Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация и характеристика штамма Drosophila melanogaster с помощью CRISPR/Cas9

62 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69546

⸱

7 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2Innovative Team for Medicinal Plant Resources and Breeding, Institute of Special Agricultural Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences

В этой статье

Краткое содержание

Равновесный нуклеозидный транспортер 2 (ENT2) — это консервативный трансмембранный белок, участвующий в транспорте нуклеозидов и клеточном метаболизме. В этом исследовании был разработан рабочий процесс редактирования генома на основе CRISPR/Cas9 для генерации аллеля, направленного на Ent2, у дрозофилы меланогастер. Была построена и поддержана стабильная гетерозиготная линия Ent2*/CyO с использованием стратегии балансирующих хромосом. В данной работе описывается проектирование, генерация и молекулярная валидация мутантной линии, а также её фенотипическая характеристика при различных температурных условиях. Установленный рабочий процесс и мутантный штамм предоставляют практическую основу для изучения генов с гомозиготными летальными фенотипами и для изучения температурно-связанной фенотипической вариации у Drosophila.

Аннотация

В этом исследовании был использован подход редактирования генома на основе CRISPR/Cas9 для введения мутаций в равновесный ген нуклеозидного транспортера 2 (Ent2) у Drosophila melanogaster. Направляющие РНК, направленные на кодирующую область Ent2, были разработаны и совместно введены с мРНК Cas9 в эмбрионыw 1118. Мутантные аллели были идентифицированы с помощью секвенирования Сэнгера и поддерживались как стабильная гетерозиготная линия Ent2*/CyO с использованием балансирующей хромосомы. Впоследствии мы оценили массу тела, способность к лазанию, уровень выживаемости и активность супероксиддисмутазы (SOD) и каталазы (CAT) у плодовых мушек при температурах 22 °C и 25 °C соответственно. Результаты показывают, что при 22 °C и 25 °C длина тела и вес плодовых мушек Ent2*/CyO значительно уменьшились по сравнению с w1118, и их развитие задержалось. При температуре 22 °C общая продолжительность жизни мух Ent2*/CyO была немного длиннее, чем у w1118, тогда как при 25 °C существенных различий не наблюдалось. Что касается подвижности, то лазание гетерозиготных мух было значительно ниже, чем у w1118 при обеих температурах, при этом самцы страдали сильнее. Кроме того, активность антиоксидантных ферментов CAT и SOD у плодовых мушек Ent2*/CyO была значительно снижена, что свидетельствует о явном снижении антиоксидантной способности. Эти результаты описывают фенотипический профиль мутантной линии Ent2, сгенерированной с помощью CRISPR, и демонстрируют возможность сочетания редактирования генома с балансирующими стратегиями хромосом у дрозофилы. Это исследование предоставляет методологическую основу и генетический ресурс для будущих исследований генов, связанных с метаболизмом и реакциями окружающей среды.

Введение

Drosophila melanogaster остаётся одним из самых широко используемых модельных организмов в области генетики и биологииразвития. 1. Он характеризуется коротким жизненным циклом, быстрым размножением, устоявшимися инструментами генетической манипуляции и полностью аннотированнымгеномом 2,3. Этот вид широко применяется в изучении функции генов, метаболической регуляции и адаптивности к окружающейсреде 4,5. Нуклеозиды и их производные, такие как АТФ, играют центральную роль в генерации клеточной энергии, синтезе нуклеиновых кислот и передаче сигналов у дрозофилы, отражая сохранённую метаболическую регуляцию междуметазоями 6. Пуринергические сигнальные пути у Drosophila, зависящие от внеклеточных аденозиновых и нуклеозидных транспортных механизмов, подчёркивают функциональную роль движения нуклеозидов через мембраны в координации энергетических и сигнальныхответов 7. Среди этих процессов транспорт нуклеозидов через цитоплазматическую мембрану в первую очередь опосредован семейством равновесных нуклеозидных транспортёров (ENT), при этом DmENT2 проявляет функциональную транспортную активность у Drosophila8.

Семейство ЛОР-инфекций включает несколько подтипов, среди которых ENT2 является широко изученным трансмембранным нуклеозиднымтранспортером 9. Она способствует энергетически независимому трансмембранному транспорту различных пуринов и пиримидиновыхнуклеозидов 10,11. У млекопитающих ENT2 — это повсеместно экспрессируемый двунаправленный транспортер, который способствует клеточному поглощению пурина и пиримидиновых нуклеозидов и нуклеобаз. Эта транспортная активность способствует спасению нуклеотидов и помогает поддерживать клеточный метаболическийгомеостаз 12. ENT2 также осуществляет транспортировку различных препаратов, полученных из нуклеозид, расширяя свою функциональную значимость за пределы движения эндогенных нуклеозидов и подчёркивая его более широкую физиологическую и клиническуюзначимость 13. Кроме того, ENT2 был связан с неврологическимизаболеваниями 14, метаболизмомопухолей 15, сосудистойдисфункцией 16 и метаболизмом клеточной энергии улюдей 17. Однако исследования, изучающие роль Ent2 на уровне организмов у дрозофил, остаются ограниченными.

Роль ENT2 в росте и развитии, энергетическом метаболизме, двигательной работе и антиоксидантной способности при изменяющихся температурных условиях до конца неизучена 18. Температура сильно влияет на базальный метаболизм и продолжительность жизни у Drosophila, при этом более высокие температуры выращивания обычно увеличивают метаболическую активность и сокращают продолжительностьжизни 19. Эти температурно-зависимые изменения экспрессии генов могут влиять на физиологические пути и, следовательно, модифицировать фенотипические эффекты специфических мутацийгенов 20.

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-ассоциированный белок 9 (CRISPR/Cas9) широко применяется у дрозофил для различных операций геномной модификации, таких как устранение, удаление, замена и введение меток, демонстрируя его эффективностьи надёжность 21,22,23. Последние достижения показывают, что редакторы баз, основанные на основе CRISPR, также могут использоваться для более тонкой модификации баз у Drosophila, предоставляя новый инструмент для точечных мутаций и точного фенотипическогоконтроля 24. Традиционные методы мутагенеза, включая химический и радиационный мутагенез, а также транспозонные скрининги, могут вызывать генетическиемутации 25. Эти подходы часто ограничены низкой эффективностью и высокой случайностью в событиях мутации. В результате исследователям приходится проводить скрининг большого количества особей, чтобы выделить конкретные аллели, представляющиеинтерес 26. CRISPR/Cas9 позволяет программируемое расщепление направляющей РНК (гРНК) на определённых последовательностях ДНК. Полученные разрывы двойных цепей восстанавливаются через негомологичное соединение концов или гомологично-ориентированное восстановление, вызывая определённые, наследственные мутации и значительно снижая фоновые мутации, которые могут запутать фенотипическийанализ 27,28. Мутантные аллели, генерируемые с помощью CRISPR/Cas9, могут поддерживаться в гетерозиготном состоянии благодаря связям с балансирующими хромосомами, такими как Curly O (CyO)29. Доказано, что эта стратегия эффективно предотвращает потерю летальных аллелей в гомозиготной форме в генетике дрозофилы. В результате он поддерживает долгосрочную и систематическую оценку фенотипов, включая функциональные исследования при различных температурах или условияхокружающей среды 29,30. Простая конструкция и высокая эффективность CRISPR/Cas9 значительно сократили цикл построения штаммов и повысили стабильность генетического фона. Это особенно важно для изучения долгосрочных факторов окружающей среды, таких как температурная реакция и гомеостаз развития.

Опираясь на эту основу, ген Ent2 у Drosophila melanogaster был выведен с помощью системы CRISPR/Cas9, и был установлен стабильно наследственный мутантный штамм Ent2*/CyO . Систематически оценивались цикл развития, масса тела, двигательные способности и активность антиоксидантных ферментов SOD и CAT. Сравнивая многомерные фенотипы w1118 и мутантных мух при изменяющихся температурных условиях, данное исследование направлено на представление воспроизводимой стратегии генерации и поддержания мутантных линий, полученных на основе CRISPR, а также предоставить описательную характеристику полученных фенотипов. Эта работа предоставляет методологическую основу и полезный генетический ресурс для будущих исследований, изучающих гены, участвующие в метаболизме и реакциях окружающей среды.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Проектирование мишень CRISPR/Cas9 для гена Ent2

  1. Выберите кандидаты на CRISPR в экзонах 2 и 5 Ent2 (FlyBase ID: FBgn0263916) с помощью CHOPCHOP (v3)31 и CCTop (v1.0)32.
  2. Референсный геном был определен как Drosophila melanogaster Release 6 (dm6) (RefSeq assembly accession: GCF_000001215.4). Затем были идентифицированы кандидатные gRNA участки. Наконец, выявленные участки были отфильтрованы для получения оптимальных гРНК.
  3. Фильтруйте цели по баллу специфичности MIT ≥ 80 (CHOPCHOP), показателю CFD ≤ 0,1 (CCTop), содержанию GC 40%–60% и минимальной дистанции PAM.
  4. Оценивайте цели с взвешенным баллом (эффективность 50%, специфичность 30%, оптимизация GC 20%) и выберите две gRNA.
  5. Добавьте по одному «G» к 5′-концу каждой gRNA, чтобы удовлетворить требование промотора T7. Используйте следующие gRNA-специфические форвардные олигонуклеотиды для получения полноразмерного шаблона транскрипции sgRNA с помощью ПЦР:
    Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTACT
    AGGTGACGTTAAATCCATCGTGTTTTTTAGAGCTAGAAAATAGC
    Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
    TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGGGTTTTTAGAGCTAGAAATAGC
  6. Оставшаяся последовательность каркасов sgRNA обеспечивается универсальным обратным олигонуклеотидом при ПЦР.

2. Подготовка шаблонов транскрипции sgRNA

  1. Подготовка шаблонов транскрипции sgRNA
    1. Соберите реакционную смесь для ПЦР объемом 60 мкл с использованием двойного олигонуклеотидного отжига и методаПЦР 33 согласно инструкции производителя. Комбинируйте гРНК-специфический прямой олигонуклеотид (Ent2-sg1-F или Ent2-sg2-F) с универсальным обратным олигонуклеотидом, кодирующем каркас sgRNA, чтобы получить полноразмерный шаблон dsDNA для транскрипции in vitro.
    2. Запрограммировать термоциклер: 95 °C 3 минуты; 35 циклов: 95 °C 30 с, 55 °C 30 с, 72 °C 20 с; затем 72 °C 10 минут; Держите при 12 °C.
  2. Очистить шаблон транскрипции
    1. Добавьте 100 мкл ацетата аммония (см. Таблицу материалов) к продукту ПЦР с объёмом 60 мкл; Добавьте 400 мкл безводного этанола; переверните, чтобы перемешать и инкубировать при -20 °C в течение 20 минут.
    2. Центрифуга при 4 °C, 20 000 x г в течение 15 минут; Отбросить супернатанта.
    3. Высушите пеллет на воздухе с открытой трубкой на 10 минут. Суспензировать гранулу в 10 мкл безнуклеазного ddH₂O.
  3. Транскрипция gRNA in vitro
    1. Настройте транскрипционную реакцию T7 объемом 10 мкл in vitro, следуя инструкциям из комплекта (см. таблицу материалов).
    2. Инкубировать при 37 °C в течение 35 минут. Добавить 0,5 мкл ДНКазы I (в наборе транскрипции) и инкубировать при 37 °C в течение 15 минут.
  4. Очистить gRNA
    1. Разбавить транскрипционную смесь до 60 мкл с помощью безнуклеазного ddH₂O. Добавить 60 мкл насыщенного водой фенол/хлороформ (см. таблицу материалов); кратковременный вихрь и центрифуга при 4 °C, 16 000 x g в течение 5 минут.
    2. Перенесите 45 мкл водной фазы в новую 1,5 мл РНаз-свободную трубку. Добавьте 5 мкл ацетата натрия; Смесь.
    3. Добавьте 125 мкл предварительно охлаждённого безводного этанола; Перемешайте и инкубировать при -20 °C в течение 20–30 минут. Центрифуга при 4 °C, 20 000 x г в течение 15 минут; Отбросить супернатанта.
    4. Промыть гранулы 200 мкл этанола 70% (без РНаз); центрифуга при 4 °C, 20 000 x g в течение 5 минут; Удалите супернатант.
    5. Сушите гранулы при 37 °C до полного испарения этанола. Повторная подвеска в 20 мкл ddH₂O; аликвот и храните при -80 °C.
    6. Измерьте концентрацию гРНК с помощью спектрофотометра NanoDrop и отрегулируйте концентрацию до 250 нг/мкл для инъекции. Обеспечьте чистоту гРНК с соотношением A260/A280 примерно 2,0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы подчеркиваем, что перчатки должны быть ношены на протяжении всего процесса для защиты от РНазы. Все расходники, включая предварительно охлаждённые центрифугные трубки и наконечники пипеток без РНаз, должны использоваться последовательно во время процедуры. Органические реагентные отходы, образующиеся в ходе эксплуатации, должны собираться отдельно в специализированных контейнерах по типу и регулярно транспортироваться на сертифицированное предприятие по утилизации опасных отходов для правильного обращения.

3. Подготовка мРНК Cas9

  1. Подготовка шаблона транскрипции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте насадки и трубки без РНК на этапах, связанных с РНК.
    1. Разморозить экспрессионную плазмиду Cas9 MLM3613 (см. таблицу материалов) на льду. В пробирке без РНазы комбинировать плазмидную ДНК объёмом 20 мкг, 7,5 мкл 10x рестрикционного буфера, 1 мкл PmeI (10 000 U/мл) и ddH₂O без нуклеазы до 75 мкл.
    2. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут. Проверьте полную линеаризацию, загрузив 5 мкл на 1% агарозный гель при 120 В в течение 30 минут.
  2. Очистка шаблонов транскрипции
    1. Добавьте 23 мкл 2% додецилсульфата натрия (SDS, см. Таблицу материалов для подробностей) и 0,5 мкл протеиназы K (см. Таблицу материалов для подробностей) к 70 мкл диджеста; Инкубировать при 50 °C в течение 30 минут.
    2. Добавьте 45 мкл хлороформ и 45 мкл тринасыщенного фенола; Вихрь на короткое время; Центрифуга 13 800 x g, 5 минут.
    3. Перенесите 90 мкл водной фазы в новую трубку. Добавьте 10 мкл ацетата натрия (предоставленного набором) и 200 мкл предварительно охлаждённого безводного этанола; микс; инкубировать −20 °C, 30 минут.
    4. Центрифуга 20 000 x g, 4 °C, 15 минут; Отбросить супернатанта. Промой гранулу дважды 100 мкл 70% этанола; центрифуга 20 000 x g, по 2 минуты каждая; Сушка на воздухе.
    5. Растворить ДНК в 20 мкл безнуклеазной ddH₂O; подтвердить >500 нг/мкл.
  3. Транскрипция in vitro с ко-каппингом
    1. Настройте реакцию с помощью комплекта транскрипции T7 in vitro с колпачками (см. таблицу материалов) согласно инструкциям производителя.
    2. Инкубировать при 37 °C в течение 2 часов, чтобы получить закрытую мРНК Cas9.
    3. После завершения транскрипционной реакции добавьте 1 мкл ДНКазы (предоставленного в наборе, концентрация 2 U/μL), тщательно перемешайте и инкубирайте при 37°C в течение 15 минут для разложения шаблона ДНК.
  4. Добавьте поли(A) хвост
    1. Поднимите РНК до 14 мкл ddH₂O.
    2. Добавьте 2 мкл 10x буфера E . coli Poly(A) полимеразы, 2 мкл АТФ (10 мМ), 1 мкл ингибитора РНазы и 1 мкл поли(A)полимеразы.
    3. Инкубировать при 37 °C в течение 45 минут.
  5. Очистить мРНК
    1. Примените реакцию к набору для полного анализа РНК с спин-колонкой (см. таблицу материалов). Загрузите образец на спин-колонку кремнеземной мембраны объемом 2 мл; центрифуга 8 000 x г, 15 с; Поток отброса.
    2. Добавьте 500 мкл буфера RPE в колонку RNeasy, центрифугите при 8000 x г на 15 секунд и сбросьте остаточную жидкость. Повторите этот шаг один раз, затем центрифугуйте 2 минуты и сбросьте остаточную жидкость.
    3. Поместите колонку RNeasy в новую центрифугную трубку на 1,5 мл. Добавьте 30 мкл ddH₂O, не содержат РНаз, центрифугите при 8000 x g на 1 минуту для элюирования РНК. Отрегулируйте концентрацию мРНК до 500 нг/мкл для введения ввода. Храните элюированную РНК при -80 °C.

4. Микроинъекция эмбрионов дрозофилы

  1. Подготовка инъекционных образцов
    1. Смешать 15 мкг Cas9 мРНК с 7,5 мкг двухцепочечной гРНК при объёмном соотношении 2:1.
    2. Отрегулировать до 30 мкл водой без РНаз, обработанной DEPC; Держи на льду.
  2. Разведение дрозофил
    1. Переведите введённый штамм Drosophila w1118 в большие пищевые трубки для усиления. Мухи W1118 использовались в качестве эталонного контроля для представления базового физиологического состояния без эффектов, связанных с балансировщиком.
    2. Держите мух в искусственной климатической камере с температурой 25 °C при влажности 60–70% и цикле 12:12 в течение 14 дней.
    3. В 17:00 на следующий день после 14-дневного периода выращивания (15-й день) собирайте взрослых мух для синхронизации откладки эмбрионов по времени. Это конкретное время сбора гарантирует, что эмбрионы, используемые для инъекций, находятся на стабильной стадии развития. Контроль времени суток важен для минимизации влияния циркадных ритмов на развитие эмбрионов и репродуктивное поведение, обеспечивая экспериментальную воспроизводимость и снижая физиологическую вариабельность между партиями.
  3. Микроинъекция дрозофилы
    1. Собирайте взрослых мух для инъекции в клетки мух, примерно по 400 взрослых в каждой клетке. Собирать эмбрионы на агарных пластинах, покрытых дрожжами; Собирайте эмбрионы в течение 60 минут после откладывания яиц и промывайте их на накладных слоях. До инъекции дехорионация не проводилась.
    2. Выровняйте эмбрионы на покрытиях так, чтобы их задние полюсы были наружу, расставленные в упорядоченном порядке сверху вниз. Убедитесь, что игла для инъекции проникает в задний полюс на соответствующую глубину (примерно пятую от длины эмбриона) для стабильной цитоплазматической доставки. В этом исследовании использовалось всего 300 эмбрионов.
    3. Под стереомикроскопом сфокусируйте кончик иглы и эмбрион в одной плоскости.
    4. С помощью инъекционного инструмента проколите задний полюс и введите 0,001 мкл смеси в каждый эмбрион.
    5. Перенос инъекционных эмбрионов в пищевые флаконы; инкубировать при 25 °C, при относительной влажности ~70% (RH) для получения образования P₀ (введённые взрослые особи, выживающие и производящие потомство).

5. Построение стабильных выражений у Drosophila

  1. Скрещивание P₀ с мухами Bc/CyO .
    1. Микроинъекция смеси гРНК, направленной на интересующий ген, и белка Cas9 в 300 эмбрионов штамма Drosophila w1118 . После инъекции получите в общей сложности 30 жизнеспособных и плодовитых взрослых особей P0. Скрещивайте каждого взрослого P0 (мозаику) по отдельности с мухами из штамма w1118 , получая 16 однопарных скрещиваний (8 флаконов с самцами P0, скрещиваемых с девственными самками, и 8 флаконов с самоками P0, скрещиваемых с самцами). Поддерживайте все скрещивания при 25 °C при постоянных условиях культуры.
    2. После появления личинок F1 удаляйте родительских мух P0. Извлекать геномную ДНК из потомства F1 и подвергать её ПЦР-анализу для определения взрослых генотипов F1 (Ent2/+).
    3. Генерировать потомство F2 путём одиночных скрещиваний между мухами Bc/CyO . Выберите отдельных взрослых особей F2 и определите их генотип, чтобы определить мух с генотипом Ent2/CyO .
    4. Интеркросс F3-мух (Ent2/CyO) для оценки наличия гомозиготных мутантов. Если гомозиготные мухи не обнаружены, скрещивайте мухи Ent2/CyO на дополнительное поколение, чтобы дополнительно определить, смертельен ли гомозиготный генотип.
  2. Экстракция геномной ДНК дрозофилы
    1. Соберите одну или две взрослые мухи в пробирку EP объёмом 1,5 мл и добавьте 110 мкл буфера для экстракции растительной ДНК.
    2. Тщательно гомогенизуйте образцы с помощью мололки для салфеток не менее 3 минут.
    3. Инкубировать гомогенаты в металлической ванне при температуре 65 °C не менее 30 минут.
    4. Добавьте 100 мкл хлороформа, аккуратно переверните смесь для смешивания и проведите вихрь в течение 10 секунд. Центрифугуйте образцы при 14 000 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре.
    5. Аккуратно перенесите примерно 65 мкл (или более) супернатанта в новую трубку, добавьте два объёма предварительно охлаждённого абсолютного этанола (предварительно инкубированного при 4 °C не менее 10 минут), аккуратно переверните для смешивания и инкубуйте при -20 °C не менее 15 минут.
    6. Центрифуга берёт образцы при 14 000 об/мин в течение 10 минут при 4 °C и аккуратно выбросить супернатант.
    7. Сушите ДНК-гранулы на воздухе при комнатной температуре или в инкубаторе до полного высыхания, затем снова суспензуйте в соответствующем объёме буфера PB. Для женских (f) образцов добавьте 50 мкл буфера PB, а для мужских (m) образцов — 15 мкл.
  3. Усиление ПЦР и секвенирование Сэнгера
    1. Проведите амплификацию ПЦР с использованием специальных праймеров, предназначенных для флангирования верхней и нижней областей целевой точки gRNA.
    2. Очистить продукты ПЦР и подвергнуть их секвенированию Сэнгера. Проанализируйте секвенирующие хроматограммы с помощью программного обеспеченияSnapGene 34 и согласуйте с эталонной последовательностью дикого типа для сравнительного анализа.
    3. Изучите пиковые графики вблизи гРНК-мишени на предмет перекрывающихся пиков, указывающих на мутации Indel. Выполните пиковое разделение для разрешения смешанных сигналов и подтверждения типа мутации, включая вставки или удаления в целевом участке.
    4. Скрещивание обратно с мужчинами Bc/CyO на 4 поколения для формирования Ent2/CyO.
      Примечание: Было отмечено, что Ent2*/Ent2* и CyO/CyO смертельны на ранних стадиях развития; поэтому гетерозиготы Ent2*/CyO сохраняются.
  4. После установления гетерозигот Ent2*/CyO собирайте образцы из той же партии гетерозигот Ent2*/CyO под стереомикроскопом.
  5. Случайным образом выберите 20 взрослых мух и взвесьте их с помощью точных весов с разрешением 0,001 г. Сфотографируйте образцы, чтобы зафиксировать фенотипические характеристики.

6. Описательная фенотипическая характеристика

  1. Позади 120 самцов и 120 самок (протестированы три флакона для каждой группы, каждая флакон содержала 20 мух) Ent2*/CyO и w1118 при 22 °C и 25 °C.
  2. Записывайте количество смертей еженедельно и строите графики кривой выживания.
  3. Создайте 30 случайных пар для спаривания в каждой группе; разрешить спаривание в течение 24 часа;
  4. Пересадить взрослых в свежие трубки; заднее потомство.
  5. Через 7 дней после эклозии оценивайте успех лазания (≥8 см за 30 секунд) с шестью репликами на группу.
  6. Все наблюдения записывались как описательные характеристики мутантной линии и не использовались для вывода о функции генов.

7. Измерять активность антиоксидантных ферментов

  1. Соберите 300 самцов и 300 самок взрослых особей (протестировали по три флакона для каждой группы, каждая флакон содержала 100 мух) контролируемых мушек Ent2*/CyO и w1118 через 5 дней после эклозии, чтобы обеспечить физиологическую зрелость и сопоставимый возраст.
  2. Переместить мух в пустые трубки без еды и голодать 2 часа для стандартизации метаболического состояния перед биохимическими анализами.
  3. Добавьте одну стальную бусину/трубку; Гомогенизировать при 60 Гц, 2 минуты.
  4. Центрифуга 4 °C, 161 x г, 10 мин; Забери супернатант.
  5. Измерять общий уровень супероксиддисмутазы (SOD, см. Таблицу материалов для подробностей) и каталазу (CAT, см. Таблицу материалов для подробностей) согласно инструкциям к набору.

8. Статистика и анализ данных

  1. Выражайте все данные как среднее ± стандартной ошибке среднего (figure-protocol-1± SEM).
  2. Используйте односторонний ANOVA для сравнения данных о активности ферментов; применяйте трёхсторонний ANOVA (факторы: генотип, температура, пол) для веса тела, способности к лазанию и длины тела. Проведите пост-хок тест Тьюки по HSD,когда это уместно 35.
  3. Определите значимость как P < 0,05 для всех статистических тестов.
  4. Проанализировать данные о продолжительности жизни с помощью кривых выживаемости и выполнить лог-ранг (Мантел-Кокс), который оценивает наличие значимых различий в траекториях выживаемости междуэкспериментальными когортами 36.
  5. Проводите все анализы и построение графиков в программном обеспечении GraphPad Prism 9.5.0, следуя рекомендациям попрограммному обеспечению 37.
  6. Все статистические анализы проводились исключительно для описательного сравнения, а не для установления причинно-следственных связей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Анализ проектирования и проверки эффективности сайтов таргетирования гена Ent2
Кандидатные мишеневые участки для гена Ent2 были разработаны с использованием платформ CHOPCHOP и CCTop (рисунок 1). Были выбраны две gRNA, направленные на регионы экзонов 2 и экзон 5, на основе критериев специфичности и эффективности. Для подтверждения успешного редактирования генома геномная ДНК случайно выбранных лиц установленной линии Ent2*/CyO была амплифика...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Лор — это эволюционно консервативный белок, влияющий на множество биологическихпроцессов 38. При экспрессии в яйцеклетках Xenopus laevis Ent2 проявляет активность переноса нуклеозидов8. Исследования показали, что гомозиготный мутант Ent2 смертелен в поздней личинке или ранней стадиикуколки 10. В настоящем исследовании был создан рабочий процесс редактирования генома на основе CRISPR/Cas9 дл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У всех авторов нет конфликтов интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

Поддержать это исследование Программой развития науки и технологий провинции Цзилинь (проект No 20230505044ZP).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

```html
Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Аммоний ацетатSigma A1542
Набор для исследования каталазы (CAT) (метод видимого света) (метод молибдат-аммония)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA007-1-1
ДодециллсульфатSigmaL3771
Устройство для инъекцииEppendorf FemtoJet 4i
Линейный плазмид: MLM3613Addgene42251
МикроскопOLYMPUS CKX3-SLP
Набор mMESSAGE mMACHINE T7Thermo FisherAM1344
Набор для транскрипции mMESSAGE mMACHINE T7Thermo FisherAM1344
Рестрикционный фермент PmeINEB R0560S
Поли(А) полимеразаNEBM0276S
Протеаза KThermo FisherEO0491
Набор RNeasy Mini KitQIAGEN74104
Система массового производства РНК T7 RiboMAX ExpressPromega P1320
Набор T7 RiboMAX KitPromega P1320
Набор для исследования общей супероксиддисмутазы (T-SOD) (метод гидроксиламин)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-1
w1118 Drosophila Fangjing Biology
Фенол/хлороформ, насыщенный водойSigmaP2069
```

Ссылки

  1. Tolwinski, N. S. Introduction: Drosophila-A Model System for Developmental Biology. J Dev Biol. 5 (3), (2017).
  2. Ogienko, A. A., et al. Drosophila as a Model Organism to Study Basic Mechanisms of Longevity. Int J Mol Sci. 23 (19), (2022).
  3. Lu, T. C., et al. Aging Fly Cell Atlas identifies exhaustive aging features at cellular resolution. Science. 380 (6650), eadg0934(2023).
  4. Koyama, T., Texada, M. J., Halberg, K. A., Rewitz, K. Metabolism and growth adaptation to environmental conditions in Drosophila. Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4523-4551 (2020).
  5. Moraes, K. C. M., Montagne, J. Drosophila melanogaster: A Powerful Tiny Animal Model for the Study of Metabolic Hepatic Diseases. Frontiers in Physiology. 12, 2021(2021).
  6. Chatterjee, N., Perrimon, N. What fuels the fly: Energy metabolism in Drosophila and its application to the study of obesity and diabetes. Sci Adv. 7 (24), (2021).
  7. Volonté, C., Alberti, F., Vitale, G., Liguori, F. Delineating Purinergic Signaling in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 15196(2022).
  8. Machado, J., Abdulla, P., Hanna, W. J., Hilliker, A. J., Coe, I. R. Genomic analysis of nucleoside transporters in Diptera and functional characterization of DmENT2, a Drosophila equilibrative nucleoside transporter. Physiol Genomics. 28 (3), 337-347 (2007).
  9. Ho, H. T., Xia, L., Wang, J. Residue Ile89 in human plasma membrane monoamine transporter influences its organic cation transport activity and sensitivity to inhibition by dilazep. Biochem Pharmacol. 84 (3), 383-390 (2012).
  10. Knight, D., et al. Equilibrative nucleoside transporter 2 regulates associative learning and synaptic function in Drosophila. J Neurosci. 30 (14), 5047-5057 (2010).
  11. Sidorov, R., Kucerova, L., Kiss, I., Zurovec, M. Mutation in the Drosophila melanogaster adenosine receptor gene selectively decreases the mosaic hyperplastic epithelial outgrowth rates in wts or dco heterozygous flies. Purinergic Signal. 11 (1), 95-105 (2015).
  12. Naes, S. M., Ab-Rahim, S., Mazlan, M., Abdul Rahman, A. Equilibrative Nucleoside Transporter 2: Properties and Physiological Roles. Biomed Res Int. 2020, 5197626(2020).
  13. Boswell-Casteel, R. C., Hays, F. A. Equilibrative nucleoside transporters-A review. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 36 (1), 7-30 (2017).
  14. Wu, K. C., Lee, C. Y., Chou, F. Y., Chern, Y., Lin, C. J. Deletion of equilibrative nucleoside transporter-2 protects against lipopolysaccharide-induced neuroinflammation and blood-brain barrier dysfunction in mice. Brain Behav Immun. 84, 59-71 (2020).
  15. Rattray, Z., et al. ENT2 facilitates brain endothelial cell penetration and blood-brain barrier transport by a tumor-targeting anti-DNA autoantibody. JCI Insight. 6 (14), (2021).
  16. Chiang, H. L., et al. The Critical Role of Equilibrative Nucleoside Transporter-2 in Modulating Cerebral Damage and Vascular Dysfunction in Mice with Brain Ischemia-Reperfusion. Pharm Res. 40 (11), 2541-2554 (2023).
  17. Chen, M., et al. SLC29A1 and SLC29A2 are human nicotinamide cell membrane transporters. Nat Commun. 16 (1), 1181(2025).
  18. Bajgar, A., et al. Extracellular adenosine mediates a systemic metabolic switch during immune response. PLoS Biol. 13 (4), e1002135(2015).
  19. Mołoń, M., et al. Effects of Temperature on Lifespan of Drosophila melanogaster from Different Genetic Backgrounds: Links between Metabolic Rate and Longevity. Insects. 11 (8), (2020).
  20. Chen, J., Nolte, V., Schlötterer, C. Temperature-Related Reaction Norms of Gene Expression: Regulatory Architecture and Functional Implications. Mol Biol Evol. 32 (9), 2393-2402 (2015).
  21. Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Curr Protoc Mol Biol. 111, 31.32.31-31.32.20 (2015).
  22. Bassett, A., Liu, J. L. CRISPR/Cas9 mediated genome engineering in Drosophila. Methods. 69 (2), 128-136 (2014).
  23. Port, F., Muschalik, N., Bullock, S. L. Systematic Evaluation of Drosophila CRISPR Tools Reveals Safe and Robust Alternatives to Autonomous Gene Drives in Basic Research. G3 Genes|Genomes|Genetics. 5 (7), 1493-1502 (2015).
  24. Clark, M., et al. Expanding the CRISPR base editing toolbox in Drosophila melanogaster. Communications Biology. 7 (1), 1126(2024).
  25. Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
  26. Port, F., Boutros, M. Drosophila: Methods and Protocols. Dahmann, C. , Springer US. 157-176 (2022).
  27. Liao, H., Wu, J., VanDusen, N. J., Li, Y., Zheng, Y. CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair for precise gene editing. Mol Ther Nucleic Acids. 35 (4), 102344(2024).
  28. Shumega, A. R., et al. CRISPR/Cas9 as a Mutagenic Factor. International Journal of Molecular Sciences. 25, 823(2024).
  29. Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. PLoS Genet. 15 (11), e1008421(2019).
  30. Muron, S., Kucera, S., Oliver, B., Benner, L. Creation of a new Drosophila melanogaster X chromosome balancer, First Multiple 8 ( FM8 ), using the CRISPR/Cas9 gene-editing system. MicroPubl Biol. 2022, (2022).
  31. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  32. Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. PLoS One. 10 (4), e0124633(2015).
  33. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  34. Wang, H., Zheng, S., Yu, X., Wu, K., Zhao, M. Clinical characteristics and genotypes of patients with Congenital fibrinogen disorders. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 42 (3), 264-273 (2025).
  35. Chotcomwongse, P., et al. The Impact of Various Surface Treatments on Adhesion Between Co-Cr Alloy and Acrylic Teeth. Int J Dent. 2026, 2199689(2026).
  36. Prakash, S., Havard, M., Hodges, E., Agrawal, A., Ahuja, S. In the artificial intelligence age, is Oswestry spinal risk index still useful? an external validation of Oswestry spinal risk index applied to radiotherapy patients and its relevance. Br J Neurosurg. , 1-9 (2026).
  37. Anaya-Ayala, J. E., et al. Analysis of Inflammatory and Angiogenic Activities in Patients with Abdominal Aortic Aneurysms with the Radiotracers (99m)Tc-HYNIC-CCR2-L and (99m)Tc-RGD with Single-Photon Emission Computed Tomography. Ann Vasc Surg. 124, 312-317 (2026).
  38. Rose, J. B., Coe, I. R. Physiology of nucleoside transporters: back to the future. Physiology (Bethesda). 23, 41-48 (2008).
  39. Niveditha, S., Deepashree, S., Ramesh, S. R., Shivanandappa, T. Sex differences in oxidative stress resistance in relation to longevity in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology B. 187 (7), 899-909 (2017).
  40. Carvalho, G. B., et al. The 4E-BP growth pathway regulates the effect of ambient temperature on Drosophila metabolism and lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (36), 9737-9742 (2017).
  41. Martelli, F., Alves, A. N., Yang, Y. T., Batterham, P., Wedell, N. Genotype and sex affect the combined impact of temperature and low-dose insecticide exposure on insect survival. Insect Sci. , (2024).
  42. Goh, G. H., Blache, D., Mark, P. J., Kennington, W. J., Maloney, S. K. Daily temperature cycles prolong lifespan and have sex-specific effects on peripheral clock gene expression in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 224 (10), (2021).
  43. Robillard, K. R., Bone, D. B. J., Hammond, J. R. Hypoxanthine uptake and release by equilibrative nucleoside transporter 2 (ENT2) of rat microvascular endothelial cells. Microvasc Res. 75 (3), 351-357 (2008).
  44. Kropotov, A., et al. Equilibrative Nucleoside Transporters Mediate the Import of Nicotinamide Riboside and Nicotinic Acid Riboside into Human Cells. Int J Mol Sci. 22 (3), (2021).
  45. Katsyuba, E., et al. De novo NAD(+) synthesis enhances mitochondrial function and improves health. Nature. 563 (7731), 354-359 (2018).
  46. Suman, R., et al. Deregulation of mitochondrial reverse electron transport alters the metabolism of reactive oxygen species and NAD+/NADH and presents a therapeutic target in Alzheimer's disease. Ageing Neur Dis. 4 (1), 4(2024).
  47. Pérez, S. E., Gooz, M., Maldonado, E. N. Mitochondrial Dysfunction and Metabolic Disturbances Induced by Viral Infections. Cells. 13 (21), (2024).
  48. Ballard, J. W., Melvin, R. G., Miller, J. T., Katewa, S. D. Sex differences in survival and mitochondrial bioenergetics during aging in Drosophila. Aging Cell. 6 (5), 699-708 (2007).
  49. Yi, Y., Xu, W., Fan, Y., Wang, H. X. Drosophila as an emerging model organism for studies of food-derived antioxidants. Food Res Int. 143, 110307(2021).
  50. Tiberi, J., et al. Sex differences in antioxidant defence and the regulation of redox homeostasis in physiology and pathology. Mechanisms of Ageing and Development. 211, 111802(2023).
  51. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  52. Yan, Y., Schetelig, M. F. Protocol for genetic engineering in Drosophila suzukii using microinjection. STAR Protocols. 5 (3), 103248(2024).
  53. Aguilar, G., et al. Seamless knockins in Drosophila via CRISPR-triggered single-strand annealing. Developmental Cell. 59 (19), 2672-2686.e5 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

234234
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.