Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Разработка и стандартизация микрометода ex vivo для внутриклеточной количественной оценки винкристина в первичных ALL клетках с помощью LC-MS/MS

467 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69535

⸱

23 января 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Mass Spectrometry Laboratory, Boldrini Children's Center, 3Boldrini Children's Center

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол был направлен на установление и оптимизацию метода LC-MS/MS для относительной количественной оценки накопления винкристина в первичных педиатрических ALL-клетках.

Аннотация

Количественная оценка внутриклеточного винкристина (VCR) в первичных детских острых лимфобластных лейкозных клетках (ОЛЛ) необходима для понимания специфических для выборки различий в поглощении препаратов и поддержки экспериментальных исследований с использованием дефицитного материала пациентов. Здесь мы представляем упрощённый микрометод LC-MS/MS, специально оптимизированный для первичных ALL-клеток, полученных с помощью ксенотрансплантатов пациентов (PDX), который решает ключевые задачи, такие как ограниченная доступность клеток, малый размер клеток и необходимость воспроизводимого восстановления после нескольких этапов промывания. Временные анализы продолжительностью от 1 до 5 часов показали, что инкубационный период в 3 часа обеспечивает самые высокие и наиболее стабильные уровни внутриклеточных видеомагнитофонов с меньшей вариабельностью между репликами. Оптимизация метода также показала, что использование 2,5 × 106 ячеек на условие повышает аналитическую устойчивость по сравнению с 1 × 106 ячейками, которые показали большую дисперсию в повторных экспериментах. Дополнительные важные усовершенствования включали использование холодного метанола для повышения эффективности осадки белков и внедрение внутреннего стандарта для мониторинга и минимизации процедурных вариаций. Метод позволяет чутко и точно измерять внутриклеточные видеомагнитофоны в соответствующих концентрационных диапазонах, хотя самая низкая протестированная доза (0,01 мкм) не была количественно измерена после 3-часовой инкубации. В целом, этот микрометод предоставляет практичный, воспроизводимый и масштабируемый подход для измерения внутриклеточного видеомагнитофона в первичных образцах ALL. Его дизайн поддерживает сравнительный анализ, валидацию ex vivo моделей и будущие методологические применения, направленные на интеграцию внутриклеточной количественной оценки лекарств в более широкие фармакологические оценки.

Введение

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) составляет примерно 25% всех детских видов рака и остаётся самым распространённым педиатрическим злокачественнымопухольем 1,2. Хотя достижения в терапии значительно повысили показатели выживаемости, теперь превышающие 90%, биологическая сложность ALL продолжает стимулировать усилия по разработке инструментов, которые лучше характеризуют заболевание наклеточном уровне 3.

Алкалоиды Винка, особенно видеомагнитофоны, являются ключевыми компонентами протоколов леченияВСЕХ 4. Поскольку видеомагнитофон оказывает свои цитотоксические эффекты внутриклеточно, понимание его поглощения и накопления в лейкемических клетках является фундаментальным для исследований, связанных с ответом на лекарства, фармакодинамикой и клеточным поведением в ex vivo системах. Однако большинство доступных методов оценки внутриклеточных уровней лекарств основаны на косвенных измерениях или полуколичественных методах, ограничивая воспроизводимость и чувствительность 5,6,7.

Параллельно многие исследования всё ещё сильно зависят от клеточных линий лейкемии, которые не обладают биологической гетерогенностью и клинической значимостью, как первичные клетки, полученные пациентами. Первичные образцы часто представляют такие проблемы, как ограниченное количество клеток, переменное качество образцов и необходимость высокочувствительных аналитических методов, способных обнаруживать малочисленные внутриклеточныесоединения 8.

Жидкостная хроматография и тандемная масс-спектрометрия (LC-MS/MS) обеспечивает специфичность и чувствительность, необходимые для точной количественной оценки химиотерапевтических агентов, однако стандартизированные протоколы для измерения внутриклеточного видеомагнитофона непосредственно в первичных лейкемических клетках остаются редкими. Создание надёжных микрометодов, совместимых с ограниченным материалом пациентов, может способствовать широкому спектру применений, включая фармакологическое профилирование, оценку взаимодействий лекарственных препаратов и клеток, а также сравнительные исследования между подтипами заболеваний или терапевтическими состояниями.

В этом протоколе мы описываем разработку и оптимизацию микрометода для экс-виво количественной оценки внутриклеточного видеомагнитофона в первичных лейкемических клетках с использованием LC-MS/MS. Для получения достаточного количества материала для разработки метода образцы пациентов пересаживались в иммунодефицитных мышей с NSG для получения моделейPDX 9. После экспансии in vivo лейкемические клетки человека были выделены икриоконсервированы 10. После этого их размораживали, инкубировали с помощью видеомагнитофона, мылили, лизировали и анализировали с помощью LC-MS/MS для определения внутриклеточных уровней лекарств.

Этот метод обладает несколькими преимуществами: требует небольшого количества клеток (2,5 миллиона), он чувствительный и быстрый, совместим с клинически значимыми первичными образцами. Поскольку он напрямую измеряет внутриклеточный состав лекарств, он предоставляет надежный количественный инструмент для исследователей, изучающих усвоение препаратов, клеточные ответы на химиотерапевтические препараты или другие фармакологические вопросы при гематологических злокачественных опухолях.

В целом этот протокол расширяет аналитический набор для изучения педиатрического ALL и может быть легко адаптирован для других препаратов или типов образцов, что поддерживает будущие исследования в области биологии лейкемии, поведения лекарств и прецизионной фармакологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Образцы лейкемии, использованные в этом исследовании, были получены из биобанковских флаконов пациентов, леченных в Centro Infantil Boldrini, которые разрешили использовать свои клетки через форму информированного согласия. Проект был одобрен Комитетом по институциональной этике (CAAE 34601120.7.0000.5376). Протоколы по созданию PDX у животных проводились в соответствии с нормативными актами и этическими рекомендациями Комитета по этике животных (Comissão de Ética no Uso de Animais) Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0011-2020).

1. Подготовка образцов и инкубация препарата (День 1)

  1. Подготовка запаса и рабочих растворов
    1. Взвесьте 2,5 мг сульфата винкристина (молекулярная масса: 923 г/моль) и растворите его в 2,0 мл диметилсульфоксида (DMSO) в микротрубке объёмом 2,0 мл для получения запасного раствора объёмом 1,354 мм. Вихрь до полного растворения.
      ВНИМАНИЕ: ДМСО раздражает; Наденьте перчатки и держите их в вытяжке с химическим паром.
    2. Подготовьте рабочий раствор на 100 мкм, смешав 147,71 мкл стандартного раствора видеомагнитофона с 1 852,28 мкл DMSO в микротрубке объёмом 2,0 мл. Вихрь тщательно.
    3. Распределите 500 мкл рабочего раствора по четырём микротрубкам по 0,6 мл и храните при -20 °C до нескольких месяцев. Избегайте размораживания аликвотов более трёх раз.
    4. Приготовьте рабочий раствор винбластина (VINB) объемом 100 мкм, смешав 181,81 мкл стандартного раствора массой 1,1 мл (сульфат винбластин 1 мг/мл, молекулярная масса: 909,07 г/моль) с 1 818,19 мкл стерильной ультрачистой воды в микротрубке объёмом 2,0 мл. Вихрь до однородности.
    5. Aliquot — рабочее решение VINB так же, как для видеомагнитофона.
    6. Приготовьте метанол + 0,1 мкм раствор VINB, смешав 49,95 мл метанола с 50 мкл рабочего раствора VINB в трубке объемом 50 мл. Вихрь до однородности. Храните при -20 °C до 3 месяцев.
      ВНИМАНИЕ: Метанол токсичен и горючий; с помощью соответствующих СИЗ в вытяжке с дымом.
    7. Приготовьте раствор в воде + 0,1% муравьиной кислоты, смешав 49,95 мл сверхчистой воды с 50 мкл муравьиной кислоты в трубке объёмом 50 мл. Вихрь. Храните при комнатной температуре (RT).
      ВНИМАНИЕ: Муравиная кислота коррозийна; Обращайтесь с перчатками и защитой для глаз.
  2. Размораживание и промывка первичных клеток
    1. Размораживайте образцы криоконсервированных клеток, аккуратно помещая флакон в стакане с 15 мл дистиллированной воды 37 °C до полного оттаивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Информация о протоколах сбора клеток и заморозке доступна в предыдущих публикациях 9,10.
    2. Переместите содержимое флакона в коническую трубку объёмом 50 мл, содержащую 10-15 мл стерильного 1x PBS с помощью стерильной одноразовой пипетки Пастера. Центрифуга при 300 × г в течение 5 минут на RT.
    3. Сбросьте супернатант, перевернув трубку.
    4. Повторно подвесьте гранулу в 10 мл среды AIM V с помощью одноразовой пипетки Пастера. Считайте жизнеспособные ячейки и измеряйте средний размер ячейки с помощью автоматического счётчика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать клетки, обладающие не менее 80% жизнеспособностью относительно общего количества собранных клеток.
    5. Рассчитайте объём, необходимый для сбора 2,5 × 106 жизнеспособных ячеек, используя простую пропорцию, основанную на измеренной концентрации. Например, если концентрация составляет 5 × 106 клеток/мл, требуемый объём составляет 0,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждую обработку проводите в трёх экземплярах для воспроизводимости данных. Оставьте средний размер ячеек, предоставленных в автоматическом счётчике ячеек; Используйте его для расчёта объёма ячеек.
  3. Система лечения наркозависимости
    1. Рассчитайте объём рабочего раствора видеомагнитофона для достижения конечной концентрации 1 мкм при общем объёме 2,0 мл. Перед пипетированием используйте стандартный раствор.
    2. Добавьте среду AIM V, затем 2,5 × 106 элементов, и наконец раствор видеомагнитофона на микротрубку объемом 2,0 мл. Кратко вторгайтесь и слегка вращите вниз (5 секунд), чтобы собрать жидкость из крышки трубки.
    3. Инкубировать открытые трубки при 37 °C, 5%CO2 в течение 3 часа.
    4. После инкубации закройте крышки и центрифугайте образцы при 300 × г в течение 5 минут при RT.
    5. Аккуратно сбросьте супернатант с помощью пипетки, затем добавьте 1 мл PBS в RT в трубку.
    6. Повторите центрифугирование при 300 × г в течение 5 минут на RT, после удаления супернатанта и промывки PBS ещё два раза, всего три промывания.
    7. Аккуратно удалите весь супернатант с помощью пипетки, повторно суспензируйте гранулу в 100 мкл PBS и используйте вихрь до полной суспензии гранулы.
    8. Добавьте 400 мкл холодного метанола + 0,1 мкм винбластина (-20 °C) непосредственно в образец, избегая контакта со стенками трубки.
    9. Храните образцы на ночь при -80 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить при -80 °C в течение нескольких недель (безопасная остановка).

2. Обработка образцов для LC-MS/MS (День 2)

  1. Извлечение образцов
    1. Предварительно охладите центрифугу до 4 °C перед тем, как извлечь образцы из морозильника с температурой -80 °C.
    2. Сразу после взятия образцов из морозильника центрифугуйте их при 13 000 × г в течение 20 минут при 4 °C.
    3. Перенесите 300 мкл супернатанта в микропробирку объемом 1,5 мл.
    4. Полностью высушите образцы с помощью вакуумного концентратора при 40-45 °C в течение 1 часа 40 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сушёные гранулы можно хранить при -20 °C в течение нескольких недель (безопасная остановка).
    5. Суспензируйте каждую гранулу в 400 мкл воды + 0,1% муравьиной кислоты (предварительно подготовленной). Аккуратно вихрь до полного растворения гранулы.
    6. Снова центрифугуйте образцы при 13 000 × г в течение 20 минут при 4 °C.
    7. Пересадите 300 мкл супернатанта в флакон с винтовой крышкой объемом 2,0 мл для анализа LC-MS/MS.

3. Настройка и сбор данных LC-MS/MS

  1. Подготовка подвижной фазы и кондиционирование колонки
    1. Приготовьте растворитель А, смешав сверхчистую воду с 0,1% муравьиной кислотой.
    2. Приготовьте растворитель B, смешав ацетонитрил с муравьиной кислотой 0,1%.
      ВНИМАНИЕ: Ацетонитрил токсичен и легковоспламеняющийся; ручка в вытяжке с химическим паром.
    3. Соникуйте каждый растворитель в ультразвуковой ванне в течение 5 минут. Подключите бутылки к насосному модулю и пропустите систему при высоком расходе для удаления загрязнений.
    4. Установите колонку BEH C18 с обратной фазой (1,7 мкм, 2,1 мм × 50 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения анализа в этом исследовании использовалась хроматографическая система класса Acquity, связанная с масс-спектрометром Xevo TQS-Micro с тройным квадрупольным масс-спектрометром.
    5. Используйте бинарный градиент, состоящий из растворителей A и B, оба подготовленных заранее.
    6. Проведите хроматографический градиент от 5% до 95% растворителя B в течение первых 2 минут, затем 2 минуты растворителя A для промывания колонок и восстановления равновесия.
    7. Установите расход 0,2 мл/мин на протяжении всего 4-минутного пробега. Поддерживайте температуру столба на уровне 40 °C и вводите по 10 мкл каждого образца.
  2. Настройка метода LC-MS/MS
    1. Откройте программное обеспечение LC-MS/MS. Нажмите File > New > MS Method, чтобы начать новый метод.
    2. Перейдите на вкладку «Функция » и установите тип функции на мониторинг множественных реакций (MRM). Введите ионные переходы и параметры, указанные в Таблице 1 для видеомагнитофона и VINB (внутренний стандарт).
    3. Установите время сбора на 4 минуты. Нажмите «Подать заявку », чтобы сохранить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 4 минуты для обеспечения повторного равновесия колонки между инъекциями.
    4. Настройте параметры UHPLC в Inlet Method > Edit LC Method и сохраните как .mth файл (Таблица 2).
    5. Параметры источника установите во вкладке Tune согласно Таблице 3. Сохраните как .tun файл.
    6. Сохраните полный метод: File > Save As и экспорт в .mth файл.
  3. Создание примерного списка и начало запуска
    1. На главном экране программы откройте Sample List и создайте список с названиями образцов, объёмами инъекций, положениями флакон и используемым методом.
    2. Поставьте флакон с ультрачистой водой в лоток для автосэмплера и назначьте его как заготовку. Проводите пустоту между каждым набором тройных инъекций, чтобы избежать переноса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом работы убедитесь, что давление в колонке (ΔP) стабильное и менее 10 psi.
    3. Выберите нужные строки в Sample List и нажмите Run > OK , чтобы начать сбор данных.

4. Анализ данных

  1. Визуализация и экспорт данных
    1. После завершения прохождения просмотрите хроматограммы, выбрав образец и нажав «Хроматограмма » в верхней строке меню.
    2. На главном экране нажмите на TargetLynx, выберите только что запущенные файлы и выберите Process > выберите метод vincristine > OK, чтобы сгенерировать таблицы выводов.
    3. Нажмите «Отчёт» > «Таблица экспорта» и сохраните обработанные данные как .csv или .xlsx файл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: экспортировать сырые пиковые области как для анализа, так и для внутреннего стандарта.
  2. Организация данных и расчёт отношений
    1. Откройте экспортированный файл и создайте следующие столбцы:
      1. Пример: Добавьте образец или имя флакона.
      2. Запуск: Укажите, к какому воспроизведению соответствует значение.
      3. Область видеомагнитофона: введите область ниже пика для винкристина.
      4. Область VINB: Введите область под пиком для винбластина.
      5. Соотношение VCR/VINB: нормализуйте каждое значение видеомагнитофона, деля его на соответствующее значение VINB.
    2. Добавьте столбцы для стандартных отклонений площади видеомагнитофона, площади VINB и соотношения видеомагнитофон/VINB для каждого тройного набора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализация с использованием внутреннего стандарта позволяет корректировать изменения в объёме экстракции или инъекции.
  3. Результаты построения графиков
    1. Откройте предпочтительное программное обеспечение для графов и выберите формат сгруппированной таблицы .
    2. Выберите «Ввести или импортировать данные в новую таблицу», а в разделе «Опции» выберите «Ввести 3 значения реплицировать» в боковых подстолбцах.
    3. Постройте только нормированные соотношения видеомагнитофона и VINB для каждого образца, опустив значения сырой площади.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Репрезентативные хроматографические результаты, полученные после внутриклеточного накопления с использованием первичных ALL PDX-клеток, инкубированных с помощью видеомагнитофона и VINB, показаны на рисунке 1. Образцы были подготовлены с использованием 2,5 × 106 клеток на каждое условие. При описанных хроматографических условиях видеомагнитофон стабильно сохранялся на 2,85 минуты с минимальным матричным эффектом, а форма пиков была симметричной и хорошо разрешённой. Эти профили илл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Точная оценка внутриклеточных уровней лекарственных средств в первичных лейкемических клетках необходима для понимания обращения с лекарствами на клеточном уровне и для поддержки разработки функциональных тестов, дополняющих молекулярное профилирование. Существующие аналитические подходы часто требуют большого количества клеток, включают длительные этапы обработки или опираются на косвенные показания, не отражающие истинную внутриклеточную доступность химиотерапевтических

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Благодарности

Мы благодарим Centro Infantil Boldrini и всех пациентов, пожертвовавших свои образцы для проведения исследования. Адриелли С. Соарес получил стипендию от Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) и от Исследовательского фонда Сан-Паулу (FAPESP, 2023/18389-3). Хосе А. Юнес получил стипендию по продуктивности от Национального совета по технологическому и научному развитию (CNPq, 308399/2021-8). Эта работа была поддержана финансированием исследований Министерством здравоохранения Бразилии в рамках программы PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Флакон с винтовой крышкой объёмом 2,0 млПотоковое снабжение8-2400Используется со стеклянными вставками с пружиной (5 x 29 мм) от той же компании (Кат. 5-29015)
Флакон с винтовой крышкой объёмом 2,0 млПотоковое снабжение8-2400Используется со стеклянными вставками с пружиной (5 x 29 мм) от той же компании (Кат. 5-29015)
АцетонитрилMerck (Sigma-Aldrich)100030
АцетонитрилMerck (Sigma-Aldrich)24010152
AIM VТермо Фишер Сайентифик12055091
Хроматографическая система Acquity UPLC H-ClassWaters Co.https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW
Графиня 3 FLТермо Фишер СайентификA49892
DMSOMerck (Sigma-Aldrich)D 8418
Falcon 50 млСарштедт62.547.254
Муравьиная кислотаMerck (Sigma-Aldrich)F0507
Стеклянная бутылкаMerck (Sigma-Aldrich)41121800
ИнкубаторPHCBIMCO-50M-PE
МетанолMerck (Sigma-Aldrich)34860
Микротрубка объёмом 1,5 млЭппендорф41121702
Микротрубка объёмом 2,0 млЭппендорф30120094
PBSMerck (Sigma-Aldrich)PPB006
Speevac miVacFisher Scientific56340
Программное обеспечение для сбора данныхWaters Co.MassLynx
Тройной квадрупольный масс-спектрометр Xevo TQ-S microWaters Co.https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW
Ультразвуковой соникаторКимисQ335D
Винбластин 1 мг/млЛиббсhttps://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/Винбластин сульфат
ВинкристинCayman Chemicals11764

Ссылки

  1. Inaba, H., Pui, C. H. Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia. J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).
  2. Pui, C. H., et al. Childhood acute lymphoblastic leukemia: progress through collaboration. J Clin Oncol. 33 (27), 2938-2948 (2015).
  3. Gaudichon, J., et al. Mechanisms of extramedullary relapse in acute lymphoblastic leukemia: reconciling biological concepts and clinical issues. Blood Rev. 36, 40-56 (2019).
  4. Dhyani, P., et al. Anticancer potential of alkaloids: a key emphasis on colchicine, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine and vincamine. Cancer Cell Int. 22, 206(2022).
  5. Mateus, A., Matsson, P., Artursson, P. Rapid measurement of intracellular unbound drug concentrations. Mol Pharmaceutics. 10 (6), 2467-2478 (2013).
  6. Chien, H. C., et al. Rapid method to determine intracellular drug concentrations in cellular uptake assays: application to metformin in organic cation transporter 1-transfected human embryonic kidney 293 cells. Drug Metab Dispos. 44 (3), 356-364 (2016).
  7. Calcagno, A. M., Ambudkar, S. V. Analysis of expression of drug resistance-linked ABC transporters in cancer cells by quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 637, 121-132 (2010).
  8. Richter, M., et al. From donor to the lab: a fascinating journey of primary cell lines. Front Cell Dev Biol. 9, 648272(2021).
  9. Borgmann, A., et al. Childhood ALL blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  10. Rosati, M. M., Corrêa, J. R., de Sousa Mariano, S., Cardoso, A., Andrés Yunes, J. Murine model of leukemia relapse to induction chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia. J Vis Exp. (224), e68797(2025).
  11. Dams, R., Huestis, M. A., Lambert, W. E., Murphy, C. M. Matrix effect in bioanalysis of illicit drugs with LC-MS/MS: influence of ionization type, sample preparation, and biofluid. J Am Soc Mass Spectrom. 14 (11), 1290-1294 (2003).
  12. Yang, Y., Cruickshank, C., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome. J Chromatogr A. 1300, 217-226 (2013).
  13. Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations. Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Разработка и стандартизация микрометода ex vivo для внутриклеточной количественной оценки винкристина в первичных ALL клетках с помощью LC-MS/MS
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.