Этот протокол был направлен на установление и оптимизацию метода LC-MS/MS для относительной количественной оценки накопления винкристина в первичных педиатрических ALL-клетках.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Разработка и стандартизация микрометода ex vivo для внутриклеточной количественной оценки винкристина в первичных ALL клетках с помощью LC-MS/MS
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Количественная оценка внутриклеточного винкристина (VCR) в первичных детских острых лимфобластных лейкозных клетках (ОЛЛ) необходима для понимания специфических для выборки различий в поглощении препаратов и поддержки экспериментальных исследований с использованием дефицитного материала пациентов. Здесь мы представляем упрощённый микрометод LC-MS/MS, специально оптимизированный для первичных ALL-клеток, полученных с помощью ксенотрансплантатов пациентов (PDX), который решает ключевые задачи, такие как ограниченная доступность клеток, малый размер клеток и необходимость воспроизводимого восстановления после нескольких этапов промывания. Временные анализы продолжительностью от 1 до 5 часов показали, что инкубационный период в 3 часа обеспечивает самые высокие и наиболее стабильные уровни внутриклеточных видеомагнитофонов с меньшей вариабельностью между репликами. Оптимизация метода также показала, что использование 2,5 × 106 ячеек на условие повышает аналитическую устойчивость по сравнению с 1 × 106 ячейками, которые показали большую дисперсию в повторных экспериментах. Дополнительные важные усовершенствования включали использование холодного метанола для повышения эффективности осадки белков и внедрение внутреннего стандарта для мониторинга и минимизации процедурных вариаций. Метод позволяет чутко и точно измерять внутриклеточные видеомагнитофоны в соответствующих концентрационных диапазонах, хотя самая низкая протестированная доза (0,01 мкм) не была количественно измерена после 3-часовой инкубации. В целом, этот микрометод предоставляет практичный, воспроизводимый и масштабируемый подход для измерения внутриклеточного видеомагнитофона в первичных образцах ALL. Его дизайн поддерживает сравнительный анализ, валидацию ex vivo моделей и будущие методологические применения, направленные на интеграцию внутриклеточной количественной оценки лекарств в более широкие фармакологические оценки.
Введение
Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) составляет примерно 25% всех детских видов рака и остаётся самым распространённым педиатрическим злокачественнымопухольем 1,2. Хотя достижения в терапии значительно повысили показатели выживаемости, теперь превышающие 90%, биологическая сложность ALL продолжает стимулировать усилия по разработке инструментов, которые лучше характеризуют заболевание наклеточном уровне 3.
Алкалоиды Винка, особенно видеомагнитофоны, являются ключевыми компонентами протоколов леченияВСЕХ 4....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Образцы лейкемии, использованные в этом исследовании, были получены из биобанковских флаконов пациентов, леченных в Centro Infantil Boldrini, которые разрешили использовать свои клетки через форму информированного согласия. Проект был одобрен Комитетом по институциональной этике (CAAE 34601120.7.0000.5376). Протоколы по созданию PDX у животных проводились в соответствии с нормативными актами и этическими рекомендациями Комитета по этике животных (Comissão de Ética no Uso de Animais) Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0011-2020).
1. Подготовка образцов и инкубация препарата (День 1)
- Подготов....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Репрезентативные хроматографические результаты, полученные после внутриклеточного накопления с использованием первичных ALL PDX-клеток, инкубированных с помощью видеомагнитофона и VINB, показаны на рисунке 1. Образцы были подготовлены с использованием 2,5 × 106 клеток на каждое условие. При описанных хроматографических условиях видеомагнитофон стабильно сохранялся на 2,85 минуты с минимальным матричным эффектом, а форма пиков была симметричной и хорошо разрешённой. Эти профили илл.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Точная оценка внутриклеточных уровней лекарственных средств в первичных лейкемических клетках необходима для понимания обращения с лекарствами на клеточном уровне и для поддержки разработки функциональных тестов, дополняющих молекулярное профилирование. Существующие аналитические подходы часто требуют большого количества клеток, включают длительные этапы обработки или опираются на косвенные показания, не отражающие истинную внутриклеточную доступность химиотерапевтических
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не заявляют о конфликтах интересов.
Благодарности
Мы благодарим Centro Infantil Boldrini и всех пациентов, пожертвовавших свои образцы для проведения исследования. Адриелли С. Соарес получил стипендию от Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) и от Исследовательского фонда Сан-Паулу (FAPESP, 2023/18389-3). Хосе А. Юнес получил стипендию по продуктивности от Национального совета по технологическому и научному развитию (CNPq, 308399/2021-8). Эта работа была поддержана финансированием исследований Министерством здравоохранения Бразилии в рамках программы PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Флакон с винтовой крышкой объёмом 2,0 мл | Потоковое снабжение | 8-2400 | Используется со стеклянными вставками с пружиной (5 x 29 мм) от той же компании (Кат. 5-29015) |
| Флакон с винтовой крышкой объёмом 2,0 мл | Потоковое снабжение | 8-2400 | Используется со стеклянными вставками с пружиной (5 x 29 мм) от той же компании (Кат. 5-29015) |
| Ацетонитрил | Merck (Sigma-Aldrich) | 100030 | |
| Ацетонитрил | Merck (Sigma-Aldrich) | 24010152 | |
| AIM V | Термо Фишер Сайентифик | 12055091 | |
| Хроматографическая система Acquity UPLC H-Class | Waters Co. | https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW | |
| Графиня 3 FL | Термо Фишер Сайентифик | A49892 | |
| DMSO | Merck (Sigma-Aldrich) | D 8418 | |
| Falcon 50 мл | Сарштедт | 62.547.254 | |
| Муравьиная кислота | Merck (Sigma-Aldrich) | F0507 | |
| Стеклянная бутылка | Merck (Sigma-Aldrich) | 41121800 | |
| Инкубатор | PHCBI | MCO-50M-PE | |
| Метанол | Merck (Sigma-Aldrich) | 34860 | |
| Микротрубка объёмом 1,5 мл | Эппендорф | 41121702 | |
| Микротрубка объёмом 2,0 мл | Эппендорф | 30120094 | |
| PBS | Merck (Sigma-Aldrich) | PPB006 | |
| Speevac miVac | Fisher Scientific | 56340 | |
| Программное обеспечение для сбора данных | Waters Co. | MassLynx | |
| Тройной квадрупольный масс-спектрометр Xevo TQ-S micro | Waters Co. | https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW | |
| Ультразвуковой соникатор | Кимис | Q335D | |
| Винбластин 1 мг/мл | Либбс | https://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/ | Винбластин сульфат |
| Винкристин | Cayman Chemicals | 11764 |
Ссылки
- Inaba, H., Pui, C. H. Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia. J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).
- Pui, C. H., et al. Childhood acute lymphoblastic leukemia: progress through collaboration. J Clin Oncol.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
