннинг (FOV 211 × 211 мкм²), (B) 2,8× и 2 биннинга (FOV 76 × 76 мкм²), (C) 4× увеличения и 4 биннинга (FOV 53 × 53 мкм²). Цвет отражает точность локализации от 0 до 16 нм в случае 1x увеличения и от 0 до 4 нм в остальных случаях. (D) Точность локализации, измеряемая на разных расстояниях (в мкм) от центра поля зрения для увеличений 1× (красный), 2,8× (жёлтый) и 4× (зелёный). Эта цифра была изменена из Заза и др.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Целая клеточная ДНК-РИСУЮЩАЯ визуализация. (A) Слева. Объемная микротрубочка в клетках HeLa с помощью ДНК-PAINT, полученная с помощью SDC-OPR при увеличении 4×, показывающая осевые срезы от z = 0 до 9 мкм (шаги 1 мкм). Каждая плоскость отображает позицию z , точность локализации и метрику NeNA. Масштабные полосы: 5 мкм (xy). Верно. Точность локализации против глубины проникновения для всех самолётов. (B) 3D-рендеринг микротрубочной сети на той же ячейке HeLa, что и в (A). Цвет представляет глубину проникновения от 0 до 9 мкм. (C) Увеличенные изображения выделенных небольших областей каждой глубины проникновения, указанных в (A). Эта цифра была изменена из Заза и др.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Суперразрешающая флуоресцентная микроскопия преодолела дифракционный барьер, значительно повысив пространственное разрешение. Тем не менее, её широкое внедрение в биологических исследованиях сталкивается с постоянными трудностями. В частности, компромиссы между FOV, разрешением и глубиной проникновения затрудняют одновременное оптимизирование всех трёх факторов. Эти задачи были решены с помощью совместных возможностей SMLM и вращающейся дисковой конфокальной микроскопии, усиленных оптическим перераспределением фотонов (SDC-OPR). Интегрировав микролинзовые массивы в стандартную конфигурацию SDC, что позволила коммерческая система SDC-OPR, сбор фотонов был увеличен, а эффективный размер отверстия был уменьшен, что привело к значительному улучшению разрешения. В сравнении со стандартным SDC, система SDC-OPR показала заметное улучшение мощности разрешения, успешно различая элементы, разделённые 10 нм14 в фокальной плоскости, тогда как стандартная SDC могла различать только расстояния более 20нм 11. Эта повышенная способность разрешать подчёркивает преимущество перераспределения фотонов для достижения молекулярного разделения. В частности, точность боковой локализации ниже 2 нм была достигнута на фокальной плоскости (z = 0 мкм), при этом боковая точность оставалась ниже 10 нм на глубинах до 9 мкм, в сочетании с высокоадаптивным FOV 53 × 53 мкм² или 76 × 76 мкм². Даже при большом поле зрения 211 × 211 мкм² система обеспечивала впечатляющую среднюю точность локализации в плоскости 9,5 нм. Эти результаты подчёркивают способность системы обеспечивать высококачественную визуализацию целых клеток.

Что касается реакций сцепления для различных используемых антител, протокол должен тщательно следовать для обеспечения оптимального соотношения антител к ДНК. Превышение этого коэффициента может снизить точность локализации и негативно повлиять на количественные измерения, например, выполненные вqPAINT 25. Поэтому крайне важно проверить соотношение с помощью микрообъёмного UV-Vis спектрофотометра, обеспечивая окончательное соотношение 1:1 между ДНК и антителами.

Критически важным этапом для получения высококачественных сверхразрешающих изображений микротрубочек является правильная фиксация. Традиционные методы фиксации, основанные исключительно на высоких концентрациях ПФА, часто нарушают структуру микротрубочек. Вместо этого использование глутаральдегида (GA) отдельно или в сочетании с PFA значительно улучшает структурнуюсохраненность 26,27.

Для оптимальной визуализации необходим объектив с высокой численной апертурой (NA), чтобы максимизировать сбор фотонов на одно событие одной молекулы. В коммерческой системе SDC-OPR мощность лазера намеренно ниже, чем в традиционных микроскопах TIRF, используемых для SMLM, чтобы минимизировать фотоотбеливание образцов. Хотя DNA-PAINT устраняет проблемы с фотоотбеливанием и теоретически может использовать более высокие лазерные мощности, современные коммерческие системы накладывают ограничения, требующие более длительного времени экспозиции по сравнению с освещением TIRF. Кроме того, поскольку освещение в SDC-OPR является конфокальным, молекулы не возбуждаются непрерывно во время воздействия. В результате требуется более длительное время экспозиции относительно непрерывного освещения TIRF; В этом исследовании использовалось время воздействия 300 мс. Однако в зависимости от требований к разрешению конкретного эксперимента можно использовать более короткие времена интегрирования (например, 150–200 мс) с минимальными потерями разрешения28.

Оптимизация концентрации цепочки имиджера — критически важный шаг для обеспечения того, чтобы одномолекулярные сигналы оставались хорошо разделёнными и при этом сохранялись достаточные локализации для точной реконструкции. Эта корректировка аналогична стандартным SMLM-приобретениям, где баланс между плотностью событий и перекрытием сигналов тщательно контролируется. Оптимальная концентрация имиджера должна корректироваться для каждой отдельной цели. Например, для микротрубочек рекомендуется начальная концентрация нити имиджера менее 1 нМ с необходимыми корректировками.

Поддержание стабильной концентрации во время длительных приобретений крайне важно, так как осевой (z) дрейф нельзя исправить после обработки. Латеральный (xy) дрейф может компенсироваться с помощью RCC или фидуциальных маркеров. В этой системе система Perfect Focus System (PFS) обеспечивает стабильность фокуса в течение нескольких часов съёмок.

В заключение, интеграция SMLM с SDC-OPR предоставляет мощную платформу для высокоразрешающей съёмки в целых ячейках, преодолевая традиционные компромиссы между разрешением, глубиной и точкой зрения. Однако для полной реализации возможностей системы необходимо тщательное внимание к экспериментальным условиям — от конъюгации и фиксации антител до настроек получения и обработки данных. Каждый этап — от подготовки образца до коррекции дрейфа — играет ключевую роль в получении надёжных и высокоточных данных. При тщательной оптимизации протокола этот подход предлагает надёжное и универсальное решение для количественной, наномасштабной визуализации сложных биологических образцов. Ожидается, что этот протокол поможет сообществу внедрить одномолекулярную локализационную микроскопию и получить суперразрешённые изображения с плоскостей образцов, к которым сложно получить доступ с помощью традиционного освещения TIRF или HILO. Обе цели реализуются с помощью коммерчески доступных микроскопов, которые обычно используются в микроскопических центрах по всему миру.

С точки зрения других и будущих применений метод применим как к целым образцам клеток, так и к более сложным образцам тканей на большей глубине визуализации, как было показано в предыдущихисследованиях 14. В отличие от подходов, требующих физического сечения, эта техника позволяет объёмно визуализировать целостные ткани, сохраняя нативную архитектуру и минимизируя артефакты, возникающие при физическом сечении. Использование меньших зондов аффинности, таких как нанотела, дополнительно усиливает проникновение тканей по сравнению с полноразмерными антителами, обеспечивая более равномерную маркировку толстых образцов. Такой подход открывает двери для изучения клеточной организации и молекулярного распределения in situ с более высокой точностью. Помимо этих применений, стратегия также способствует высокопроизводительному скринингу наноструктур и биомолекулярных сборок, что позволяет систематически исследовать структурную гетерогенность и функции. Кроме того, недавние достижения в области DNA-PAINT привели к созданию самозатухающих датчиков изображения, основанных либо на взаимодействиях красителя или красителя(29,30,31), которые эффективно снижают фоновые сигналы, увеличивают интенсивность флуоресценции и улучшают пространственное разрешение, обеспечивая более ускорённую скорость обнаружения. Интеграция этих фторогенных зондов в фреймворк SDC-OPR может дополнительно повысить скорость визуализации и разрешение. Объединение этих достижений с сильными сторонами системы SDC-OPR может расширить её применение к более сложным биологическим образцам, утвердив платформу как гибкий инструмент для детального картирования клеточных и молекулярных структур в широком спектре тканей.

Раскрытие информации

Авторам нечего заявлять.

Благодарности

Эти исследования были профинансированы Организацией программы науки на человеческом фронтире (HFSP) через междисциплинарную постдокторскую стипендию в CZ (LT0025/2023-C) и Исследовательский совет по инженерии и физическим наукам для поддержки M.T. (EP/R513143/1 и EP/W524335/1) и O.P.L.D (EP/R513143/1 и EP/T517793/1). S.S также отмечает Королевское общество через стипендию Дороти Ходжкин (DHF\R1\191019 и DHF\R\251006). Эта работа также была поддержана грантами The Chan Zuckerberg Initiative (2023-321188) и грантами BBSCR (BB/Y513064/1) для S.S.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
(±)-6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислотаMerck 238813-5GТролокс
3,4-дигидроксибензойная кислота Merck 37580-25G-FPCA
60 с лишним раз; Объектив Apo NA 1.49Nikon
7.0 KDA колонна для десолизации спинов, содержащая смолу с исключением размера Fisher Scientific Ltd89882Колонки для десолирования Zeba Spin для шага 2.4
Аккутаза — среда для отслоения ферментных клетокПромо-ячейкаC-41310
Alpaca sdAb (1H1) против GFP в сочетании с кастомной ДНК (sdAB-5'-TCCTCCTCCCCCT-3')Массивная фотоникаИндивидуальный продуктАнти-GFP nanobody для Drosophila
Alpaca sdAb (1H1) анти-GFP в сочетании с ДНКМассивная фотоникаMASSIVE-TAG-Q-FAST анти-GFP - F3Анти-GFP nanobody для NUP
Антиальфа-тубулин (YL1/2)Термо Фишер СайентификMA1-80017
Антикроликовый IgGМассивная фотоникаMassive-sdAB-FAST 2-Plex, вторичный sdAB F2
Против TCRζ (6B10.2)BioLegend644102
Бычий сывороточный альбуминMerck A4503-10GBSA
Коническая центробежная трубка 15 млFisher Scientific Ltd17705004
Коническая центробежная трубка 50 млVWR International734-0448
CSU-W1 SoRaNikonМикроскоп SDC-OPR
Осушивание шиповых колонн Sephadex G-25 (смола с исключением размера для очистки ДНК) и nbsp;Fisher Scientific Ltd11743309Бренд: Cytiva. Столбцы G-25 для шага 2.5
D-глюкозаMerck G8270-1KG
Медиа DMEMТермо Фишер Сайентифик11965092
DMSO, AnhydrousТермо Фишер СайентификD12345
DTT  (Дитиотрейтол)Термо Фишер Сайентифик15976082
EDTAТермо Фишер Сайентифик15575020
EGTAМарк324626
Сыворотка плода для быкаТермо Фишер СайентификA5256701
ГлутаральдегидСерва2311402
ГлицеринMerck G5516-500ML 
ГлицинMP Biomedicals219482580
Maleimide-PEG2-сукцинимидил Merck 746223-50MG
Медиа 5A МаккояFisher Scientific Ltd16600082
MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота)MerckM3671-50G
МетанолFisher Scientific Ltd32213-25L
MgCl2Fisher Scientific Ltd10418464
Микроцентрифугные трубки объёмом 0,5 млFisher Scientific Ltd11508232
Микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 млЭппендорф10509691 
Микрообъёмный UV-Vis спектрофотометрТермо Фишер СайентификND-ONE-WНанодроп
NaCl2Сигма-ОлдричS6546-1L 
Наночастицы 90 нм — золотоЦитодиагностикаG-90-100
CMOS-камера Orca Fusion-BTХамамацу
Пенициллин-стрептомицинТермо Фишер Сайентифик15070063P/S
Физиологический раствор с фосфатным буфером (1 раз)Fisher Scientific Ltd11530546PBS
Pierce 16% формальдегида (w/v), без метанолаFisher Scientific Ltd11586711PFA
хлорид калия Merck   P9541-500G
Протокатехуат 3,4-диоксигеназа и nbsp;Merck P8279-25UN PCD
Натрий  гидроксидFisher Scientific Ltd12963614
Антитела к TOM20AbcamAb186735
Трис-буферVWR InternationalA4577.1000
Triton  X-100   VWR International1086031000
Tween-20Merck P9416-50ML
Ультрафильтрационный центробежный фильтр, 100 кДа MWCOMerck UFC510024Производитель: Amicon Ultra
μ-Слайд 8 Стеклянное дно с высоким колодцемИбидиIB-80807
μ-Стеклянное дно VI 0.5ИбидиIB-80607

Ссылки

  1. Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).
  2. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  3. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  4. Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms. Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).
  5. Kim, J., et al. Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals. Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).
  6. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  7. Wäldchen, F., et al. Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM. Nat Commun. 11 (1), 887(2020).
  8. Zagato, E., et al. Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM). Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).
  9. Galland, R., et al. 3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
  10. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. 236, Springer Science & Business Media. (2006).
  11. Schueder, F., et al. Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).
  12. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  13. York, A. G., et al. Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing. Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).
  14. Zaza, C., et al. Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment. Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).
  15. Jungmann, R., et al. Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).
  16. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  17. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy. Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  18. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  19. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  20. Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. Localization accuracy in single-molecule microscopy. Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).
  21. Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes. , (2025).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).
  23. Schlichthaerle, T., et al. Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT. Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).
  24. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).
  25. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  26. Whelan, D. R., Bell, T. D. M. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).
  27. Xie, Z., et al. Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy. Cytoskeleton. , (2025).
  28. Steen, P. R., et al. The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes. Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).
  29. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy. J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).
  30. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy. Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).
  31. Chung, K. K. H., et al. Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging. Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).

Перепечатки и разрешения

Теги

DNA PAINT
Сверхразрешающая визуализация целой клетки с помощью DNA-PAINT на вращающемуся диске с оптическим перераспределением фотонов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.