Method Article

Анализ профилирования тромба: платформа на основе микрофлюидики для всесторонней характеристики биомеханического тромбогенеза

DOI:

10.3791/69555

⸱

January 9th, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Department of Pathology, University of Texas Medical Branch

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе описывается микрофлюидный анализ, использующий сдвиговое напряжение для запуска образования тромба в крови, и характеризует тромб по множеству измерений показаний. Анализ может измерять протромботическую склонность образцов крови и, следовательно, полезен для диагностики заболеваний, поиска лекарств, а также в базовых механистических исследованиях, связанных с тромбозом.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тромбоз — это патологическое состояние, описывающее аномальное накопление тромбоцитов и факторов свертывания в кровеносном сосуде. Хотя многие работы были посвящены активации тромбоцитов растворимыми агонистами как основному механизму тромбоза, часто упускается из виду, что кровоток также способствует формированию тромба. Особенно в артериях тромбоз обычно связан с артериальным стенозом, который увеличивает сдвиговое напряжение в кровотоке и способствует процессу тромбогенеза — феномену, называемого биомеханическим тромбогенезом. Долгое время не существовало биоанализа, который бы дал всестороннее и детальное понимание процесса биомеханического тромбогенеза. Для решения этой проблемы был разработан анализ профилирования тромба, сочетающий микрофлюидику с многоцветной флуоресцентной визуализацией, что позволяет всесторонне охарактеризовать биомеханический тромбогенез с семью показателями, охватывающими размер и состав тромба, а также уровень активации тромбоцитов. Этот анализ профилирования тромба может использоваться для оценки протромботической склонности у человека и эффективности антитромботических препаратов, а также полезен для дальнейшего понимания механизмов, лежащих в основе артериального тромбоза.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тромбоз является одной из основных причин сердечно-сосудистых заболеваний, который ежегодно приводит к миллионам смертей по всемумиру. В настоящее время биоанализ в стандартных клинических условиях для оценки рисков тромбоза не доступен. Среди коммерциализированных лабораторных и гематологических анализов на функции лечения традиционные анализы на коагуляцию и агрегометрия доказали ненадёжность при прогнозировании тромбоза или крупных побочных сердечно-сосудистыхсобытий 2,3,4. Глобальный тесттромбоза 5, PFA-100/2006 и глобальные анализы на коагуляцию7, 8, 9, 10, 11 также имеют ограниченные данные, подтверждающие их эффективность.

Исходя из современного понимания, процесс тромбогенеза в основном обусловлен тремя механизмами. Помимо двух признанных на конвенции механизмов — биохимической агрегации и коагуляции тромбоцитов, третий механизм, который недостаточно изучен и часто недооценивается, — это сдвиговая агрегация тромбоцитов, также известная как «биомеханическая агрегация тромбоцитов»12,13. В биомеханической агрегации тромбоцитов высокие сдвиговые напряжения и градиент сдвига служат основным приводом для перекрёстного сшивания тромбоцитов с помощью фактора GPIbα-фон Виллебранда (VWF), интегрина αIIbβ 3-VWF и интегрина αIIbβвзаимодействия с 3-фибриногенами. При артериальном тромбозе наиболее важным механизмом является биомеханическая агрегация тромбоцитов, учитывая, что она значительно усиливается высоким сдвиговым потоком, вызванным артериальным стенозом. Таким образом, тромбогенез, вызванный агрегацией тромбоцитов, получил название «биомеханический тромбогенез»12,14.

В предыдущих работах распространённым методом экспериментального наблюдения за скоплением тромбоцитов является микрофлюидный стенозный анализ, при котором участок тяжёлого стеноза встраивается в прямой канал. Когда кровь проникает через канал под физиологическим сдвигом стенки, вокруг стенозного участка возникает патологически высокое сдвиговое напряжение, что приводит к накоплению тромбоцитов к формированию тромба. Однако в предыдущих работах использовался только один (для тромбоцитов, отражающий размер тромба) 15, 16, 17, 18, 19 или максимум два (один для тромбоцитов, другой для другого биомаркера) 13,20, что не позволяет обеспечить полную характеристику тромба.

Недавно был разработан тромб-профилирующий анализ, который включает многоцветную флуоресцентную визуализацию в микрофлюидном тесте стеноза, обеспечивая отслеживание в реальном времени 7 биомаркеров (тромбоциты, уровень фибриногена, уровень фактора фон Виллебранда, уровень экспрессии P-селектина, уровень воздействия фосфатидилсерина, расширенный уровень интегрина αIIbβ 3, полностью активный интегрин αIIbβ 3 уровень экспрессии) в тромбе, что заложивает основу для всесторонней характеристики биомеханическоготромбогенеза 21. В этой работе приводятся подробные протоколы по подготовке и выполнению анализа профилирования тромба, а также соответствующего анализа данных. Оборудование, необходимое для анализа, включает инвертированный многоцветный флуоресцентный микроскоп и микрофлюидическую систему. Анализ использует относительно небольшое количество цельной крови человека (менее 2 мл), обладает высокой экономической эффективностью (~$12 за образец) и даёт результаты в течение 30 минут. Анализ позволяет точно выявлять многомерные протромботические аномалии у людей и оценивать влияние антитромботических препаратов на изменение размера, состава и статуса активации тромбоцитов тромбоцитов, что подтверждает его широкое применение как в исследованиях, так и в клинических целях в будущем. Примечательно, что анализ должен использовать свежесобранную гепаринизированную кровь. Хранение крови при 4 °C или более 6 часов или использование антикоагулянтов, кроме гепарина, либо предотвращает образование тромба, либо приводит к нетверным результатам.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол соответствует руководящим принципам и был одобрен Комитетом по этике исследований в области человеческих исследований Медицинского отделения Техасского университета. Экспериментальная аппаратная установка состоит из микрофлюидного устройства, перфузионных компонентов (соединители, трубки, шприц и насос для шприца) и инвертированного микроскопа с оптическими компонентами, позволяющими делать яркополевые и многоцветные флуоресцентные изображения. В микроскопе используется многосветодиодный маяк и многочастотный фильтрующий куб для разделения 4 люминесцентных каналов с минимальным взаимным протоком: возбуждение: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31 и излучение: 435/30, 519/25, 594/32, 695/58. Для всех экспериментальных процедур используйте средства индивидуальной защиты, включая перчатки, защиту для глаз и лабораторную куртку. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка микрофлюидных устройств

  1. Спроектировать главную форму с прямоугольными каналами (шириной 200 мкм × высотой 50 мкм), которые включают участок с сужением света на 80%. Каждый канал имеет отдельные входы и выходы для соединения труб (рисунок 1; см. дополнительный файл 1 для оригинального проектного файла).
  2. В зависимости от конструкции используйте кремниевую пластину для изготовления мастер-формы с фоторезистом SU-8 с помощью стандартной фотолитографии. Приклейте форму скотчем внизу чашки Петри диаметром 15 см (рисунок 2A).
  3. Приготовьте смесь PDMS, смешивая преполимерную основу и отверждающий агент в наборе силиконового эластомера с соотношением веса 10:1. Вылейте смесь на основную форму (рисунок 2B).
  4. Поместите пластину с PDMS смесью в вакуумный осушитель для дегазировки и удаления запертых пузырьков воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте пластину в вакууме минимум 2 часа, пока пузырьки полностью не будут удалены.
  5. Термически отверждайте смесь PDMS, инкубируя её при 75 °C в течение 2 часов.
  6. Аккуратно вырежьте отвергнутый PDMS из основной формы (рисунок 2C,D) и разделите его на отдельные блоки микросхемы.
  7. Создайте вход и выход, пробивая отверстия в указанных местах с помощью иголки зонда (рисунок 2E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сжатый воздухоочиститель, чтобы удалить остатки мусора из пробитых отверстий. Чтобы минимизировать загрязнение поверхности, перед склеиванием очистите устройства PDMS с помощью клейкой герметической ленты.
  8. В химическом капюшоне распылите 75% этанола на салфетку, а влажной салфеткой используйте для протирания и очистки стеклянных стеклов. Оставьте стеклянные стекла сохнуть.
  9. В химической вытяжке обработайте стеклянные стекла и PDMS-чипы высокочастотным генератором на 30 и 20 с соответственно, а затем выровняйте каждый чип с помощью стеклянного затвора. Аккуратно прижмите щепу к поверхности стеклянного затвора, чтобы его можно было перевязать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходимо выполнять в химической вытяжке, так как высокочастотный генератор производит озон во время использования, что вредно для здоровья.
  10. Термически соединяйте устройства, инкубируя их при 150 °C в течение 15 минут. После охлаждения устройства будут готовы к использованию (рисунок 2F).
  11. Храните устройства при комнатной температуре в условиях без пыли.
  12. Используйте клещу, чтобы удалить пластиковую часть игл, и согните металлические трубки под углом 90°. Эти изогнутые трубки будут использоваться как соединители для микрофлюидных устройств.

2. Подготовка люминесцентных датчиков

ПРИМЕЧАНИЕ: В эксперименте используется всего 7 люминесцентных датчиков: SZ22-FITC, фибриноген-Alexa Fluor 405, 2.2.9-Alexa Fluor 555, AK4-Alexa Fluor 647, Annexin V-Pacific Blue, MBC 370.2-Alexa Fluor 555, PAC-1-Alexa Fluor 647. Среди них фибриноген, 2.2.9 и MBC 370.2 коммерчески доступны только в неконъюгированной форме и требуют флуоресцентной конъюгации в лаборатории.

  1. Для сопряжения фибриногена с Alexa Fluor 405:
    1. Сделайте свежий буфер с бикарбонатом натрия с концентрацией 0,1 М, pH 8,5.
    2. Разбавить фибриноген до 1 мг/мл в фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO 4, 1,8 мМ KH2PO 4, pH7,4).
    3. Добавьте 1/10 объёма буфера бикарбоната натрия в раствор фибриногена.
    4. Смешайте 1 мл фибриногена с 1 мг Alexa Fluor 405 NHS-эфира и инкубировать 1 час при комнатной температуре на ротаторе. Защищайте от света.
    5. Удалите буфер хранения из колонки очистки, центрифугая колонку при 1 100 × г в течение 2 минут и сбросьте проток сквозного канала. Загрузите реакционный раствор в колонку, установите колонку на совместимый флакон для сбора и центрифугуйте при 1 100 × г в течение 5 минут для получения фибриноген-Alexa Fluor 405.
    6. Используйте спектрофотометр для измерения поглощения на длине волны 280 нм (A280; белковый сигнал) и 405 нм (A405; красительный сигнал). Рассчитайте концентрацию белка и соотношение F/P (флуоресценция: молярное соотношение белка).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение F/P должно быть в диапазоне 8-10.
    7. Храните фибриноген-Alexa Fluor 405 при 4 °C в темноте.
  2. Для сопряжения антител 2.2.9 и MBC 370.2 с Alexa Fluor 555:
    1. Сделайте свежий буфер с бикарбонатом натрия с концентрацией 0,1 М, pH 8,5.
    2. Разведите запас антител до 1 мг/мл в буфере без аминов.
    3. Добавьте 1/10 объема буфера бикарбоната натрия в раствор антител.
    4. Смешайте антитело 100 мкл с 1 флаконом (100 мкг) Alexa Fluor 555 NHS-эфира и инкубировать 1 час при комнатной температуре на ротаторе. Защищайте от света.
    5. Удалите буфер хранения из колонки очистки, центрифугая колонку при 1 100 × г на 2 минуты, и сбросьте проток сквозного канала. Загрузите реакционный раствор в колонку, установите её на совместимый флакон для сбора и центрифугуйте при 1 100 × г в течение 5 минут, чтобы собрать 2.2.9- или MBC 370.2-Alexa Fluor 555.
    6. Используйте спектрофотометр для измерения поглощения на длине волны 280 нм (A280; белковый сигнал) и 555 нм (A555; сигнал красителя). Рассчитайте концентрацию антител и соотношение F/P (флуоресценция: молярное отношение антител).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение F/P должно быть в диапазоне 1-1,5.
    7. Храните 2.2.9- и MBC 370.2-Alexa Fluor 555 при 4 °C в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного маркировки — высокое соотношение F/P может ухудшить биологическую функцию.

3. Забор крови у людей

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура должна проводиться квалифицированным медицинским персоналом (например, лицензированными медсёстрами, сертифицированными флеботомистами). Также получите письменное информированное согласие от участников исследования.

  1. Подготовьте шприц, аспирируя 500 мкл тиродного буфера (12 мМNaHCO 3, 10 мМ Гепес, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 5,5 мМ D-глюкозы, 0,5% бычьей сывороточной альбумин, pH 7,4), содержащего 0,32 Ед/мл гепарина на 10 мл крови для сбора.
  2. Собирайте кровь с помощью венипункции. Используйте пустой шприц, чтобы собрать первые 2 мл крови и сбросить. Затем замените шприц с гепарином для взятия образца крови. Медленно тяните шприц, чтобы минимизировать активацию тромбоцитов.
  3. Переведите собранную кровь в центрифугную трубку объёмом 15 мл и поддерживайте температуру ниже 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы крови следует использовать для экспериментов в течение 6 часов после сбора данных.

4. Тромбовый профилирующий анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выполнять все процедуры, связанные с обработкой крови, в шкафу для биобезопасности, чтобы избежать проливания крови на экспериментатора. Если это невозможно, используйте настольный щит.

  1. Разбавить мономер VWF до 2 мкг/мл в PBS. Предварительное покрытие микрофлюидных устройств мономером VWF и инкубировать 1 час при комнатной температуре.
  2. Инкубировать образец крови с помощью люминесцентного датчика 1 или 2 на 10 минут при комнатной температуре:
    1. Набор 1: SZ22-FITC (0,5 мкг/мл), фибриноген-Alexa Fluor 405 (60 мкг/мл), 2.2,9-Alexa Fluor 555 (1 мкг/мл), AK4-Alexa Fluor 647 (1 мкг/мл).
    2. Набор 2: SZ22-FITC (0,5 мкг/мл), Annexin V-Pacific Blue (1 мкг/мл), MBC 370.2-Alexa Fluor 555 (1 мкг/мл), PAC-1-Alexa Fluor 647 (1 мкг/мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку два набора датчиков необходимо использовать отдельно, каждый образец крови должен быть протестирован как минимум дважды (один раз с набором датчиков 1 и один раз с набором датчиков 2), чтобы получить полный набор данных.
  3. Подключите микрофлюидное устройство с входными и выходными разъёмами, а также трубками. Подключите другой конец входного разъёма трубкой с PBS, а другой конец выходного разъёма — шприцем. Закрепите шприц на насос для шприца. Установите микрофлюидное устройство на перевёрнутый микроскоп и вручную управляйте ступенью, чтобы найти место стеноза под микроскопом (рисунок 3A).
  4. Заполните микрофлюидный канал и трубку PBS с помощью шприцового насоса с расходом 0,5 мл/мин. Убедитесь, что вокруг места стеноза нет пузырьков воздуха.
  5. Соедините впускную трубку с образцом крови и пропустите образец крови через микрофлюидный канал с помощью насоса шприца при расходе 0,018 мл/мин (см. рисунок 3A).
  6. Установите время экспозиции и усиление каждого флуоресцентного канала. Проводите многоцветную флуоресцентную визуализацию в реальном времени, чередуя четыре канала, возбуждая по одному виду флуорофора за раз. Тем временем найдите фокусировочную плоскость тромба и записывайте сигналы в месте стеноза, обычно продолжительность от 15 до 30 минут (см. рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время экспозиции каждого канала необходимо регулировать так, чтобы флуоресцентный сигнал был легко различим, избегая насыщения (рисунок 4). В настоящей системе образцы крови здоровых испытуемых обычно выдают следующий диапазон интенсивности сигнала внутри сформированного тромба: SZ22-FITC, 70-110; фибриноген-Alexa Fluor 405, 60-100; 2.2.9-Alexa Fluor 555, 70-110; AK4-Alexa Fluor 647, 45-75; Annexin V-Pacific Blue, 35-65; MBC 370.2-Alexa Fluor 555, 45-85; PAC-1-Alexa Fluor 647, 10-30. Примечательно, что небольшая часть здоровых испытуемых могла бы получить нетипичный результат. Поэтому рекомендуется анализировать как минимум 5 здоровых образцов крови, чтобы убедиться, что время воздействия для каждого канала выбрано правильно.

5. Анализ данных

  1. Откройте файл данных с помощью ImageJ 1.53 (Фиджи, Национальные институты здравоохранения).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый файл должен содержать всего 4 видео с 4 разных каналов. Следующая процедура обычно применима к любому моменту времени, который пользователь заинтересован в анализе.
  2. Используйте канал SZ22-FITC для определения контура тромба, а для примерного выбора площади тромба используйте «выбор полигонов» (рисунок 5A,B).
  3. Для каждого канала используйте Image -> Adjust -> Threshold , чтобы устранить фон (рисунок 5C), а затем Analyze -> Measure для измерения площади и средней интенсивности сигнала внутри тромба.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SZ22-FITC окрашивает тромбоциты и, следовательно, отражает размер тромба. В наборе 1 фибриноген-Alexa Fluor 405 отражает уровень обогащения фибриногеном, 2.2.9-Alexa Fluor 555 отражает уровень обогащения фактора фон Виллебранда (VWF), а AK4-Alexa Fluor 647 — экспрессию P-селекции. В наборе 2 Annexin V-Pacific Blue отражает воздействие фосфатидилсерина (PS), MBC 370.2-Alexa Fluor 555 отражает активацию интегрина αIIbβ 3 в расширенную конформацию (E+ αIIbβ 3), а PAC-1-Alexa Fluor 647 отражает интегрин αIIbβ 3 полную активацию (акт αIIbβ 3)21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ профилирования тромба пропускает кровь через стенозный канал, обеспечивая формирование тромба, управляемого сдвигом, и выполняет многоцветную флуоресцентную визуализацию в реальном времени для сбора многомерной информации о сформированном тромбе. Проведя эксперименты с использованием сенсоров Set 1 и Set 2, можно охарактеризовать тромб по таким аспектам, как размер, обогащение перекрёстных сшивающих белков (фактор фон Виллебранда, фибриноген), а также уровень активации тромбоцитов...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сочетая анализ микрофлюидного стеноза с многоцветной флуоресцентной визуализацией, анализ профилирования тромба предоставляет удобный и мощный подход к изучению биомеханического тромбогенеза и механобиологии тромбоцитов. В то же время анализ полезен в широком спектре применений. Например, он может использоваться для скрининга антитромботических агентов, которые специфически ингибируют биомеханическую агрегацию тромбоцитов, где молекулярная мишень и механизм действия можно вывести из штри...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования, связанные с этой статьёй и разработкой анализа профилирования тромба в лаборатории Чена, были поддержаны грантом Национального института сердца, лёгких и крови R00HL153678 (Y.C.), Национальным институтом старения, премией Центра независимости пожилых американцев имени Клода Д. Пеппера #P30-AG024832 (Y.C.), премией UTMB Team Science Pilot Research Award (Y.C.), постдокторской стипендией Американской кардиологической ассоциации 20POST35080023 (Y.C.), и премию Американской кардиологической ассоциации за трансформационный проект 25TPA1471420 (Y.C.). Частично эта работа была выполнена в Сан-Диего Нанотехнологической инфраструктуре (SDNI) UCSD, входящей в Национальную координированную инфраструктуру нанотехнологий, поддерживаемой Национальным научным фондом (грант ECCS-2025752).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Шприцы по 10 млХенке Сасс Вольф5100-X00V0Сбор образцов крови
Трубки Falcon объемом 15 млGenesee Scientific28-101Хранение образцов крови
Газогерметичный стеклянный шприц объёмом 1 млГамильтон81331Сборка аппаратного обеспечения
2.2.9MERU VasImmuneТромбовое окрашивание
20 игл для зонда размером 20 X1/2МакМастер-КаррM919Создание PDMS-устройств
Шприцы по 20 млХенке Сасс Вольф5200-X00V0Сбор образцов крови
70% этанолСигма-ОлдричEX0281-1Дезинфекция газогерметичных шприцев и очистка стеклянных стеклян
AK4-Alexa Fluor 647BioLegend304918Тромбовое окрашивание
Alexa Fluor 405 NHS EsterИнвитрогенA30000Маркировка фибриногенов
Набор для маркировки антител Alexa Fluor 555ИнвитрогенA88065Маркировка MBC 370.2 и 2.2.9
Annexin V-Pacific BlueИнвитроген501121505Тромбовое окрашивание
Чистящий ДустерОфисный депо911245Создание PDMS-устройств
Набор ножей для рукоделия с деревянной коробкойЛезвия Excel44282Создание PDMS-устройств
Деионизированная вода ThermoFisher Scientific 751-628Промывка газонепроницаемых шприцев
ДесикаторBel ArtF420270000Дегазирование PDMS
Одноразовая многофункциональная лабораторная лопаткаLevGo17211Смешивание силиконовой эластомерной основы и отверждающего агента 
Спин-колонна для удаления красителей и биотинаЗебаA44296SМаркировка фибриногенов
ФибриногенИнновационные исследованияIHUFBG25MGТромбовое окрашивание
Шприцовый насос Fusion 200-XChemyx Inc.0720XСборка аппаратного обеспечения
Heparin Сигма-ОлдричH3149Антикоагулянт по образцам крови
Генератор высоких частотЭлектротехнический продукт Инк.BD-20Создание PDMS-устройств
Человеческий мономер VWFSino Biological Inc.10973-H08CПокрытие микрофуидных устройств
Программное обеспечение Image J v1.53Фиджи, Национальный институт здравоохраненияАнализ данных
Инвертированный микроскопLeicaDM IL ВОЗГЛАВИЛ; фильтрующий куб: Leica DFT51010; Маяк: LED5Сборка аппаратного обеспечения
КимвайпсКимберли-Кларк Профессионал34120Очистка стеклянных стеклян
Крышки замков LuerInternational Medical Industries, Inc.57100BСбор образцов крови
MBC 370.2КерафастEBW104Тромбовое окрашивание
Стекла для крышки микроскопаPaul Marienfeld GmbH & Рота KGES0107222Создание PDMS-устройств
Мини-скребок для лезвийСтэнли28-100Создание PDMS-устройств
NanoDrop 2000 UV-Vis спектрофотометрThermo ScientificND-2000Измерение концентрации белка и соотношения F/P
ДуховкаЛабораторные линейные инструменты3512Создание PDMS-устройств
PAC-1-Alexa Fluor 647BioLegend362806Тромбовое окрашивание
Пластиковая чашкаThermoFisher Scientific S04589Смешивание силиконовой эластомерной основы и отверждающего агента 
СУ-8 фоторезист мастер и bbsp; ПлесеньЧистая лаборатория нанофабрикации Nano3 в Калифорнийском университете в Сан-ДиегоСоздание PDMS-устройств
Набор силиконового эластомера Sylgard 184Крейден ДоуDC4019862PDMS
SZ22-FITC Бекман КоултерIM 1756UТромбовое окрашивание
ТрубкиCole - Palmer Instrument Co.06422-01Сборка аппаратного обеспечения

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lindstrom, M., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risks collaboration, 1990-2021. J Am Coll Cardiol. 80 (25), 2372-2425 (2022).
  2. Lim, H. Y., O'malley, C., Donnan, G., Nandurkar, H., Ho, P. A review of global coagulation assays - is there a role in thrombosis risk prediction. Thromb Res. 179, 45-55 (2019).
  3. Paniccia, R., Priora, R., Liotta, A. A., Abbate, R. Platelet function tests: A comparative review. Vasc Health Risk Manag. 11, 133-148 (2015).
  4. Zhang, Y., Jiang, F., Chen, Y., Ju, L. A. Platelet mechanobiology inspired microdevices: From hematological function tests to disease and drug screening. Front Pharmacol. 12, 779753(2021).
  5. Gorog, D. A., et al. First direct comparison of platelet reactivity and thrombolytic status between Japanese and Western volunteers: Possible relationship to the "Japanese paradox". Int J Cardiol. 152 (1), 43-48 (2011).
  6. Gorog, D. A., Becker, R. C. Point-of-care platelet function tests: Relevance to arterial thrombosis and opportunities for improvement. J Thromb Thrombolysis. 51 (1), 1-11 (2021).
  7. Lopez-Jaime, F. J., et al. Clot stiffness measured by seer sonorheometry as a marker of poor prognosis in hospitalized COVID-19 patients. Clin Appl Thromb Hemost. 28, 10760296221112085(2022).
  8. Bochsen, L., Wiinberg, B., Kjelgaard-Hansen, M., Steinbruchel, D. A., Johansson, P. I. Evaluation of the TEG platelet mapping assay in blood donors. Thromb J. 5, 3(2007).
  9. Lipets, E. N., Ataullakhanov, F. I. Global assays of hemostasis in the diagnostics of hypercoagulation and evaluation of thrombosis risk. Thromb J. 13 (1), 4(2015).
  10. Thromboelastography loinc code 67790-6. , LOINC Committee. (2022).
  11. Volod, O., Viola, F. The quantra system: System description and protocols for measurements. Methods Mol Biol. 2663, 743-761 (2023).
  12. Nesbitt, W. S., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nature Medicine. 15 (6), 665-673 (2009).
  13. Chen, Y., et al. An integrin alphaiibbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nat Mater. 18 (7), 760-769 (2019).
  14. Li, M., Hotaling, N. A., Ku, D. N., Forest, C. R. Microfluidic thrombosis under multiple shear rates and antiplatelet therapy doses. PLoS One. 9 (1), e82493(2014).
  15. Colace, T. V., Diamond, S. L. Direct observation of von Willebrand factor elongation and fiber formation on collagen during acute whole blood exposure to pathological flow. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (1), 105-113 (2013).
  16. Westein, E., et al. Atherosclerotic geometries exacerbate pathological thrombus formation poststenosis in a von Willebrand factor-dependent manner. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (4), 1357-1362 (2013).
  17. Brazilek, R. J., et al. Application of a strain rate gradient microfluidic device to von Willebrand's disease screening. Lab Chip. 17 (15), 2595-2608 (2017).
  18. Tovar-Lopez, F. J., et al. A microfluidics device to monitor platelet aggregation dynamics in response to strain rate micro-gradients in flowing blood. Lab Chip. 10 (3), 291-302 (2010).
  19. Kim, D. A., Ku, D. N. Structure of shear-induced platelet aggregated clot formed in an in vitro arterial thrombosis model. Blood Adv. 6 (9), 2872-2883 (2022).
  20. Receveur, N., et al. Shear rate gradients promote a bi-phasic thrombus formation on weak adhesive proteins, such as fibrinogen, in a vwf-dependent manner. Haematologica. 105 (10), 2471-2483 (2020).
  21. Din, M., et al. Multi-parametric thrombus profiling microfluidics detects intensified biomechanical thrombogenesis associated with hypertension and aging. Nat Commun. 15, 9067(2024).
  22. Stein, P. D., Sabbah, H. N. Measured turbulence and its effect on thrombus formation. Circ Res. 35 (4), 608-614 (1974).
  23. Mahalingam, A., et al. Numerical analysis of the effect of turbulence transition on the hemodynamic parameters in human coronary arteries. Cardiovasc Diagn Ther. 6 (3), 208-220 (2016).
  24. Thomson, E. E., et al. Gigapixel imaging with a novel multi-camera array microscope. Elife. 11, e74988(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Thrombus ProfilingBiomechanical ThrombogenesisMicrofluidic DevicesPlatelet ActivationFluorescence ImagingArterial ThrombosisVon Willebrand FactorProthrombotic TendencySyringe PumpImageJ Analysis

Related Articles