Методическая статья

Установление модифицированного тромбоза верхнего сагиттального синуса, индуцированного хлоридом железа

379 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69563

⸱

30 декабря 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, Xuanwu Hospital Capital Medical University, 2Department of Neurosurgery, Xuanwu Hospital Capital Medical University

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании представлен протокол создания воспроизводимой, минимально инвазивной модели тромбоза верхнего сагиттального синуса, вызванного хлоридом железа, с использованием метода шелкового шва в сочетании с лазерной спекл-контрастной визуализацией и высокоразрешающим ультразвуком для оценки.

Аннотация

Церебральный венозный тромбоз (CVT) — это редкое, но потенциально угрожающее жизни неврологическое заболевание. Животные модели предоставляют критически важные платформы для изучения их патофизиологии и оценки возможных терапий. В этом исследовании мы представляем модифицированную модель тромбоза верхнего сагиттального синуса (SSS) у крыс с использованием техники швов, пропитанного FeCl₃. Самцы крыс рода Спраг-Доули (220–250 г) прошли парамедиальный разрез головы и создание окна черепной кости диаметром 1 см над SSS. По сравнению с традиционным среднелинейным разрезом, этот подход предотвращает склеивание между разрезанной кожей, костным окном и подлежащей твердой мозговой оболочкой. Кроме того, он избегает помех, вызванных узлами, расположенными над ССС, что улучшает качество ультразвуковой съёмки. Шёлковый шов размером 2-0, пропитанный 40%FeCl 3 , наносился непосредственно на открытый синус в течение двух последовательных интервалов по 5 минут. По сравнению с традиционным методом бумаги с3-фильтром FeCl, этот метод минимизирует прямое химическое повреждение парасагиттальной коры. Лазерная спекл-контрастная визуализация использовалась для оценки венозной перфузии мозга до и после применения FeCl3 . Значительное снижение кровотока подтвердило успешный тромбоз. Через семь дней после операции образование тромба и гемодинамические изменения оценивались с помощью высокоразрешающего ультразвука и анализировали с помощью программного обеспечения Vevo LAB, которое предоставило объемные и гемодинамические данные тромба. Эта модифицированная модель предлагает воспроизводимый, минимально инвазивный и совместимый с визуализацией подход для доклинических исследований CVT.

Введение

Венозный тромбоз мозга (CVT) — это особый тип цереброваскулярного заболевания, составляющий 0,5–3% всех инсультов и являющийся важной причиной инсульта умолодых взрослых 1. Основным патологическим изменением этого заболевания является тромбоз внутри дуральных венозных пазух и/или церебральных вен, что приводит к нарушению венозного дренажа мозга, а затем к повышению внутричерепного давления, отёку мозга, венозному инфаркту иликровоизлиянию 2. Для лучшего разъяснения его основных механизмов и оценки новых терапевтических вмешательств необходимы надёжные и воспроизводимые модели на животных. Учитывая, что верхний сагиттальный синус (SSS) является наиболее часто поражаемым местом, а его поверхностное расположение облегчает эксплуатацию 2,3, современные эксперименты на животных в основном используют модель тромбоза верхнего сагиттального синуса (SSST).

Среди различных методов моделирования метод индукции железохлоридом (FeCl3) стал одним из самых широко используемых благодаря своей операционной простоте и экономическойэффективности 4. В этой модели местное применение раствораFeCl 3 напрямую повреждает эндотелий венозного синуса, обнажая субэндотелиальный матрикс благодаря его сильным окислительным свойствам. Это воздействие активирует агрегацию тромбоцитов и каскад, в конечном итоге вызывая тромбоз венозногосинуса 5. Однако по сравнению с другими методами традиционная модель бумагис тремя фильтрами FeCl также имеет ряд недостатков. Самая критичная проблема заключается в том, что парамагнитные свойства и высокая магнитная восприимчивостьFeCl 3 вызывают значительные артефакты при магнитно-резонансной томографии, что серьёзно снижает точность оценки тромба и наблюдения реканализации венозныхсинусов 6. Кроме того, форма фильтрующей бумаги плохо сочетается с SSS, что делает её склонной к повреждению паренхимы мозга вокруг пазухи. Поэтому трудно определить, связано ли паренхимальное повреждение вокруг SSS самим тромбозом или прямым химическим повреждением, вызванным FeCl3.

Общая цель настоящей работы — создать модифицированную модель крыс SSST, индуцированнуюFeCl 3, которая снижает прямое повреждение коры от FeCl3 и позволяет оценивать кровоток и размер тромба внутри SSS. В данном исследовании применяется парамедианный подход в сочетании с техникой шва, пропитанногоFeCl 3, которая минимизирует прямое химическое повреждение коры от FeCl3 и позволяет проводить неинвазивный и количественный мониторинг кровотока венозных пазух и образования тромба с помощью высокоразрешающего ультразвука.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был утверждён Комитетом по экспериментам с животными и экспериментальному благополучию животных Капитального медицинского университета с номером одобрения. AEEI-2025-138. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Создание модифицированной модели SSST крыс, индуцированнойFeCl 3

  1. Для эксперимента используйте самцов крыс Sprague-Dawley (SD) возрастом 6-7 недель, весом 220-250 г. Перед операцией акклиматизируйте крыс на 1 неделю и задержите кормление на 12 часов.
  2. Подготовьте следующие реагенты, инструменты и оборудование: 2% раствора пентобарбитала, 40% раствора FeCl3 , 5% повидон-йод, физиологический раствор, офтальмологическая мазь, одноразовые лезвия для бритвы, скальпели, хирургические ножницы, щипцы, швы 2-0 и 4-0 для шелка, иглы для обратного резания, держатели для игл, шприцы объемом 1 мл и 5 мл, медицинские ленты, платформа для работы с грызунами, грелка с датчиком температуры прямой кишки и микропортативный ручной черепной дрель.
  3. После взвешивания крысу анестезируйте с помощью внутрибрюшинной инъекции 2% пентобарбитала (50 мг/кг) (согласно утверждённым институциональными протоколами). Затем щипните кожу задних конечностей щипцем, чтобы подтвердить отсутствие реакций на отмену и боль.
  4. Нанесите офтальмологическую мазь и побрийте волосы на голове крысы одноразовым лезвием.
  5. Закрепите крысу в положении лежа на платформе для работы с грызунами медицинскими лентами и поддерживайте температуру тела на уровне 37 ± 0,2 °C с помощью грелки и постоянно контролируйте температуру корпуса с помощью ректального зонда.
  6. Дезинфицируйте кожу головы 5% повидона-йода.
  7. Сделайте 15-миллиметровый парамедианный разрез кожи головы, затем тупо вскрытие подлежащей фасции и надкостника, чтобы полностью обнажить череп.
  8. Протоньте череп с помощью черепного сверла до чёткого открытия SSS, начиная с лямбда и простираясь на 10 мм вперёд вдоль сагиттального шва. Применяйте периодическую технику бурения, чтобы избежать повреждения подлежащей твердой орудости и SSS, а также многократно поливайте бурильное сверло обычным физиологическим раствором, чтобы предотвратить термическое повреждение коры.
  9. Нанесите 10-мм сегмент шва 2-0, пропитанный раствором 40%FeCl 3 , на открытую поверхность SSS на 5 минут, затем замените шов на свежий пропитанный сегмент для ещё 5 минут.
  10. Промывайте хирургическое поле с 0,5 мл физиологического раствора с обычным раствором три раза, чтобы удалить остаточный FeCl3.
  11. Закройте кожу прерванными швами с помощью шва 4-0, затем дезинфекцию повидон-йод.
  12. Наблюдайте за крысой до полного пробуждения, затем возвращайте её в клетку.

2. Оценка успешного создания модели

ПРИМЕЧАНИЕ: Во время хирургической процедуры LSCI использовался для измерения венозного кровотока в SSS после создания черепного окна, до нанесения FeCl3 , а также снова после нанесения FeCl3 и промывания хирургического поля, но до закрытия кожи. Модель считается успешно установленной, когда венозный кровоток в ССС демонстрирует значительное снижение.

  1. Включите LSCI и соответствующее программное обеспечение (RFLSI v5.0), затем нажмите кнопку онлайн-режима .
  2. Регулируйте высоту и положение прибора до того момента, когда индикаторный лазер не будет центрирован в поле зрения.
  3. Поставьте крысу на поролоновую платформу и отрегулируйте положение, пока SSS не выровняется с индикаторным лазером.
  4. Регулируйте увеличение и фокус, пока изображение не станет чётким. Установите нижний и верхний пределы порога псевдоцвета на 10 и 200 для оптимизации визуального вида псевдоцветного изображения.
  5. Нажмите кнопку Set ROI , выберите круглый инструмент и определите регион SSS.
  6. Нажмите кнопку «Запись », чтобы получить венозный кровоток и запечатлеть как оригинальные, так и псевдоцветные изображения.

3. Оценка изменений площади/объема тромба и гемодинамики

ПРИМЕЧАНИЕ: Через несколько дней или несколько недель после процедуры используйте высококачественное ультразвуковое исследование для оценки изменений тромба и сосудистой реканализации.

  1. Подготовьте следующие препараты, приборы и оборудование: изофлуран, ультразвуковой гель, одноразовые лезвия для бритвы, медицинские ленты, аппарат для анестезии мелких животных, высокоразрешающую систему ультразвуковой и фотоакустической визуализации мелких животных, ультра-высокочастотный UHF57x линейный антенный преобразователь на частоте 70 МГц и 3D-мотор для получения информации.
  2. Установите 3D-мотор захвата и преобразователь UHF57x. Затем инициализируйте двигатель.
  3. Обезболить крысу в индукционной камере с 3% изофлураном, смешанным с кислородом 1 л/мин.
  4. Поместите крысу в положение лежа на термостатической пластине при температуре 37 °C, аккуратно закрепив голову и конечности медицинскими лентами и поддерживайте анестезию с помощью изофлурана 1,5%-2% через носовой конус.
  5. Побрийте волосы на коже головы одноразовым лезвием, чтобы обнажить область обнаружения, затем нанесите ультразвуковой гель.
  6. Отрегулируйте положение и ориентацию крысы относительно преобразователя, пока SSS и внутрилюминальный тромб не будут чётко визуализированы.
  7. Получить последовательные томографические изображения SSS как в сагиттальной, так и в корональной плоскости с помощью 3Dimaging в режиме B с шагом 0,04 мм.
  8. Используйте режим цветного доплера для наблюдения кровотока в SSS, а затем применяйте режим импульсной волны (PW) для измерения скорости кровотока.
  9. Прекратите анестезию и верните крысу в клетку, когда она полностью проснётся.
  10. Экспортируйте изображения и анализируйте их с помощью программного обеспечения Vevo LAB. Запишите максимальные сагиттальные и корональные сечения сечений, а также объём тромба в SSS, а также максимальную скорость кровотока в пазухе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Схематическая схема модифицированной модели SSST, индуцированнойFeCl 3, показана на рисунке 1. Экспериментальные результаты показали, что после нанесения насыщенногоFeCl 3 шелкового шва на SSS LSCI обнаружил значительное снижение локального кровотока, что свидетельствует о успешной окклюзии венозного синуса и подтверждении чувствительности LSCI к обнаружению динамических изменений перфузии (см. рисунок 2). ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

CVT — это редкий, но потенциально опасный для жизни специфический тип цереброваскулярногозаболевания 1. Для дальнейшего изучения патологических механизмов и разработки эффективных стратегий вмешательства исследователи разработали различные модели SSST на животных, в первую очередь лигацию SSS или окклюзию 7,8,9, инъекцию протромботическоговещества 10

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82401527).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприц объёмом 1 млShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.21-3020
2-0 шелковых швовШанхайская Пудун Цзиньхуань Медицинская Продукция Ко., ЛтдA224
Мотор 3D-приёмаFujifilm VisualSonicshttps://www.visualsonics.com/gallery/extended-3d-motor
4-0 швы из шелкаШанхайская Пудун Цзиньхуань Медицинская Продукция Ко., ЛтдA222
5% повидон-йодShandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.https://www.lircon.cn/products_details/100.html
Шприц объёмом 5 млShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.21-3023
Одноразовое лезвие бритвыТорговая компания Dongyang Jinmin Ltd.ST300
FeCl3МаклинI811935
ГрелкаShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.36-0001
ИзофлуранRWD Life ScienceR510-22-10
Система лазерной спекл-визуализацииRWD Life ScienceRFLSI III
Линейный преобразователь решеткиFujifilm VisualSonicsUHF57x
Медицинская лентаSuzhou Konlida Medical Supplies Co., Ltd.B02
Микропортативный ручной черепный дрельRWD Life Science78001
Держатель для иглыRWD Life ScienceF31025-13
Обычный физиологический растворShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.ST341-500 мл
Офтальмологическая мазьShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.19-7223
Иглы с обратной резкойШанхайская Пудун Цзиньхуань Медицинская Продукция Ко., ЛтдTJ-3-514
Операционная платформа для грызуновShanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.30150
Лезвие скальпеляRWD Life ScienceS31015-01
Рукоятка скальпеляRWD Life ScienceS32003-12
Аппарат для анестезии мелких животныхRWD Life ScienceR500
Система ультразвука мелких животных и фотоакустической визуализацииFujifilm VisualSonicsVevo F2
Гладкие щипцыRWD Life ScienceF12013-10
Пентобарбитал натрияSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.P3761
Хирургические ножницыRWD Life ScienceS14014-10
Зубчатые щипцыRWD Life ScienceF12011-13
Гель для ультразвукаShandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.https://www.lircon.cn/products_details/230.html

Ссылки

  1. Saposnik, G., et al. Diagnosis and management of cerebral venous thrombosis: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 55 (3), e77-e90 (2024).
  2. Cohen, O., Pegoraro, S., Ageno, W. Cerebral venous thrombosis. Minerva Med. 112 (6), 755-766 (2021).
  3. Li, M., Chen, J., Meng, R., Ji, X. Rhythmic deep-brain magnetic stimulation promotes angiogenesis and inhibits apoptosis by regulating the JAK2/STAT3 pathway in rats with superior sagittal sinus thrombosis. Brain Res. 1852, 149509(2025).
  4. Röttger, C., et al. A new model of reversible sinus sagittalis superior thrombosis in the rat: magnetic resonance imaging changes. Neurosurgery. 57 (3), 573-580 (2005).
  5. Schoenwaelder, S. M., Jackson, S. P. Ferric chloride thrombosis model: unraveling the vascular effects of a highly corrosive oxidant. Blood. 126 (24), 2652-2653 (2015).
  6. Hachenberger, M., et al. Aluminium chloride instead of ferric chloride for inducing superior sagittal sinus thrombosis to reduce ferromagnetic artifacts on MRI imaging in experimental models. Sci Rep. 14 (1), 10998(2024).
  7. Gotoh, M., Ohmoto, T., Kuyama, H. Experimental study of venous circulatory disturbance by dural sinus occlusion. Acta Neurochir (Wien). 124 (2-4), 120-126 (1993).
  8. Mu, S., et al. A novel rat model for cerebral venous sinus thrombosis: verification of similarity to human disease via clinical analysis and experimental validation. J Transl Med. 20 (1), 174(2022).
  9. Fries, G., et al. Occlusion of the pig superior sagittal sinus, bridging and cortical veins: multistep evolution of sinus-vein thrombosis. J Neurosurg. 77 (1), 127-133 (1992).
  10. Wang, J., Ji, X., Ling, F., He, X. Comparison of anticoagulation and thrombolysis treatments in a rat model of superior sagittal sinus thrombosis. Int J Neurosci. 124 (7), 532-541 (2014).
  11. Ye, Y., et al. Impacts on thrombus and chordae Willisii during mechanical thrombectomy in the superior sagittal sinus. Front Neurol. 12, 639018(2021).
  12. Chen, C., et al. Photothrombosis combined with thrombin injection establishes a rat model of cerebral venous sinus thrombosis. Neuroscience. 306, 39-49 (2015).
  13. Rahal, J. P., Malek, A. M., Heilman, C. B. Toward a better model of cerebral venous sinus thrombosis. World Neurosurg. 82 (1-2), 50-53 (2014).
  14. Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
  15. Srivastava, A. K., Kalita, J., Haris, M., Gupta, R. K., Misra, U. K. Radiological and histological changes following cerebral venous sinus thrombosis in a rat model. Neurosci Res. 65 (4), 343-346 (2009).
  16. Wang, W., et al. Establishment of a rat model of superior sagittal-sinus occlusion and recanalization via a thread-embolism method. Neuroscience. 416, 41-49 (2019).
  17. Hachenberger, M., et al. Comparison of edoxaban and enoxaparin in a rat model of AlCl3-induced thrombosis of the superior sagittal sinus. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 396 (12), 3887-3892 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

III

Похожие статьи