В данном исследовании представлен протокол создания воспроизводимой, минимально инвазивной модели тромбоза верхнего сагиттального синуса, вызванного хлоридом железа, с использованием метода шелкового шва в сочетании с лазерной спекл-контрастной визуализацией и высокоразрешающим ультразвуком для оценки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Установление модифицированного тромбоза верхнего сагиттального синуса, индуцированного хлоридом железа
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Церебральный венозный тромбоз (CVT) — это редкое, но потенциально угрожающее жизни неврологическое заболевание. Животные модели предоставляют критически важные платформы для изучения их патофизиологии и оценки возможных терапий. В этом исследовании мы представляем модифицированную модель тромбоза верхнего сагиттального синуса (SSS) у крыс с использованием техники швов, пропитанного FeCl₃. Самцы крыс рода Спраг-Доули (220–250 г) прошли парамедиальный разрез головы и создание окна черепной кости диаметром 1 см над SSS. По сравнению с традиционным среднелинейным разрезом, этот подход предотвращает склеивание между разрезанной кожей, костным окном и подлежащей твердой мозговой оболочкой. Кроме того, он избегает помех, вызванных узлами, расположенными над ССС, что улучшает качество ультразвуковой съёмки. Шёлковый шов размером 2-0, пропитанный 40%FeCl 3 , наносился непосредственно на открытый синус в течение двух последовательных интервалов по 5 минут. По сравнению с традиционным методом бумаги с3-фильтром FeCl, этот метод минимизирует прямое химическое повреждение парасагиттальной коры. Лазерная спекл-контрастная визуализация использовалась для оценки венозной перфузии мозга до и после применения FeCl3 . Значительное снижение кровотока подтвердило успешный тромбоз. Через семь дней после операции образование тромба и гемодинамические изменения оценивались с помощью высокоразрешающего ультразвука и анализировали с помощью программного обеспечения Vevo LAB, которое предоставило объемные и гемодинамические данные тромба. Эта модифицированная модель предлагает воспроизводимый, минимально инвазивный и совместимый с визуализацией подход для доклинических исследований CVT.
Введение
Венозный тромбоз мозга (CVT) — это особый тип цереброваскулярного заболевания, составляющий 0,5–3% всех инсультов и являющийся важной причиной инсульта умолодых взрослых 1. Основным патологическим изменением этого заболевания является тромбоз внутри дуральных венозных пазух и/или церебральных вен, что приводит к нарушению венозного дренажа мозга, а затем к повышению внутричерепного давления, отёку мозга, венозному инфаркту иликровоизлиянию 2. Для лучшего разъяснения его основных механизмов и оценки новых терапевтических вмешательств необходимы надёжные и воспроизводимые модели на животных. Учитывая, что верхний сагиттальный синус (SSS) является наиболее часто поражаемым местом, а его поверхностное расположение облегчает эксплуатацию 2,3, современные эксперименты на животных в основном используют модель тромбоза верхнего сагиттального синуса (SSST).
Среди различных методов моделирования метод индукции железохлоридом (FeCl3) стал одним из самых широко используемых благодаря своей операционной простоте и экономическойэффективности 4. В этой модели местное применение раствораFeCl 3 напрямую повреждает эндотелий венозного синуса, обнажая субэндотелиальный матрикс благодаря его сильным окислительным свойствам. Это воздействие активирует агрегацию тромбоцитов и каскад, в конечном итоге вызывая тромбоз венозногосинуса 5. Однако по сравнению с другими методами традиционная модель бумагис тремя фильтрами FeCl также имеет ряд недостатков. Самая критичная проблема заключается в том, что парамагнитные свойства и высокая магнитная восприимчивостьFeCl 3 вызывают значительные артефакты при магнитно-резонансной томографии, что серьёзно снижает точность оценки тромба и наблюдения реканализации венозныхсинусов 6. Кроме того, форма фильтрующей бумаги плохо сочетается с SSS, что делает её склонной к повреждению паренхимы мозга вокруг пазухи. Поэтому трудно определить, связано ли паренхимальное повреждение вокруг SSS самим тромбозом или прямым химическим повреждением, вызванным FeCl3.
Общая цель настоящей работы — создать модифицированную модель крыс SSST, индуцированнуюFeCl 3, которая снижает прямое повреждение коры от FeCl3 и позволяет оценивать кровоток и размер тромба внутри SSS. В данном исследовании применяется парамедианный подход в сочетании с техникой шва, пропитанногоFeCl 3, которая минимизирует прямое химическое повреждение коры от FeCl3 и позволяет проводить неинвазивный и количественный мониторинг кровотока венозных пазух и образования тромба с помощью высокоразрешающего ультразвука.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол был утверждён Комитетом по экспериментам с животными и экспериментальному благополучию животных Капитального медицинского университета с номером одобрения. AEEI-2025-138. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.
1. Создание модифицированной модели SSST крыс, индуцированнойFeCl 3
- Для эксперимента используйте самцов крыс Sprague-Dawley (SD) возрастом 6-7 недель, весом 220-250 г. Перед операцией акклиматизируйте крыс на 1 неделю и задержите кормление на 12 часов.
- Подготовьте следующие реагенты, инструменты и оборудование: 2% раствора пентобарбитала, 40% раствора FeCl3 , 5% повидон-йод, физиологический раствор, офтальмологическая мазь, одноразовые лезвия для бритвы, скальпели, хирургические ножницы, щипцы, швы 2-0 и 4-0 для шелка, иглы для обратного резания, держатели для игл, шприцы объемом 1 мл и 5 мл, медицинские ленты, платформа для работы с грызунами, грелка с датчиком температуры прямой кишки и микропортативный ручной черепной дрель.
- После взвешивания крысу анестезируйте с помощью внутрибрюшинной инъекции 2% пентобарбитала (50 мг/кг) (согласно утверждённым институциональными протоколами). Затем щипните кожу задних конечностей щипцем, чтобы подтвердить отсутствие реакций на отмену и боль.
- Нанесите офтальмологическую мазь и побрийте волосы на голове крысы одноразовым лезвием.
- Закрепите крысу в положении лежа на платформе для работы с грызунами медицинскими лентами и поддерживайте температуру тела на уровне 37 ± 0,2 °C с помощью грелки и постоянно контролируйте температуру корпуса с помощью ректального зонда.
- Дезинфицируйте кожу головы 5% повидона-йода.
- Сделайте 15-миллиметровый парамедианный разрез кожи головы, затем тупо вскрытие подлежащей фасции и надкостника, чтобы полностью обнажить череп.
- Протоньте череп с помощью черепного сверла до чёткого открытия SSS, начиная с лямбда и простираясь на 10 мм вперёд вдоль сагиттального шва. Применяйте периодическую технику бурения, чтобы избежать повреждения подлежащей твердой орудости и SSS, а также многократно поливайте бурильное сверло обычным физиологическим раствором, чтобы предотвратить термическое повреждение коры.
- Нанесите 10-мм сегмент шва 2-0, пропитанный раствором 40%FeCl 3 , на открытую поверхность SSS на 5 минут, затем замените шов на свежий пропитанный сегмент для ещё 5 минут.
- Промывайте хирургическое поле с 0,5 мл физиологического раствора с обычным раствором три раза, чтобы удалить остаточный FeCl3.
- Закройте кожу прерванными швами с помощью шва 4-0, затем дезинфекцию повидон-йод.
- Наблюдайте за крысой до полного пробуждения, затем возвращайте её в клетку.
2. Оценка успешного создания модели
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время хирургической процедуры LSCI использовался для измерения венозного кровотока в SSS после создания черепного окна, до нанесения FeCl3 , а также снова после нанесения FeCl3 и промывания хирургического поля, но до закрытия кожи. Модель считается успешно установленной, когда венозный кровоток в ССС демонстрирует значительное снижение.
- Включите LSCI и соответствующее программное обеспечение (RFLSI v5.0), затем нажмите кнопку онлайн-режима .
- Регулируйте высоту и положение прибора до того момента, когда индикаторный лазер не будет центрирован в поле зрения.
- Поставьте крысу на поролоновую платформу и отрегулируйте положение, пока SSS не выровняется с индикаторным лазером.
- Регулируйте увеличение и фокус, пока изображение не станет чётким. Установите нижний и верхний пределы порога псевдоцвета на 10 и 200 для оптимизации визуального вида псевдоцветного изображения.
- Нажмите кнопку Set ROI , выберите круглый инструмент и определите регион SSS.
- Нажмите кнопку «Запись », чтобы получить венозный кровоток и запечатлеть как оригинальные, так и псевдоцветные изображения.
3. Оценка изменений площади/объема тромба и гемодинамики
ПРИМЕЧАНИЕ: Через несколько дней или несколько недель после процедуры используйте высококачественное ультразвуковое исследование для оценки изменений тромба и сосудистой реканализации.
- Подготовьте следующие препараты, приборы и оборудование: изофлуран, ультразвуковой гель, одноразовые лезвия для бритвы, медицинские ленты, аппарат для анестезии мелких животных, высокоразрешающую систему ультразвуковой и фотоакустической визуализации мелких животных, ультра-высокочастотный UHF57x линейный антенный преобразователь на частоте 70 МГц и 3D-мотор для получения информации.
- Установите 3D-мотор захвата и преобразователь UHF57x. Затем инициализируйте двигатель.
- Обезболить крысу в индукционной камере с 3% изофлураном, смешанным с кислородом 1 л/мин.
- Поместите крысу в положение лежа на термостатической пластине при температуре 37 °C, аккуратно закрепив голову и конечности медицинскими лентами и поддерживайте анестезию с помощью изофлурана 1,5%-2% через носовой конус.
- Побрийте волосы на коже головы одноразовым лезвием, чтобы обнажить область обнаружения, затем нанесите ультразвуковой гель.
- Отрегулируйте положение и ориентацию крысы относительно преобразователя, пока SSS и внутрилюминальный тромб не будут чётко визуализированы.
- Получить последовательные томографические изображения SSS как в сагиттальной, так и в корональной плоскости с помощью 3Dimaging в режиме B с шагом 0,04 мм.
- Используйте режим цветного доплера для наблюдения кровотока в SSS, а затем применяйте режим импульсной волны (PW) для измерения скорости кровотока.
- Прекратите анестезию и верните крысу в клетку, когда она полностью проснётся.
- Экспортируйте изображения и анализируйте их с помощью программного обеспечения Vevo LAB. Запишите максимальные сагиттальные и корональные сечения сечений, а также объём тромба в SSS, а также максимальную скорость кровотока в пазухе.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Схематическая схема модифицированной модели SSST, индуцированнойFeCl 3, показана на рисунке 1. Экспериментальные результаты показали, что после нанесения насыщенногоFeCl 3 шелкового шва на SSS LSCI обнаружил значительное снижение локального кровотока, что свидетельствует о успешной окклюзии венозного синуса и подтверждении чувствительности LSCI к обнаружению динамических изменений перфузии (см. рисунок 2). ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
CVT — это редкий, но потенциально опасный для жизни специфический тип цереброваскулярногозаболевания 1. Для дальнейшего изучения патологических механизмов и разработки эффективных стратегий вмешательства исследователи разработали различные модели SSST на животных, в первую очередь лигацию SSS или окклюзию 7,8,9, инъекцию протромботическоговещества 10
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.
Благодарности
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82401527).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Шприц объёмом 1 мл | Shenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd. | 21-3020 | |
| 2-0 шелковых швов | Шанхайская Пудун Цзиньхуань Медицинская Продукция Ко., Лтд | A224 | |
| Мотор 3D-приёма | Fujifilm VisualSonics | https://www.visualsonics.com/gallery/extended-3d-motor | |
| 4-0 швы из шелка | Шанхайская Пудун Цзиньхуань Медицинская Продукция Ко., Лтд | A222 | |
| 5% повидон-йод | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | https://www.lircon.cn/products_details/100.html | |
| Шприц объёмом 5 мл | Shenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd. | 21-3023 | |
| Одноразовое лезвие бритвы | Торговая компания Dongyang Jinmin Ltd. | ST300 | |
| FeCl3 | Маклин | I811935 | |
| Грелка | Shenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd. | 36-0001 | |
| Изофлуран | RWD Life Science | R510-22-10 | |
| Система лазерной спекл-визуализации | RWD Life Science | RFLSI III | |
| Линейный преобразователь решетки | Fujifilm VisualSonics | UHF57x | |
| Медицинская лента | Suzhou Konlida Medical Supplies Co., Ltd. | B02 | |
| Микропортативный ручной черепный дрель | RWD Life Science | 78001 | |
| Держатель для иглы | RWD Life Science | F31025-13 | |
| Обычный физиологический раствор | Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | ST341-500 мл | |
| Офтальмологическая мазь | Shenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd. | 19-7223 | |
| Иглы с обратной резкой | Шанхайская Пудун Цзиньхуань Медицинская Продукция Ко., Лтд | TJ-3-514 | |
| Операционная платформа для грызунов | Shanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd. | 30150 | |
| Лезвие скальпеля | RWD Life Science | S31015-01 | |
| Рукоятка скальпеля | RWD Life Science | S32003-12 | |
| Аппарат для анестезии мелких животных | RWD Life Science | R500 | |
| Система ультразвука мелких животных и фотоакустической визуализации | Fujifilm VisualSonics | Vevo F2 | |
| Гладкие щипцы | RWD Life Science | F12013-10 | |
| Пентобарбитал натрия | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd. | P3761 | |
| Хирургические ножницы | RWD Life Science | S14014-10 | |
| Зубчатые щипцы | RWD Life Science | F12011-13 | |
| Гель для ультразвука | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | https://www.lircon.cn/products_details/230.html |
Ссылки
- Saposnik, G., et al. Diagnosis and management of cerebral venous thrombosis: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 55 (3), e77-e90 (2024).
- Cohen, O., Pegoraro, S., Ageno, W. Cerebral venous thrombosis. Minerva Med. 112 (6), 755-766 (2021).
- Li, M., Chen, J., Meng, R., Ji, X. Rhythmic deep-brain magnetic stimulation promotes angiogenesis and inhibits apoptosis by regulating the JAK2/STAT3 pathway in rats with superior sagittal sinus thrombosis. Brain Res. 1852, 149509(2025).
- Röttger, C., et al. A new model of reversible sinus sagittalis superior thrombosis in the rat: magnetic resonance imaging changes. Neurosurgery. 57 (3), 573-580 (2005).
- Schoenwaelder, S. M., Jackson, S. P. Ferric chloride thrombosis model: unraveling the vascular effects of a highly corrosive oxidant. Blood. 126 (24), 2652-2653 (2015).
- Hachenberger, M., et al. Aluminium chloride instead of ferric chloride for inducing superior sagittal sinus thrombosis to reduce ferromagnetic artifacts on MRI imaging in experimental models. Sci Rep. 14 (1), 10998(2024).
- Gotoh, M., Ohmoto, T., Kuyama, H. Experimental study of venous circulatory disturbance by dural sinus occlusion. Acta Neurochir (Wien). 124 (2-4), 120-126 (1993).
- Mu, S., et al. A novel rat model for cerebral venous sinus thrombosis: verification of similarity to human disease via clinical analysis and experimental validation. J Transl Med. 20 (1), 174(2022).
- Fries, G., et al. Occlusion of the pig superior sagittal sinus, bridging and cortical veins: multistep evolution of sinus-vein thrombosis. J Neurosurg. 77 (1), 127-133 (1992).
- Wang, J., Ji, X., Ling, F., He, X. Comparison of anticoagulation and thrombolysis treatments in a rat model of superior sagittal sinus thrombosis. Int J Neurosci. 124 (7), 532-541 (2014).
- Ye, Y., et al. Impacts on thrombus and chordae Willisii during mechanical thrombectomy in the superior sagittal sinus. Front Neurol. 12, 639018(2021).
- Chen, C., et al. Photothrombosis combined with thrombin injection establishes a rat model of cerebral venous sinus thrombosis. Neuroscience. 306, 39-49 (2015).
- Rahal, J. P., Malek, A. M., Heilman, C. B. Toward a better model of cerebral venous sinus thrombosis. World Neurosurg. 82 (1-2), 50-53 (2014).
- Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
- Srivastava, A. K., Kalita, J., Haris, M., Gupta, R. K., Misra, U. K. Radiological and histological changes following cerebral venous sinus thrombosis in a rat model. Neurosci Res. 65 (4), 343-346 (2009).
- Wang, W., et al. Establishment of a rat model of superior sagittal-sinus occlusion and recanalization via a thread-embolism method. Neuroscience. 416, 41-49 (2019).
- Hachenberger, M., et al. Comparison of edoxaban and enoxaparin in a rat model of AlCl3-induced thrombosis of the superior sagittal sinus. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 396 (12), 3887-3892 (2023).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
