Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Лентивирально-индуцированная стриатальная патология как доклиническая модель полиглутаминной спиномозжечковой атаксии

426 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69550

⸱

13 марта 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1ABC-RI, Algarve Biomedical Center Research Institute, 2Faculdade de Medicina e Ciências Biomédicas, Universidade do Algarve, 3ABC Collaborative Laboratory: Integrated Ageing and Rejuvenation Solutions (ABC CoLAB - Ageing Better)

В этой статье

Краткое содержание

Атаксии спиномозжечковых полиглутаминов вызываются экспансиями CAG, производящими белки, склонные к агрегации. Этот протокол описывает производство векторов, стереотаксичную доставку и анализ включений и потери нейронных маркеров, предоставляя контролируемую платформу для изучения механизмов и оценки таргетной терапии нейродегенеративных заболеваний.

Аннотация

Полиглутаминные спиноцеребеллярные атаксии — это группа из шести нейродегенеративных заболеваний, вызванных мутацией в тринуклеотидном КАГ-тракте в кодирующей области каждого гена-причинителя. Эта мутация приводит к аномально расширенному растяжению полиглутамина в белке, что делает его склонным к агрегации и приводит к образованию внутринейронных включений, которые являются характерной чертой этих заболеваний. Молекулярные механизмы, лежащие в основе патогенеза этих заболеваний, сложны и не полностью изучены. Пока эти болезни остаются неизлечимыми. Понимание молекулярных механизмов в уязвимых областях мозга крайне важно для терапевтического развития. Для быстрого тестирования механизмов и вмешательств необходимы гибкие, специфичные для региона экспериментальные платформы, не тратя времени и затрат на генерацию нескольких трансгенных линий, даже не учитывая селективную уязвимость. В последние годы мы и другие разработали несколько лентивирусных моделей для изучения влияния расширенной экспрессии белка в определённых областях мозга. Эти модели демонстрируют нейропатологические и поведенческие особенности, имитирующие некоторые признаки заболевания, подчёркивая их важность для понимания патогенеза и разработки новых терапевтических стратегий. В этой статье мы описываем разработку стриатальной модели на примере SCA2. Мы выделяем развитие и производство лентивирусных векторов, а также стереотаксичное введение векторов, экспрессирующих расширенную форму атаксина-2 (белока, вызывающего болезни). Наконец, мы характеризуем два основных нейропатологических признака: формирование включений и потерю нейронных маркеров. Предоставляя контролируемую платформу, воспроизводящую эти ключевые патологические особенности, эта модель предлагает ценный инструмент для анализа специфических регионов механизмов нейродегенерации и оценки целенаправленных терапевтических вмешательств.

Введение

Полиглутаминные спиномозжечковые атаксии (polyQ SCA) — это группа из шести аутосомно-доминантных нейродегенеративных заболеваний, вызванных расширением повторов тринуклеотида CAG в различных вызывающих генах, приводящих к токсичным полиглутаминным (polyQ) трактам внутри кодируемыхбелков 1. Среди них наиболее распространёнными polyQ-SCA являются SCA3/болезнь Мачадо-Джозефа и SCA22. Эти заболевания в первую очередь поражают нейронные клетки в определённых областях мозга, включая мозжечок и ствол мозга, а также стриатум и другие области. В результате они вызывают прогрессирующую моторную дестабилизацию, нарушения походки, тяжёлую нейродегенерацию и преждевременнуюсмерть 3.

Было разработано несколько животных моделей для изучения полиQ SCA и тестирования терапевтических подходов. Для объяснения молекулярной основы прогрессирования заболевания и клеточных путей использовались трансгенные мыши, линии с отступлением и условная экспрессиямышей 4,5. Однако создание новой модели животных на болезни занимает много времени и требует затрат, и часто не подходит для изучения регионального участия мозга в патогенезеболезни 6.

Модели мышей на основе лентивируса (ЛВ) предлагают дополнительную альтернативу традиционным моделям, с более низкой стоимостью и возможностью изучения отдельных областеймозга 7,8. Лентивирусные векторы позволяют доставлять крупные трансгены (до 8 кб), что способствует быстрой индукции патологии в определённых областях мозга без необходимости модификации зародышевой линии, и могут использоваться у животных разных возрастов. Прямое введение лентивирусных векторов в целевой область мозга позволяет обеспечить регионально-специфическую экспрессию патогенных или терапевтических генов с пониженной иммуногенностью по сравнению с другими вируснымивекторами 4. Кроме того, послеродовые роды позволяют избежать компенсации развития для изучения механизмов заболевания при условиях, более близких к человеческомуначалу 9. Уровни экспрессии можно титрировать путём корректировки дозы вируса, что приводит к формированию фенотипов контролируемой тяжести и способствует моделированию прогрессирующего прогрессирования заболевания. Кроме того, этот метод позволяет экспрессию, специфичную для типа клеток, зависящую от выбранногопромотора 4,7.

Несколько исследований показали практичность и полезность моделей мышей на основе LV для моделирования polyQSCA 10, 11, 12, 13. Мы и другие разработали модели на основе ЛЖ для SCA111, SCA212, SCA311,12 и SCA714, которые служат платформами для быстрой, специфичной для региона экспрессии или подавления генов заболеваний при воспроизведении ключевых аспектов нейропатологии.

В итоге, описанный здесь лентивирусный подход предоставляет универсальный и эффективный инструмент для моделирования патогенеза полиQ SCA. Преодолевая некоторые основные недостатки современных животных моделей, этот метод ускоряет проведение исследований на основе концепции и обеспечивает лучший контроль за началом, локализацией и тяжестью заболевания — особенности, которые делают его очень подходящим для терапевтического скрининга и изучения молекулярных механизмов. Здесь мы описываем воспроизводимый метод генерации и характеристики стриатальной лентивирусной модели полиглутаминной спиноцеребеллярной атаксии, позволяющий детально анализировать ранние патогенные события и оценить кандидатурные терапевтические препараты.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с руководящими принципами Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) и Руководством Национального института здоровья по уходу и использованию лабораторных животных. Настоящее исследование было одобрено Direção-Geral da Alimentação e Veterinária (DGAV). В этом исследовании использовались мыши C57BL/6J, которые содержались в стандартных клетках в рамках цикла 12 часов света и 12 часов темноты, при условии предоставления пищи и воды.

ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, используемые в этом протоколе, подробно описаны в Таблице материалов.

1. Упаковка лентивирусных векторов

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, связанные с лентивирусными векторами, должны проводиться в лаборатории BSL-2 с соблюдением правил безопасности учреждения. Мы использовали систему трансфекции из 4 плазмид из-за её более высокой биобезопасности по сравнению с другими системами, производящими лентивирусы (см. рисунок 1 для подробностей о переносной плазмиде).

  1. Разморозить клетки HEK 293T в водяной бане и засеять их в колбу T75 с использованием модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM), дополненной 2 мМ L-глутамина, 10% FBS и 1% Pen-Strep. Этот полный формат DMEM использовался на всех этапах протокола. Используйте клетки с номером прохода ≤10, чтобы обеспечить высокий вирусный титр и стабильные результаты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда проверяйте наличие загрязнения микоплазмой перед тем, как продолжать.
  2. Когда клетки достигают слияния 80%-90%, их размножайте до 2 колбы T175, разделив исходную культуру 1:2. Посейте 20 посевных чаш по 100 мм по 3,8 x10 6 ячеек на одну тарелку (конечный объём 10 мл) и инкубировать их 24 часа при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂. Подсчёт клеток с помощью трипан-синего исключения с помощью гемоцитометра Нойбауэра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрите возможность исключения Pen-Strep из среды для снижения стресса клетки и, соответственно, максимизации трансфекции клеток.
  3. На следующий день подготовьте смесь для трансфекции, как описано в таблице 1. Вихрь и ненадолго вращается вниз для гомогенизации. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 10–20 минут для формирования комплексов ДНК: PEI.
  4. После ДНК: комплексы PEI формировались в течение 15 минут при комнатной температуре, затем отрегулировали смесь до 5 мл с полным ДМЭМ.
    Удалите 5 мл среды из каждой культурной чаши (половину всего объёма) и замените его 5 мл трансфекционной смеси. Это поддерживает конечный объём культуры на уровне 10 мл во время трансфекции.
  5. Трансфицировать клетки тремя упаковочными плазмидами и переносной плазмидой, как описано в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все плазмиды, используемые для производства лентивируса, должны быть подготовлены с использованием наборов для очистки без эндотоксинов. Кроме того, целостность плазмиды должна быть проверена анализом рестрикционных ферментов для подтверждения корректности LTR-областей и трансгенной кассеты перед трансфекцией.
  6. Добавьте 5 мл смеси для трансфекции по капле на каждую пластину и инкубируйте 6 часов. Аспирируйте всю среднюю жидкость и замените его на 10 мл свежего медиума. Инкубировать 48 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы увеличить вирусный титр, собирайте среду через 48 часов, добавьте 10 мл свежей среды на каждую пластину и снова собирайте через 24 часа. Ранее собранную среду можно хранить при 4 °C до 24 часов. Это позволит увеличить концентрацию в два раза больше и увеличить вирусный титр.
  7. Фильтруйте все кондиционируемые среды, содержащие лентивирусные векторы, с помощью фильтра 0,22 мкм.

2. Очищение и титрование лентивирусных векторов

  1. Переместить фильтрованный супернатант в соответствующие конические ультрацентрифугные трубки и центрифугировать при давлении 65 000 x g в течение 1 часа 30 минут при 4 °C, например, с помощью вращающегося ротора.
  2. Аккуратно сбросьте супернатант и снова суспензируйте каждую гранулу в 400 мкл 1% BSA, разбавленной в 1x PBS, чтобы избежать образования пузырьков. Инкубировать на льду не менее 1 часа.
  3. После 1 часа инкубации аккуратно перемешайте каждую трубку, чтобы гранулы были полностью суспендированы и однородны, затем объедините все вновь взвешенные гранулы в одну трубку.
  4. Заполните трубку 1% BSA/PBS до полного минимум на две трети, чтобы предотвратить коллапс во время центрифугации.
  5. Снова центрифугировать при 65 000 г в течение 1 часа 30 минут при 4 °C для гранулирования лентивирусных векторов. Аккуратно сбросьте супернатант и высушите край трубки стерильной бумагой.
  6. Ресуспензировать гранулу с лентивирусными векторами в 45 мкл 1% BSA/PBS, избегая пузырьков. Запечатайте трубку прозрачной пленкой и инкубуйте при 4 °C в течение 24 часов.
  7. На следующий день подготовьте 10 мкл аликвотов лентивирусных векторов. Оставьте 10 мкл аликвот для титрации: 5 мкл для комплекта p24 ELISA и 2 мкл для комплекта qPCR. Титруйте лентивирусные векторы с помощью ELISA и qPCR согласно инструкциям производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор метода титрирования зависит от экспериментальных потребностей, например, от быстрой оценки или точной количественной оценки инфекционных единиц. ELISA на основе p24 количественно определяет белок капсида и, следовательно, измеряет общие физические частицы; Он быстрый, дешевле других методов и высоковоспроизводимый. Однако он не различает инфекционные частицы от неинфекционных частиц, что может привести к переоценке функционального титра. Титрование на основе qPCR измеряет количество вирусных геномов (vg), упакованных в частицы, что обеспечивает более точную оценку геномсодержащих вирионов и позволяет напрямую сравнивать векторные препараты. Однако он всё ещё не может оценить эффективную инфекционность вирусных частиц. Наконец, анализы на основе инфекционности, такие как потоковая цитометрия для флуоресцентных векторов или формирование колоний, устойчивых к антибиотикам, напрямую измеряют функциональные трансдукционные единицы (TU/ml) и являются наиболее биологически значимыми, хотя они более трудоёмкие, зависят от клеточного типа, занимают много времени идороже 15,16.

3. Стереотаксическая хирургия для двусторонней лентивирусной доставки в стриатуме мыши

  1. Приготовление животных
    1. Взвесьте животное и рассчитайте необходимую дозу анестезии. Вводите анестезию внутрибрюшно при дозе 10 мкл/г массы тела с использованием раствора готовой смеси. Этот раствор готовится путём сочетания 7,5 мл 0,9% NaCl, 500 мкл медетомидина (1,0 мг/мл), 1,0 мл мидазолама (5,0 мг/мл) и 1,0 мл фентанила (0,05 мг/мл), с итоговым объёмом 10 мл. Дайте примерно 10 минут для полной индукции анестезии.
    2. Подтвердите глубину анестезии (например, рефлекс сжатия пальца ног). Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза и побрийте кожу головы.
    3. Поместите животное в стереотаксичную раму на грелке. Разместите голову с помощью ушных планок и планки укуса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество животных для инъекции и хронология зависят от эксперимента и должны определяться априорным статистическим анализом мощности на основе конкретных гипотез и ожидаемых размеров эффектов. Например, в нашем предыдущемисследовании 12 инъекционные мозги анализировались через 4, 8 и 12 недель после инъекции для оценки прогрессирования невропатологических изменений.
  2. Подготовка шприца и вирусная нагрузка
    1. Используйте стандартную иглу Hamilton для загрузки и иглу с тупым кончиком 26G для инъекций. Загрузите 2 мкл раствора лентивирусного вектора в шприц. Убедитесь, что вирусная доза на место инъекции составляет 400 нг p24 антигена/мл или 5 x 109 МЕ/мл 10,12,17.
    2. Вставьте шприц в автоматический микроинъекционный насос (например, Stoelting). Подготовьте шприц в режиме инфузии, пока на кончике иглы не появится капля жидкости. Убедитесь, что фаска направлена вперёд.
    3. Установите параметры насоса — скорость: 0,25 мкл/мин, объём на полушарие: 2 мкл, тип шприца: соответствующий используемому использованию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем инъекции зависит от вида грызуна и целевой области мозга, которую нужно трансдуциировать. Инъекции 1 мкл приводят к фокальной экспрессии, тогда как большие объёмы (до 10 мкл) требуют очень низких частот инъекций и несут более высокий риск разрушения тканей или рефлюкса.
  3. Стриатальное таргетирование и инъекция
    1. Дезинфицируйте кожу головы 70% этанола. Сделайте разрез по средней линии (~1–1,5 см) стерильным лезвием скальпеля от ушей до глаз.
    2. Обнажите и очистите череп, удаляя надственность ватными палочками. Найдите Брегму и запишите стереотаксичную нулевой точку (вручную или цифрово).
    3. Определить координаты инъекции относительно Bregma (для мыши в возрасте 8-12 недель с примерно 18-20 г): передне-задняя (AP) +0,6 мм; Среднелатеральный (ML) ±1,8 мм; Дорсо-вентральный (DV): –3,3 мм.
    4. Аккуратно тренируйтесь по отмеченным координатам AP/ML. Двигайтесь медленно, чтобы не проникнуть в мозг. В качестве альтернативы прекратите процедуру, когда кость достаточно истончена — это подтверждается визуализацией кровеносных сосудов в твердой мозочке через череп. Аккуратно перфорируйте твердую матер маленькой иголкой.
    5. Проверьте, правильно ли находится отверстие, опустив иглу для инъекции. Проверьте наличие засора иглы, введя часть раствора до тех пор, пока капля не станет чётко видна.
    6. Медленно опускайте иглу для инъекции до координаты DV. Введите 2 мкл вирусного раствора на каждую полушарие при 0,25 мкл/мин. После инъекции подождите 5 минут, прежде чем медленно втягивать иглу, чтобы избежать рефлюкса.
    7. Введите лентивирус, кодирующее белок дикого типа (ATXN2WT или ATXN3WT), в одно полушарие, и лентивирус, кодирующее мутантное/расширенное белоковое (ATXN2MUT или ATXN3MUT) на противоположную сторону (рандомизированную или заранее определённую)12,13.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используя атлас мозгамыши 18, практически все области мозга могут быть стереотаксисно воздействованы за пределами стриатума, включая кору, гиппокамп, черную субстанцию и мозжечок. Поскольку мозжечок является основным центром патологии у СКА, он представляет собой особенно важную цель для доставки векторов. Для разработки этой модели мыши с мозжечком SCA3 мы использовали координаты 1,6 мм ростраль до лямбда, 0 мм от средней линии и 1 мм вентрально к поверхности черепа, при этом планка рта была установлена на −3,3, что обеспечивало точное наведение коры мозжечка12,15.
  4. Мониторинг во время операции
    1. Следите за движением усов и рефлексами. Если наблюдается движение, введите дополнительную дозу анестезии (треть начального объёма).
  5. Закрытие и восстановление раны
    1. Закройте разрез 3–5 прерванными 5-0 нейлоновым швами. Введите смесь антагонистических препаратов подкожно в дозе 10 мкл/г массы тела, чтобы обратить действие первоначальных анестетиков. Этот раствор готовится путём смешивания 1,5 мл 0,9% NaCl, 500 мкл атипамезола (5,0 мг/мл), 5,0 мл флумазенила (0,1 мг/мл) и 3,0 мл налоксона (0,4 мг/мл), обеспечивая итоговый объём 10 мл.
    2. Поместите животное в чистую клетку для восстановления над грелкой и наблюдайте за ним всю ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале комната для инъекции должна быть оборудована биологическим защитным шкафом для обращения с векторами. Исследователи должны носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторный халат, перчатки и защиту для глаз. Все отходы (например, иглы, шприцы и загрязнённые материалы) должны утилизироваться в контейнеры для биологической опасности в соответствии с институциональными и национальными нормативами.

4. Сбор, подготовка и обработка тканей

  1. Приготовление
    1. Подготовьте все инструменты для вскрытия и необходимые растворы для эвтаназии мышей и сбора тканей (например, анестезия, 4% параформальдегид [PFA] в PBS).
    2. Заранее подготовьте 4% PFA, храните в замороженном состоянии и размораживайте не более чем за 24 часа до использования. Убедитесь, что раствор тщательно охлаждён перед перфузией.
      ВНИМАНИЕ: PFA токсична. Обращайтесь только с вытяжкой с соответствующими средствами индивидуальной защиты (СИЗ) и обучением.
    3. Введите смертельной дозы пентобарбитала (100–200 мг/кг, внутрибрюшинно) для анестезии животного. Подтвердить глубокий наркоз по отсутствию рефлекса сжатия пальцев; Если рефлекс сохраняется, введите дополнительную дозу.
  2. Транскардиальная перфузия
    1. Разместите и закрепите животное в аппарате для вскрытия. С помощью щипцов поднимите кожу брюшной полости и сделайте вертикальный разрез с помощью ножниц (рисунок 2A, розовая стрелка).
    2. Поднимите поверхностную фасцию и сделайте верхний разрез, пока печень не станет видимой, чтобы избежать повреждений органов брюшной полости.
    3. Разрежьте диафрагму горизонтально, затем протяните разрез к подмышке (рисунок 2A, белая стрелка). Отражайте и закрепляйте грудную стенку.
    4. Введите иглу для перфузии в вершину левого желудочка, чтобы она не пробила стенку желудочка. Сделайте небольшой разрез в правом предсердии тонкими ножницами (рисунок 2B).
    5. Начать транскардиальную перфузию с использованием 50 мл ледяного 4% параформальдегида (PFA) при расходе 1-2 мл/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Часто холодный раствор вызывает сгибание хвоста и подёргивания мышц, что является признаком хорошей перфузии.
  3. Вскрытие мозга
    1. Подготовьте трубку с достаточным содержанием PFA 4% для полного погружения мозга. Отрубите мыши голову большими ножницами. Утилизировать тело в герметичный мешок для сожжения.
    2. Отразите кожу головы, чтобы обнажить череп. Определите отверстие magnum и начните удаление черепа, резая тонкими ножницами боково, параллельно мозгу (рисунок 2C).
    3. Повторите на противоположной стороне, затем разрежьте череп между глазами над обонятельными луковицами.
    4. Поднимите череп от мозжечка к обонятельным луковицам, чтобы обнажить мозг. С помощью лопатки аккуратно удалите мозг от задней части к передней части и погрузите его в 4% PFA не более 24 часов при 4 °C.
    5. Замените раствор для вложения сахарозой 20%-30% в PBS и инкубируйте при 4 °C до завершения инфильтрации. Мозг сначала плавает, а затем опускается после полного проникновения, обычно в течение 24 часов. Если он остаётся на плаву, продлите инкубацию до осядения на дне трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг криозащиты минимизирует замораживающие артефакты, снижая содержание воды в тканях.
      Аккуратно просушите мозг и трубку, затем храните при -80 °C до дальнейшего использования.
  4. Криосекция и сбор свободно плавающих тканей
    1. Перед секционированием установите криостат на -20 °C и желаемой толщине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для стриатума корональные срезы толщиной 20-25 мкм обеспечивают идеальный компромисс между сохранением структуры и проникновением антител, обеспечивая участки, достаточно прочные для обработки при сохранении высокого качества окрашивания и пространственного разрешения. Криосекционные условия также следует указывать для других областей мозга, так как оптимальная толщина может варьироваться в зависимости от цитоархитектуры. Для мозжечка обычно рекомендуются сагиттальные срезы размером 25–35 мкм, так как эта толщина сохраняет слоистую структуру коры мозжечка.
    2. Транспортируйте мозг по сухому льду и дайте ему уравновеситься внутри криостата в течение 5-10 минут. Этот шаг важен для предотвращения повреждения тканей.
    3. Удалите обонятельные луковицы скальпелем; Они должны быть мягкими и легко нарезать. Нанесите каплю свежего O.C.T. размером с горошину на диск образца и установите мозжечок в контакт (рисунок 1D). Разместить мозг для коронального сечения. После заморозки добавьте дополнительный O.C.T., чтобы встроить весь мозг.
      ПРИМЕЧАНИЕ: O.C.T. прозрачен при комнатной температуре и становится непрозрачным белым при полной заморозке; Если он остаётся блестящим, оставьте больше времени на заморозку в криостате.
    4. Установите диск образца в держатель и обрежайте, пока не станет видно стриатум (два белых круга в каждом полушарии). Если полушария получили разные обработки, проколите одно полушарие иглой, чтобы сохранить ориентацию. Запишите это для дальнейшего анализа.
    5. Переключитесь в режим секционирования и собирайте свободно плавающие секции в пластину на 48 лунок с помощью тонкой кисти или пипетки Пастера, отполированного огнем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Свободно плавающий метод улучшает проникновение антител, уменьшает фон, позволяет хранить их длительное время и обеспечивает равномерное распределение участков для полного покрытия стриатального покрытия.
    6. Заполните скважины PBS, содержащим 0,05% натриевого азида.
      ВНИМАНИЕ: Натрий азид токсичен — обращайтесь с СИЗ и правильно утилизируйте отходы.
    7. Разместите первый участок в колодце A1, второй — в A2 и продолжайте последовательно. Когда пластина заполнена, либо продолжайте в новой пластине, либо возвращайтесь к колодцу A1 и продолжайте до разреза всего стриатума (~3 полных пластины на 48 ямак). Запечатайте пластины прозрачной пленкой и храните при 4 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа целой стриатумной формы выделение одного столбца из пластины даёт равномерно расположенные сечения, представляющие всю область.

5. Иммуногистохимия с окрашиванием DAB

  1. Промывайте секции 3 раза в PBS, чтобы удалить остаточный азид натрия. Инкубировать в растворе фенилгидразина (0,2 - 0,3 мг/мл в PBS) в течение 30 минут при 37 °C.
    ВНИМАНИЕ: Фенилгидразин канцерогенен — выполните этот этап в выхлопной камере и утилизируйте отходы как опасные.
  2. Постирайте 3 раза в PBS по 5 минут, 10 минут и 10 минут последовательно. Заблокировать ткань на 1 час при RT в PBS, содержащем 10% нормальной козьей сыворотки (NGS) и 0,1% Triton X-100.
  3. Инкубировать ночь при 4 °C с первичным антителом в рекомендованном разбавлении (например, мышиный антиатаксин-2, 1:1000 в блокирующем растворе) при мягком перемешивании. Постирайте 3 раза в PBS по 5 минут, 10 минут и 10 минут последовательно.
  4. Инкубировать с биотинилированным вторичным антителом (1:200 в блокирующем растворе) в течение 2 часов при РТ при мягком перемешивании. Постирайте 3 раза в PBS по 5 минут, 10 минут и 10 минут последовательно.
  5. Инкубировать в ABC-комплексе 30–40 минут при RT. Промывать 3 раза в PBS по 5 минут, 10 минут и 10 минут подряд.
  6. Приготовьте раствор DAB свежим: для 2,5 мл ультрачистой воды добавьте 1 каплю буфера и вихрь; добавьте 2 капли DAB и вихрь; Добавьте 1 каплю H₂O₂ и снова вихрь.
    ВНИМАНИЕ: DAB канцерогенен — используйте в вытяжном контейнере и правильно выбрасывайте отходы.
  7. Прорабатывайте секции в растворе DAB по отдельности, пока не достигнете желаемой интенсивности окрашивания (обычно 1–10 минут). Немедленно прекращайте реакцию, перенеся на PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Реактивность DAB со временем снижается; Работайте эффективно. Если в колодце одновременно несколько секций, убедитесь, что они не соприкасаются, так как это влияет на процесс окрашивания.
  8. Постирайте 3 раза в PBS по 5 минут, 10 минут и 10 минут последовательно. Крепите секции на стекли с желатиновым покрытием и дайте им полностью высохнуть. Не маркируйте слайды графитовым карандашом, так как это может мешать съёмке.
  9. Обезвоживайте, проясняйте и скользите следующим образом: погружать в дистиллированную воду на 30 секунд, обезвоживать по серии этанола: 75%, 96%, 100% (по 3 минуты каждая). Прочистите в растворе ксилола на 5 минут и высушите на воздухе. Нанесите покрытие с помощью быстрозатвердеющего монтажного материала и дайте ему затвердеть внутри вытяжки не менее 24 часов перед изображением или хранением.

6. Количественная оценка объёма, обедненного DARPP-32, в полосе мыши с помощью FIJI (ImageJ)

  1. Получение изображений
    1. Сделайте изображения корональных срезов мозга, охватывающих всю стриатум (примерно Брегма +1,0––0,5 мм). Поддерживайте постоянное освещение, увеличение (например, 10x) и разрешение. Сохраняйте изображения в формате TIFF с последовательными именами файлов (например, Striatum_Bregma_+0.5.tif).
  2. Подготовка изображений на Фиджи
    1. Откройте каждое изображение в FIJI. Калибруйте размер пикселя: перейдите в раздел анализа > установите масштаб. Используйте известный масштаб микрометра или метаданные изображения (например, 1 пиксель = 1 мкм).
    2. Преобразование изображений в 8-битные: Image > Type > 8-битный. При необходимости регулировать яркость/контраст для оптимальной визуализации истощённой области (на этом этапе избегайте порогового ограничения).
  3. Выбор возврата инвестиций в истощённых районах
    1. Используйте инструменты Polygon, Freehand или Brush, чтобы обвести область, опустошённую DARPP-32 (обычно более светлую или отсутствующую окрашивание в стриатуме). Перейдите в раздел Анализ > Измерить , чтобы зафиксировать площадь в μm2.
    2. Сэкономьте ROI, зайдя в ROI Manager > Add > More > Save или используйте функцию Multi-measure для пакетного анализа.
    3. Повторяйте для всех соответствующих участков мозга.
  4. Расчёт обеднённого объёма
    1. Умножьте истощённую площадь в каждом срезе на расстояние между секциями (обычно 120–240 мкм, в зависимости от толщины и расстояния между срезами).
      Объём на секцию (мм3) = Обеднённая площадь (мм 2) × Интервал сечения (мм)
    2. Суммируем объём по всем разделам:
      Общий истощённый объём (мм3) = Σ (площадь × интервал)
    3. Опционально: наложение для визуализации. Используйте Image > Overlay > From ROI , чтобы визуализировать истощённые области по секциям. Экспортируйте краткое изображение или анимацию для фигурок.
  5. Всегда проверяйте выравнивание с атласом мозга мыши для точного ростро-каудального картирования. Анализируйте каждое полушарие отдельно, чтобы различать единосторонние эффекты (например, инъекция WT и мутант).

7. Количественная оценка белковых агрегатов в мышиной стриатуме

  1. Ручная количественная оценка с использованием FIJI
    1. Загрузите и откалибруйте изображение. Откройте изображение на FIJI. Калибруйте размер пикселей (пропустите этот шаг, если используете изображения с метаданными).
    2. Перейдите в Анализ > Set Scale, введите известное расстояние (например, 1 пиксель = 0,5 мкм). В FIJI перейдите в раздел Плагины > Анализ > Ячейковый счётчик > Ячейки. Нажмите «Инициализировать», затем выберите изображение.
    3. Выберите тип маркера (например, тип 1) для агрегатов. Вручную кликайте по каждому видимому агрегату, чтобы отметить его. Данные записи: FIJI будет отображать подсчёт в панели счётчика ячеек. Счёт записей для каждого изображения/раздела. Экспортируйте подсчёты вручную или используйте макрос для компиляции результатов.
  2. Полуавтоматическая количественная оценка с использованием IHCAggreCount
    1. Загрузка и обработка изображений. Откройте IHCAggreCount и нажмите Загрузить изображение (дополнительный рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приложение IHCAggreCount было разработано нашей лабораторией как самостоятельный научный инструмент, предназначенный для упрощения и стандартизации количественной оценки клеточных агрегатов на основе микроскопических изображений. Программное обеспечение было полностью создано на Python с использованием модульной архитектуры, разделяющей обработку изображений, коррекцию выбора, вычисление измерений и другие функции. IHCAggreCount полностью совместим с Windows 10 и Windows 11, а также с macOS 13 Ventura и macOS 14 Sonoma, и успешно протестирован на обеих платформах. По сравнению с традиционными методами ручного осмотра изображений, программное обеспечение обладает значительными аналитическими преимуществами: снижает субъективность пользователя, устраняет повторяющиеся ручные шаги, ускоряет обработку изображений, обеспечивает воспроизводимые измерения, обеспечивает последовательное извлечение по регионам интереса и позволяет пакетную обработку в нескольких средах. В целом, приложение обеспечивает более быстрый, объективный и надёжный рабочий процесс для обнаружения и количественной оценки глобул, чем традиционный ручной подход. Заявка доступна авторами при разумном запросе.
    2. Изображение будет отображаться в оригинальном отображении изображений. Перейдите на вкладку Processing. Примените HiLo для улучшения контраста агрегатов/фона (см. Дополнительный рисунок 2). Примените порог яркости для фильтрации агрегатов с фона (дополнительный рисунок 3). Используйте фильтр минимального размера для удаления мелких частиц (шума) (дополнительный рисунок 4). По желанию примените порог округлости для исключения неагрегатных форм (дополнительный рисунок 5).
    3. Для обнаружения агрегатов IHC перейдите на вкладку «Общие цели» и нажмите «Вычислить общие агрегаты » и «Рассчитать площадь агрегата». Все обнаруженные агрегаты выделены и перечислены в матричной таблице (ID, площадь, средний размер; Дополнительный рисунок 6).
  3. Ручные коррекции (опционально)
    1. Перейдите на вкладку коррекции, используйте Smart Add для автоматического обнаружения агрегатов в выбранных регионах (дополнительный рисунок 8). Используйте ручное добавление, чтобы вручную маркировать агрегаты. Используйте Smart Delete, чтобы удалить нежелательные метки. (Выделенные агрегаты отображаются для визуального осмотра; Дополнительный рисунок 7).
  4. Результаты экспорта
    1. Нажмите «Экспортировать CSV», чтобы экспортировать текущие данные изображения. Нажмите «Экспортировать всё», чтобы пакетно экспортировать данные из нескольких проанализированных изображений. Всегда анализируйте изображения при одинаковых настройках яркости/контрастности и других параметрах (например, пороге) в экспериментальных группах в IHCAggreCount.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом исследовании успешно выявлена экспрессия атаксина-2 и DARPP-32 с использованием настоящего протокола. После стереотаксичного введения лентивирусных векторов в стриатум мышей C57BL/6J была обнаружена устойчивая экспрессия как дикого , так и мутантного атаксина-2 через 12 недель. Ранее мыпоказали 12 , что эти конструкции специфичны для нейронов, эффективно трансдуцируя в среднем 20 000 нейронов намиллиметр 3. В наших экспериментальных усло...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье описывается создание стриатальной лентивирусной мышиной модели для полиQ SCA. Также описывается образование высокотитровых лентивирусных векторов, кодирующих дикий тип и расширенную форму вызывающего белка, а также двустороннее введение ЛЖ в стриатум мыши с помощью стереотаксической хирургии. Кроме того, описывается процедура сбора мозга, гистологическая обработка и количественное определение признаков заболеваний на основе изображений. Вместе эти методы позволяют ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

Лаборатория Клевио Нобреги финансируется проектом Cure CSB, Ассоциацией детей с редкими заболеваниями имени Вильема Юлияна (Словения) и Исследовательским институтом биомедицинского центра Алгарве (ABC-Ri). Некоторые авторы этой статьи имеют стипендию PhD, финансируемую Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), с такими ссылками: Тиаго Морейра-Гомес (2022.11008.BD), Инес Т. Афонсу (2022.10161.BD) и Рафаэль Г. Коста (2022). 11973.BD).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0.9% NaClМестный поставщик—Используется для приготовления анестезирующих и антагонистических смесей
100 мм тканевых культуральных блюдSPL Life Sciences11090
ABC-комплект (Avidin-Biotin Complex)VECTASTAIN Elite
Атипамезол (5.0 мг/мл)Местный поставщик—Антагонист медетомидина
Настольный центробежный аппарат--
Биобезопасный шкаф, класс II (соответствует BSL-2)--
Биотиниловый вторичный антибиотик--
Бычий серумоальбумин (BSA)NZYTechMB47002
Секции мозга (например, корональные секции 30-40 мкм), иммуноокрашенные на DARPP-32--
Плагин подсчета клеток (FIJI)Встроенный / ImageJ—Инструмент для ручного подсчета агрегатов
Инкубатор CO2 (37 °С, 5% CO2, увлажненный)--
Компьютерная рабочая станцияМестный поставщик—Используется для обработки изображений и запуска программного обеспечения
Конические трубки для ультрацентрифугированияBeckman Coulter358126
Ватные тампаныМестный поставщик—Используется для удаления периоста
Криостат с держателем дисков для образцов--
DAB (Диаминобензидин)--
Цифровой стереотаксический координатный считывательStoelting/WPI51725Цифровой дисплей для измерения координат
Измененная среда Дульбекко (DMEM, высокий уровень глюкозы)Gibco/Thermo Fisher11-965-092
Этанол 70, 96 и 100%--
Этанол, 70%Местный поставщик—Для дезинфекции кожи головы
Фентанил (0.05 мг/мл)Местный поставщик—Компонент анестезии
Фетальный бычий сывороточный альбумин (FBS), инактивированный тепломGibco/Thermo Fisher10500064
FIJI (дистрибутив ImageJ)NIH / ImageJhttps://fiji.sc/Проприетарное программное обеспечение для ручной идентификации агрегатов
Тонкие щипцы (для щипания пальцев)Местный поставщик—Для контроля глубины анестезии
Флумазенил (0.1 мг/мл)Местный поставщик—Антагонист мидазолама
Щипцы и скальпельМестный поставщик—Для удаления периоста и выставления черепа
Микроспринцы Hamilton 700/1700 Series Microliter/GastightHamilton / Fisher Sci.7653-01/10550203Для загрузки вирусного раствора
Маленькие иглы с убирающимся хабом HamiltonHamilton / Fisher Sci.7804-03/ 10698205Для доставки вируса
Огревающий валик (для грызунов)Kent Scientific / SOMNIнапример 04-777-177Для поддержания температуры тела
Клетки HEK 293T (≤ пассаж 10, свободны от микоплазмы)ATCC или эквивалентCRL-3216
Перекись водорода--
Проприетарное программное обеспечение IHCAggreCountПоставляется по требованиюN/AПроприетарное программное обеспечение для полуавтоматического обнаружения и идентификации агрегатов
Инвертированный микроскоп (для конфлюентности клеток)--
Лабораторный миксер-вортекс--
Лентовирусные векторы (WT и мутант)Собственные / Центр обслуживанияN/AВирусный раствор для инъекции
L-глутамин (200 мМ)Gibco/Thermo Fisher25030081
Легкий микроскоп с камерой (яркое поле)--
Медетомидин (1.0 мг/мл)Местный поставщик—Компонент анестезии
Микродрель (совместима со стереотаксическим аппаратом)Stoelting / Местный поставщик—Для краниотомии
Помпа для микроинъекций (например, Stoelting)Stoelting/WPI53210Автоматизированная насосная система для вирусных инъекций
Микропипетка (P1000, P200, P10) и насадки--
Микрографии (секции ИХК)Созданы внутри лабораторииN/AИзображения иммуногистохимии, подлежащие анализу
Лезвия микротомов (низкопрофильные, одноразовые)--
Мидазолам (5.0 мг/мл)Местный поставщик—Компонент анестезии
Монтажно

Ссылки

  1. Afonso-Reis, R., Afonso, I. T., Nóbrega, C. Current Status of Gene Therapy Research in Polyglutamine Spinocerebellar Ataxias. Int J Mol Sci. 22 (8), 4249(2021).
  2. Durr, A. Autosomal dominant cerebellar ataxias: polyglutamine expansions and beyond. Lancet Neurol. 9 (9), 885-894 (2010).
  3. McIntosh, C. S., Li, D., Wilton, S. D., Aung-Htut, M. T. Polyglutamine Ataxias: Our Current Molecular Understanding and What the Future Holds for Antisense Therapies. Biomedicines. 9 (11), 1499(2021).
  4. Henriques, C., et al. Viral-based animal models in polyglutamine disorders. Brain. 147 (4), 1166-1189 (2024).
  5. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The Construction of Transgenic and Gene Knockout/Knockin Mouse Models of Human Disease. Transg Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  6. Tello, J. A., Williams, H. E., Eppler, R. M., Steinhilb, M. L., Khanna, M. Animal Models of Neurodegenerative Disease: Recent Advances in Fly Highlight Innovative Approaches to Drug Discovery. Front Mol Neurosci. 15, 883358(2022).
  7. Moreira-Gomes, T., Nóbrega, C. Development of a gene therapy with lentiviral vectors for spinocerebellar ataxias. Methods Mol Biol. 2974, 215-225 (2026).
  8. Parr-Brownlie, L. C., et al. Lentiviral vectors as tools to understand central nervous system biology in mammalian model organisms. Front Mol Neurosci. 8, 14(2015).
  9. Zwi-Dantsis, L., Mohamed, S., Massaro, G., Moeendarbary, E. Adeno-Associated Virus Vectors: Principles, Practices, and Prospects in Gene Therapy. Viruses. 17 (2), 239(2025).
  10. Moreira-Gomes, T., Nóbrega, C. From the disruption of RNA metabolism to the targeting of RNA-binding proteins: The case of polyglutamine spinocerebellar ataxias. J Neurochem. 168 (8), 1442-1459 (2024).
  11. Matsuzaki, Y., Oue, M., Hirai, H. Generation of a neurodegenerative disease mouse model using lentiviral vectors carrying an enhanced synapsin I promoter. J Neurosci Meth. 223, 133-143 (2014).
  12. Marcelo, A., et al. Autophagy in Spinocerebellar ataxia type 2, a dysregulated pathway, and a target for therapy. Cell Death Dis. 12 (12), 1117(2021).
  13. Alves, S., et al. Striatal and nigral pathology in a lentiviral rat model of Machado-Joseph disease. Human Mol Genet. 17 (14), 2071-2083 (2008).
  14. Alves, S., et al. Lentiviral vector-mediated overexpression of mutant ataxin-7 recapitulates SCA7 pathology and promotes accumulation of the FUS/TLS and MBNL1 RNA-binding proteins. Mol Neurodegenerat. 11 (1), 58(2016).
  15. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6 (1), 34(2006).
  16. Arrasate, A., et al. Establishment and Characterization of a Stable Producer Cell Line Generation Platform for the Manufacturing of Clinical-Grade Lentiviral Vectors. Biomedicines. 12 (10), 2265(2024).
  17. Nóbrega, C., et al. Overexpression of Mutant Ataxin-3 in Mouse Cerebellum Induces Ataxia and Cerebellar Neuropathology. Cerebellum. 12 (4), 441-455 (2013).
  18. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Compact Second Edition, Gulf Professional Publishing. (2004).
  19. Bateup, H. S., et al. Distinct subclasses of medium spiny neurons differentially regulate striatal motor behaviors. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14845-14850 (2010).
  20. Nóbrega, C., et al. Molecular hallmarks of neurodegeneration in polyglutamine spinocerebellar ataxias. Cell Death Dis. 16 (1), 826(2025).
  21. Murakami, Y., et al. AAV-based gene therapy ameliorated CNS-specific GPI defect in mouse models. Mol Ther Meth Clin Dev. 32 (1), 101176(2024).
  22. Wada, H., et al. AAV-based gene therapy ameliorates neurological deficits in a mouse model of childhood-onset neurodegeneration with cerebellar atrophy. Mol Ther J Am Soc Gene Ther. 33 (11), 5829-5839 (2025).
  23. Konno, A., Shinohara, Y., Hirai, H. Production of Spinocerebellar Ataxia Type 3 Model Mice by Intravenous Injection of AAV-PHP.B Vectors. Int J Mol Sci. 25 (13), 7205(2024).
  24. Jansen-West, K., et al. Plasma PolyQ-ATXN3 Levels Associate With Cerebellar Degeneration and Behavioral Abnormalities in a New AAV-Based SCA3 Mouse Model. Front Cell Dev Biol. 10, 863089(2022).
  25. Nóbrega, C., Mendonça, L., Matos, C. A. A Handbook of Gene and Cell Therapy. , Springer International Publishing. Cham. (2020).
  26. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4 (5), 346-358 (2003).
  27. Schambach, A., Zychlinski, D., Ehrnstroem, B., Baum, C. Biosafety Features of Lentiviral Vectors. Human Gene Ther. 24 (2), 132-142 (2013).
  28. de Almeida, L. P., Ross, C. A., Zala, D., Aebischer, P., Déglon, N. Lentiviral-Mediated Delivery of Mutant Huntingtin in the Striatum of Rats Induces a Selective Neuropathology Modulated by Polyglutamine Repeat Size, Huntingtin Expression Levels, and Protein Length. J Neurosci. 22 (9), 3473-3483 (2002).
  29. Fisher, E. M. C., Bannerman, D. M. Mouse models of neurodegeneration: Know your question, know your mouse. Sci Transl Med. 11 (493), eaaq1818(2019).
  30. Bii, V. M., Collins, C. P., Hocum, J. D., Trobridge, G. D. Replication-incompetent gammaretroviral and lentiviral vector-based insertional mutagenesis screens identify prostate cancer progression genes. Oncotarget. 9 (21), 15451-15463 (2018).
  31. Alves-Cruzeiro, J. M. D. C., Mendonça, L., Pereira de Almeida, L., Nóbrega, C. Motor Dysfunctions and Neuropathology in Mouse Models of Spinocerebellar Ataxia Type 2: A Comprehensive Review. Front Neurosci. 10, 572(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

2
Лентивирально-индуцированная стриатальная патология как доклиническая модель полиглутаминной спиномозжечковой атаксии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.