Генерация и характеристика штамма Drosophila melanogaster с помощью CRISPR/Cas9

Краткое содержание

Равновесный нуклеозидный транспортер 2 (ENT2) — это консервативный трансмембранный белок, участвующий в транспорте нуклеозидов и клеточном метаболизме. В этом исследовании был разработан рабочий процесс редактирования генома на основе CRISPR/Cas9 для генерации аллеля, направленного на Ent2, у дрозофилы меланогастер. Была построена и поддержана стабильная гетерозиготная линия Ent2*/CyO с использованием стратегии балансирующих хромосом. В данной работе описывается проектирование, генерация и молекулярная валидация мутантной линии, а также её фенотипическая характеристика при различных температурных условиях. Установленный рабочий процесс и мутантный штамм предоставляют практическую основу для изучения генов с гомозиготными летальными фенотипами и для изучения температурно-связанной фенотипической вариации у Drosophila.

Аннотация

В этом исследовании был использован подход редактирования генома на основе CRISPR/Cas9 для введения мутаций в равновесный ген нуклеозидного транспортера 2 (Ent2) у Drosophila melanogaster. Направляющие РНК, направленные на кодирующую область Ent2, были разработаны и совместно введены с мРНК Cas9 в эмбрионы^{w 1118}. Мутантные аллели были идентифицированы с помощью секвенирования Сэнгера и поддерживались как стабильная гетерозиготная линия Ent2*/CyO с использованием балансирующей хромосомы. Впоследствии мы оценили массу тела, способность к лазанию, уровень выживаемости и активность супероксиддисмутазы (SOD) и каталазы (CAT) у плодовых мушек при температурах 22 °C и 25 °C соответственно. Результаты показывают, что при 22 °C и 25 °C длина тела и вес плодовых мушек Ent2*/CyO значительно уменьшились по сравнению с w¹¹¹⁸, и их развитие задержалось. При температуре 22 °C общая продолжительность жизни мух Ent2*/CyO была немного длиннее, чем у w¹¹¹⁸, тогда как при 25 °C существенных различий не наблюдалось. Что касается подвижности, то лазание гетерозиготных мух было значительно ниже, чем у w¹¹¹⁸ при обеих температурах, при этом самцы страдали сильнее. Кроме того, активность антиоксидантных ферментов CAT и SOD у плодовых мушек Ent2*/CyO была значительно снижена, что свидетельствует о явном снижении антиоксидантной способности. Эти результаты описывают фенотипический профиль мутантной линии Ent2, сгенерированной с помощью CRISPR, и демонстрируют возможность сочетания редактирования генома с балансирующими стратегиями хромосом у дрозофилы. Это исследование предоставляет методологическую основу и генетический ресурс для будущих исследований генов, связанных с метаболизмом и реакциями окружающей среды.

Введение

Drosophila melanogaster остаётся одним из самых широко используемых модельных организмов в области генетики и биологии^{развития. 1}. Он характеризуется коротким жизненным циклом, быстрым размножением, устоявшимися инструментами генетической манипуляции и полностью аннотированным^{геномом 2,3}. Этот вид широко применяется в изучении функции генов, метаболической регуляции и адаптивности к окружающей^{среде 4,5}. Нуклеозиды и их производные, такие как АТФ, играют центральную роль в генерации клеточной энергии, синтезе нуклеиновых кислот и передаче сигналов у дрозофилы, отражая сохранённую метаболическую регуляцию между^{метазоями 6}. Пуринергические сигнальные пути у Drosophila, зависящие от внеклеточных аденозиновых и нуклеозидных транспортных механизмов, подчёркивают функциональную роль движения нуклеозидов через мембраны в координации энергетических и сигнальных^{ответов 7}. Среди этих процессов транспорт нуклеозидов через цитоплазматическую мембрану в первую очередь опосредован семейством равновесных нуклеозидных транспортёров (ENT), при этом DmENT2 проявляет функциональную транспортную активность у Drosophila⁸.

Семейство ЛОР-инфекций включает несколько подтипов, среди которых ENT2 является широко изученным трансмембранным нуклеозидным^{транспортером 9}. Она способствует энергетически независимому трансмембранному транспорту различных пуринов и пиримидиновых^{нуклеозидов 10,11}. У млекопитающих ENT2 — это повсеместно экспрессируемый двунаправленный транспортер, который способствует клеточному поглощению пурина и пиримидиновых нуклеозидов и нуклеобаз. Эта транспортная активность способствует спасению нуклеотидов и помогает поддерживать клеточный метаболический^{гомеостаз 12}. ENT2 также осуществляет транспортировку различных препаратов, полученных из нуклеозид, расширяя свою функциональную значимость за пределы движения эндогенных нуклеозидов и подчёркивая его более широкую физиологическую и клиническую^{значимость 13}. Кроме того, ENT2 был связан с неврологическими^{заболеваниями 14}, метаболизмом^{опухолей 15}, сосудистой^{дисфункцией 16} и метаболизмом клеточной энергии у^{людей 17}. Однако исследования, изучающие роль Ent2 на уровне организмов у дрозофил, остаются ограниченными.

Роль ENT2 в росте и развитии, энергетическом метаболизме, двигательной работе и антиоксидантной способности при изменяющихся температурных условиях до конца не^{изучена 18}. Температура сильно влияет на базальный метаболизм и продолжительность жизни у Drosophila, при этом более высокие температуры выращивания обычно увеличивают метаболическую активность и сокращают продолжительность^{жизни 19}. Эти температурно-зависимые изменения экспрессии генов могут влиять на физиологические пути и, следовательно, модифицировать фенотипические эффекты специфических мутаций^{генов 20}.

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-ассоциированный белок 9 (CRISPR/Cas9) широко применяется у дрозофил для различных операций геномной модификации, таких как устранение, удаление, замена и введение меток, демонстрируя его эффективность^{и надёжность} 21,22,23. Последние достижения показывают, что редакторы баз, основанные на основе CRISPR, также могут использоваться для более тонкой модификации баз у Drosophila, предоставляя новый инструмент для точечных мутаций и точного фенотипического^{контроля 24}. Традиционные методы мутагенеза, включая химический и радиационный мутагенез, а также транспозонные скрининги, могут вызывать генетические^{мутации 25}. Эти подходы часто ограничены низкой эффективностью и высокой случайностью в событиях мутации. В результате исследователям приходится проводить скрининг большого количества особей, чтобы выделить конкретные аллели, представляющие^{интерес 26}. CRISPR/Cas9 позволяет программируемое расщепление направляющей РНК (гРНК) на определённых последовательностях ДНК. Полученные разрывы двойных цепей восстанавливаются через негомологичное соединение концов или гомологично-ориентированное восстановление, вызывая определённые, наследственные мутации и значительно снижая фоновые мутации, которые могут запутать фенотипический^{анализ 27,28}. Мутантные аллели, генерируемые с помощью CRISPR/Cas9, могут поддерживаться в гетерозиготном состоянии благодаря связям с балансирующими хромосомами, такими как Curly O (CyO⁾²⁹. Доказано, что эта стратегия эффективно предотвращает потерю летальных аллелей в гомозиготной форме в генетике дрозофилы. В результате он поддерживает долгосрочную и систематическую оценку фенотипов, включая функциональные исследования при различных температурах или условиях^{окружающей среды 29,30}. Простая конструкция и высокая эффективность CRISPR/Cas9 значительно сократили цикл построения штаммов и повысили стабильность генетического фона. Это особенно важно для изучения долгосрочных факторов окружающей среды, таких как температурная реакция и гомеостаз развития.

Опираясь на эту основу, ген Ent2 у Drosophila melanogaster был выведен с помощью системы CRISPR/Cas9, и был установлен стабильно наследственный мутантный штамм Ent2*/CyO . Систематически оценивались цикл развития, масса тела, двигательные способности и активность антиоксидантных ферментов SOD и CAT. Сравнивая многомерные фенотипы w¹¹¹⁸ и мутантных мух при изменяющихся температурных условиях, данное исследование направлено на представление воспроизводимой стратегии генерации и поддержания мутантных линий, полученных на основе CRISPR, а также предоставить описательную характеристику полученных фенотипов. Эта работа предоставляет методологическую основу и полезный генетический ресурс для будущих исследований, изучающих гены, участвующие в метаболизме и реакциях окружающей среды.

Протокол

1. Проектирование мишень CRISPR/Cas9 для гена Ent2

1. Выберите кандидаты на CRISPR в экзонах 2 и 5 Ent2 (FlyBase ID: FBgn0263916) с помощью CHOPCHOP (v3)³¹ и CCTop (v1.0)³².
2. Референсный геном был определен как Drosophila melanogaster Release 6 (dm6) (RefSeq assembly accession: GCF_000001215.4). Затем были идентифицированы кандидатные gRNA участки. Наконец, выявленные участки были отфильтрованы для получения оптимальных гРНК.
3. Фильтруйте цели по баллу специфичности MIT ≥ 80 (CHOPCHOP), показателю CFD ≤ 0,1 (CCTop), содержанию GC 40%–60% и минимальной дистанции PAM.
4. Оценивайте цели с взвешенным баллом (эффективность 50%, специфичность 30%, оптимизация GC 20%) и выберите две gRNA.
5. Добавьте по одному «G» к 5′-концу каждой gRNA, чтобы удовлетворить требование промотора T7. Используйте следующие gRNA-специфические форвардные олигонуклеотиды для получения полноразмерного шаблона транскрипции sgRNA с помощью ПЦР:
   Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTACT
   AGGTGACGTTAAATCCATCGTGTTTTTTAGAGCTAGAAAATAGC
   Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
   TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGGGTTTTTAGAGCTAGAAATAGC
6. Оставшаяся последовательность каркасов sgRNA обеспечивается универсальным обратным олигонуклеотидом при ПЦР.

2. Подготовка шаблонов транскрипции sgRNA

1. Подготовка шаблонов транскрипции sgRNA
   1. Соберите реакционную смесь для ПЦР объемом 60 мкл с использованием двойного олигонуклеотидного отжига и метода^{ПЦР 33} согласно инструкции производителя. Комбинируйте гРНК-специфический прямой олигонуклеотид (Ent2-sg1-F или Ent2-sg2-F) с универсальным обратным олигонуклеотидом, кодирующем каркас sgRNA, чтобы получить полноразмерный шаблон dsDNA для транскрипции in vitro.
   2. Запрограммировать термоциклер: 95 °C 3 минуты; 35 циклов: 95 °C 30 с, 55 °C 30 с, 72 °C 20 с; затем 72 °C 10 минут; Держите при 12 °C.
2. Очистить шаблон транскрипции
   1. Добавьте 100 мкл ацетата аммония (см. Таблицу материалов) к продукту ПЦР с объёмом 60 мкл; Добавьте 400 мкл безводного этанола; переверните, чтобы перемешать и инкубировать при -20 °C в течение 20 минут.
   2. Центрифуга при 4 °C, 20 000 x г в течение 15 минут; Отбросить супернатанта.
   3. Высушите пеллет на воздухе с открытой трубкой на 10 минут. Суспензировать гранулу в 10 мкл безнуклеазного ddH₂O.
3. Транскрипция gRNA in vitro
   1. Настройте транскрипционную реакцию T7 объемом 10 мкл in vitro, следуя инструкциям из комплекта (см. таблицу материалов).
   2. Инкубировать при 37 °C в течение 35 минут. Добавить 0,5 мкл ДНКазы I (в наборе транскрипции) и инкубировать при 37 °C в течение 15 минут.
4. Очистить gRNA
   1. Разбавить транскрипционную смесь до 60 мкл с помощью безнуклеазного ddH₂O. Добавить 60 мкл насыщенного водой фенол/хлороформ (см. таблицу материалов); кратковременный вихрь и центрифуга при 4 °C, 16 000 x g в течение 5 минут.
   2. Перенесите 45 мкл водной фазы в новую 1,5 мл РНаз-свободную трубку. Добавьте 5 мкл ацетата натрия; Смесь.
   3. Добавьте 125 мкл предварительно охлаждённого безводного этанола; Перемешайте и инкубировать при -20 °C в течение 20–30 минут. Центрифуга при 4 °C, 20 000 x г в течение 15 минут; Отбросить супернатанта.
   4. Промыть гранулы 200 мкл этанола 70% (без РНаз); центрифуга при 4 °C, 20 000 x g в течение 5 минут; Удалите супернатант.
   5. Сушите гранулы при 37 °C до полного испарения этанола. Повторная подвеска в 20 мкл ddH₂O; аликвот и храните при -80 °C.
   6. Измерьте концентрацию гРНК с помощью спектрофотометра NanoDrop и отрегулируйте концентрацию до 250 нг/мкл для инъекции. Обеспечьте чистоту гРНК с соотношением A260/A280 примерно 2,0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы подчеркиваем, что перчатки должны быть ношены на протяжении всего процесса для защиты от РНазы. Все расходники, включая предварительно охлаждённые центрифугные трубки и наконечники пипеток без РНаз, должны использоваться последовательно во время процедуры. Органические реагентные отходы, образующиеся в ходе эксплуатации, должны собираться отдельно в специализированных контейнерах по типу и регулярно транспортироваться на сертифицированное предприятие по утилизации опасных отходов для правильного обращения.

3. Подготовка мРНК Cas9

1. Подготовка шаблона транскрипции
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте насадки и трубки без РНК на этапах, связанных с РНК.
   1. Разморозить экспрессионную плазмиду Cas9 MLM3613 (см. таблицу материалов) на льду. В пробирке без РНазы комбинировать плазмидную ДНК объёмом 20 мкг, 7,5 мкл 10x рестрикционного буфера, 1 мкл PmeI (10 000 U/мл) и ddH₂O без нуклеазы до 75 мкл.
   2. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут. Проверьте полную линеаризацию, загрузив 5 мкл на 1% агарозный гель при 120 В в течение 30 минут.
2. Очистка шаблонов транскрипции
   1. Добавьте 23 мкл 2% додецилсульфата натрия (SDS, см. Таблицу материалов для подробностей) и 0,5 мкл протеиназы K (см. Таблицу материалов для подробностей) к 70 мкл диджеста; Инкубировать при 50 °C в течение 30 минут.
   2. Добавьте 45 мкл хлороформ и 45 мкл тринасыщенного фенола; Вихрь на короткое время; Центрифуга 13 800 x g, 5 минут.
   3. Перенесите 90 мкл водной фазы в новую трубку. Добавьте 10 мкл ацетата натрия (предоставленного набором) и 200 мкл предварительно охлаждённого безводного этанола; микс; инкубировать −20 °C, 30 минут.
   4. Центрифуга 20 000 x g, 4 °C, 15 минут; Отбросить супернатанта. Промой гранулу дважды 100 мкл 70% этанола; центрифуга 20 000 x g, по 2 минуты каждая; Сушка на воздухе.
   5. Растворить ДНК в 20 мкл безнуклеазной ddH₂O; подтвердить >500 нг/мкл.
3. Транскрипция in vitro с ко-каппингом
   1. Настройте реакцию с помощью комплекта транскрипции T7 in vitro с колпачками (см. таблицу материалов) согласно инструкциям производителя.
   2. Инкубировать при 37 °C в течение 2 часов, чтобы получить закрытую мРНК Cas9.
   3. После завершения транскрипционной реакции добавьте 1 мкл ДНКазы (предоставленного в наборе, концентрация 2 U/μL), тщательно перемешайте и инкубирайте при 37°C в течение 15 минут для разложения шаблона ДНК.
4. Добавьте поли(A) хвост
   1. Поднимите РНК до 14 мкл ddH₂O.
   2. Добавьте 2 мкл 10x буфера E . coli Poly(A) полимеразы, 2 мкл АТФ (10 мМ), 1 мкл ингибитора РНазы и 1 мкл поли(A)полимеразы.
   3. Инкубировать при 37 °C в течение 45 минут.
5. Очистить мРНК
   1. Примените реакцию к набору для полного анализа РНК с спин-колонкой (см. таблицу материалов). Загрузите образец на спин-колонку кремнеземной мембраны объемом 2 мл; центрифуга 8 000 x г, 15 с; Поток отброса.
   2. Добавьте 500 мкл буфера RPE в колонку RNeasy, центрифугите при 8000 x г на 15 секунд и сбросьте остаточную жидкость. Повторите этот шаг один раз, затем центрифугуйте 2 минуты и сбросьте остаточную жидкость.
   3. Поместите колонку RNeasy в новую центрифугную трубку на 1,5 мл. Добавьте 30 мкл ddH₂O, не содержат РНаз, центрифугите при 8000 x g на 1 минуту для элюирования РНК. Отрегулируйте концентрацию мРНК до 500 нг/мкл для введения ввода. Храните элюированную РНК при -80 °C.

4. Микроинъекция эмбрионов дрозофилы

1. Подготовка инъекционных образцов
   1. Смешать 15 мкг Cas9 мРНК с 7,5 мкг двухцепочечной гРНК при объёмном соотношении 2:1.
   2. Отрегулировать до 30 мкл водой без РНаз, обработанной DEPC; Держи на льду.
2. Разведение дрозофил
   1. Переведите введённый штамм Drosophila w¹¹¹⁸ в большие пищевые трубки для усиления. Мухи W¹¹¹⁸ использовались в качестве эталонного контроля для представления базового физиологического состояния без эффектов, связанных с балансировщиком.
   2. Держите мух в искусственной климатической камере с температурой 25 °C при влажности 60–70% и цикле 12:12 в течение 14 дней.
   3. В 17:00 на следующий день после 14-дневного периода выращивания (15-й день) собирайте взрослых мух для синхронизации откладки эмбрионов по времени. Это конкретное время сбора гарантирует, что эмбрионы, используемые для инъекций, находятся на стабильной стадии развития. Контроль времени суток важен для минимизации влияния циркадных ритмов на развитие эмбрионов и репродуктивное поведение, обеспечивая экспериментальную воспроизводимость и снижая физиологическую вариабельность между партиями.
3. Микроинъекция дрозофилы
   1. Собирайте взрослых мух для инъекции в клетки мух, примерно по 400 взрослых в каждой клетке. Собирать эмбрионы на агарных пластинах, покрытых дрожжами; Собирайте эмбрионы в течение 60 минут после откладывания яиц и промывайте их на накладных слоях. До инъекции дехорионация не проводилась.
   2. Выровняйте эмбрионы на покрытиях так, чтобы их задние полюсы были наружу, расставленные в упорядоченном порядке сверху вниз. Убедитесь, что игла для инъекции проникает в задний полюс на соответствующую глубину (примерно пятую от длины эмбриона) для стабильной цитоплазматической доставки. В этом исследовании использовалось всего 300 эмбрионов.
   3. Под стереомикроскопом сфокусируйте кончик иглы и эмбрион в одной плоскости.
   4. С помощью инъекционного инструмента проколите задний полюс и введите 0,001 мкл смеси в каждый эмбрион.
   5. Перенос инъекционных эмбрионов в пищевые флаконы; инкубировать при 25 °C, при относительной влажности ~70% (RH) для получения образования P₀ (введённые взрослые особи, выживающие и производящие потомство).

5. Построение стабильных выражений у Drosophila

1. Скрещивание P₀ с мухами Bc/CyO .
   1. Микроинъекция смеси гРНК, направленной на интересующий ген, и белка Cas9 в 300 эмбрионов штамма Drosophila w1118 . После инъекции получите в общей сложности 30 жизнеспособных и плодовитых взрослых особей P0. Скрещивайте каждого взрослого P0 (мозаику) по отдельности с мухами из штамма w1118 , получая 16 однопарных скрещиваний (8 флаконов с самцами P0, скрещиваемых с девственными самками, и 8 флаконов с самоками P0, скрещиваемых с самцами). Поддерживайте все скрещивания при 25 °C при постоянных условиях культуры.
   2. После появления личинок F1 удаляйте родительских мух P0. Извлекать геномную ДНК из потомства F1 и подвергать её ПЦР-анализу для определения взрослых генотипов F1 (Ent2/+).
   3. Генерировать потомство F2 путём одиночных скрещиваний между мухами Bc/CyO . Выберите отдельных взрослых особей F2 и определите их генотип, чтобы определить мух с генотипом Ent2/CyO .
   4. Интеркросс F3-мух (Ent2/CyO) для оценки наличия гомозиготных мутантов. Если гомозиготные мухи не обнаружены, скрещивайте мухи Ent2/CyO на дополнительное поколение, чтобы дополнительно определить, смертельен ли гомозиготный генотип.
2. Экстракция геномной ДНК дрозофилы
   1. Соберите одну или две взрослые мухи в пробирку EP объёмом 1,5 мл и добавьте 110 мкл буфера для экстракции растительной ДНК.
   2. Тщательно гомогенизуйте образцы с помощью мололки для салфеток не менее 3 минут.
   3. Инкубировать гомогенаты в металлической ванне при температуре 65 °C не менее 30 минут.
   4. Добавьте 100 мкл хлороформа, аккуратно переверните смесь для смешивания и проведите вихрь в течение 10 секунд. Центрифугуйте образцы при 14 000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре.
   5. Аккуратно перенесите примерно 65 мкл (или более) супернатанта в новую трубку, добавьте два объёма предварительно охлаждённого абсолютного этанола (предварительно инкубированного при 4 °C не менее 10 минут), аккуратно переверните для смешивания и инкубуйте при -20 °C не менее 15 минут.
   6. Центрифуга берёт образцы при 14 000 об/мин в течение 10 минут при 4 °C и аккуратно выбросить супернатант.
   7. Сушите ДНК-гранулы на воздухе при комнатной температуре или в инкубаторе до полного высыхания, затем снова суспензуйте в соответствующем объёме буфера PB. Для женских (f) образцов добавьте 50 мкл буфера PB, а для мужских (m) образцов — 15 мкл.
3. Усиление ПЦР и секвенирование Сэнгера
   1. Проведите амплификацию ПЦР с использованием специальных праймеров, предназначенных для флангирования верхней и нижней областей целевой точки gRNA.
   2. Очистить продукты ПЦР и подвергнуть их секвенированию Сэнгера. Проанализируйте секвенирующие хроматограммы с помощью программного обеспечения^{SnapGene 34} и согласуйте с эталонной последовательностью дикого типа для сравнительного анализа.
   3. Изучите пиковые графики вблизи гРНК-мишени на предмет перекрывающихся пиков, указывающих на мутации Indel. Выполните пиковое разделение для разрешения смешанных сигналов и подтверждения типа мутации, включая вставки или удаления в целевом участке.
   4. Скрещивание обратно с мужчинами Bc/CyO на 4 поколения для формирования Ent2/CyO.
      Примечание: Было отмечено, что Ent2*/Ent2* и CyO/CyO смертельны на ранних стадиях развития; поэтому гетерозиготы Ent2*/CyO сохраняются.
4. После установления гетерозигот Ent2*/CyO собирайте образцы из той же партии гетерозигот Ent2*/CyO под стереомикроскопом.
5. Случайным образом выберите 20 взрослых мух и взвесьте их с помощью точных весов с разрешением 0,001 г. Сфотографируйте образцы, чтобы зафиксировать фенотипические характеристики.

6. Описательная фенотипическая характеристика

1. Позади 120 самцов и 120 самок (протестированы три флакона для каждой группы, каждая флакон содержала 20 мух) Ent2*/CyO и w¹¹¹⁸ при 22 °C и 25 °C.
2. Записывайте количество смертей еженедельно и строите графики кривой выживания.
3. Создайте 30 случайных пар для спаривания в каждой группе; разрешить спаривание в течение 24 часа;
4. Пересадить взрослых в свежие трубки; заднее потомство.
5. Через 7 дней после эклозии оценивайте успех лазания (≥8 см за 30 секунд) с шестью репликами на группу.
6. Все наблюдения записывались как описательные характеристики мутантной линии и не использовались для вывода о функции генов.

7. Измерять активность антиоксидантных ферментов

1. Соберите 300 самцов и 300 самок взрослых особей (протестировали по три флакона для каждой группы, каждая флакон содержала 100 мух) контролируемых мушек Ent2*/CyO и w¹¹¹⁸ через 5 дней после эклозии, чтобы обеспечить физиологическую зрелость и сопоставимый возраст.
2. Переместить мух в пустые трубки без еды и голодать 2 часа для стандартизации метаболического состояния перед биохимическими анализами.
3. Добавьте одну стальную бусину/трубку; Гомогенизировать при 60 Гц, 2 минуты.
4. Центрифуга 4 °C, 161 x г, 10 мин; Забери супернатант.
5. Измерять общий уровень супероксиддисмутазы (SOD, см. Таблицу материалов для подробностей) и каталазу (CAT, см. Таблицу материалов для подробностей) согласно инструкциям к набору.

8. Статистика и анализ данных

1. Выражайте все данные как среднее ± стандартной ошибке среднего (± SEM).
2. Используйте односторонний ANOVA для сравнения данных о активности ферментов; применяйте трёхсторонний ANOVA (факторы: генотип, температура, пол) для веса тела, способности к лазанию и длины тела. Проведите пост-хок тест Тьюки по HSD,^{когда это уместно 35}.
3. Определите значимость как P < 0,05 для всех статистических тестов.
4. Проанализировать данные о продолжительности жизни с помощью кривых выживаемости и выполнить лог-ранг (Мантел-Кокс), который оценивает наличие значимых различий в траекториях выживаемости между^{экспериментальными когортами 36}.
5. Проводите все анализы и построение графиков в программном обеспечении GraphPad Prism 9.5.0, следуя рекомендациям по^{программному обеспечению 37}.
6. Все статистические анализы проводились исключительно для описательного сравнения, а не для установления причинно-следственных связей.

Результаты

Анализ проектирования и проверки эффективности сайтов таргетирования гена Ent2
Кандидатные мишеневые участки для гена Ent2 были разработаны с использованием платформ CHOPCHOP и CCTop (рисунок 1). Были выбраны две gRNA, направленные на регионы экзонов 2 и экзон 5, на основе критериев специфичности и эффективности. Для подтверждения успешного редактирования генома геномная ДНК случайно выбранных лиц установленной линии Ent2*/CyO была амплификация и подвергнута секвенированию Сэнгера. Секвенирующие хроматограммы показали перекрывающиеся пики, начинающиеся возле целевого участка, что соответствует мутациям вставки/делеции (indel). Дальнейший анализ последовательностей выявил мутации фреймшифта, приводящие к преждевременным стоп-кодонам (рисунок 2). Эти результаты подтверждают, что система CRISPR/Cas9 успешно ввела мутации в целевом локусе Ent2, и демонстрируют осуществимость рабочего процесса редактирования генома.

Рисунок 1. Схематическая диаграмма места нокаута гена Ent2 и расположение праймера обнаружения в геноме . Эта схема иллюстрирует геномную структуру локуса Ent2, выделяя CDS (зелёный), стартовые и стоп-кодоны (красный), мотив gRNA PAM (серый), последовательность gRNA (синий) и праймер амплификации gRNA (жёлтый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Пиковый график результатов секвенирования потомства Drosophila у стабильной линии самоинбридинга Ent2*/CyO. Секвенирующая хроматограмма, подтверждающая генотип потомства, полученный при самоскрещивании стабильной гетерозиготной линии Ent2*/CyO . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Описательные морфологические наблюдения линии Ent2/CyO
Мы наблюдали различия в форме тела между двумя генотипами плодовых мушек при условиях 22 °C и 25 °C с помощью стереомикроскопа (рисунок 3). При обоих температурах и самцы, и самки плодовых мушек демонстрировали типичную форму тела «длинного веретена». Брюшко самок было широким и веретенообразным, кончики крыльев немного выходили за пределы брюшной кончика. Соединение грудной клетки с брюшком у самцов было чётко очерченным, а потемневшая пигментация на конце брюшка — отличительная черта самцов — была заметна. Крылья мушек w¹¹¹⁸ обоих полов были прозрачными с чётко очерченными жилками, и не наблюдалось кривизны кромки крыльев или разрыва вен. В отличие от этого, гетерозиготы Ent2*/CyO демонстрировали заметное изгиб основания крыла и кривизну кромки крыла. При температуре 22 °C, независимо от пола, длина тела плодовых мушек была значительно больше, чем у того же генотипа при 25 °C. Кроме того, длина тела у женщин была значительно больше, чем у самцов при той же температуре. Кроме того, при 22 °C и 25 °C размер тела гетерозигот Ent2*/CyO был меньше, чем у соответствующих мушек w¹¹¹⁸ . Для изучения морфологической основы мы одновременно измеряли длину тела мух (рисунок 3E, Таблица 1). Трёхсторонний ANOVA выявил значимые основные эффекты генотипа (F(1,16)=230,1, P<0,0001), температуры (F(1,16)=19,50, P=0,0004) и пола (F(1,16)=166,9, P<0,0001). Также были отмечены значимые генотипные x половые взаимодействия (F(1,16)=14,96, P=0,0014) и значимое трёхстороннее взаимодействие генотипа x x пола (F(1,16)=6,231, P=0,0239).

Рисунок 3. Контрольная морфология взрослых W¹¹¹⁸ и Ent2*/CyO . Репрезентативные изображения, показывающие характеристики осанки самок (A, C) и самцов (B, D) дрозофил при 22 °C и 25 °C, а также количественное сравнение длины тела (E). ** P < 0.01. Масштабная полоса: 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Анализ выживаемости при различных температурных условиях
Мы статистически проанализировали кривые выживаемости гетерозигот Ent2*/CyO и мух w¹¹¹⁸ при температурах 22 °C и 25 °C (рисунок 4). Результаты показали, что кривая выживаемости у гетерозиготных самок Ent2*/CyO была самой высокой, при этом два человека остались живы на 14-й неделе. Все с¹¹¹⁸ самоками умерли к 14-й неделе. Все гетерозиготные самцы Ent2*/CyO умерли к 12-й неделе, тогда как все мужчины с¹¹¹⁸ умерли к 11-й неделе. Эти данные показывают, что при температуре 22 °C общая продолжительность жизни самок дольше, чем у самцов, и внутри одного пола способность к выживанию гетерозигот Ent2*/CyO немного выше, чем у типа w¹¹¹⁸ .

При температуре 25 °C общий период выживаемости значительно сокращается. Кривая выживаемости у^{w 1118} самок и гетерозиготных самцов Ent2*/CyO снизилась до нуля к 10-й неделе. Кривая выживаемости гетерозиготных самок Ent2*/CyO и самцов w¹¹¹⁸ снизилась до 1–2 особей к 8-й неделе и достигла нуля к 9-й. Разница между мутантом и w¹¹¹⁸ не была статистически значимой (P > 0,05). Эти наблюдения описывают характеристики выживаемости мутантной линии при различных условиях окружающей среды.

Рисунок 4. Кривые выживаемости Drosophila при различных температурных условиях. Анализ выживаемости, сравнивающий продолжительность жизни Ent2*/CyO и мух w¹¹¹⁸ при 22 °C и 25 °C. n=3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Оценка локомоторной активности
Лазающие способности плодовых мушек^Ent2*/CyO сравнивались при двух температурных условиях: 22 °C и 25 °C (рисунок 5, таблица 2). Результаты показывают, что при 22 °C (рисунок 5A) 98,15% из¹¹¹⁸ самок успешно поднялись более чем на 8 см за 30 секунд, тогда как эта доля снизилась до 89,74% у гетерозиготных самок Ent2*/CyO (P < 0,05). Все с¹¹¹⁸ самцами смогли подняться более 8 см, тогда как успех у гетерозиготных самцов Ent2*/CyO составил 98,14% (P < 0,05). При 25 °C (рисунок 5B) все с¹¹¹⁸ самоками (100%) поднялись более чем на 8 см за 30 секунд, но эта доля снизилась до 91,31% у гетерозиготных самок Ent2*/CyO (P < 0,05). Среди мужчин^{с w 1118} 77,28% успешно поднялись более чем на 8 см (P < 0,01), тогда как только 63,57% гетерозиготных самцов Ent2*/CyO достигли этого (P < 0,01). Для дальнейшей оценки работы двигателей была проанализирована доля мушок, поднимающихся выше 15 см (рисунок 5C). Трёхсторонний ANOVA выявил очень значимые основные эффекты секса (F(1,16) = 201,7, P < 0,0001) и температуры подъёма (F(1,16) = 72,60, P < 0,0001) на лазание. Однако основной эффект генотипа был незначим (F(1,16) = 0,59, P = 0,4545). Эти результаты показывают, что двигательная эффективность варьируется в зависимости от экспериментальных условий и может различаться между группами в зависимости от контекста.

Рисунок 5. Сравнение лазающих способностей Drosophila при разных температурах. Количественная оценка высоты при 22 °C (A) и 25 °C (B) и статистика для людей с дальностью лазания > 15 см (C). ** P < 0.01. n=3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Измерение массы тела
Масса тела измерялась в W¹¹¹⁸ и гетерозиготных плодовых мушках Ent2*/CyO при температурах 22 °C и 25 °C (см. рисунок 6). Наши результаты показывают, что по сравнению с w ¹¹¹⁸ мухами вес гетерозигот Ent2*/CyO значительно снижался при 22 °C и 25 °C (P < 0,05 или P < 0,01). Мы наблюдали, что вес самцов с ¹¹¹⁸ мухами значительно ниже, чем у самок с¹¹¹⁸ мухами (P < 0,01). Аналогично, вес самцов гетерозигот Ent2*/CyO был значительно ниже, чем у женских гетерозигот Ent2*/CyO (P < 0,01). Мы провели трёхсторонний ANOVA для оценки независимого и интерактивного влияния генотипа, температуры повышения и пола на массу тела у дрозофилы. Анализ показал значимые основные эффекты генотипа (F(1,16) = 32,38, P < 0,0001), температуры (F(1,16) = 23,31, P = 0,0002) и пола (F(1,16) = 25,52, P = 0,0001) (рисунок 6; Таблица 3). Кроме того, наблюдалось значительное двустороннее взаимодействие между температурой и полом (F(1,16) = 24,76, P = 0,0001), что указывает на различие влияния температуры на массу тела в зависимости от пола. Однако не было обнаружено значимых взаимодействий между генотипом и температурой (F(1,16) = 0,40, P = 0,538), генотипом и полом (F(1,16) = 1,31, P = 0,269) или трёхсторонним взаимодействием (генотип x температура x пол: F(1,16) = 0,48, P = 0,497), что свидетельствует о схождении реакции мутантов Ent2*/CyO на температуру и пол дикой природы.

Учитывая значительную температуру × половое взаимодействие, мы провели простой анализ эффектов, чтобы прояснить его специфическую закономерность. Результаты показали, что у самок мух особи, выращиваемые при 22 °C, имели значительно большую массу тела, чем те, что выращивались при 25 °C (P = 0,0012); однако у мужчин существенной разницы в массе тела между двумя температурами не было (P > 0,9999). Это указывает на то, что снижение температуры с 25–22 °C конкретно увеличивало массу тела самок мух, при этом не оказывая значительного влияния на самцов.

Хотя значимых взаимодействий между генотипом и другими факторами не наблюдалось, сильный основной эффект генотипа указывал на то, что у мутантов Ent2*/CyO обычно меньшая масса тела по всем условиям по сравнению с дикими типами. Пост-хок сравнения также показали, что при 22 °C у самок дикого типа (w¹¹¹⁸:22 °C Самки) вес тела значительно выше, чем у всех мутантных групп (P < 0,0001), и при одинаковой температуре оба генотипа демонстрировали значительный половой диморфизм (самки > самцы, P < 0,01). При 25 °C разница в массе тела между дикими типами и мутантами показала схожую тенденцию, но не достигла статистической значимости. Эти данные описывают характеристики массы тела мутантной линии при различных условиях окружающей среды и биологии.

Рисунок 6. Сравнение массы тела у Drosophila при различных температурах. Измерение массы тела при 22 °C и 25 ° ^C. P > 0,05, * P < 0,05, ** P < 0,01. n=3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Активность антиоксидантных ферментов
Активность антиоксидантных ферментов у w¹¹¹⁸ и гетерозиготных дрозофил Ent2*/CyO сравнивалась при 25 °C (рисунок 7). Наши результаты показали, что по сравнению с мухами w¹¹¹⁸, как самцы, так и самки гетерозиготы Ent2*/CyO демонстрировали значительно сниженную активность каталазы (CAT) и супероксиддисмутазы (SOD) (P < 0,01). Мы также обнаружили, что активность CAT и SOD у самцов с^{w 1118} была значительно выше, чем у самок w¹¹¹⁸ (P < 0,05 или P < 0,01). Аналогично, активность антиоксидантных ферментов у гетерозиготных мужчин Ent2*/CyO была значительно выше, чем у гетерозиготных самок Ent2*/CyO (P < 0,01).

Рисунок 7. Сравнение антиоксидантной способности дрозофилы при оптимальной температуре питания. Ферментативные анализы активности, показывающие активность CAT (A) и SOD (B) у мух Ent2/CyO по сравнению с мухами w¹¹¹⁸ . * P < 0,05, ** P < 0,01. n=3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	Значение p
Генотип	0.8026	1	0.8026	F (1, 16) = 230,1	P<0.0001
Температура	0.06803	1	0.06803	F (1, 16) = 19,50	P=0,0004
Пол	0.5822	1	0.5822	F (1, 16) = 166,9	P<0.0001
Генотип x Температура	0.005798	1	0.005798	F (1, 16) = 1,662	P=0,2156
Генотип x Пол	0.05218	1	0.05218	F (1, 16) = 14.96	P=0,0014
Температура x Пол	0.01323	1	0.01323	F (1, 16) = 3.793	P=0,0692
Генотип x Температура x Пол	0.02173	1	0.02173	F (1, 16) = 6.231	P=0.0239
Остаточные	0.05581	16	0.003488

Таблица 1: Анализ дисперсии измерений длины тела у дрозофил.

Таблица ANOVA	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	Значение p
Пол	0.1483	1	0.1483	F (1, 16) = 201,7	P<0.0001
Генотип	0.0004319	1	0.0004319	F (1, 16) = 0,5877	P=0,4545
Температура	0.05336	1	0.05336	F (1, 16) = 72.60	P<0.0001
Гендер x генотип	0.01418	1	0.01418	F (1, 16) = 19.30	P=0,0005
Пол x Температура	0.007134	1	0.007134	F (1, 16) = 9.708	P=0,0067
Генотип x Температура	0.0135	1	0.0135	F (1, 16) = 18,37	P=0,0006
Пол x Генотип x Температура	0.005903	1	0.005903	F (1, 16) = 8.032	P=0.0120
Остаточные	0.01176	16	0.0007349

Таблица 2: Анализ дисперсии способности к скалолазанию (> 15 см) у дрозофилы.

	SS	DF	MS	F (DFn, DFd)	Значение p
Генотип	4.363E-07	1	4.363E-07	F (1, 16) = 32.38	P<0.0001
Температура	3.141E-07	1	3.141E-07	F (1, 16) = 23.31	P=0,0002
Пол	3.439E-07	1	3.439E-07	F (1, 16) = 25,52	P=0,0001
Генотип x Температура	5.333E-09	1	5.333E-09	F (1, 16) = 0,3958	P=0,5381
Генотип x Пол	1.765E-08	1	1.765E-08	F (1, 16) = 1.310	P=0,2692
Температура x Пол	3.336E-07	1	3.336E-07	F (1, 16) = 24,76	P=0,0001
Генотип x Температура x Пол	6.513E-09	1	6.513E-09	F (1, 16) = 0,4834	P=0,4968
Остаточные	2.156E-07	16	1.347E-08

Таблица 3: Анализ дисперсии измерений массы тела у дрозофил.

Обсуждение

Лор — это эволюционно консервативный белок, влияющий на множество биологических^{процессов 38}. При экспрессии в яйцеклетках Xenopus laevis Ent2 проявляет активность переноса нуклеозидов⁸. Исследования показали, что гомозиготный мутант Ent2 смертелен в поздней личинке или ранней стадии^{куколки 10}. В настоящем исследовании был создан рабочий процесс редактирования генома на основе CRISPR/Cas9 для генерации аллелей, направленных на Ent2, у дрозофилы меланогастер. Наблюдаемая летальность гомозиготных мутантов во время формирования штамма согласуется с предыдущими данными, что подтверждает обоснованность стратегии редактирования генома. В рамках этой структуры гетерозиготная линия Ent2*/CyO , полученная в этом исследовании, служит моделью для документирования фенотипических характеристик, связанных с частичной потерей Ent2. В экспериментальных условиях наблюдались различия в размере тела, массе тела, двигательной активности и уровнях ферментов антиоксидантов между мухами Ent2*/CyO и w¹¹¹⁸ . Эти наблюдения описывают фенотипический профиль установленной мутантной линии.

С точки зрения развития и размера тела, гетерозиготные особи Ent2*/CyO были значительно меньше мух w¹¹¹⁸ при температурах 22 °C и 25 °C. Это различие можно объяснить снижением эффективности транспортировки нуклеозидов из-за отсутствия гена Ent2, что, в свою очередь, влияет на стабильность энергетического обмена и регуляцию экдисзона. Кроме того, побочные эффекты становились более выраженными при 25 °C. Исследования показали, что продолжительность жизни животных зависит от метаболической скорости — концепции, известной как теория метаболической^{скорости 19}. Результаты этого исследования показывают, что повышенный метаболизм у плодовых мушек при высоких температурах может быть тесно связан с дефицитом питательных веществ и задержками развития, вызванными нарушением обмена нуклеозидами. Однако, учитывая использование одного аллеля, полученного из CRISPR, эти результаты следует интерпретировать как описательные наблюдения, а не как прямые доказательства функции генов.

Температурно-зависимые вариации также были заметны в нескольких фенотипических показаниях. Мутант демонстрирует умеренное продление жизни при температуре 22 °C, особенно у самок, что соответствует предыдущим^{исследованиям 39,40}. В отличие от этого, при 25 °C разница в сроке службы уменьшается или даже исчезает. Как пойкилотермические организмы, плодовые мушки демонстрируют более высокий метаболизм и, следовательно, более короткую продолжительность жизни при повышенных^{температурах 41,42}, что соответствует результатам данного исследования. В этом контексте наблюдаемые закономерности могут отражать общие физиологические реакции на температуру.

Двигательная активность и активность антиоксидантных ферментов также варьировалась в зависимости от генотипа, пола и температурных условий. У мух Ent2/CyO наблюдались снижение лазания и снижение активности SOD и CAT при определённых условиях. Предыдущие исследования связывали нуклеозидные транспортеры с метаболизмом NAD⁺, функцией митохондрий и регуляцией окислительного^{стресса} 17,43,44,45,46,47. Хотя эти отчёты дают возможный биологический контекст, текущие данные ограничиваются фенотипической характеристикой и не устанавливают механистических связей между Ent2 и этими путями.

Наши результаты также показывают, что при тех же условиях самцы плодовых мушек обычно демонстрируют более высокую антиоксидантную ферментационную активность, чем самки плодовых^{мушек 39,48}. Это означает, что гендерные факторы могут регулировать антиоксидантный ответ через различные сигнальные пути. Транскрипционные факторы, связанные с антиоксидантными ответами, такие как Nrf2/CncC и их гены-мишени по последующему потоку, демонстрируют различия экспрессии между разными полами, что влияет на общую антиоксидантную^{способность 49}. Это наблюдение согласуется с сообщениями о половых различиях в устойчивости к окислительному стрессу и антиоксидантной защите у Drosophila, где у самок обычно более низкий уровень ROS и более высокая базовая активность антиоксидантных ферментов по сравнению с самцами, что может способствовать различиям в стрессоустойчивости и продолжительности жизни между^{полами 50}. Эти наблюдения дополнительно подчёркивают важность учёта биологических переменных, таких как пол, при характеристике мутантных фенотипов.

С методологической точки зрения это исследование описывает воспроизводимый рабочий процесс для генерации и валидации мутаций, опосредованных CRISPR/Cas9, у дрозофилы. Точный дизайн и выбор gRNA имеют решающее значение, поскольку эффективные gRNA определяют эффективность целевого расщепления Cas9 и минимизируют непреднамеренные^{изменения 21,51}. Высокоточная микроинъекция компонентов Cas9 и gRNA в эмбрионы также имеет решающее значение, поскольку неэффективные инъекции могут привести к низким показателям редактирования или^{мозаицизму.} Тщательное подтверждение генотипа с помощью секвенирования гарантирует наличие запланированных правок и исключает нецелевые или неполные правки, тем самым укрепляя целостность модели⁵³. В частности, использование хромосомы балансировщика CyO было необходимым для поддержания мутантного аллеля Ent2 из-за летальности гомозиготных мутантов. Этот подход широко используется в генетике дрозофил для сохранения вредных мутаций и обеспечения дальнейших анализов. Настоящее исследование демонстрирует практическое применение этой стратегии в рамках редактирования CRISPR/Cas9.

Следует учитывать несколько ограничений. Во-первых, фенотипические анализы проводились с использованием одной мутантной линии, полученной на основе CRISPR. Хорошо известно, что редактирование CRISPR/Cas9 может генерировать гетерогенные аллели, и обычно рекомендуется анализ нескольких независимых линий для укрепления генетических выводов. Поэтому представленные здесь результаты следует интерпретировать как предварительная характеристика одного мутантного аллеля. Будущие исследования с включением дополнительных независимо генерируемых аллелей Ent2 будут необходимы для повышения устойчивости выводов... Во-вторых, мутантная линия поддерживалась с помощью балансирующей хромосомы CyO, тогда как контрольная группа (w¹¹¹⁸) не несёт балансирующую хромосому. Поскольку сами балансирующие хромосомы могут влиять на развитие и физиологические особенности, отсутствие контроля, сопоставленного с балансом, может стать источником путаницы. Это ограничение следует учитывать при интерпретации фенотипических различий между генотипами. В-третьих, такие условия окружающей среды, как влажность, световой цикл и питание, поддерживались в стандартных лабораторных условиях, но не были систематически изменяемыми. Поскольку эти факторы могут влиять на метаболизм и стрессовые реакции, будущие исследования с использованием контролируемых градиентов окружающей среды обеспечат более комплексную оценку взаимодействий фенотипа и окружающей среды.

В итоге это исследование устанавливает рабочий процесс на основе CRISPR/Cas9 для генерации и поддержания мутантных аллелей Ent2 у Drosophila melanogaster и даёт описательную характеристику полученной гетерозиготной линии при различных условиях окружающей среды. Результаты подчёркивают применимость этого подхода для изучения генов с летальными фенотипами и подчеркивают важность экспериментальных проектных аспектов, включая генетический фон, балансирующие хромосомы и переменные окружающей среды.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Аммоний ацетат	Sigma	A1542
Набор для исследования каталазы (CAT) (метод видимого света) (метод молибдат-аммония)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1
Додециллсульфат	Sigma	L3771
Устройство для инъекции	Eppendorf FemtoJet	4i
Линейный плазмид: MLM3613	Addgene	42251
Микроскоп	OLYMPUS	CKX3-SLP
Набор mMESSAGE mMACHINE T7	Thermo Fisher	AM1344
Набор для транскрипции mMESSAGE mMACHINE T7	Thermo Fisher	AM1344
Рестрикционный фермент PmeI	NEB	R0560S
Поли(А) полимераза	NEB	M0276S
Протеаза K	Thermo Fisher	EO0491
Набор RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Система массового производства РНК T7 RiboMAX Express	Promega	P1320
Набор T7 RiboMAX Kit	Promega	P1320
Набор для исследования общей супероксиддисмутазы (T-SOD) (метод гидроксиламин)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-1
w1118 Drosophila	Fangjing Biology
Фенол/хлороформ, насыщенный водой	Sigma	P2069