Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Установка опухолевых органоидов, фибробластов, ассоциированных с карциномой, и аналогичных фибробластов у одного и того же пациента с раком пищевода

528 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69548

⸱

3 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Esophageal and Gastroenterological Surgery, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Department of Molecular Pathogenesis, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 3Department of Pathology and Oncology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Faculty of Health Sciences, Graduate School of Medicine, Juntendo University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод одновременной изоляции органоидов рака, фибробластов, ассоциированных с карциномой (CAF) и неопухолевых фибробластов (CF) у одного и того же пациента с плоскоклеточной карциномой пищевода (ESCC). Использование этих материалов, подбираемых пациентам, могло бы избежать проблем с межпациентской вариабельностью и предоставить подходящую экспериментальную платформу для исследований ESCC.

Аннотация

При плоскоклеточной карциноме пищевода (ESCC) приобретение устойчивости к лечению и рецидив опухоли остаются серьёзными клиническими вызовами. Фибробласты, ассоциированные с карциномой (CAF), ключевые компоненты микросреды опухоли, известны тем, что влияют на прогрессирование ESCC и терапевтический ответ. Однако многие аспекты роли CAF при злокачественных опухолях остаются неизвестными, предположительно из-за межпациентной изменчивости у пациентов с ESCC. Считается, что различные человеческие линии ESCC для исследований частично имитируют характер человеческой карциномы. Их также размножают in vitro годами и десятилетиями в чашке Петри, что приводит к адаптации к условиям культуры. Кроме того, клеточные линии ESCC человека содержат различные генетические и эпигенетические изменения, характерные для первоначальных пациентов, что приводит к межпациентской вариабельности. Тем не менее, долгосрочные культивируемые раковые клеточные линии использовались в большинстве предыдущих исследований для экспериментов с несовпадающими пациентами CAF. Изменчивость между пациентами внутри каждой линии раковых клеток и между раковыми клетками и CAF может привести к снижению воспроизводимости и надёжности результатов. Для устранения вариативности между пациентами у одного пациента были выделены три различных типа клеток: раковоорганоиды и CAF из хирургически расчленённой области ESCC, а также аналогичные фибробласты (CF) из соседней неопухолевой области в качестве специфических для пациента контроля CAF. Представлен подробный протокол, позволяющий одновременно выделять органоиды рака, CAF и CF. Раковые органоиды хорошо росли в трёхмерных условиях. CAF и CF положительно окрашивались на виментин — один из фибробластных маркеров, поддерживающий обогащение этих клеток в фибробластных линиях. Описанный протокол позволяет нам устанавливать ESCC-органоиды и фибробласты, соответствующие пациенту, предоставляя ценную экспериментальную платформу, исключающую межпациентную вариабельность при изучении взаимодействий опухоли и стромы.

Введение

Рак пищевода связан с высоким уровнем заболеваемости и смертности во всеммире 1. Он широко классифицируется на два основных гистологических подтипа: плоскоклеточный карцинома пищевода (ESCC) и аденокарцинома пищевода (EAC)2. ESCC более распространён, чем EAC, особенно выше в Восточной Азии иАфрике 3. Стратегии лечения ESCC относительно хорошоустановлены 4,5. Для ранних стадий поражений, ограниченных слизистым слоем, эндоскопическая резекция показана как лечебный и минимально инвазивный вариант. У пациентов с локально задутым, но резектируемым заболеванием комбинация неоадъювантной химиолучевой терапии с последующей эзофагэктомией продемонстрировала клиническую эффективность. При нерезектируемых или метастатических случаях основой лечения остаётся системная химиотерапия. Тем не менее, терапевтическая устойчивость и рецидив заболеваний продолжают создавать серьёзные клинические проблемы.

Опухоли состоят не только из раковых клеток, но и из сложной микросреды опухоли, включающей различные типы стромальных клеток. Среди них фибробласты, ассоциированные с карциномой, (CAF), основные клеточные компоненты микросреды опухоли, играют критическую роль в прогрессировании опухоли и терапевтической реакции 6,7,8,9. В ESCC также всё чаще сообщается о роли CAF в опухолевой злокачественности и устойчивости клечению 10,11,12. Однако точные молекулярные механизмы CAF, лежащие в основе злокачественной опухоли ESCC, остаются в значительной степени неясными.

В большинстве предыдущих исследований влияние CAF на раковые клетки оценивалось с использованием различных клеточных линий ESCC, распространяемых в чашках Петри на протяжении многих лет, а то и десятилетий. Такие клеточные линии адаптируются к условиям культуры и мало похожи на исходныеопухоли 13. Кроме того, линии ESCC производятся от разных пациентов и содержат различные генетические и эпигенетические изменения, которые явно отличаются в соответствующих клетках ESCC, служа межпациентскими вариативностями. Экспериментальные результаты одной линии раковых клеток часто могут не совпадать с результатами другой линии раковых клеток. Поэтому эксперименты с использованием различных клеточных линий ESCC и несовпадающих с пациентом CAF могут привести к затруднению точного выявления взаимодействий этих клеток в воспроизводимой и надёжной форме.

Для устранения этих ограничений был разработан протокол для одновременного выделения опухолевых органоидов, CAF и неопухолевых аналогов (CF) из одного и того же хирургического образца ESCC. Органоиды, полученные от пациентов, обычно воспроизводят ключевые архитектурные и фенотипические особенности первичных опухолей, сохраняя при этом молекулярную гетерогенность. Устоявшиеся органоиды формировали сфероиды в трёхмерных (3D) культурных условиях и демонстрировали стабильную пролиферационную способность. И CAF, и CF были подтверждены как обогащённые для популяций фибробластных клеток, положительных на виментин, фибробластный маркер.

Этот протокол предусматривает подробные, воспроизводимые этапы обработки тканей, ферментативной диссоциации, органоидного сея, выделения CAF/CF, передачи и криоконсервации. Чтобы помочь исследователям оценить применимость до внедрения, включена практическая информация: органоиды обычно формируются в течение 3–5 дней, достигают готовности к проходу в течение 7–10 дней и могут стабильно расширяться более чем на десять отрывков. CAF и CF могут передаваться как минимум восемь поколений. Органоиды и фибробласты могут быть криоконсервированы примерно в течение 20 дней. Уровень успешности создания составляет примерно 70% для органоидов и 80% для CAF и CF. Кроме того, включен валидированный тест на условной среде с использованием среды, кондиционируемой CAF- или CF, что обеспечивает надёжный подход к оценке паракринных эффектов стромальных клеток на поведение опухолевого органоида. В совокупности эта сопоставленная платформа органоидоид–строма опухоли предлагает экспериментально доступную и биологически значимую модель для изучения взаимодействий между опухолью и стромой ESCC и поддержки разработки прецизионных терапевтических стратегий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, связанные с человеческими тканями, должны выполняться с соблюдением соответствующих институциональных разрешений на биобезопасность и в сертифицированном шкафе биологической безопасности. Пациент предоставил письменное информированное согласие, и проект был одобрен Комитетом по этике исследований медицинского факультета Университета Хунтендо. Обзор процедуры с протоколов 2 по 6 показан на рисунке 1. Состав и концентрации каждого компонента в органоидной среде ESCC (Eso_v1) были определены на основе Kijima et al.14 и другихисследований 15, 16, 17 с незначительными изменениями. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Реагенты и подготовка тканей

  1. Подготовьте реагенты и оборудование.
    1. Стерилизуйте все инструменты, включая ножницы, щипцы и пипетки, перед началом процедуры.
    2. Приготовьте 10 мл физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS) в трубке объёмом 15 мл.
    3. Подготовьте пробирки с низким уровнем прикрепления 15 мл и маркируйте их по происхождению образца (например, промывка опухолей (A), трубка для пищеварения опухолей (B), неопухолевая промывальная трубка (C), неопухолевая пищеварительная трубка (D)).
    4. Покрытие пипеток путем аспирации и выдачи сыворотки плода (FBS) 2–3 раза, чтобы уменьшить адгезию клеток во время обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FBS-покрытие предотвращает прилипание фрагментов тканей к пластиковым поверхностям во время механической диссоциации.
  2. Подготовьте ферментные растворы
    1. Приготовьте ферментный раствор I для пищеварения опухоли, смешав 2,7 мл модифицированной среды Eagle's Medium (DMEM) от Dulbecco с 10% FBS и 1x пенициллин-стрептомицином (PS) (далее DMEM/10% FBS), 0,3 мл 10 мг/мл коллагеназы, 0,15 мл диспаза 10000 ПУ/мл и 0,03 мл 2,5 мкг/мл амфотерицина B. При температуре до 37 °C.
    2. Приготовьте ферментный раствор II для неопухолевого переваривания, смешивая 2,7 мл DMEM/10% FBS, 0,3 мл 1 мг/мл коллагеназы и 0,03 мл 2,5 мкг/мл амфотерицина B. При температуре до 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коллагеназа и диспаза способствуют диссоциации опухолевой ткани.
  3. Подготовьте органоидную культурную среду
    1. Приготовьте органоидную среду ESCC (Eso_v1 среду), содержащую 60% органоидную базальную среду, 40% L-WRN кондиционированнуюсреду 18 (см. шаг 1.4), 50 нг/мл EGF (фактор роста), 1 мМ N-ацетил-L-цистеина (антиоксидант), 5 мМ никотинамида (водорастворимый витамин), 500 нМ A83-01 (ингибитор TGF-βR (предотвращающий рост фибробластов)), 1x B-27 (добавка без сывороточной культуры), 1x N-2 (добавка без сыворотки) и 10 мкм Y-27632 (ингибитор ROCK).
    2. Перед использованием уравновесьте среду до 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: L-WRN кондиционируемая среда (супернатированная из клеток L-WRN) обеспечивает сигналы WNT, R-спондина и Ноггина, необходимые для инициации органоидов. Y27632 присутствует в среде на протяжении всего культурного периода.
  4. Подготовьте среду с кондиционированной L-WRN
    1. Разморозить флакон клеток L-WRN и засеять их на чашу диаметром 100 мм с 10 мл DMEM/10% FBS и посеять в течение 1–2 дней.
    2. Замените среду на 10 мл DMEM/10% FBS, содержащего G418 (последние 500 мкг/мл) и гигромицин B (последние 500 мкг/мл), культивируя до достижения слияния клеток до 80%.
    3. Переместить клетки в две антенны диаметром 100 мм с 10 мл DMEM/10% FBS (с G418 и гигромицином B) и культивировать до достижения 100% слияния.
    4. Переведите клетки в пять антенн диаметром 150 мм с 20 мл DMEM/10% FBS (без антибиотиков) на одну чашку и посялите до 100% слияния.
    5. Аспирируйте и сбросьте среду из каждой 150-мм тарелки.
    6. Добавьте по 25 мл на одну чашу коллекционной среды (органоидная базальная среда, дополненная 5% FBS).
    7. Инкубировать 24 часа.
    8. Соберите среду из всех пяти тарелок (25 мл × 5 = 125 мл) в стерильную стеклянную бутылку.
    9. Повторите шаги 1.4.6–1.4.8 для всего 8 коллекций (целевой пулированный объём: ~1 000 мл).
    10. Стерильно фильтруйте объединённый CM с помощью фильтра с крышкой бутылки.
    11. Aliquot 40 мл в 25 стерильных трубок по 50 мл.
    12. Храните аликвоты при −80 °C.
  5. Подготовьте фибробластную культурную среду
    1. Подготовьте фибробластную среду-1.
    2. Перед использованием уравновесьте среду до 37 °C.
  6. Приготовьте блюда для обращения с салфетками
    1. Нанесите несколько (от трёх до пяти) капель FBS с наконечником P1000 на две тарелки диаметром 100 мм, чтобы создать покрытие (Чашка T для опухолевой ткани, Dish N для неопухолевой ткани).
      ПРИМЕЧАНИЕ: FBS-покрытие способствует более плавному механическому измельчению и предотвращает прилипывание мелких фрагментов ткани к поверхности посуды.
  7. Обращение с тканями и идентификация образцов
    1. Подтвердите, что опухолевые и неопухолевые образцы транспортируются на льду.
    2. Положите салфетки на чашу диаметром 60 мм с небольшим количеством DMEM/10% FBS и храните на льду до использования. Начинайте обработку в течение 16 часов после хирургической резекции для поддержания жизнеспособности.
    3. Определите ткань опухоли по её плотной текстуре и неправильной морфологии поверхности, которые отличаются от морфологии неопухолевой ткани.

2. Обработка тканей, промывка и ферментативное пищеварение

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется для переваривания измельчённых опухолевых и неопухолевых срезов ткани с помощью различных ферментных растворов.

  1. Измельчите опухоль и неопухолевые ткани
    1. Переместите каждый образец ткани (примерно 5 мм × 5 мм) в соответствующую чашу, покрытую FBS (чашка T для опухолевой ткани, Dish N для неопухолевой ткани).
    2. Измельчите каждую ткань на фрагменты толщиной ~0,5 мм с помощью стерильного скальпеля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меньшие фрагменты увеличивают доступность ферментов и повышают эффективность переваривания.
  2. Помой нарезанную салфетку.
    1. Покрыть пипетку объемом 10 мл FBS, чтобы предотвратить прилипывание тканей.
    2. Добавьте 5 мл PBS на каждую тарелку с помощью пипетки с FBS-покрытием и аккуратно подвесьте измельченную ткань.
    3. Переведите подвеску в соответствующую тубу для промывания опухолей (Tube A) или неопухолевую промывку (Tube C).
    4. Повторите шаги 2.2.2 и 2.2.3 (общий объём: 10 мл).
    5. Дайте трубкам постоять 2 минуты при комнатной температуре; Удалите супернатант, оставив примерно 0,5–1 мл PBS и ткани на дне.
    6. Добавьте 10 мл свежей PBS с новой пипеткой; после покрытия пипетки FBS сильно закалывают подвеску, избегая образования пузырьков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сильное пипетирование способствует механической диссоциации и удалению крови и слизи. Избегание пузырьков предотвращает лизис клеток, вызванный сдвигом сдвига. Все этапы промывки направлены на удаление мусора.
    7. Дайте трубкам постоять 2 минуты при комнатной температуре; Удалите супернатант, оставив примерно 0,5–1 мл PBS и ткани на дне.
    8. Повторите процедуру стирки (шаги 2.2.6 и 2.2.7) дважды, всего три промывки.
  3. Перенесите ткани в пищеварительные трубки.
    1. Добавьте 10 мл свежей PBS с новой пипеткой; после покрытия пипетки FBS переносят ткань опухоли в трубку для пищеварения опухолей (трубка B), а неопухолевую ткань — в неопухолевую пищевариальную трубку (трубка D).
    2. Дайте трубкам постоять 2 минуты при комнатной температуре, удалите супернатант, оставив примерно 0,5 мл PBS и ткани на дне.
  4. Проведите ферментативное переваривание.
    1. Пищеварение опухолевой ткани
      1. Добавьте весь объём ферментного раствора I (коллагеназу + диспаза) в трубку для пищеварения опухолей (трубка B).
      2. Инкубировать при 37 °C в течение 2 часов с плавным вращением.
    2. Пищеварение неопухолевых тканей
    3. Добавьте весь объём ферментного раствора II (только коллагенази) в неопухолевую трубку для пищеварения (трубка D).
      1. Инкубировать при 37 °C в течение 4 часов с мягким вращением.
    4. Переходите к этапу 3 (обработка образца опухоли) или шагу 6 (посев фибробластов), в зависимости от происхождения образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типы ферментов, используемых для переваривания опухолевых и неопухолевых тканей, а также время обработки были определены на основе предварительной экспериментальной оптимизации. Ткани опухоли часто содержат плотный внеклеточный матрикс; Диспаза в сочетании с коллагеназой улучшает пищеварительную способность.

3. Обработка образцов опухоли для выделения органоидов и CAF

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется для выделения эпителиальных опухолевых клеток для формирования органоидов и стромальных фибробластов (CAF) из одних и тех же переваренных образцов опухоли.

  1. Фильтруйте и собирайте клетки, полученные от опухолей.
    1. Поставьте сито для ячейки 100 мкм на коническую трубку объёмом 50 мл.
    2. Предварительно смочите сито, пропустив 3 мл DMEM/10% FBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное смачивание снижает потерю клеток, предотвращая прилипывание к сухим волокнам сетки.
    3. Перенесите всё содержимое трубки для пищеварения опухолей (трубка B) на сито с помощью наконечника P1000, покрытого FBS, чтобы удалить непереваренные фрагменты ткани.
    4. Добавьте дополнительно 6 мл DMEM/10% FBS, чтобы промыть остатки кластеров через сито.
    5. Снимите сито и верните фильтрат в трубку B (также можно использовать новую трубку с низким уровнем прикрепления 15 мл).
  2. Промой и концентрируй фильтрат.
    1. Центрифугуйте трубку при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
    2. Удалите супернатант с помощью одноразовой пипетки.
    3. Добавьте 10 мл DMEM/10% FBS, аккуратно перемешайте инверсией и снова центрифугуйте при 300 × г в течение 5 минут.
    4. Аккуратно аспирируйте супернатант, сохраняя гранулу.
    5. Уменьшите оставшийся объём до 40 мкл с помощью пипетки P200.
  3. Выделяйте клетки для органоидных и CAF культур.
    1. Выделяйте 30 мкл для органоидного посева.
    2. Выделите 10 мкл на посев CAF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это соотношение эмпирически обеспечивает достаточное количество эпителиальных и фибробластных популяций для параллельного расширения.

4. Органоидная сева (3D-культура)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется для установления органоидов ESCC из суспензии клеток, полученной из опухоли.

  1. Подготовьте купола матрицы базальных мембран.
    1. Предварительно разогрейте стандартную пластину с 24 лунками до 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное нагрев пластины ускоряет затвердевание куполов матрицы базальной мембраны.
    2. Смешайте 30 мкл суспензии, полученной от опухоли, с 90 мкл ледяной матрицы базальной мембраны (соотношение 1:3).
    3. Нанесите 30 мкл на купол на четыре скважины.
    4. Дайте куполам затвердеть на 15 минут в CO₂-инкубаторе.
  2. Добавьте органоидную культурную среду
    1. Приготовьте органоидную среду с предварительно смешанными добавками (FGF10, SB202190 и антибиотиками, такими как 1× амфотерицин B и 100 мкг/мл примоцин, если используются).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колодец 1: Eso_v1; Колодец 2: Eso_v1 + 10 мкм SB202190; Колодец 3: Eso_v1 + 100 нг/мл FGF10; Колодец 4: Eso_v1 + 10 мкм SB202190 + 100 нг/мл FGF10 (конечные концентрации).
    2. Аккуратно добавьте по 1 мл среднего масла в каждую ячейку вдоль стены.
    3. Инкубировать в стандартных условиях CO₂-культуры.
    4. Меняйте среду каждые 3–5 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное смешивание добавок предотвращает необходимость наносить небольшие объёмы непосредственно на хрупкие купола матрицы базальных мембран. Антибиотики вводят только в первые 6 дней после формирования органоидов. Условия культуры (FGF10 +/-, SB202190 +/-) определяются на основе скорости роста и морфологии (предпочтительно сферических).
  3. Следите за формированием органоидов.
    1. Ежедневно наблюдайте купола с помощью перевёрнутого микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемая морфология: 3–5 дней → видимые сфероиды; Дни 7–10 → плотные сфероиды, готовые к уходу.
    2. Проходят органоиды, когда они достигают размера примерно 100–200 мкм или демонстрируют скученность купола 90% и более.

5. Посев CAF

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется для установления CAF из клеточной суспензии, полученной от опухоли.

  1. Посеяйте CAF на коллагеновой посуде.
    1. Приготовьте коллагеновое покрытие 60-мм тарелку, содержащее 1,5 мл фибробластной среды-1.
    2. Добавьте 10 мкл филтрата опухоли, выделенного для посева CAF.
    3. Добавьте антибиотики, такие как 1× амфотерицин B и 100 мкг/мл примоцин.
    4. Инкубировать в стандартных условиях CO₂-культуры.
    5. Меняйте среду каждые 3–5 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмпирически фибробластная среда-1 часто более подходяща, чем другие среды, для начального формирования и роста CAF и CF. Антибиотики добавляют только в первые 6 дней.
  2. Мониторинг роста CAF
    1. Следите за появлением фибробластоподобной морфологии веретена начиная примерно с 3–5 дней.
    2. Проходные фибробласты имеют слияние 90–100%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если происходит загрязнение эпителиальных клеток, фибробласты можно селективно выделить, регулировав длительность трипсинизации, поскольку фибробласты отсоединяются быстрее, чем эпителиальные клетки во время перехода.

6. Посев CF

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется для получения пациенту совпадения CF из соседних неопухолевых тканей.

  1. Промой и приготовь неопухолевой дайджест.
    1. Центрифугуйте неопухолевую пищевариальную трубку (трубка D) при 300 × г в течение 5 минут.
    2. Удалите супернатант с помощью одноразовой пипетки.
    3. Добавьте 10 мл DMEM/10% FBS, аккуратно перемешайте инверсией и снова центрифугуйте при 300 × г в течение 5 минут.
    4. Аккуратно вдыхайте супернатант, сохраняя гранулу.
    5. Повторите шаги 6.1.3 и 6.1.4 ещё раз.
  2. Семена CF на коллагеновой чашке
    1. Перенесите всю суспензию на коллагеновое покрытие 60-мм антенну с 1,5 мл фибробластного среднего состава-1.
    2. Добавьте антибиотики, такие как 1× амфотерицин B и 100 мкг/мл примоцин.
    3. Инкубировать в стандартных условиях CO₂-культуры.
    4. Меняйте среду каждые 3–5 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотики добавляют только в первые 6 дней.
  3. Следите за ростом муковисцидозии.
    1. Наблюдайте морфологию веретена, похожей на фибробласты, начиная с 3–5 дней.
    2. Проходные фибробласты имеют слияние 90–100%.

7. Проход органоидов и криоконсервация

  1. Проход органоидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага — расширить органоиды, когда они достигнут нужной плотности.
    1. Аспирируйте старый медиум и хорошо промой каждую сковороду 1 мл PBS.
    2. Добавьте 0,5 мл предварительно подогретого трипсина для органоидов в каждую колодцу.
    3. Энергично разбивайте пипетку с наконечником P1000, используя край наконечника для нарушения купола матрицы базальной мембраны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Механическое сдвиг помогает расщеплять плотную матрицу базальных мембран, улучшая доступ к ферментам.
    4. Инкубировать 10–15 минут в CO₂-инкубаторе, пока все комки геля не растворятся. Диссоциировать органоиды на 20–50 клеточных сгустков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте полной одноклеточной диссоциации, так как она снижает жизнеспособность.
    5. Соберите подвеску в низкоокреплённую трубку объёмом 15 мл.
    6. Промыйте колодец четыре раза с помощью 0,5 мл DMEM/10% FBS и перенесите все промывания в одну и ту же трубку с низким уровнем крепления.
    7. Центрифугуйте трубку при 300 × г на 5 минут.
    8. Удалите супернатант и заново суспензуйте гранулу в минимальной температуре DMEM/10% FBS; отрегулировать объём подвески до 80 мкл.
    9. Смешайте 80 мкл органоидной суспензии с 240 мкл ледяной матрицы базальных мембран (соотношение 1:3).
    10. Поставьте смесь на предварительно подогретую пластину с 6 лунками (37 °C), с 4–6 куполами на каждую.
    11. Дайте куполам затвердеть на 15 минут, затем добавьте 3 мл среды Eso_v1 (состав, который был оптимальным в начальной культуре на шаге 4,2) в каждую скважину.
    12. Меняйте среду каждые 3–5 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды проходят, когда их диаметр достигает примерно 100–200 мкм или когда плотность купола превышает 90%. Подсчёт клеток не проводится. Для рутинных субкультур органоиды делятся в соотношении 1:4 к 1:10. Ожидается быстрое восстановление сфероидов в течение 48–72 часов.
  2. Криоконсервация органоидов
    1. Промой каждую колодцу 3 мл PBS.
    2. Добавьте 1,5 мл трипсина для органоидов в каждую яму, интенсивно пипетьте и инкубуйте 10 минут.
    3. Соберите всю подвеску в трубку с низким креплением на 15 мл и промыйте колодец четыре раза.
    4. Центрифугуйте трубку при 300 × г на 5 минут и удалите супернатант.
    5. Суспензируйте пеллет в 2 мл 90% FBS/10% DMSO.
    6. Аликвот по 0,5 мл в каждый криовиал.
    7. Поместите флаконы в заморозительный контейнер и храните при −80 °C на ночь.
    8. Перенесите флаконы в жидкий азот для длительного хранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды заселяются, когда их диаметр достигает примерно 100–200 мкм или когда плотность купола превышает 90%.
  3. Восстановление замороженных органоидов
    1. Криовиал быстро разморозил в водяной бане при температуре 37 °C.
    2. Перенесите содержимое в 5 мл DMEM/10% FBS в пробирку на 15 мл.
    3. Центрифугуйте трубку при 300 × г на 5 минут.
    4. Удалите супернатант и снова суспензируйте гранулу в 40–60 мкл DMEM/10% FBS.
    5. Смешайте суспензию с ледяной матрицей базальных мембран в соотношении 1:3.
    6. Поставьте смесь на предварительно подогреную пластину на 6 лунок (37 °C) как по 4–6 куполов на колодцу.
    7. Дайте куполам затвердеть на 15 минут, затем добавьте 3 мл среды Eso_v1 (состав, который был оптимальным в начальной культуре на шаге 4,2) в каждую скважину.

8. Пасаж фибробластов и криоконсервация

  1. Проходящие CAF и CF
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага — расширить фибробласты, когда они достигнут соответствующей плотности.
    1. Помой посуду 2 мл PBS.
    2. Добавьте 0,4 мл 0,25% трипсина.
    3. Инкубировать в течение 5 минут в CO₂-инкубаторе, контролируя отслоение под микроскопом.
    4. Нейтрализуйте трипсин с помощью DMEM/10% FBS и перенесите всю суспензию клетки на 100-мм антенну с 10 мл среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фибробласты проходят, когда достигают 90%–100% слияния. Для рутинных субкультур они делятся в соотношении 1:3. Эмпирически пролиферация фибробластов замедляется или прекращается при низкой плотности клеток.
  2. Криоконсервация фибробластов
    1. Промой клетки 5 мл PBS.
    2. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина, затем инкубируем 5 минут в CO₂-инкубаторе.
    3. Нейтрализуйте трипсин с помощью DMEM/10% FBS и перенесите всю суспензию клетки в трубку на 15 мл.
    4. Центрифугу при 300 × г в течение 5 минут.
    5. Суспензируйте клеточную гранулу в 2 мл 90% FBS/10% DMSO.
    6. Аликвот по 0,5 мл в каждый криовиал.
    7. Поместите флаконы в заморозительный контейнер и храните при −80 °C на ночь.
    8. Переведите флаконы в жидкий азот для длительного хранения.

9. Тест с кондиционированной средой

ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага — оценить паракринные эффекты фибробластов на органоиды опухолей ESCC с использованием кондиционированной среды (CM). Этот анализ обеспечивает воспроизводимую модель взаимодействия стромально-опухоль, когда прямая совместная культура ещё не оптимизирована.

  1. Подготовка среды, обусловленной CAF/CF
    1. Культивировать такое же количество CAF или CF в 3 мл DMEM/10% FBS на 60-мм антеннах до 80%–90% совпадения.
    2. Промывайте клетки один раз 2 мл PBS.
    3. Добавьте 3 мл DMEM/2% FBS.
    4. Инкубировать 48 часов в CO₂-инкубаторе.
    5. Соберите супернатант в трубку на 15 мл.
    6. Центрифугу при 2000 × г в течение 5 минут, чтобы удалить клеточный мусор.
    7. Соберите 2,5 мл супернатанта в новую трубку на 15 мл.
    8. Аликвотируйте кондиционированную среду на порции по 100–500 мкл и храните при -80 °C.
  2. Подготовка органоидной анализной среды
    1. Подготовьте органоидную среду ESCC, как описано в шаге 1.3.
    2. Смешайте органоидную среду и кондиционированную среду в соотношении 1:1 (50% v/v).
  3. Культура ракових органоидов с использованием среды для органоидного анализа.
    1. После прохода органоидов, как описано на шаге 7, семена органоидов выкладывают в один купол базальной мембраны объёмом 20 мкл на каждую скважину на предварительно нагретой пластине с 48 лунками (37 °C).
    2. После затвердевания купола добавьте в каждую скважину по 0,3 мл среды для органоидного анализа.
    3. Заменяйте органоидную анализационную среду каждые 3–7 дней.
    4. Оценить морфологию и размер органоидов рака.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы, полученные человеком, рассматриваются как потенциально заразные. Всегда носятся соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки, маски и защитные очки. Коллагеназа, диспаза и диметилсульфоксид (ДМСО) могут вызывать раздражение кожи, глаз и дыхательных путей; поэтому избегаются прямого контакта и вдыхания. Все ферментативные процедуры с человеческими тканями проводятся в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности. Жидкие отходы, содержащие человеческую ткань, собираются в герметичные контейнеры для биологической опасности и автоклавируют перед утилизацией. Химические отходы, включая DMSO и ферментные растворы, утилизируются в соответствии с институциональными рекомендациями по опасным отходам. Все многоразовые инструменты промываются 70% этанола и автоклавируют перед повторным использованием.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Образцы тканей были взяты из области опухоли и соседней неопухолевой области, расположенной в 3 см от опухоли, хирургически удаленных у пациента с ESCC, который не получал неоадъювантную химиотерапию. Раковоорганоиды и CAF были выделены из области опухоли, тогда как CF — из неопухолевой области. Хирургические ткани были измельчены на части размером примерно 0,5 мм (рисунок 2A), затем ферментативно обработаны, после чего отдельно выделены раковоорганоиды и фи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В предыдущих отчётах использовались раковые органоиды и пациент-сопоставимые CAF для изучения роли CAF в пролиферации и лекарственной устойчивости при раке толстой кишки, молочной железы, поджелудочной железы, а также головы ишеи 20,21,22,23,24. Эти исследования показали, что CAF влияют на пролиферацию и лекарственную устойчив...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана премией Juntendo University Young Investigator Award (2024 и 2025) для P. Z. и грантами на научные исследования от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии (23K07362, 21K08693). Мы хотели бы поблагодарить всех сотрудников кафедр патологии и онкологии, а также пищевода и гастроэнтерологической хирургии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100-мм тарелкаTPP93100
100x пенициллин-стрептомицин (PS)Накалай26253-84
15 мл трубкаFastGeneFG2001
24-ячественная клеточная культивная пластинаTPP92024
Клеточная культивная пластина с 48 лункамиTPP92448
Трубка объемом 50 млFastGeneFG2004
Антенна 60 ммTPP93060
Пластина с 6-ячественной клеточной культуройTPP92006
A83-01Кайман9001799
Продвинутые DMEM/F12 Gibco12634010Органоидная базальная среда = Advanced DMEM/F12 + GlutaMAX + 1x PS
Alexa488 антимышиный IgGИнвитрогенA11029
Амфотерицин BThermoFisher15290018
Антитела к Виментину (V9)Санта-КрусSC-6260Разбавление 1/500 для использования
B-27ThermoFisher17504044
Фильтр с крышкой бутылкиСарториус180F15
Клеточное сито, 100 и микро; m poreBD Falcon352360
Коллагеназа, тип ISIGMAC0130
Коллагеновое покрытие 60 мм дишеIWAKI4010-010
Диметилсульфоксид (DMSO)Вако043-07216
Dispase IГОДО СЮСЭЙ386-02271
Модифицированный Eagle Medium (DMEM) от DulbeccoНакалай08459-64
Затемление Ti2Никон
Сыворотка для плода быка (FBS)SERANAS-FBS-CO-015
Среда роста фибробластов 2PromoCellC-23020Среда для фибробластов-1 = среда роста фибробластов 2
G418InvivogenANT-GN-1
GlutaMAX Gibco35050061
HFDM-1KSK87-160Фибробластная среда-2 = HFDM-1 + 1% FBS + 1 x PS
Hoechst33342 Накалай04929-82
ГигромицинInvivogenANT-HG-1
Система IncuCyteEssen BioScience
Элементы L-WRNATCCCRL-3276
МатригельКорнинг354234Матрица базальной мембраны = матригель
N2ThermoFisher17502048
N-ацетил-L-цистеинВако017-05131
НикотинамидTCIN0078
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Накалай14249-24
ПримоцинInvivogenANT-PM-05
Рекомбинантный человеческий EGFPEPROTECHAF-100-15
Рекомбинантный человек FGF-10PEPROTECHPEP-100-26
SB202190СеллекS1077
Скальпель, No 11Feather8-3086-02
STEMFULLSumitomo bakeliteMS-90150Трубка с низким креплением 15 мл = STEMFULL
TrypLE ExpressGibco12605028Трипсин для органоида = TrypLE Express
ТрипсинНакалай35556-44
Y-27632СеллекS1049

Ссылки

  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Abbas, G., Krasna, M. Overview of esophageal cancer. Ann Cardiothorac Surg. 6 (2), 131-136 (2017).
  3. Morgan, E., et al. Global burden of colorectal cancer in 2020 and 2040: Incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Gut. 72 (2), 338-344 (2023).
  4. Lagergren, J., Smyth, E., Cunningham, D., Lagergren, P. Oesophageal cancer. Lancet. 390 (10110), 2383-2396 (2017).
  5. Lordick, F., et al. Oesophageal cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 27 (suppl 5), v50-v57 (2016).
  6. Chhabra, Y., Weeraratna, A. T. Fibroblasts in cancer: Unity in heterogeneity. Cell. 186 (8), 1580-1609 (2023).
  7. Caligiuri, G., Tuveson, D. A. Activated fibroblasts in cancer: Perspectives and challenges. Cancer Cell. 41 (3), 434-449 (2023).
  8. Mezawa, Y., Orimo, A. The roles of tumor- and metastasis-promoting carcinoma-associated fibroblasts in human carcinomas. Cell Tissue Res. 365 (3), 675-689 (2016).
  9. Mezawa, Y., Orimo, A. Phenotypic heterogeneity, stability and plasticity in tumor-promoting carcinoma-associated fibroblasts. FEBS J. 289 (9), 2429-2447 (2022).
  10. Qiu, L., et al. Cancer-associated fibroblasts: An emerging target against esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 546, 215860(2022).
  11. Xue, M., Tong, Y., Xiong, Y., Yu, C. Role of cancer-associated fibroblasts in the progression, therapeutic resistance and targeted therapy of oesophageal squamous cell carcinoma. Front Oncol. 13, 1257266(2023).
  12. Dunbar, K. J., Wong, K. K., Rustgi, A. K. Cancer-associated fibroblasts in esophageal cancer. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 17 (5), 687-695 (2024).
  13. Pimkhaokham, A., et al. Nonrandom chromosomal imbalances in esophageal squamous cell carcinoma cell lines: Possible involvement of the ATF3 and CENPF genes in the 1q32 amplicon. Jpn J Cancer Res. 91 (11), 1126-1133 (2000).
  14. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  15. Fuchino, T., et al. Characterization of residual cancer by comparison of a pair of organoids established from a patient with esophageal squamous cell carcinoma before and after neoadjuvant chemotherapy. Hum Cell. 37 (2), 491-501 (2024).
  16. Shen, S., et al. Advancing precision medicine in esophageal squamous cell carcinoma using patient-derived organoids. J Transl Med. 22 (1), 1168(2024).
  17. Zhang, S., Wang, C. Protocol to establish patient-derived xenograft and organoid for radiosensitivity of esophageal squamous cell carcinoma. STAR Protoc. 5 (4), 103273(2024).
  18. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  19. Mashima, Y., et al. KIF24 depletion induces clustering of supernumerary centrosomes in PDAC cells. Life Sci Alliance. 5 (11), e202201470(2022).
  20. Hogstrom, J. M., et al. Simultaneous isolation of hormone receptor-positive breast cancer organoids and fibroblasts reveals stroma-mediated resistance mechanisms. J Biol Chem. 299 (8), 105021(2023).
  21. Schuth, S., et al. Patient-specific modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system. J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 312(2022).
  22. Farin, H. F., et al. Colorectal cancer organoid-stroma biobank allows subtype-specific assessment of individualized therapy responses. Cancer Discov. 13 (10), 2192-2211 (2023).
  23. Zapatero, M. R., et al. Trellis tree-based analysis reveals stromal regulation of patient-derived organoid drug responses. Cell. 187 (25), 7335-7349 (2024).
  24. Rademaekers, M., Johansson, E. O., Johansson, E., Roberg, K., Wiechec, E. Tumor-matched and unmatched cancer associated fibroblasts exhibit differential effect on proliferation and FMOD and MMP9 gene expression in head and neck squamous cell carcinoma cells when co-cultured in spheroids. Cancer Cell Int. 24 (1), 190(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Органоиды плоскоклеточного рака пищеводамикроокружение опухолимаркеры фибробластоваутологичные фибробласты пациентовтрехмерная культураопухолево-стромальные взаимодействия
Установка опухолевых органоидов, фибробластов, ассоциированных с карциномой, и аналогичных фибробластов у одного и того же пациента с раком пищевода
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.