Методическая статья

Анализ стабильных изотопных трассеров витамина А с использованием LC-MS/MS

684 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69558

⸱

30 декабря 2025 г.

 ,  ,  , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Newcastle University Centre for Cancer, 3Fera Science Ltd

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол для одновременной количественной оценки как изотопно маркированных, так и нативных ретиноидов в человеческой плазме с использованием LC-MS/MS, с пределами обнаружения 6 fmol в колонке. Метод включает простую процедуру извлечения образцов и короткое аналитическое время, что обеспечивает высокую пропускную способность образцов.

Аннотация

Метод разбавления изотопов ретинола (RID) оценивает общие запасы витамина А в организме (TBS) у человека посредством стабильного разбавления изотопов с запасом витамина А. Для этого крайне важно точно и эффективно определить плазменное изотопное соотношение меченного и немаркированного ретинола с помощью масс-спектрометрии. Чтобы избежать обширных и трудоёмких процедур извлечения и/или очистки, таких как подготовка ВЭЖХ и дериватизация, LC-MS/MS используется для быстрого, чувствительного и одновременного анализа маркированных и немаркированных ретиноидов. Метод использует два уровня обнаружения: (i) начальное разделение массы и заряда (m/z) между родительскими (предшественниками) ионами, затем (ii) обнаружение фрагментированных дочерних (продуктовых) ионов. Это приводит к высокой чувствительности, при этом пределы обнаружения ретинола на столбце опускаются до 6 фмоль. Несмотря на преимущества тандемной масс-спектрометрии, для разделения ретинола от ретиниловых эфиров требуется жидкостная хроматографическая сепарация, поскольку конечные функциональные группы теряются при ионизации, что приводит к схожим родительским (м/з из 269) и дочерним узорам фрагментации ионов. В статье описывается выделение эндогенного и маркированного (13C или 2H) ретинола из плазмы методом экстракции растворителем, а затем количественная оценка с помощью LC-MS/MS под атмосферным давлением химической ионизации (APCI) в положительном ионном режиме.

Введение

Витамин A — жирорастворимое питательное вещество, необходимое для здоровьячеловека 1. Дефицит витамина А увеличивает восприимчивость к тяжелой инфекционной заболеваемости и смертности и, по оценкам, имеет глобальную распространённость в 29%, при этом более высокий уровень в странах Африки к югу от Сахары (48%) и Южной Азии (44%)2. Добавки витамина А — эффективная стратегия снижения детской смертности, особенно в регионах с высоким риском, таких как Африка к югу отСахары. Однако введение полугодового приема витамина А вместе с крупномасштабной обогащением основных продуктов витамина А и распределением порошка микронутриентов, которые часто управляются через различные государственные и частные организации, может привести к чрезмерному потреблению витаминаА 4,5,6,7,8,9,10. Таким образом, биомаркеры витамина А должны в идеале покрывать весь спектр статуса витамина А — от дефицита до токсичности. Метод разведения изотопов ретинола (RID) в настоящее время является самым точным косвенным методом оценки общего количества запасов витамина А в организме у людей 11,12,13 и был проверен по концентрациям витамина А в печени, считаясь лучшим биохимическим маркером статуса витамина А 14,15. Метод основан на принципе, что пероральная трассерная доза стабильного изотопного витамина A смешивается с немаркированным витамином A (tracee) в обменных бассейнах организма. Измерение специфической активности ретинола в плазме (то есть соотношение маркированного трекера ретинола к общему ретинолу в плазме (трейсер/трейсер в плазме)) в определённое время после дозировки позволяет оценить статус витамина А с помощью уравненияRID 11,12,13.

Для определения точных и точных концентраций как ретинолового трассера, так и следа в плазме применялись различные методы количественной оценки стабильного изотопного витамина А, включая газовую хроматографию-масс-спектрометрию (GC-MS), масс-спектрометрию с соотношением изотопов (IRMS) и жидкостную хроматографическую тандемную масс-спектрометрию (LC-MS/MS)16,17,18,19,20,21,22,23, 24, 25, 26. Важно, что LC-MS/MS сочетает высокую чувствительность, специфичность и операционную простоту с возможностью непосредственного измерения как натурального, так и маркированного ретинола в сложных матрицах. Таким образом, чтобы избежать трудоёмкой подготовки образцов, такой как подготовка с высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC) для IRMS или дериватизация для GC-MS, LC-MS/MS является идеальным выбором, поскольку этот метод включает простую процедуру экстракции, очень низкие пределы обнаружения стабильных изотопов и короткие срокивыполнения 7,18,19. Здесь мы представляем обновлённый метод LC-MS/MS с более коротким временем работы, простыми рабочими процессами в сочетании с высокой чувствительностью и селективностью как крайне подходящий метод для высокопроизводительного анализа образцов из крупномасштабных человеческих и наблюдательных исследований, где требуется определение общего количества запасов витамина А в организме.

Протокол

Исследование было одобрено Советом по этике исследований Университета Филиппин в Маниле (IRB ID: UPMREB 2016-282-01), Институциональным обзорным советом UC, Дэвис (IRB ID: 903681-2), и зарегистрировано по адресу ClinicalTrials.gov (ID: NCT03030339). Исследование было одобрено Комитетом по этическому обзору Службы здравоохранения Ганы (GHS-ERC 012/07/20), а исследование зарегистрировано в https://clinicaltrials.gov как NCT04632771.

1. Подготовка внутренних стандартов

  1. Внутренний стандартный раствор: Приготовить внутренний стандартный раствор в концентрации 1 мг/мл ретинилацетата в этаноле, содержащем 0,1% бутилированного гидрокситолуола (BHT; w/v). Разделите запасные растворы на аликвоты и храните их при -80 °C до 3 месяцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для внутреннего стандарта возможно использовать либо немаркированный ретинилацетат, либо маркированный ретинилацетат. Если используется немаркированный стандарт ретинилацетата, крайне важно получить базовое разрешение пиков ретинацетата и ретинола (см. рисунок 1).
  2. Рабочее решение для внутреннего стандарта: подготовьте внутреннее стандартное рабочее решение, разбавляя стандартный стандарт (1 мг/мл) до 1 мкг/мл. Сначала разведите 60 мкл стандартного стандарта 300 мкл этанола, затем разведите 60 мкл этого раствора в 10 000 мкл этанола. Для каждого образца добавляется 20 мкл рабочего внутреннего стандартного раствора, содержащего 20 нг ретинацетата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартные рабочие растворы могут храниться при -20 °C до 1 недели.

2. Подготовка калибровочных стандартов

  1. Стандарт калибровочного запаса: Подготовьте стандартные растворы калибровочного запаса в концентрации 1 мг/мл ретинола в этаноле, содержащем 0,1% BHT (w/v) как для следа, так и для трассера. Аликвот храните растворы и храните при -80 °C до 3 месяцев. Используйте каждый аликвот только один раз, чтобы избежать циклов замораживания и оттаивания.
  2. Стандартный рабочий раствор калибровки: Вынимите 100 мкл стандартного раствора калибровочного стандарта и разбавьте 10 000 мкл этанола в объёмной колбе. Определите концентрацию разбавлённого раствора калибровочного запаса на 325 нм в спектрофотометре с помощью кварцевой кюветы (см. таблицу 1 для подробностей).
  3. Возьмите аликвот стандарта разбавленной калибровочной булки и отрегулируйте концентрацию на 8 мкм для трассера и до 2 мкм для трассера с использованием 50% этанола и 50% ацетонитрила/dH 2O (70:30 (v/v).
  4. Подготовьте дублирующие калибровочные стандарты в семи различных концентрациях с использованием 50% этанола и 50% ацетонитрила/dH 2O (70:30 (v/v). Если извлечь 200 мкл плазмы, стандарты калибровки трассеров должны варьироваться от 6 мкм до 0,03 мкм, а калибровочные стандарты трассеров — от 0,5 мкм до 0,004 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для точной количественной оценки изотопно маркированные ретинол и ретиниловые эфиры в плазме количественно оцениваются с помощью дублированных 7-точечных калибровочныхкривых 27. Самая высокая точка на калибровочной кривой (вдвое выше максимальной ожидаемой концентрации следа и трассера в плазме) учитывает коэффициент концентрации восстановленного экстракта из исходного объёма плазмы.

3. Извлечение ретиноидов из плазмы

  1. Извлечь образцы плазмы из морозильника при температуре -80 °C и разморозить при комнатной температуре (примерно 30 минут).
  2. После размораживания используйте вихрь каждого образца и покрутите несколько секунд, чтобы убедиться, что в крышке не осталось плазмы. После этого положите образцы на лёд.
  3. Включите охлаждённую центрифугу и дайте ей остыть до 4 °C. Маркируйте стеклянные трубки объёмом 15 мл с винтовыми крышками (идентификатор субъекта и временная точка) и пипетку 200 мкл деионизированной воды (dH2O) в каждую пробирку.
  4. Из внутреннего стандартного рабочего раствора пипетка 20 мкл внутренней стандартной смеси в стеклянную трубку.
  5. С помощью пипетки введите 200 мкл плазмы в соответствующую трубку с внутренним стандартом иdH 2O.
  6. Пипетте 400 мкл этанола в каждую пробирку и покрутите пробирку, смешивая этанол с плазмой. Не создавайте вихрь, чтобы белковые остатки не прилипали к стеклянной стенке.
  7. Для первой экстракции гексана добавьте 2 мл гексана в каждую трубку и плотно зафиксируйте крышки трубки.
  8. Поместите трубки в орбитальный шейкер и встряхивайте со скоростью 15 000 об/мин в течение 30 минут. Перенесите трубки в охлаждённую центрифугу и открутите при 1 800 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  9. Используя стеклянные пипетки Пастера, перенесите супернатант в чистый набор маркированных стеклянных пробирок. Будьте осторожны, чтобы не переносить белковые осадки или воду.
  10. Произведите вторую экстракцию гексана, добавив ещё 2 мл гексана к оставшимся остаткам, плотно зафиксируйте крышки трубок и поместите трубки в орбитальный шейкер, встряхивая со скоростью 15 000 об/мин в течение 15 минут.
  11. Перенесите трубки в охлаждённую центрифугу и открутите при 1 800 x g в течение 10 минут при 4 °C. Используя стеклянные пипетки Пастера, перенесите супернатант в стеклянную пробирку, содержащую супернатант первой экстракции гексана (шаг 3.9) для каждого образца соответственно.
  12. Испарить комбинированный растворитель экстракции гексана (первый и второй экстракционные супернатанты для каждого образца) под мягким струёйN2 в затемнённой вытяжной вытяжке примерно 30 минут. Установите нагревательный блок на 35 °C.
  13. Засохший остаток снова суспензировать в 50 мкл этанола, кратковременно выйти в вихрь и добавить 50 мкл подвижной фазы (70:30 ацетонитрила/dH 2O (v/v)) и снова создать вихрь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ресуспензия высохших остатков должна проводиться с использованием 100 мкл этанола только если цель — количественное определение ретинил-эфиров.
  14. Перенесите в маркированные микроцентрифугные пробирки объемом 0,5 мл. Центрифугу при 16 900 x g на 5 минут.
  15. Перенесите 80 мкл восстановленного остатка в янтарные флаконы ВЭЖХ с вставками 300 мкл. Немедленно закройте флакон, чтобы предотвратить потерю растворителя из-за испарения.
  16. Переместите стеклянные флаконы в криобокс, маркируйте их названием исследования, датой извлечения и ID образцов, а затем храните в морозильнике при температуре -80 °C до анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ хранящихся образцов должен быть завершен в течение 3-5 дней. Объём плазмы 200 мкл обычно достаточно для обнаружения маркированного индикатора витамина А до 90 дней после дозировки. Однако объём плазмы можно отрегулировать до 400 мкл, если соотношение плазмы/воды/этанола поддерживается на уровне 1:1:2 по объёму.

4. Подготовка внутренних стандартных контрольных образцов

  1. Подготовьте раствор этанола/подвижной фазы, пипетируя 120 мкл этанола в микроцентрифугную трубку и добавив 200 мкл (70:30) ацетонитрила/dH 2O (v/v) и вихрь.
  2. В три отдельных трубки по 0,6 мл, пипетка 20 мкл внутреннего стандартного рабочего раствора.
  3. Добавьте 80 мкл раствора этанола/мобильной фазы и завихрьте. Перенесите три внутренних стандартных контрольных образца в янтарные флаконы ВЭЖХ с вставками по 300 мкл и немедленно закройте флаконы, чтобы предотвратить потерю растворителя из-за испарения.

5. Стандарты плазменного дома

  1. Для подготовки стандартных образцов в доме необходимо получить достаточный объём плазмы, позволяющий анализировать минимум три образца за один аналитический запуск. Общий требуемый объём плазмы определяется количеством образцов, которые необходимо проанализировать.
  2. Aliquot хранят стандартную плазму в небольшие криовиалы в объёмах, необходимых для каждого аналитического запуска, и хранят при -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы в стандарте дома содержался изотопно-маркированный трассер ретинола, используемый в неизвестных образцах. Достаточно материала можно получить, объединив образцы добровольцев в одну аликвоту.
  3. Извлекать не менее трёх стандартных образцов из плазмы для каждого аналитического запуска в том же объёме, что и неизвестные образцы плазмы, как это делается на шаге 3.
  4. Разместите стандарты плазменного дома по всей стойке с образцами, между которыми будет не менее 10 неизвестных плазменных образцов. Используйте стандарты плазменного дома для расчёта внутри- и междневных вариаций.

6. Внешние стандартные образцы

  1. Получите сертифицированные внешние стандартные образцы и храните при -80 °C. Широко используемым сертифицированным внешним стандартом является NIST Standard Reference Material SRM 968.
  2. Извлекайте не менее четырёх внешних стандартных образцов плазмы за один анализ в том же объёме, что и неизвестные образцы плазмы, используя шаг 3. Используйте внешние стандартные образцы для проверки точности полученных результатов.

7. Ручная оптимизация соединений

  1. Убедитесь, что нагреваемый небулайзерный зонд APCI установлен в корпусе источника MS. Приготовьте раствор для инфузии для каждого стабильного изотопного трассера примерно 1 мкг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен быть похож на подвижную фазу и содержать кислоту для протонирования. Хорошим растворителем будет ацетонитрил/dH 20с 0,1% муравьиной кислоты (v/v).
  2. Наполните раствором инфузии в шприц Hamilton объемом 1 мл Luer-lock, затем подключите шприц к источнику с помощью трубки PEEK через заземляющий соединение. Установите расход инфузии на 10 мкл/с.
  3. Выберите «Ручная настройка » и убедитесь, что инструмент находится в режиме «Настройка и калибровка». Запустите насос для шприца и выберите Q1 Scan Type в положительном режиме.
  4. Установите меньший массовый диапазон в 50 Да, а верхний диапазон массы примерно на 100 Да выше молекулярной массы целевого соединения.
  5. Установить циклы на 500, скорость сканирования 200 Da/s. Нажмите «Старт » и наблюдайте сигнал в окне масс-спектров.
  6. Дождитесь, пока сигнал стабилизируется, затем проверьте, появляются ли ожидаемые пики m/z. Рассмотрим пики [M+H]+ и [M+2H]2+ , поскольку MS находится в положительном режиме.
  7. Максимальная высота цели должна быть около 1e6. Общий ионный ток (TIC) должен составлять 1e7-1e9. Продолжайте инфузию, пока сигнал не стабилизируется, затем нажмите «Остановить». Должен быть чёткий пик высокой интенсивности, который образуется из соединения в растворе инфузии. Отображается общий ионный ток (TIC), который показывает общий сигнал для всех совокупных ионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ожидаемая масса ретинола 12C составляет 269 Да, поэтому диапазон от 50 до 300 Да уместен для показа ионов [M+H]+ и [M+2H]2+ .

8. Проверка сканирования продуктовых ионов (MS2) / спектров CE

  1. Установите начальную массу на более низкой массе, например, 50 Da, а стоп-массу чуть выше массы Q1 (например, 269,1 для 12C ретинола). Установите циклы на 5 и измените энергию столкновения (CE) на 10. Проверьте Q1 массу как предшественник иона. Если мелких фрагментов не появляется, увеличьте CE до 20.
  2. По мере увеличения CE образуется больше продуктовых ионов. Продолжайте увеличивать CE, пока прекурсорный ион справа спектра полностью не исчезнет. Увеличите CE ещё больше, чтобы увидеть потенциальную вторичную фрагментацию.

9. МРМ-сканирование

  1. Из сканирования MS2 выберите три наиболее распространённых или наиболее подходящих производных иона для дальнейшей оптимизации.
  2. Для каждого продукта иона введём Q1 (прекурсор) массу и Q3 (производные) массы. Установите время задержки на 200 мс. Назовите каждый фрагмент соответственно (например, 12C_Frag_93).
  3. Выберите энергию столкновения и определите оптимальное значение CE с помощью функции рампы. Заполните столбец CE оптимизированным значением CE для каждого фрагмента.
  4. Оптимизировать потенциал декластеризации (DP) после оптимизации CE для минимизации изобарических помех. Оптимизировать выходной потенциал ячеек столкновений (CXP) для одного перехода за раз.

10. Оптимизация источника/газа

  1. Эти параметры не могут быть автоматически оптимизированы. Если нужно повысить интенсивность сигнала, выполните процесс ручной оптимизации. Меняйте параметр за раз и сравнивайте, увеличился ли сигнал, остался прежним или уменьшился.

11. Условия жидкой хроматографии

  1. Для хроматографии используйте градиент двойной фазы мобильной клетки 0,1% (v/v) муравьиной кислоты вdH 2O (A) и 0,1% (v/v) муравьиной кислоты в ацетонитриле (B).
  2. В зависимости от применяемой системы LC используйте либо колонку ABZ PLUS размером 100 мм x 2,1 мм (3 мкм) с патроном C18 размером 4 мм x 2 мм (для HPLC), либо щит Premier BEH размером 100 мм x 2,1 мм (1,7 мкм) с колонкой RP18 FIT (для хроматографии сверхвысокого давления (UPLC)) для анализа ретинала. Поддерживайте колонны при температуре 40 или 50 °C соответственно.
  3. Введите 10 мкл экстракта плазмы в колонку. Элют анализирует с расходом 0,4 мл/мин. Для систем ВЭЖХ линейный градиент составляет: 60% B до 95% B за 6,0 минуты; 100% B с 6,1 минуты до 13,0 мин; 100% B до 60% B с 13,1 до 14,0 мин; и 60% B с 14,0 до 17,0 мин. Для систем UPLC линейный градиент зависит от исследовательского вопроса. Если определять только ретинол, градиент составляет: 40% B до 60% B за 1,0 минуту; 60% B до 95% B с 1,0 минуты до 6,0 мин; 100% B с 6,5 минут до 7,5 мин; 100% B до 40% B с 7,5 до 7,6 мин; и 40% B с 7,6 до 8,5 минут. Если цель — также анализировать ретинилэфиры вместе с ретинолом, то линейный градиент выглядит: 60% B до 95% B за 3,0 минуты; 100% B с 3,5 минуты до 6,5 мин; 100% B до 60% B с 6,5 до 7,0 мин; и 60% B с 7,0 до 8,5 минут.

12. Состояния РС/РС

  1. Провести анализ MS/MS под атмосферным давлением химической ионизации (APCI) в положительном режиме. APCI выбирается вместо электрораспылительной ионизации, так как обеспечивает более высокую интенсивность сигнала, более широкий линейный диапазон и меньший фоновойшум 26.
  2. Для соответствующих массовых переходов для [12C]ретинола, [13C10]ретинола, [2H 6]ретинола и их соответствующих эфиров/ацетата с выбранными параметрами мониторинга реакции (SRM) для API4000 и масс-спектрометра QTRAP 5500, см. таблицу 2, Таблицу 3 и Рисунок 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранный мониторинг ионов для ретинала, ретинилэфиров и ретинилацетата — это тот же фрагмент-ион, что и m/z 269 для количественной оценки APCI, поскольку этот ион соответствует потере воды, жирной или уксусной кислоты из протонированных молекул. Поскольку LC-MS/MS способен отделять пики ретинола от эфиров, одна инъекция позволяет определить обогащение изотопов как в фракциях ретина, так и в фракциях ретинил-эфира в одном образце.

13. Количественная оценка ретинала

  1. Количественно измерить концентрации ретинола [12C], ретинола, [2H6] и [13C10] ретинола по соответствующим калибровочным стандартам.
  2. Определить потери при извлечении с помощью возврата внутренних стандартных концентраций для каждого образца по сравнению с внутри стандартных контрольных образцов.
  3. Проведите подтверждение концентраций ретинола в плазме с использованием стандартного эталонного материала Национального института стандартов и технологий (NIST) (SRM) 968.

Результаты

Чтобы проиллюстрировать эффективность аналитического метода анализа стабильного изотопно-маркированного ретинола в различных хроматографических системах, мы представляем результаты двух разных исследований.

Для использования API4000 с предварительным ВЭЖХ были проанализированы плазменные образцы 111 филиппинских детей в возрасте от 12 до 18 месяцев, получивших пероральную дозу ретинацетата 400 мкг (1,17 ммоль) [13C10] в первый день, а затем взят образец крови 6 мл через 4 дня после дозировки, 7,28. Средняя концентрация ретинола в плазме составляла 1,1 мкмоль/л, а средняя [13C10] ретинола — 0,007 мкмоль/л. Поскольку уровень фонового шума в переходе от 279 до 100 м/з имел среднюю максимальную высоту ~50 cps (рисунок 1), уровень обнаружения (LOD) и количественной оценки (LOQ) для [13C10] ретинола были установлены на уровне 150 cps и 500 cps, что соответствует 6 fmol и 19 fmol на столбце соответственно. Поскольку между [12C] ретинолом и применяемым внутренним стандартом ретинилацетата было достигнуто хорошее базовое разрешение, не было необходимости использовать стабильный изотоп-метичный ретинацетат.

Более быстрое хроматографическое разделение достигается с помощью UPLC в сочетании с QTRAP 5500, при длительности работы менее 10 минут. В зависимости от исследовательского вопроса могут применяться два различных метода разделения; (i) если цель — определить нативный и изотопно-маркированный ретинол с использованием немаркированного внутреннего стандарта ретинилацетата, время удержания между ретинолом (4,37 мин) и ретинацетатом (5,33 мин) обеспечивает хорошее исходное разделение (рисунок 3); (ii) если цель состоит в разделении нативного и изотопного меченого ретинола вместе с нативными и маркированными ретинил-эфирами, хорошее разделение можно достичь за 8,5 минуты (см. рисунок 4). Однако из-за близкого времени удержания между ретинолом (2,10 мин) и ретинацетатом (2,43 мин) рекомендуется использовать изотопно маркированный ретинацетат ([2H4] ретинацетат). В этом примере были проанализированы образцы сыворотки у 80 ганских женщин репродуктивного возраста, получивших эквивалентную дозу 2 мг ретинола [2H6] ретинацетата, после чего был взят образец крови через 21 день после дозировки. Средняя концентрация ретинола в сыворотке составляла 1,89 мкмоль/л, средний [2H6] ретинола — 0,027 мкмоль/л, а средний [13C10] ретинола — 0,025 мкмоль/л.

Представленный метод достиг низкого уровня обнаружения (LOD = 6 fmol; LOQ = 19 фмоль на столбце), демонстрируя высокую чувствительность и специфичность для обнаружения стабильного изотопно-маркированного ретинола с чётким базовым разделением между нативным ретинолом и внутренними стандартами. Кроме того, метод эффективно работал как с HPLC, так и с UPLC, несмотря на различия во времени удержания. Использование изотопно маркированных внутренних стандартов ([2H4] ретинилацетат) обеспечивало точную количественную оценку при более быстрых условиях UPLC, если необходимо определить ретинил-эфиры. Валидация по сертифицированным стандартам NIST подтвердила точность, тогда как внутридневные и междневные коэффициенты вариаций (2,3% и 4,4% соответственно) показали отличную точность и воспроизводимость. Успешный анализ образцов плазмы/сыворотки из двух различных популяций (филиппинских детей и женщин из Ганы) с разными протоколами дозирования демонстрирует надёжность и практическую пользу в различных исследованиях питания.

figure-results-1
Рисунок 1: Хроматограмма LC-MS/MS с использованием масс-спектрометра API4000. Хроматограмма сывороточного ретинола была получена через 4 дня после перорального приема 0,4 мг [13C10] ретинилацетата. Выбранный мониторинг реакций (SRM) от m/z 269 до 93 показывает разделение [12C] ретинола (RT = 5,06 мин) и [12C] ретинацетата (RT = 5,83 мин) как внутренний стандарт (IS). Сигнал ретинола [13C10] при m/z 279–100 значительно превышает как предел обнаружения (LOD), так и предел количественной оценки (LOQ). Хроматографические условия: (A) градиент фазы двойной клетки 0,1% (v/v) муравьиной кислоты в dH2O и (B) 0,1% (v/v) муравьиной кислоты в ацетонитриле; расход 0,4 мл/мин с линейным градиентом: 60% B до 95% B за 6,0 минуты; 100% B с 6,1 минуты до 13,0 мин; 100% B до 60% B с 13,1 до 14,0 мин; и 60% B с 14,0 до 17,0 мин; Колонка ABZ PLUS размером 100 мм x 2,1 мм (3 мкм), оснащённая патроном C18 4 мм x 2 мм с температурой 40 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Масс-спектры ионов продукта APCI-MS/MS. Масс-спектры ионов продукта APCI-MS/MS с потоком: (A) m/z 269 [12C] ретинола, (B) m/z 273 [2H4] ретинола, (C) m/z 275 [2H 6] ретинола и (D) m/z 279 [13C 10] ретинола в положительном ионном режиме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Хроматограмма LC-MS/MS с использованием масс-спектрометра QTRAP 5500. Хроматограмма LC-MS/MS типичного экстракта из плазменного стандарта была взята за 21 день после перорального приема 1,0 мг [2H 6] ретинацетата и 90 дней после перорального приема 1,0 мг [13C 10] ретинацетата. Выбранный мониторинг реакции (SRM) по m/z 269→93 показывает пик ретинола [12C] (RT = 4,37 мин) и ретинацетата (RT = 5,33 мин) в качестве внутреннего стандарта (IS); ретинол [2H6] (RT = 4,36 мин) при м/з 275→96; и пик ретинола [13C 10] (RT = 4,38) при м/з 279→100. Хроматографические условия: (A) градиент фазы двойной клетки 0,1% (v/v) муравьиной кислоты приdH 2Oи (B) 0,1% (v/v) муравьиной кислоты в ацетонитриле; расход 0,4 мл/мин с линейным градиентом: 40% B до 60% B за 1,0 минуты; 60% B до 95% B с 1,0 минуты до 6,0 мин; 100% B с 6,5 минут до 7,5 мин; 100% B до 40% B с 7,5 до 7,6 мин; и 40% B с 7,6 до 8,5 мин; 100 мм x 2,1 мм (1,7 мкм) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT колонна, поддерживается при 50°C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Хроматограмма LC-MS/MS ретинола и ретинилэфиров с использованием масс-спектрометра QTRAP 5500. Хроматограмма LC-MS/MS типичного экстракта из плазменного стандарта была взята через 6 часов после перорального приема 1,0 мг [2H 6] ретинацетата и 90 дней после перорального приема 1,0 мг [13C 10] ретинацетата. Избранный мониторинг реакции (SRM) по m/z 269→93 показывает пик [12C]ретинола (RT = 2,10 мин); [2H 4]ретинилацетат при m/z 273→94 (RT = 2,43 мин) как внутренний стандарт (IS); разделение между [2H 6]ретинолом (RT = 2,09 мин) и [2H 6]ретинилпальмитата (RT = 5,11 мин) достигает пиков на m/z 275→96; и пик ретинола [13C 10] (RT = 2,10) на м/з 279→100. Хроматографические условия: (A) градиент фазы двойной клетки 0,1% (v/v) муравьиной кислоты приdH 2Oи (B) 0,1% (v/v) муравьиной кислоты в ацетонитриле; расход 0,4 мл/мин с линейным градиентом: 60% B до 95% B за 3,0 минуты; 100% B с 3,5 минуты до 6,5 мин; 100% B до 60% B с 6,5 до 7,0 мин; и 60% B с 7,0 до 8,5 мин; 100 мм x 2,1 мм (1,7 мкм) колонка AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT, поддерживается при температуре 50 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Параметры
Молярная абсорбция (ɛ) ретинола в этаноле:52 770 М-1 см-1
Коэффициент разбавления:100 (100 мкл стандартного калибровочного стандарта в 10 мл этанола)
Измеряемая средняя поглощение:0.575
Расчёт
Концентрация (моль) [12C]ретинола в этаноле:Концентрация (моль) = Поглощение / ɛ x Длина кюветы
= 0,575 / 52770 М-1 см-1 x 1 см = 1,09 x 10-5 м
Коррекция разбавления:1,09 x 10-5 M x 100 = 1,09 x 10-3 M или 1,09 mM

Таблица 1: Определение стандартной концентрации ретинола.

AnalyteПереходы MRM (m/z)Потенциал декластеризации (V)Потенциал входа (V)Энергия столкновения (eV)Потенциал выхода при столкновении (V)
[12C]-ретинол/эфиры269→935110276
[2H4]ретинилацетат273→945110276
[2H6]ретинол/эфиры275→965110276
[13C10]-ретинол/эфиры279→1004110276

Таблица 2: Выбранные параметры мониторинга реакций (SRM). Параметры для [12C] ретинола, [13C 10] ретинола и [2H 6] ретинола и их соответствующих эфиров с использованием API4000

AnalyteПереходы MRM (m/z)Потенциал декластеризации (V)Потенциал входа (V)Энергия столкновения (eV)Потенциал выхода при столкновении (V)
[12C]-ретинол/эфиры269→939410338
[2H4]ретинилацетат273→9454102011
[2H6]ретинол/эфиры275→966910253
[13C10]-ретинол/эфиры279→10010210359

Таблица 3: Выбранные параметры мониторинга реакций (SRM). Параметры для [12C] ретинола, [13C10] ретинола и [2H 6] ретинола и их соответствующих эфиров с использованием QTRAP 5500

Обсуждение

Представленный метод LC-MS/MS обеспечивает чрезвычайно высокую чувствительность, с пределами обнаружения до 6 фоль/л, что позволяет исследователям использовать от 100 до 200 мклплазмы 19. Этот таргетированный метод тандемного МС особенно эффективен для подтверждения идентичности изотополога ретиноидов при использовании как квантификаторов, так и квалификаторных продуктовыхионов 18. Однако, поскольку изотопно-маркированные ретиноиды присутствуют в значительно более низких концентрациях, чем физиологические немаркированные ретиноиды, образцы плазмы, содержащие маркированные ретиноловые и ретиниловые эфиры, могут потребовать дополнительного этапа концентрации. Эта необходимость зависит от таких факторов, как время подачи образца крови после нанесения, концентрация орального трассера и чувствительность системы LC-MS/MS. Исторически более высокие дозы применения использовались для преодоления низкой чувствительности предыдущих масс-спектрометров, но недавние достижения позволили использовать более низкиедозы 13. В приведённых примерах более высокая пероральная доза повышает уровень стабильного изотопно-маркированного ретинола даже в более поздние периоды времени, то есть через 21 день против 4 дней.

Поскольку конечные функциональные группы ретиниловых эфиров теряются при ионизации, наблюдаются те же родительские m/z 269 и схожие дочерние узоры фрагментации ионов как для ретинололовых, так и для ретиниловых эфиров. Поэтому хроматографическое разделение имеет решающее значение для определения их отдельныхконцентраций 18. Кроме того, из-за высокого естественного содержания стабильных изотопов 13C в эндогенных изотопологах ретинола рекомендуется включать более трёх атомов 13C в трассер ретинола, чтобы избежать необходимости коррекции базового естественного обогащения ретинола на 13C в человеческойплазме 29.

Образцы плазмы требуют обработки перед анализом изотопов в два этапа. Сначала плазменные образцы необходимо депротеинизировать, затем экстракцию ретинолов и ретиниловых эфиров с помощью неполярного растворителя, что создаёт бифазнуюсистему 18,19,20. Хотя чёткое фазовое разделение достигается с помощью вышеуказанного протокола, крайне важно, чтобы межфаза в бифазной системе не нарушалась и не собиралась, так как это увеличивает время сушки и снижает точность анализа. В качестве альтернативы наша группа также изучала применение однофазной процедуры экстракцииретиноидов 20. Для этого образцы плазмы объёмом 200 мкл пипетируются в пластиковую микроцентрифугную трубку объемом 2 мл, а ретиноиды извлекаются с помощью комбинации этанола и этилацетата. Применение этого протокола экстракции позволяет анализировать ретинол и более полярные ретиноиды, такие как изомеры ретиноевой кислоты, с эквивалентным восстановлением по сравнению с бифазной экстракцией, а также сопоставим с одноступенчатым методом экстракции ацетонитрила, разработанным Kane иNapoli 30.

Учитывая, что ретиноиды подвержены окислению и изомеризации при воздействии ультрафиолетового света и тепла, крайне важно провести анализ как можно быстрее, а также соблюдать общие меры предосторожности при сборе, обработке и храненииплазмы 30. Традиционные методы анализа стабильных ретиноидов с меткой изотопов используют трудоёмкую изоляцию и/или дериватизацию. Анализ GC-MS требует выделения фракции ретинола из человеческой сыворотки с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), после чего дериватизацияретинола-22. Хотя дериватизация не требуется для GC-C-IRMS, рекомендуется предварительное отделение ретинола с помощью двух отдельных этапов очисткиВЭЖХ 17,25,31, а также для определения исходного естественного обогащения ретинола 13C в человеческой плазме в популяции образцов17,32. В отличие от этого, представленный метод LC-MS/MS обладает несколькими преимуществами. Он избегает обширных и трудоёмких процедур извлечения и/или очистки, позволяя быстро, чувствительно и одновременно анализировать ретиниловые эфиры и свободныйретинол 16,18,26,32. Кроме того, метод эффективен, поскольку обеспечивает высокую точность с низкой вариабельностью и адаптируется к различным системам LC-MS/MS.

Раскрытие информации

Авторам нечего заявлять.

Благодарности

Поддержку этой работы оказали Фонд Билла и Мелинды Гейтс (номер проекта: OPP1115464) и Международное агентство по атомной энергии (МАГАТЭ) в Вене (номер проекта E4.30.30).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильные>растворители
Абсолютный этанол, HPLCФишер10428671
Ацетонитрил ВЭЖХ классаФишер10660131
Гексан 95% n-гексан для сертифицированного ВЭЖХФишерH/0406/17
Изопропанол ВЭЖХ классаVWR20880.32
Изопропанол ВЭЖХ классаVWR20880.32
Метанол 99% 2,5 лThermo Scientific11367996
<Сильные>Стандарты/изотопы
Алл-транс-ретинолBioXtra95144
РетинилацетатSigmaPHR1236
Стабильный изотоп, маркированный ретинолом:ReseaChem/Buchem BV
Стабильный изотоп, маркированный ретинилацетат:ReseaChem/Buchem BVН/ДДля метода RID можно использовать ряд стабильных изотопов. Список различных коммерчески доступных изотопов приведён в таблице 1.
Витамин A  (19,19,19,20,20,20-D6)
Витамин A  (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Ацетат витамина А (10,19,19,19-D4)
Ацетат витамина А (19,19,19,20,20,20-D6)
Ацетат витамина А (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
<Сильно>Снаряжение
5 мл регулируемый дозатор растворителяСигма-ОлдричZ627607-1EA
ABI 4000 LC-MS/MS.AB Sciex
Аналитические весы Фишер13592970
Капиллярные поршни (наконечники пипетки) CP100 10x96 TIPACKГилсонFD148314
Капиллярные поршни CP250ST 6x96ГилсонF148714
Шкаф с дымом
Microman E M100E Pipette (положительный рабочий объем)ГилсонFD10004
Microman E M250E Pipette (положительный объём)ГилсонFD10005
Pipetman P100, 10-100ul, металлический эжекторГилсонF114057M
Pipetman P1000, 100-1000ul, металлический эжекторГилсонF114059M
Pipetman P20, 2-20ul, металлический эжекторГилсонF144056M
QTRAP 5500 LC-MS/MSAB Sciex
Рефрижераторная центрифуга 5810 RЭппендорф
Звуковая водяная баняVWRUSC100T
СпектрофотометрТермо Фишер СайентификA51119600C
Концентратор образцов Techne и термоблок.VWR
Vibrax VXR Базовый шейкерIKA0002819002
Вихревой миксер; MS3 базовая IKAФишерMPR-555-050L
Насадка для пробирки VX2 — werke typ VX2IKA0000568900
<сильные>расходники
Микроцентрифугные пробирки 1,5 млФишерFB74323
100 мм x 2,1 мм (1,7 и мю; m) Колонка AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FITВоды186009498
100 мм x 2,1 мм (3 и микро; m) Колонка Supelcosil ABZ PLUSSupelco57917
Наконечники пипеток диаметром 1000ulСтарлабS1122-1830
Колбы объемом 100 млФишер11323644Пирекс боросиликатное стекло сертифицированного объемного колбы класса A
Наконечники пипеток диаметром 200ulСтарлабS1120-8810
Патрон SecurityGuard C18 калибра 4 мм x 2 ммФеноменэксAJ0-4286
Колбы объемом 50 млФишер11313644Пирекс боросиликатное стекло сертифицированного объемного колбы класса A
Флаконы янтарного стекла 9 мм с вставкамиФишер11583680
Колпачки с резьбой на флаконах 9 ммФишер13206419
Картонный криобоксСтарлабA9623-8181
УФ-кварц Hellma cuvetteSLSCEL1600
Азотный газ (высочайшая чистота и кислород)BOC
Пастер ПипеттФишер11546963
Культивные трубки Pyrex 100x16 ммКорнингCLS9944916
Крышки винтов PTFE 16 ммКорнингCLS999815
Флаконные стеклянные карпочки янтарного цвета 2 мл PTFEФишер11573542
Крышка винтов флакона, 9 мм, силикон, белый/PTFE красный.Thermo 13206419

Ссылки

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of Nutrition for Development (BOND)-Vitamin A Review. J Nutr. 146 (9), 1816-1848 (2016).
  2. Stevens, G. A., et al. Trends and mortality effects of vitamin A deficiency in children in 138 low-income and middle-income countries between 1991 and 2013: a pooled analysis of population-based surveys. Lancet Global Health. 3 (9), E528-E536 (2015).
  3. Baye, K., et al. Estimates of child mortality reductions attributed to vitamin A supplementation in sub-Saharan Africa: scale up, scale back, or refocus. Am J Clin Nutr. 116 (2), 426-434 (2022).
  4. Bielderman, I., Vossenaar, M., Melse-Boonstra, A., Solomons, N. W. The potential double-burden of vitamin A malnutrition: under- and overconsumption of fortified table sugar in the Guatemalan highlands. Eur J Clin Nutr. 70 (8), 947-953 (2016).
  5. Brown, K. H., Engle-Stone, R., Kagin, J., Rettig, E., Vosti, S. A. Use of Optimization Modeling for Selecting National Micronutrient Intervention Strategies: An Example Based on Potential Programs for Control of Vitamin A Deficiency in Cameroon. Food Nutr Bull. 36 (3 Suppl), S141-S148 (2015).
  6. Bruins, M. J., et al. Maximizing the benefits and minimizing the risks of intervention programs to address micronutrient malnutrition: symposium report. Matern Child Nutr. 12 (4), 940-948 (2016).
  7. Engle-Stone, R., et al. Filipino Children with High Usual Vitamin A Intakes and Exposure to Multiple Sources of Vitamin A Have Elevated Total Body Stores of Vitamin A But Do Not Show Clear Evidence of Vitamin A Toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  8. Engle-Stone, R., et al. Weighing the risks of high intakes of selected micronutrients compared with the risks of deficiencies. Ann New York Acad Sci. 1446 (1), 81-101 (2019).
  9. Raiten, D. J., et al. Perspective: Integration to Implementation (I-to-I) and the Micronutrient Forum-Addressing the Safety and Effectiveness of Vitamin A Supplementation. Adv Nutr. 11 (2), 185-199 (2020).
  10. van Stuijvenberg, M. E., et al. South African preschool children habitually consuming sheep liver and exposed to vitamin A supplementation and fortification have hypervitaminotic A liver stores: a cohort study. Am J Clinical Nutr. 110 (1), 91-101 (2019).
  11. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among Equations Used for Retinol Isotope Dilution in the Assessment of Total Body Stores and Total Liver Reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  12. Green, M. H., Green, J. B., Ford, J. L. Better Predictions of Vitamin A Total Body Stores by the Retinol Isotope Dilution Method Are Possible with Deeper Understanding of the Mathematics and by Applying Compartmental Modeling. J Nutr. 150 (5), 989-993 (2020).
  13. Lietz, G., et al. Current Capabilities and Limitations of Stable Isotope Techniques and Applied Mathematical Equations in Determining Whole-Body Vitamin A Status. Food Nutr Bull. 37, S87-S103 (2016).
  14. Furr, H. C., et al. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  15. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).
  16. Fleshman, M. K., Riedl, K. M., Novotny, J. A., Schwartz, S. J., Harrison, E. H. An LC/MS method for d8-β-carotene and d4-retinyl esters: β-carotene absorption and its conversion to vitamin A in humans. J Lipid Res. 53 (4), 820-827 (2012).
  17. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  18. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of beta-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  19. Oxley, A., et al. Determination of Vitamin A Total Body Stores in Children from Dried Serum Spots: Application in a Low- and Middle-Income Country Community Setting. J Nutr. 151 (5), 1341-1346 (2021).
  20. Oxley, A., Lietz, G. Use of stable isotopes to study bioconversion and bioefficacy of provitamin A carotenoids. Meth Enzymol. 670, 399-422 (2022).
  21. Parker, R. S., et al. Study of beta-carotene metabolism in humans using 13C-beta-carotene and high precision isotope ratio mass spectrometry. Ann N Y Acad Sci. 691, 86-95 (1993).
  22. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. Deuterium enrichment of retinol in humans determined by gas chromatography electron capture negative chemical ionization mass spectrometry. J Nutr Biochem. 9 (7), 408-414 (1998).
  23. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. G., Russell, R. M. Short-term (intestinal) and long-term (postintestinal) conversion of beta-carotene to retinol in adults as assessed by a stable-isotope reference method. Am J Clin Nutr. 78 (2), 259-266 (2003).
  24. Tang, G. W., Qin, J., Hao, L. Y., Yin, S. A., Russell, R. M. Use of a short-term isotope-dilution method for determining the vitamin A status of children. Am J Clin Nutr. 76 (2), 413-418 (2002).
  25. Tanumihardjo, S. A. Vitamin A status assessment in rats with C-13(4)-retinyl acetate and gas chromatography/combustion/isotope ratio mass spectrometry. J Nutr. 130 (11), 2844-2849 (2000).
  26. van Breemen, R. B., et al. Development of a method for quantitation of retinol and retinyl palmitate in human serum using high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry. J Chromatogr A. 794 (1-2), 245-251 (1998).
  27. Fu, Y., Li, W., Flarakos, J. Recommendations and best practices for calibration curves in quantitative LC-MS bioanalysis. Bioanalysis. 11 (15), 1375-1377 (2019).
  28. Ford, J. L., et al. Use of Model-Based Compartmental Analysis and a Super-Child Design to Study Whole-Body Retinol Kinetics and Vitamin A Total Body Stores in Children from 3 Lower-Income Countries. J Nutr. 150 (2), 411-418 (2020).
  29. van Lieshout, M., West, C. E., van Breemen, R. B. Isotopic tracer techniques for studying the bioavailability and bioefficacy of dietary carotenoids, particularly beta-carotene, in humans: a review. Am J Clinical Nutr. 77 (1), 12-28 (2003).
  30. Kane, M. A., Napoli, J. L. Quantification of endogenous retinoids. Methods Mol Biol. 652, 1-54 (2010).
  31. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84, 30-39 (2014).
  32. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).

Перепечатки и разрешения

Теги

Видео скоро будет доступно
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.