Этот протокол содержит пошаговую инструкцию по созданию неонатального травмы плечевого сплетения у крыс для использования в качестве модели в исследованиях травм при рождении плечевого сплетения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Разработка модели новорождённой крысы для травмы плечевого сплетения при рождении
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Изучение травм при рождении плечевого сплетения (BPBI) было сложным из-за гетерогенных клинических проявлений и ограниченного количества надёжных животных моделей. С этой целью мы разработали хирургический протокол, который воспроизводимо вызывает пан-плексальное повреждение плечевого сплетения новорождённого у 5-дневных крысных детёнышей Sprague-Dawley. В этой статье приведены пошаговые инструкции по приближению к плечевому сплетению у щенка крысы. Техника была выполнена на 15 детёнышах крыс Sprague Dawley. Используя дорсальный подход при операционной микроскопии, был сделан дорсальный разрез диаметром 5 мм, начиная от основания черепа к уровню перехода позвоночника C7-T1. Тупое рассечение проводится вниз к трапециеобразной мышце, затем рассечение через подлежащие ромбовидные и леваторные лопаточные мышцы. После определения анатомических ориентиров, таких как позвоночник и лопатка, верхний угол лопатки был аккуратно убран, чтобы визуализировать плечевое сплетение. Плечевое сплетение было локализовано и прижжено, о чём свидетельствуют заметные подёргивания в верхнем конечном крае. Чтобы предотвратить регенерацию нервов, между проксимальными и дистальными концами повреждённых нервов был помещён небольшой блок всыпаемой желатиновой губки. Эта процедура была успешно проведена на всех 15 щенках крыс с выживаемостью 87%. После операции и с жертвой все выжившие крысы продемонстрировали полные повреждения пан-плекса, что подтверждает эффективность и воспроизводимость этой модели для исследований травм плечевого сплетения при рождении.
Введение
Травма при рождении плечевого сплетения (BPBI) — это травматическое повреждение нерва, возникающее во время родов. Тяговые силы во время сложных родов, часто вызванные дистоцией плеча, затяжными родами или фетальной макросомией, приводят к слабости или параличу поражённойруки 1. Заболеваемость варьируется от 1 до 2 на 1 000 живорождённыхи 2, 3, 4. В то время как большинство младенцев полностью восстанавливают функцию, у 30% остаются остаточные симптомы во взрослом возрасте, такие как функциональные ограничения, неравенство длины конечностей, деформации и контрактуры суставов 5,6,7,8.
Модель BPBI демонстрирует различные паттерны травм с последствиями для лечения и прогноза. Травмы верхнего сплетения (C5-C6, паралич Эрба) являются наиболее частыми и в основном связаны с разрывом, а не савульсиями 9. В отличие от этого, повреждения пан-плексального (C5-T1) часто демонстрируют смешанную картину разрывов черепных корней и хвостовыхавульсий 10. Авульсии — это преганглиозные повреждения, которые нарушают ганглий дорсального корня и не способны к спонтанномувосстановлению 11.
Текущие клинические методы ведения варьируются от консервативной физиотерапии до ранней микрохирургической реконструкции нервов, в зависимости от тяжеститравмы 12,13. Пациентам часто необходимы вторичные операции, включая высвобождение мягких тканей, перенос сухожилий и остеотомию, чтобы улучшить моторную функцию, качество жизни и вторичные последствия опорно-двигательного аппарата. Однако эффективность этих ранних и поздних вмешательствварьируется 14, 15 и 16. Кроме того, изменённое развитие опорно-двигательного аппарата способствует функциональным ограничениям, неравенству длины конечностей и другим деформациям, которые в настоящее время не поддаются лечению, что подчёркивает необходимость дальнейшихисследований 17,18. Поэтому остаётся острая необходимость в надёжной, жизнеспособной и воспроизводимой модели животных для исследования этих повреждений.
Модели грызунов часто используются в моделях травм плечевого сплетения, при этом мыши являются наиболее распространённым выбором благодаря их экономичности и простоте обращения. Однако создание воспроизводимой неонатальной травмы плечевого сплетения может быть анатомически сложным из-за их небольшого размера. Крупные модели животных, такие как кролики, свиньи и приматы, предлагают несколько преимуществ для создания моделей, но при значительно более высокой стоимости19. Крысы, напротив, крупнее и генетически похожи на людей, чем мыши, при этом остаются значительно более экономичными и доступными, чем крупные животные модели. Поэтому по-прежнему необходима реализуемая и воспроизводимая животное для исследования BPBI. В данном исследовании описывается пошаговая модель создания пан-плексального BPBI у новорождённых крыс, которая может использоваться для изучения механизмов травм, лечебных вмешательств, а также краткосрочных и долгосрочных последствий.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры на животных проводились с одобрения Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC A0007335). Метод был проведён на 15 щенках крыс Спраг-Доули для оценки осуществимости и долгосрочных функциональных результатов.
1. Животноводство
- Содержать многоплодную беременную крысу рода Sprague Dawley (гестационный возраст: 14 дней) в гнездовой коробке (1354см²), содержащей подстилку на основе целлюлозной бумаги, обогащённую гнездовым материалом и клетками; Поддерживайте температуру в комнате на уровне 21 °C с относительной влажностью 28% и цикл свет/тьма 12:12 часа. Обеспечьте крысиную еду и воду ad libitum.
- Очищайте клетки каждую неделю; Оставляйте клетку нетронутой в течение 48 часов после родов. Чтобы способствовать привыканию и снизить стресс, обеспечивайте слуховое успокоение с помощью мягкого обращения и разговора. В поздней беременности убедитесь, что плотина привыкла к исследователю с помощью ежедневного аккуратного обращения и обонятельной обработки, помещая в клетку ватные шарики с запахом этанола и бетадина.
- После родов помещайте лакомства в клетку, не беспокоя плотину на 48 часов и не открывайте её.
2. Подготовка материалов
- Убедитесь, что все необходимые хирургические инструменты подготовлены до операции (см. Таблицу материалов). Стерилизуйте все хирургические материалы с помощью парового автоклава при 121 °C в течение 1 часа.
- Создайте хирургическое место из расширенного полистирола. (Рисунок 1)
3. Хирургическая подготовка
- Проводите операции щенкам крыс в возрасте 5 дней [диапазон от 3 до 9 дней].
- Индуцировать анестезию, поместив крысу в индукционную камеру с 2% изофлурана в кислороде 2 л/мин до достижения стадии средне- и глубокого анестетика. Подтвердите адекватную анестезию с помощью лёгкого щипка пальца на ноге. Положите щенка крысы на заранее подогреную грелку. Поддерживайте анестезию на уровне 1,5-2% изофлурана в кислороде и постоянно контролируйте частоту дыхания.
- Определите подходящую дозировку обезболивающего в зависимости от веса щенка. Назначайте бупренорфин с пролонгированным высвобождением (1 мг/кг с.к.) для контроля боли.
- Подготовьте асептическое хирургическое место, нанеся три чередующихся скраба бетадина и этанола.
- Расположите анестезиированного щенка в положение лежа на готовой хирургической койке, надёжно поместив нос и рот в носовой конус испарителя изофлурана (рисунок 1B).
- Чтобы минимизировать движение во время процедуры, прикрепите голову крысы к испарителю изофлурана и накройте нижнюю часть тела, чуть ниже верхних конечностей, фольгой.
4. Хирургический подход к плечевому сплетению
- Создайте кожный разрез диаметром 5 мм с помощью лопасти No11, начинающийся у основания черепа и продолжающийся каудально до перехода позвоночника C7-T1 (см. рисунок 1C).
- Аккуратно прижигайте поверхностные артерии, избегая кожных краёв.
- Проводите тупую диссекцию, пока не достигнет трапециеобразной мышцы.
- Вскрытие через трапециевидную и подлежащие мышцы ромбовидных и леваторных лопаток с помощью прижигания. Разместите щипцы для коагуляции перпендикулярно ткани, чтобы избежать термических повреждений краёв кожи.
- Аккуратно уберите верхний угол лопатки, чтобы открыть плечевое сплетение. Определите и изолируйте плечевое сплетение с помощью тупой диссекции (рисунок 1D и рисунок 2A).
- Прижигайте выявленные нервы плечевого сплетения с помощью биполярного электрокоагулятера на 15 и подтверждайте успешное повреждение, наблюдая подёргивания мышц верхних конечностей.
- Поместите небольшой кусочек васывающейся желатиновой губки (примерно 2 мм на 2 мм) между проксимальными и дистальными сегментами плечевого сплетения, чтобы предотвратить регенерацию нервов (рисунок 2B).
- Закройте кожу впитывающимся швом 7-0 в непрерывном узоре шва и нанесите ветеринарный тканевой клей, чтобы предотвратить расслоение раны (см. рисунок 3).
5. Послеоперационное лечение
- Поместите щенка крысы на грелку из гнездового материала из клетки плотины (рисунок 4). Следите за частотой дыхания и движениями щенка крысы, пока он не вернётся к нормальным дыхательным режимам.
- Чтобы предотвратить материнское отторжение, аккуратно потерете щенка с материалом для гнездования в домашней клетке, прежде чем положить его обратно в плотину.
- Осматривайте щенка крыс 3 раза в день в течение первых 48 часов после операции. Если наблюдаются признаки боли или отсутствия молочного пятна, назначайте дополнительное обезболивающее (бупренорфин 0,05 мг/кг с.с.).
- Внимательно следите за послеоперационными осложнениями, включая ослоение раны, инфекцию раны, снижение чувствительности конечностей с возможной аутоузацией и материнский каннибализм.
- Взвешивайте щенка крыс ежедневно. Если у крысы наблюдается потеря веса или отсутствие набора веса в течение двух последовательных дней, считайте это неудачей в процветании и проводите эвтаназию с помощью инъекции пентобарбитала (390 мг/мл) внутрибрюшинного препарата.
- Оценивайте моторную функцию через 1 день после операции и еженедельно следите за работой с помощью шкалы движения конечностей: 0 = отсутствующая функция, 1 = частичная функция, 2 = нормальная симметричная функция.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Эффективность хирургической техники можно оценить по отсутствию подвижности в поражённой конечности, наличию контрактур, уменьшении амплитуды движений и, при жертве, степени атрофии мышц, укорочении конечности, а также морфологических различий между костями и мышцами по сравнению с неповреждённой конечностью. В исследование было включено всего 15 детёнышей крыс. В период выживания двое крысиных щенков не смогли процветать после операции из-за плохого набора веса. Самоповреждение было заф...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол подробно описывает развитие травмы плечевого сплетения у новорождённой крысы с целью проведения исследований краткосрочных и долгосрочных последствий BPBI, изучения вариантов лечения и изучения последствий.
Ранее уже описывалось использование неинвазивной модели грызунов для изучения повреждения плечевого сплетения; однако эти модели не были специально адаптированы для воспроизведения определённого типа повреждениянервов 21,22
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.
Благодарности
Мы с большой благодарностью выражаем признательность доктору Фелиции Бойнтон, ветеринару ветеринара, и доктору Крису Гоу, ветеринару, за их экспертные рекомендации по обращению с щенками крыс и крысиных дам, периоперационном и послеоперационном уходе за крысиными щенками, которые существенно способствовали оптимизации этого протокола.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 мл шприца Luer-Lok Tip | BD | 309628 | |
| 7-0 покрытый викрил (полиглактин 910) | Ethicon | J576G | |
| 70% изопропилспирт | Vet-One | 13985-598-01 | |
| Впитывающаяся желатиновая губка | Surgifoam | ETH1972 | |
| Раствор бетадина с 5% повидон-йодным антисептическим микробицидом | PBS Animal Health | 11205 | |
| Материал для гнездования | Bed 'r Nest | BRN8SR | |
| Биполярные струповы | ASSI | АССИ. ATK26426 | |
| Бупренорфин (основание 0,5 мг/мл) с пролонгированным высвобождением | Связь Веджвуд | 49426-0517-1 | |
| Обогащение в клетках | Twist 'n Rich | 10003949 | |
| Подстилка на основе целлюлозы | Альфа Дри | NC2193839 | |
| Экспелатированный полистирол (пенопласт) | Fisher | 22-130-407 | |
| FREER крюк для кожи | Свободнее | MI2152 | |
| Крюк Gillies Skin Hook полуострый | DTR | GHB2001 | |
| Аппарат для самопроточной анестезии Isoflurane | E-Z Systems | EZ-190F | |
| Isoflurane, USP | Patterson Veterinary | 1403-704-06 | |
| Ювелирные Bipolar Pincops Антиприлипывающие, 11 см, прямой заострённый кончик, 0,25 мм, диаметр наконечника | ASSI | АССИ. BPNS11223 | |
| Микроножницы в стиле штыка | ASSI | АССИ. SNS21 | |
| Микроскоп (хирургический) | Leica | M525 F40 | |
| Микрохирургические щипцы Dumont #4 Dumont Swiss производства 1708-4TM-PO | Ambler Surgical | 31-906 | |
| Держатель для игл для микрохирургии и nbsp; | ASSI | B-14-8 | |
| Носовой конус, 9 мм, мышь, длина 2 см | VetEquip | 921609 | |
| Флакон для пентобарбитала и эвтаназии (390 мг/мл) 250 мл | Fatal plus | 9373 | |
| Фольга из пищевой плёнки | Press 'n Seal | Press'n-70-1-no3 | |
| Одноразовые иглы, 30 г | BD | 14-821-13A | |
| Операционный стол с подогревом мелких животных (регулируемый) | Peco Services Ltd | 69023 | |
| Лезвие из нержавеющей стали No 11 | Бард Паркер | 371211 | |
| Стерильная шторка полотенца | Dynarex Corporation | 4410 | |
| Тканевой клей | Vetbond 3M | NC9259532 | |
| Ватные палочки и аппликаторы с деревянными ручками | Fisher | 22-363-157 |
Ссылки
- Johnson, G. J., Denning, S., Clark, S. L., Davidson, C. Pathophysiologic origins of brachial plexus injury. Obstet Gynecol. 136 (4), 725-730 (2020).
- Abzug, J. M., Mehlman, C. T., Ying, J. Assessment of current epidemiology and risk factors surrounding brachial plexus birth palsy. J Hand Surg Am. 44 (6), e1-e515 (2019).
- Foad, S. L., Mehlman, C. T., Ying, J. The epidemiology of neonatal brachial plexus palsy in the United States. J Bone Joint Surg Am. 90 (6), 1258-1264 (2008).
- Walsh, J. M., et al. Neonatal brachial plexus injury: Comparison of incidence and antecedents between 2 decades. Am J Obstet Gynecol. 204 (4), e1-e324 (2011).
- Pondaag, W., Malessy, M. J., van Dijk, J. G., Thomeer, R. T. Natural history of obstetric brachial plexus palsy: A systematic review. Dev Med Child Neurol. 46 (2), 138-144 (2004).
- Foad, S. L., Mehlman, C. T., Foad, M. B., Lippert, W. C. Prognosis following neonatal brachial plexus palsy: An evidence-based review. J Child Orthop. 3 (6), 459-463 (2009).
- Hoeksma, A. F., ter Steeg, A. M., Nelissen, R. G., van Ouwerkerk, W. J., Lankhorst, G. J., de Jong, B. A. Neurological recovery in obstetric brachial plexus injuries: An historical cohort study. Dev Med Child Neurol. 46 (2), 76-83 (2004).
- Pondaag, W., Malessy, M. J. The evidence for nerve repair in obstetric brachial plexus palsy revisited. Biomed Res Int. 2014, 434619(2014).
- Executive SHORT ABSTRACT: Neonatal brachial plexus palsy. Report of the American College of Obstetricians and Gynecologists Task Force on Neonatal Brachial Plexus Palsy. Obstet Gynecol. 123 (4), 902-904 (2014).
- Zlotolow, D. A., Chen, C. J., Crowe, C. S., Park, E., Kozin, S. H. A novel intraoperative classification for brachial plexus birth injury based on operative findings in 162 patients. J Hand Surg Eur Vol. , (2025).
- Smith, B. W., Daunter, A. K., Yang, L. J., Wilson, T. J. An update on the management of neonatal brachial plexus palsy-Replacing old paradigms: A review. JAMA Pediatr. 172 (6), 585-591 (2018).
- Bauer, A. S., et al. Microsurgery for brachial plexus injury before versus after 6 months of age: Results of the multicenter treatment and outcomes of brachial plexus injury (TOBI) study. J Bone Joint Surg Am. 102 (3), 194-204 (2020).
- Muhlestein, W. E., et al. Impact of timing of primary nerve surgery on shoulder, forearm, and elbow recovery in neonatal brachial plexus palsy. Neurosurgery. , (2023).
- Hulleberg, G., Elvrum, A. K., Brandal, M., Vik, T. Outcome in adolescence of brachial plexus birth palsy: 69 individuals re-examined after 10-20 years. Acta Orthop. 85 (6), 633-640 (2014).
- Sarac, C., et al. What range of motion is achieved 5 years after external rotationplasty of the shoulder in infants with an obstetric brachial plexus injury. Clin Orthop Relat Res. 478 (1), 114-123 (2020).
- Adidharma, W., et al. Shoulder release and tendon transfer following neonatal brachial plexus palsy: Gains, losses, and midline function. Plast Reconstr Surg. 146 (2), 321-331 (2020).
- Ruoff, J. M., van der Sluijs, J. A., van Ouwerkerk, W. J., Jaspers, R. T. Musculoskeletal growth in the upper arm in infants after obstetric brachial plexus lesions and its relation with residual muscle function. Dev Med Child Neurol. 54 (11), 1050-1056 (2012).
- Gosk, J., Wnukiewicz, W., Urban, M. The effect of perinatal brachial plexus lesion on upper limb development. BMC Musculoskelet Disord. 15, 116(2014).
- Vela, F. J., et al. Animal models used to study direct peripheral nerve repair: A systematic review. Neural Regen Res. 15 (3), 491-502 (2020).
- Nikolaou, S., Peterson, E., Kim, A., Wylie, C., Cornwall, R. Impaired growth of denervated muscle contributes to contracture formation following neonatal brachial plexus injury. J Bone Joint Surg Am. 93 (5), 461-470 (2011).
- Yang, J., et al. Development of a novel experimental rat model for brachial plexus avulsion injury. Neuroreport. 26 (9), 501-509 (2015).
- Spinner, R. J., et al. Model for avulsion injury in the rat brachial plexus using passive acceleration. Microsurgery. 20 (2), 94-97 (2000).
- Hayek, A., Kuehn, C. A method for preventing maternal cannibalism after neonatal rat surgery. Lab Anim Sci. 32 (2), 171-172 (1982).
- Libbin, R. M., Person, P. Neonatal rat surgery: Avoiding maternal cannibalism. Science. 206 (4414), 66(1979).
- Park, C. M., Clegg, K. E., Harvey-Clark, C. J., Hollenberg, M. J. Improved techniques for successful neonatal rat surgery. Lab Anim Sci. 42 (5), 508-513 (1992).
- Koplovitch, P., Minert, A., Devor, M. Spontaneous pain in partial nerve injury models of neuropathy and the role of nociceptive sensory cover. Exp Neurol. 236 (1), 103-111 (2012).
- Zeltser, R., Beilin, B. Z., Zaslansky, R., Seltzer, Z. Comparison of autotomy behavior induced in rats by various clinically-used neurectomy methods. Pain. 89 (1), 19-24 (2000).
- Griggs, R. B., Bardo, M. T., Taylor, B. K. Gabapentin alleviates affective pain after traumatic nerve injury. Neuroreport. 26 (9), 522-527 (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
