Методическая статья

Внутримышечная трансплантация эндокринных клеток поджелудочной железы, полученных из множественных стволовых клеток человека, у мышей

409 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69562

⸱

10 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigaciones Biomédicas Sols-Morreale, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universidad Autónoma de Madrid, 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas CIBERDEM, Instituto de Salud Carlos III

В этой статье

Краткое содержание

Мы предлагаем минимально инвазивный протокол для внутримышечной трансплантации островков поджелудочной железы, полученных из человеческих стволовых клеток, в иммунодефицитных мышей для имплантации in vivo и дальнейшего анализа.

Аннотация

Эндокринные клетки поджелудочной железы, полученные из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC), являются перспективным источником терапии диабетических клеток и моделирования заболеваний. Хотя было установлено несколько протоколов дифференцировки, имплантация in vivo обычно требуется для изучения созревания и функционирования в физиологическом контексте. Большинство методов трансплантации опираются на такие участки, как капсула почки или подкожное пространство, что может иметь технические или физиологические ограничения. Здесь мы представляем подробный протокол внутреннемышечной трансплантации поджелудочных SC-островков, полученных из hPSC, в иммунодефицитных мышей. Этот участок обеспечивает простой хирургический доступ, снижает инвазивность и обеспечивает надёжное извлечение трансплантата для последующего анализа. Процедура позволяет внутреннемышечно имплантировать островки, полученные из стволовых клеток, и поддерживает их восстановление для дальнейшей оценки секреции инсулина после внутреннего анализа глюкозы. Протокол включает этапы подготовки и уплотнения кластеров, трансплантационной хирургии, секреции инсулина in vivo с глюкозостимулированной (GSIS) и извлечения трансплантата для гистологического анализа, обеспечивая воспроизводимую основу для внутримышечной трансплантации в доклинических мышиных моделях.

Введение

Диабет — это гетерогенное метаболическое расстройство, распространённость которого удвоилась за последние три десятилетия и, какожидается, к 2050 году затронет 1,3 миллиарда человек. Хотя факторы окружающей среды, такие как питание и образ жизни, играют значительную роль в развитии диабета 2 типа (Т2D), генетическая предрасположенность также существенно способствует егопатогенезу 2. Клетки поджелудочной желез β ы отвечают за синтез и секрецию инсулина и играют центральную роль в патофизиологиидиабета 3. Чтобы понять, как генетический риск способствует дисфункции β-клеток, β клетки, полученные из человеческих стволовых клеток, организованные в трёхмерные эндокринные кластеры (далее — SC-островки), предоставляют высокоинформативную и релевантную модельнуюсистему 4,5. Современные протоколы эффективно направляют дифференцировку человеческих стволовых клеток в инсулинпроизводящие β клетки, повторяя ключевые этапы развития поджелудочной железы с использованием специфических ингибиторов и факторовроста 6,7.

Эти системы надёжно воспроизводят этапы развития масштабируемым и воспроизводимым образом, преодолевая ограничения донорских островков, которые не поддерживают моделирование развития и подвержены ограничениям по предложению. Мышиные модели дали ценные данные о развитии поджелудочной железы, но они часто не могут полностью воспроизвести фенотипические проявления, наблюдаемые у пациентов5. В результате использование системы на основе стволовых клеток позволяет характеризуть генетические варианты, участвующие в развитии поджелудочной железы человека и β клеточной дисфункции8.

Несмотря на эти достижения, SC-островки, созданные in vitro, остаются транскриптомически и функционально незрелыми по сравнению с нативными взрослыми β клетками. Они демонстрируют субоптимальную секрецию инсулина, стимулируемую глюкозой, и не имеют экспрессии зрелых β-клеточных маркеров, таких как MAFA и G6PC2 9,10. Для преодоления этого разрыва часто применяется созревание in vivo через трансплантацию в иммунодефицитных мышей; Это обычно улучшает как динамику секреции инсулина, так и профили экспрессиигенов 6.

Метаболизм глюкозы строго регулируется и требует интеграции системных сигналов. Трансплантированные SC-островки способны интегрировать сигналы от нескольких органов, обеспечивая более физиологически значимую среду, ключевую для оценки функциональных последствий генетической вариации в клетках человека β11.

Трансплантация SC-островков у мышей проводилась на различных анатомических участках. Обычным отделением является капсула почек, эффективная для стимулирования созревания β-клеток и обращения диабета у грызунов, обработанных стрептозотоцином (STZ) 12, но она включает сложную инвазивную операцию, ограничивающую её внедрение влабораториях 13. Кроме того, этот метод не применяется в клинических условиях для лечения пациентов с диабетом 1 типа из-за ограничений по размеру и сосудистойактивности 14. Были сообщены альтернативные участки трансплантации, такие как внутримышечная, подкожная и жировая ткани, предлагающие менее инвазивные и более клинически применимые пути. Хотя внутримышечная трансплантация может представлять трудности для достижения оптимального созревания β-клеток и секреции инсулина по сравнению с капсулойпочки 12, она всё же может обеспечить эффективную секрецию инсулина и поддержание гомеостаза глюкозы, предлагая при этом более простой и доступный хирургическийподход 15,16.

Поэтому в этом протоколе мы предлагаем подход к внутримышечной трансплантации, который учитывает ряд ограничений других протоколов трансплантации. Этот метод минимально инвазивен и обеспечивает надежную in vivo стратегию для созревания SC-островков и изучения генетических вариантов, связанных с дисфункцией β-клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты с плюрипотентными стволовыми клетками (hPSC) и лабораторными животными были одобрены институциональными, региональными и национальными этическими комитетами. Используемые здесь линии hPSC изначально были получены и распространены в соответствии с соответствующими этическими одобрениями и процедурами информированного согласия в исходных учреждениях. Рисунок 1 показывает общий рабочий процесс — от поддержания hPSC через направленное дифференцирование линии поджелудочной железы и созревания до SC-островков, подходящих для трансплантации.

1. Дифференциация hPSC к предкам поджелудочной железы

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол основан на двух основных подготовительных этапах: 1) поддержании и расширении ГПСК, и 2) их направленной дифференциации в сторону линии эндокринной поджелудочной железы. Оба шага описаны подробно 7,17. hPSC поддерживаются в покрытых пластинах с B8-средой в соответствии с рекомендациями Lyria-Leyte и др.17. Собирайте hPSC для дифференцировки во время экспоненциального роста до их слияния. При рекомендуемой плотности посева они должны достичь 90-100% слияния на следующий день, готовые к дифференциации. Дифференцировка по линии эндокринной поджелудочной железы проводится согласно процедуре, описанной Барсби и др.7. Полная информация о материалах содержится в Таблице 1.

  1. Свежепокрытие дифференциационных пластин внеклеточным матриксом, полученным из базальной мембраны.
  2. Семена 0,16-0,19 миллиона клеток/см2 на 0-й день (1,7 миллиона клеток в колодце из пластины с 6 колодцами). Используйте в 1,5-2 раза больше объёма B8 + CEPT, чтобы предотвратить истощение питательных веществ (3-4 мл на одну скважину в пластине с 6 лунками).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При прохождении hPSC или экспериментах по дифференциации посева мы предпочитаем дополнять B8 среду CEPT — коктейлем из хрома-1, эмрикасана, полиаминов и trans-ISRIB, вместо обычного ингибитора ROCK Y-27632, благодаря его доказанной способности повышать выживаемостьhPSC 18. Тем не менее, Y27632 остаётся валидной альтернативой для этого протокола.
  3. Выполняйте изменения медиа с помощью дифференциационных носителей S1–S4 по следующему расписанию: S1 (дни 1-4), S2 (дни 4-7), S3 (дни 7-9) и S4 (дни 9-11).
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу 1 для полных медиа-композиций; дополнительные процедурные детали описаны Барсби и др. 7.

2. Генерация 3D-кластеров и дифференцировка в клетки, производящие инсулин,

ПРИМЕЧАНИЕ: На 11-й день дифференцированные клетки должны были развиться в предшественников поджелудочной железы. Для дальнейшего стимулирования эндокринной дифференцировки на этом этапе клетки переходят от планарной культуры к трёхмерной культуре.

  1. Добавьте 0,5 мл 5% (w/v) антиадгеренсного раствора (см. таблицу 1 для подробностей), чтобы покрыть дно пластины с 24 лунками, содержащей инвертированные пирамидальные микроскважины (диаметром 400 мкм). Центрифуга при 1 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре (RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-адхерентный раствор создаёт анти-адгерентную поверхность, которая предотвращает прилипывание клеток к пластику и способствует равномерной агрегации.
  2. Осмотрите микроскважины под микроскопом на наличие пузырьков воздуха и при необходимости повторно центрифугуйте для удаления задержанного воздуха (рисунок 2A). Аспирируйте раствор против прилипления и дважды промывайте 0,5 мл PBS на скважину. Оставьте колодцы покрытыми PBS до готовности к использованию.
  3. Промыйте клетки 1 мл PBS-0,5 мМ EDTA, аспирируйте PBS-EDTA и закройте колодцы трипсином (1 мл для колодца с 6 колодцами). Инкубировать при 37 ºC в течение 8-12 минут (до тех пор, пока постукивание не приведёт к заметному отслою).
  4. Не удаляйте трипсин; вместо этого разбавьте с помощью двух объёмов DMEM-F12 или PBS и аккуратно подвесьте с помощью пипетирования. Поместите подвеску в коническую трубку и сразу переходите к следующему этапу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше инкубировать трипсин дольше, чем выполнять жёсткую механическую тритурацию.
  5. Центрифугуйте суспензию при 200 г в течение 3 минут при RT. Аккуратно аспирируйте супернатант и аккуратно суспензируйте гранулу в предварительно нагретой среде S4 (по 1,25 мл на каждую скважину микроколодца на 24 луки).
  6. Аспирируйте PBS из тарелок MicroWell. Аккуратно добавьте 1,25 мл взвешенных клеток в каждую яме пластины микроколодца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая скважина пластины с 24 микроскважиной содержит 1 200 микроскважин. Плотность посева, необходимая для получения кластеров соответствующего размера, составляет 1500 клеток на микроскважину, что соответствует 1,8 миллиону клеток на скважину. В качестве альтернативы можно использовать микроколодцы с 6 ячецами, регулирующие объёмы и количество клеток (примерно 8,85 миллиона клеток в 5 мл среды 4-й стадии).
  7. Центрифугуйте пластину при 100 г в течение 3 минут при RT, чтобы равномерно распределить клетки в микроколодцах. Аккуратно перенесите пластины микроколодца в увлажнённый инкубатор.
  8. Выполняйте изменения медиа с помощью дифференциационных сред S5 (D14-D18), S6 (D18-D25) и S7 (D25-D46).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полные детали состава приведены в Таблице 1, с дополнительными процедурными деталями, описанными Барсби и др. 7.
    Коктейль CEPT может использоваться на этом этапе вместо ингибитора ROCK Y-27632 благодаря его доказанной способности повышать выживаемость клеток во время формированияорганоидов 18. Успешное агрегирование обозначено формированием компактных сферических скоплений в течение 24–48 часов (см. рисунок 2B).

3. Трансплантация SC-островков в напряжённую мышцу иммунодефицитных мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: SC-островки были пересажены на различных стадиях дифференцировки (с 4 по 7 стадию). Хотя трансплантация дифференцированных островков SC S7 является оптимальной стратегией оценки чувствительности кглюкозе 6, трансплантация предшественников более ранних стадий (S4-S5) или незрелых SC-островков (S6) может помочь выявить различия дифференцировки или созревания, которые маскируются in vitro с помощью очерчённых условий культуры. Однако трансплантация менее дифференцированных предшественников несёт повышенный риск образования тератом, главным образом из-за остаточных недифференцированных клеточных популяций.

  1. Уплотнение кластеров
    1. Перенесите соответствующее количество кластеров в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл (см. примечание).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дозировка клеток зависит от цели эксперимента. Для гистологии достаточно 0,5–1 миллиона клеток на мышь для надёжного извлечения трансплантата, тогда как функциональные анализы или обращение диабета у мышей, обработанных STZ, обычно требуют более высоких доз — до 2-5 миллионов клеток. До уплотнения SC-островки должны иметь однородную сферическую морфологию с целевым диаметром ~150-250 мкм (допустимый диапазон: 100-300 мкм). Этот размерный диапазон примерно соответствует ~10³-4 × 10³ клеток на кластер, поэтому следует избегать крупных агрегатов (>300-400 мкм), так как они более подвержены центральному некрозу. Размер и однородность кластера проверяются перед уплотнением с помощью яркой или стереомикроскопической съёмки представительных скважин, затем измерения диаметра с помощью стандартного программного обеспечения для анализа изображений.
    2. Подключите шприц к игольчатой трубке и наполните его средой S7.
    3. Аспирируйте кластеры в трубку непосредственно из микроцентрифугальной трубки. Согните трубку пополам и вставьте сложенный участок в наконечник пипетки объёмом 200 мкл. Вставьте коническую трубку-иглу в коническую трубку объёмом 15 мл и закрепите концы на краю трубки с помощью ленты.
    4. Центрифугуйте трубку при 100 г в течение 2 минут при 4 °C, чтобы уплотнить скопления. Сразу поставьте трубку на лёд.
  2. Пересадка кластеров мышам
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические процедуры должны проводиться с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты и в соответствии с институциональными нормами по биобезопасности и благополучию животных. Анестетики и острые изделия должны обращаться и утилизироваться в соответствии с одобренными мерами безопасности.
    1. Индуцировать анестезию у NOD-scid-гамма-мышей с использованием 3-5% изофлурана.
    2. Сбрийте заднюю сторону правой ноги ниже колена и продезинфицируйте 70% этанолом.
    3. Отсоедините трубку от кончика пипетки и подключите её к шприцу. Отрежьте трубку близко к уплотнённым кластерам и прикрепите её к тупому концу иглы. Вдавливайте физиологический раствор, пока первый пучок не достигнет кончика иглы.
    4. Положите мышь на землю, наклонившись вправо, и вытяните правую ногу. Введите иглу на глубину 4–5 мм в медиальный отсек правого бедра, в области между приводящей и грацилисной мышцами.
    5. Вводите скопления, втягивая иглу на ~3 мм. Поверните шприц и вынимите иглу.
    6. Следите за мышью, пока полностью не выйдет из наркоза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для функциональной характеристики (например, in vivo GSIS, раздел 4) должны использоваться SC-островки одного генотипа на мышь; Достаточно одной пересадки. Однако для гистологической или транскриптомической характеристики созревания после имплантации могут использоваться обе ноги (например, одна нога с SC-кластерами, полученными из hPSC с генетическим вариантом, ассоциированным с болезнью, и другая нога с исправленным вариантом). Правильное внутримышечное введение нельзя напрямую подтвердить in vivo сразу после инъекции. Успешная имплантация подтверждается ретроспективно с помощью макроскопической идентификации трансплантата в момент забора (рисунок 3) и гистологического анализа (рисунок 4).

4. Секреция инсулина, стимулированная глюкозой in vivo (GSIS)

ПРИМЕЧАНИЕ: In vivo GSIS с помощью перорального глюкозного вызова оценивает функциональную секрецию инсулина в ответ на физиологический стимул. Все процедуры должны соответствовать институциональным рекомендациям по уходу за животными и использованию. Функциональные ответы трансплантированных β-клеток улучшаются при созревании in vivo: человеческий C-пептид можно обнаружить уже через 2 недели после трансплантации, тогда как устойчивая глюкозочувствительная секреция обычно достигается через 4 недели. Эти сроки могут варьироваться в зависимости от стадии развития SC-островков на момент трансплантации

  1. Быстрые мыши в течение 4-6 часов перед введением глюкозы, обеспечивая доступ к воде.
  2. Приготовьте раствор глюкозы с содержанием 20% (w/v) D-(+)-глюкозы в воде. Стерилизуйте через фильтр 0,22 мкм и прогревая до комнатной температуры перед использованием.
  3. Взвесьте каждую мышь и рассчитайте необходимую дозу глюкозы при 3 г/кг массы тела.
  4. Загрузите соответствующий объём раствора глюкозы в изогнутую иглу на 20 Г, прикреплённую к шприцу объёмом 1 мл.
  5. Аккуратно фиксируйте мышь и выполняйте оральную аспирацию, обеспечивая плавное введение иглы для гаважа, чтобы избежать аспирации трахеи.
  6. Берите образцы крови через прокол поднижней челюсти или хвостовой вены на исходном уровне (0 мин) и через 15 и 30 минут после введения с использованием капиллярных трубок и микроцентрифуг объёмом 1,5 мл. Дайте крови свернуться при комнатной температуре примерно 15 минут, затем храните трубки на льду.
  7. Центрифугуйте образцы при 1000 г в течение 15 минут при 4 °C и перенесите сыворотку в новые пробирки. Храните при −80 °C до анализа с помощью ELISA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Временные точки можно корректировать в зависимости от экспериментальной модели. Крайне важно использовать анализ, способный различать человеческий и мышиный инсулин или C-пептид для оценки секреции инсулина, полученного из трансплантата, в моделях ксенотрансплантации.

5. Извлечение прививочных кластеров

  1. Усыпить мышь в соответствии с институциональными этическими правилами по защите животных.
  2. Чтобы минимизировать загрязнение тканей шерстью, распыляйте этанол на 70% (v/v) по всему телу.
  3. Удалите кожу, чтобы обнажить мышцы нижней части конечностей, и определите пересаженные скопления с помощью увеличительного стекла. Ткань, содержащая акцизный трансплантат, с помощью ножниц и щипцов.
  4. Прополосните ткань один раз PBS и перенесите её на 4% (с/в) параформальдегида (PFA) на льду. Зафиксируйте ткань в 4% PFA при 4 °C в течение 4 часов с аккуратным встряхиванием.
  5. Промой образец в PBS 1 час с лёгким встряхиванием. Перенесите ткань до 30% сахарозы на PBS и инкубировать ночь при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биологические ткани, образцы крови и химические отходы (включая фиксаторы и анестетики) должны утилизироваться в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности и управлению химическими отходами.

6. Окрашивание эксплантов

  1. Вложение в OCT
    1. Вставьте ткань в форму, заполненную смесью с оптимальной температурой резки (OCT).
    2. Поместите форму в сухую ванну с изопропанолом, чтобы быстро заморозить образец. Храните при -80 °C до криосекции.
    3. Используя криостат, вырежьте срезы диаметром 5-7 мкм и храните стекли при -80 °C.
  2. Иммунокраска
    1. Уравновесьте стекли на RT на 15 минут внутри контейнера, чтобы избежать конденсации.
    2. Промывайте стекли PBS в течение 3 x 5 минут.
    3. Инкубировать каждую секцию с 100 мкл раствора блокирующего/проницаемого вещества в течение 30 минут при RT (0,1% неионного поверхностно-активного вещества в PBS, с 5% сывороткой вида, в котором был повышен вторичный антител).
    4. Инкубировать каждую секцию с 50 мкл первичного антитела, разбавленного в растворе блокирующего/проницаемого вещества на ночь при 4 °C.
    5. Промывайте стекли PBS в течение 3 x 5 минут.
    6. Инкубировать каждую секцию с 50 мкл вторичного антитела, разбавленного в растворе блокирующего/проницаемого вещества через 1 час при RT.
    7. Промывайте стекли PBS в течение 3 x 5 минут.
    8. Закрепите затворы с помощью 15 мкл монтажного раствора с помощью DAPI и установите защитную защиту. Храните при 4 °C в темноте до проведения визуализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Полученные результаты соответствуют внутримышечной трансплантации островков SC-островков 7-й стадии иммунодефицитным мышам и анализу, проведённому через 6 недель после трансплантации. Было проанализировано ограниченное количество животных с представительными трансплантатами, чтобы проиллюстрировать осуществимость этой процедуры. В данном исследовании успешным результатом определяется макроскопическое извлечение внутримышечного трансплантата с гистологичес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе мы описываем внутримышечную трансплантацию SC-островков как простой, воспроизводимый и минимально инвазивный подход для созревания in vivo с потенциалом для функциональной оценки. Хотя трансплантация под капсулу почки широко считается «золотым стандартом» для присаживания островков или SC-островков у грызунов, она требует большей технической экспертизы и более длительной хирургической процедуры. В отличие от этого, внутримышечная зона обеспечивает процедурную пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

Благодарим доктора Данвэя Хуанфу (Мемориальный онкологический центр Слоан Кеттеринг, Нью-Йорк, США) за щедрое предоставление линий hPSC, использованных в этом исследовании. Эта работа была поддержана грантами PID2021-122284NA-I00 и CNS2023-145179 от Министерства науки, инноваций и университетов Испании MICIU/AEI/10.13039/501100011033 и Next GenerationEU/PRTR (A.B.), а также CIBER-Consortium for Biomedical Research in Network, CB07/08/0029 и PID2023-150719OB-I00 (M.V.), Instituto de Salud Carlos III (ISCIII). Центр биомедицинских исследований диабета и сопутствующих метаболических расстройств (CIBERDEM) — это инициатива ISCIII и частично поддерживаемая Европейским фондом регионального развития (FEDER).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma Aldrich49752
Activin AQkineQk001
AggreWell 400 24-well (microwell plate)Stemcell34415
BetacellulinGenScriptZ03102
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Fatty Acid FreeGoldbioA-421
CHIR 99021LC labsC-6556 
Chroman-1Medchem ExpressHY-15392CEPT cocktail
CMRL-1066Pan BiotechP04-84600
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7021
Dibenzazepine (DBZ)SyncomCustom productGamma-secretase inhibitor
Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham’s F12 media (DMEM/F12)Corning15383541
EGFQkineQk011
EmricasanMedchem ExpressHY-10396CEPT cocktail
EthanolamineSigma AldrichE9508
FGF2-G3GenScriptCustom product
FGF7GenScriptZ03047
HeparinSigma AldrichH3149
InsulinGibco30284510
L-Alanyl-L-GlutamineLinusX0551-100
L-Ascorbic AcidSanta Cruzsc-202686
LDN-193189 Sigma AldrichSML0559
Lipid ConcentrateGibco11548846
Matrigel (basement membrane-derived extracellular matrix)Falcon354230
MCDB 131Corning15-100-CV
N-acetylcysteineThermo Scientific10521221
NaHCO3Fisher Scientific10553325
NicotinamideSigma AldrichN0636
NRG-1QkineQk045
Pluronic F-127 (anti-adherence solution)Sigma Aldrich82184Used at 5% (w/v)
Polyamine Supplement (1000×)Sigma AldrichP8483CEPT cocktail
RepSoxMedChemExpressHY-13012Alk5 Inhibitor
Retinoic AcidSigma AldrichR2625
SANT-1SelleckchemS7092
Sobetirome (GC1)Sigma AldrichSML1900-5MGCell-permeable T3 analog
Sodium PyruvateCorning25-000-CI
Sodium SeleniteSigma AldrichS5261
T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)Sigma AldrichT6397
TGF-β1 QkineQk010
TPBTocris5343
Trace Elements ACorning15333641
Trace Elements BCorning15343641
Trans-ISRIBMedchem ExpressHY-12495CEPT cocktail
TransferrinInVitria777TRF029
Triton X-100 (nonionic surfactant)Thermo Scientific11488696
TrypLEGibco11538856
Y-27632LC LaboratoriesY-5301ROCK inhibitor
ZM-447439 MedChemExpressHY-10128
ZnSO4Sigma AldrichZ0251
Antibodies
Rat anti-Human C-peptide (insulin)DSHBGN-ID4-sUsed at 150 ng/mL
Mouse anti-glucagonProteintech67286-1-Ig1:2000
Rabbit anti-somatostatinMilliporeAB54941:500
Goat anti-rat AF488InvitrogenA-110061:500
Donkey anti-mouse AF488InvitrogenA-212021:500
Donkey anti-rabbit AF488InvitrogenA-212061:500

Ссылки

  1. Ong, K. L., et al. regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. The Lancet. 402 (10397), 203-234 (2021).
  2. Ismail, L., Materwala, H., Al Kaabi, J. Association of risk factors with type 2 diabetes: A systematic review. Comput Struct Biotechnol J. 19, 1759-1785 (2021).
  3. Prasad, M. K., Mohandas, S., Ramkumar, K. M. Dysfunctions, molecular mechanisms, and therapeutic strategies of pancreatic β-cells in diabetes. Apoptosis. 28 (7-8), 958-976 (2023).
  4. Xue, D., et al. Functional interrogation of twenty type 2 diabetes-associated genes using isogenic human embryonic stem cell-derived β-like cells. Cell Metab. 35 (11), 1897-1914.e11 (2023).
  5. Bartolomé, A. Stem cell-derived β cells: A versatile research platform to interrogate the genetic basis of β cell dysfunction. Int J Mol Sci. 23 (1), 501(2022).
  6. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nat Biotechnol. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  7. Barsby, T., et al. Differentiating functional human islet-like aggregates from pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (4), 101711(2022).
  8. Shi, Z. -D., et al. Genome editing in hPSCs reveals GATA6 haploinsufficiency and a genetic interaction with GATA4 in human pancreatic development. Cell Stem Cell. 20 (5), 675-688.e6 (2017).
  9. Fantuzzi, F., et al. In depth functional characterization of human induced pluripotent stem cell-derived beta cells in vitro and in vivo. Front Cell Dev Biol. 10, e967765(2022).
  10. Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Single-cell transcriptome profiling reveals β cell maturation in stem cell-derived islets after transplantation. Cell Rep. 32 (8), 108850(2020).
  11. Lin, H., et al. Glucose metabolism and regulation in establishing human stem cell-derived β cell maturation. Cell Rep. 44 (7), 115892(2025).
  12. Maxwell, K. G., Kim, M. H., Gale, S. E., Millman, J. R. Differential function and maturation of human stem cell-derived islets after transplantation. Stem Cells Transl Med. 11 (3), 322-331 (2022).
  13. Thévenet, J., Gmyr, V., Delalleau, N., Pattou, F., Kerr-Conte, J. Pancreatic islet transplantation under the kidney capsule of mice: Model of refinement for molecular and ex-vivo graft analysis. Lab Anim. 55 (5), 408-416 (2021).
  14. Scholl, V. G. S., et al. Assessing implantation sites for pancreatic islet cell transplantation: Implications for type 1 diabetes mellitus treatment. Bioengineering. 12 (5), 499(2025).
  15. Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), e141553(2021).
  16. Lithovius, V., et al. Non-invasive quantification of stem cell-derived islet graft size and composition. Diabetologia. 67 (9), 1912-1929 (2024).
  17. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  18. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  19. Wells, S. A., Ellis, G. J., Gunnells, J. C., Schneider, A. B., Sherwood, L. M. Parathyroid autotransplantation in primary parathyroid hyperplasia. N Engl J Med. 295 (2), 57-62 (1976).
  20. Kim, H. -I., Yu, J. E., Park, C. -G., Kim, S. -J. Comparison of four pancreatic islet implantation sites. J Korean Med Sci. 25 (2), 203(2010).
  21. Axen, K. V., Pi-Sunyer, F. X. Long-term reversal of streptozotocin-induced diabetes in rats by intramuscular islet implantation. Transplantation. 31 (6), 439-441 (1981).
  22. Prokhorova, T. A., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. Stem Cells Dev. 18 (1), 47-54 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи