Стандартизация модели Rat Intraluminal MCAO: подробный протокол с мерами контроля качества

Краткое содержание

Этот протокол демонстрирует оптимизированную 60-минутную технику окклюзии средней церебральной артерии (MCAO) у крыс. Протокол валидирован с использованием мультимодальных подходов, достигая 87,5% успешности при минимальной смертности и воспроизводимых инфарктных и поведенческих результатов для исследований инсульта.

Аннотация

Модель окклюзии средней церебральной артерии (MCAO) у крысы остаётся эталоном для разъяснения ишемической патофизиологии инсульта и валидации нейропротекторных методов. Однако тонкие хирургические отклонения могут существенно изменить объём инфаркта и поведенческие последствия. Используя фреймворк «визуализируй, а потом систематизировать», мы пересмотрели каждый этап создания и валидации модели. Была проведена детальная фотодокументация ключевых хирургических ориентиров и ключевых этапов для стандартизации анатомической ориентации и размещения нитей. Для точного отображения объёма и топологии инфарктов через 24 и 72 часа после реперфузии использовалось окрашивание с использованием 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (TTC). Неврологические дефициты оценивались по шкалам Зеа-Лонги, Бедерсона и модифицированных Гарсии. Двадцать четыре самца крыс Спраг-Доули прошли 60-минутный переходный MCAO; Объём инфаркта и неврологические показатели оценивались через 24 и 72 часа. Примерно 87,50% животных добились успешной блокады кровотока в мозге (Zea-Longa ≥ 1 и однозначный инфаркт, определённый TTC), с общей смертностью 12,50%, что свидетельствует о высокой точности модели. Этот стандартизированный протокол обеспечивает технически усовершенствованную, воспроизводимую основу для доклинических исследований инсульта, способствуя межлабораторной согласованности в исследованиях, изучающих патофизиологию инсульта и терапевтические вмешательства.

Введение

Инсульт — вторая по величине причина смерти и третья по величине причина инвалидности в мире ^1,2. Инсульт непропорционально часто затрагивает страны с низким и средним уровнем дохода, где он происходит в среднем на 15 лет раньше, чем в странах с высоким уровнем^{дохода 1}. Два основных типа — ишемический инсульт (85%) и внутримозговое кровоизлияние (15%)³. Ишемический инсульт, составляющий подавляющее большинство инсультов, возникает из-за блокировки кровотока в мозге, что приводит к гибели клеток и инфаркту^{мозга 4}. Ишемический каскад включает множество биохимических событий, включая значительные прооксидативные^{процессы 5,6}.

Несмотря на обширные доклинические и клинические исследования, лишь несколько терапий — особенно внутривенный тромболиз с активатором тканевого плазминогена и механическая тромбэктомия — доказали свою эффективность, и эти методы ограничены узкими терапевтическими окнами и строгими критериями отбора пациентов. Следовательно, существует острая необходимость прояснить клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе ишемического повреждения, нейроваскулярного восстановления и восстановления после инсульта. Воспроизводимая, клинически значимая модель животных необходима для достижения этой цели.

Модель окклюзии средней церебральной артерии (MCAO) широко используется для изучения ишемического инсульта у^{грызунов 7,8}. Метод интралюминальной окклюзии филамента является одним из самых классических и широко используемых методов^{MCAO 9}. Эта техника может моделировать как постоянные, так и временные окклюзии без необходимости краниэктомии. Новая трансфеморальная техника с эндоваскулярными проводами показала перспективы для индуцирования временного MCAO у крыс, обеспечивая более стабильные^{результаты 10}. Эта модель включает окклюзию средней церебральной артерии, обычно с помощью техники внутрилюминального^{филамента 11}. MCAO вызывает фокальную гипоперфузию мозга, что приводит к ишемии и^{реперфузионному повреждению 12}.

Хотя MCAO ценен для изучения патофизиологии инсульта и возможных методов лечения, он может приводить к переменным объёмам^{поражения 7}. Поэтому улучшения модели MCAO — такие как совершенствование реперфузионных методов, установление стандартизированных операционных протоколов и разработка единых критериев оценки — могут снизить вариабельность расположения и объёма инфаркта, тем самым повышая её полезность в исследованиях ишемического инсульта.

Этот протокол требует кривой обучения примерно из 10–15 операций для достижения единообразных^{результатов 13}. Показатели успеха могут варьироваться в зависимости от опыта оператора и штамма^{крыс 14}. Модель подходит для изучения острого ишемического инсульта, но может не полностью воспроизводить сопутствующие заболевания человека, такие как гипертония или диабет¹⁵. Соответственно, мы стремились разработать и тщательно проверить оптимизированный протокол MCAO, направленный на снижение экспериментальной вариабельности с помощью стандартизированных процедур и строгих мер контроля качества. Для достижения двойных улучшений в стандартизации и надёжности данных были интегрированы четыре взаимодополняющие инновации: (1) продольная оценка с двойными временными точками — неврологические показатели по шкалам Зеа-Лонга, Бедерсона и Модифицированной Гарсии были получены параллельно с инфарктными объёмами, полученными на основе 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (TTC), через 24 и 72 часа после реперфузии, что определяло временную связь между разрешение отёка и функциональным восстановлением; (2) Тройная перекрёстная валидация — слепая оценка с двумя исследователями с интегрированной трёхмасштабной калибровкой значительно повысила чувствительность и точность поведенческой оценки; (3) Целостное быстрое гипотермическое сечение — стандартная операционная процедура (SOP) «экстракция в ледяной ванне 90-х с последующим одноступенчатым корональным разрезом диаметром 2 мм в предварительно охлаждённых формах» была введена для минимизации аутолиза и человеческой ошибки, обеспечивая высокоточные объемные измерения; (4) Интегрированная система контроля качества — комплексная SOP, охватывающая предоперационное голодание, контроль глубины анестезии, предоперационную терморегуляцию и предотвращение перекрёстного загрязнения, чтобы обеспечить воспроизводимую и легко передаваемую процедуру стандарта MCAO, заложив прочную основу для межлабораторной согласованности и сопоставимости между исследованиями.

Протокол

Эксперимент был одобрен и контролировался Комитетом по институциональным экспериментам на животных и Экспериментальному комитету по благополучию животных Капитального медицинского университета. Все протоколы соответствуют Руководству NIH по уходу и использованию лабораторных животных (NIH Publ. 80-23, пересмотр 1996 года), а стерильное оборудование и асептические методы необходимы.

1. Отбор животных

1. Используйте самцов крыс Спраг-Доули (возрастом 6–8 недель, весом 240–270 г), полученных у сертифицированного поставщика лабораторных животных (Лицензия No SCXK (Пекин) 2021-0011) для создания модели MCAO.
2. Живут животных традиционным образом с едой и водой; все процедуры следовали Международному кодексу этики.
3. Используйте следующие критерии, основанные на массе тела животного, для выбора размера нити, чтобы обеспечить равномерную окклюзию:
   - 220–250 г: диаметр 0,33–0,35 мм
   - 250–280 г: диаметр 0,35–0,38 мм
   - 280–310 г: диаметр 0,38–0,40 мм
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти спецификации учитывают возрастное увеличение диаметра сосуда и снижают заболеваемость SAH или неполной^{окклюзии 13}.

2. Размер выборки

1. Рассчитайте размер выборки с помощью программного обеспечения для расчёта размера выборки. Основываясь на предварительных данных, показывающих ожидаемый объём инфаркта в составе 35% ± 10% (средний ± SD) в группе MCAO против 0% ± 2% в группе SHAM, оцените размер эффекта (Коэна d). Для двухстороннего теста Mann-Whitney U (непараметрическая альтернатива t-тесту) с α = 0,05 и степенью (1-β) = 0,80 вычислите минимальный размер выборки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер эффекта оценивался как 3,5, а минимальный размер выборки составлял 6 животных на группу.
2. Для учёта предполагаемой смертности (12,5%) и уровня исключения (5–10%) включите 24 крысы в группу MCAO и 6 крыс в группу SHAM, обеспечивая достаточную мощность (>0,90) для первичной конечной точки (объём инфаркта через 24 часа).

3. Критерии включения и исключения

1. Включите животных, если они соответствовали следующим критериям: (1) самцы крыс Sprague-Dawley, весом 240–270 г, возраст 6–8 недель; (2) отсутствие предшествующих неврологических дефицитов (предоперационный неврологический балл = 0); (3) успешное введение анестезии без осложнений.
2. Исключить животных из анализа, если у них наблюдалось: (1) субарахноидальное кровоизлияние (SAH), проявившееся при вскрытии; (2) преждевременная смерть (<24 часа после реперфузии), не связанная с экспериментальным вмешательством; (3) неудачная окклюзия (неврологический балл = 0 и отсутствие инфаркта, определённого TTC); (4) технический хирургический отказ (например, разрыв CCA).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти критерии были заранее определены до начала исследования, чтобы минимизировать предвзятость отбора.
3. Политика замены животных: Заменять только животных, исключённых из-за технической хирургической неисправности или интраоперационной смерти, чтобы сохранить статистическую эффективность. Не заменяйте животных неудачным моделированием (неудачной окклюзией), а сообщайте о них в рамках расчёта успеха, чтобы избежать искусственного снижения вариабельности.

4. Предоперационная подготовка

1. Подготовьте автоклавные инструменты, стерильную филамент и драпированное поле.
2. Регулярное голодание не требуется; При необходимости ограничивайте продолжительность голодания 2–4 часами. Индуцировать анестезию изофлураном (3–4%) и поддерживать её на уровне 1,5–2% при 30–40% O₂ во время процедуры. Подтвердите глубину анестезии потерей рефлекса выпрямления и защемления пальцев.
3. Поддерживайте температуру тела на уровне 37 ± 0,5 °C с помощью грелки с обратной связью и контролем температуры ректа.
4. Побрейте шею и кожу головы, затем очистите участок повидон-йодом, затем 70% этанола.
5. Вводите бупренорфин (0,05 мг/кг, подкожно) за 30 минут до операции и каждые 12 часов после операции в течение 48 часов, или мелоксикам (1 мг/кг, подкожно) один раз в день в течение 3 дней¹⁶. Оценивайте боль, отслеживая поведение при груминге, осанку и спонтанную активность; Дополнительное обезболивание, если признаки дискомфорта сохраняются.

5. Закрытие MCA

1. Поместите крысу в спинное положение, аккуратно вытянув голову, чтобы открыть вентральную шею.
2. Сделайте разрез шейки по средней линии (1,5–2,0 см) с помощью ирисовых ножниц.
3. Грубо разделяйте грудинномастовидные и омоподъязычные мышцы с помощью изогнутых щипцов, чтобы обнажить бифуркации левой общей сонной артерии (CCA).
4. Перевязывайте наружную сонную артерию (ЭКА) дистально постоянным швом 4-0 и проксимально временной перевязкой. Сделайте небольшой разрез между двумя лигатурами ECA с помощью микроножниц.
5. Временно блокируйте CCA и внутреннюю сонную артерию (ICA) с помощью микрососудистых зажимов (давление 60 g).
6. Вставьте монофиламент с силиконовым покрытием 4-0 (диаметром 0,35–0,40 мм) через разрез ECA. Продвигайте его назад в CCA, затем перенаправляйте в ICA за бифуркации CCA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что филамент поступает в ICA в сторону основания черепа, а не крыло-небёжной артерии (PPA), которая ветвится вбок. Если сопротивление встречается на <10 мм, втяните нить, поверните голову животного на 30° в сторону противоположной стороны и снова продвигайтесь, чтобы перенаправить мимо начала PPA.
7. Продвигайте филамент на 18–20 мм от бифуркации CCA, пока небольшое сопротивление не покажет окклюзию начала MCA. Проверьте глубину с помощью заранее отмеченной опорной линии на филаменте (расположенной в 2 мм непосредственно к силиконовой пробке), измеренной суппортом из точки вставки пня ECA. Освободите зажим CCA, когда филамент окажется на месте.

6. Реперфузия

1. Через 60 минут окклюзии откройте разрез и ослабьте временную ЭКА-лигатуру.
2. Аккуратно убирайте филамент, пока её кончик не очистит пень, восстановив кровоток. Немедленно установите постоянную связку проксимально к пеню, чтобы предотвратить обратное кровотечение. Закройте рану слоями.
3. Переместите крысу в тёплую клетку для восстановления для постоянного наблюдения.

7. Фиктивная операция

1. Подготовьте животное по той же процедуре, описанной выше, для MCAO (голодание, анестезия, контроль температуры, стерильное драпирование).
2. Выполните разрез шейки матки и экспозицию бифуркации CCA, как указано выше.
3. Вскрыть и обнажить сосуд. Не вставляйте филамент.
4. Пусть артерии останутся открытыми; Не вызывайте ишемию мозга.
5. Закройте разрез слоями после 10 минут экспозиции. Переместите животное в тёплую клетку для восстановления для наблюдения.

8. Послеоперационные неврологические показатели

1. Оценивайте через 24 и 72 часа после реперфузии, непосредственно перед жертвой для измерения объёма инфаркта.
2. Приучите животное в тихой комнате при температуре 25 °C в течение 30 минут.
3. Пусть два независимых следователя не видят распределения групп. Пусть каждый следователь записывает результаты на отдельных листах без консультаций; Любое различие между оценщиками ≥1 балл приводит к переоценке.
4. Шкалы (в порядке введения): Проведите оценку^{Zea-Longa 17} (Таблица 1), Bederson¹⁸ (Таблица 2) и Modified Garcia¹⁹ (Таблица 3), следуя последним опубликованным протоколам для согласованности критериев.
5. Используйте среднее значения двух наблюдателей для статистического анализа. Исключить данные любого животного, если средние баллы отличаются на >10%, и заменить их новым испытуемым.

9. Измерение объёма инфаркта мозга

1. Через 24 и 72 часа после реперфузии глубоко анестезируйте крыс с помощью 5% изофлурана. Подтвердите глубокую анестезию потерей рефлекса выпрямления и реакции на сжатие пальцев ног, а также при стабильном дыхании, прежде чем приступить к действию.
2. Быстро удалять мозг в течение 90 секунд после подтверждения глубокой анестезии, промывать его ледяным PBS и разрезать на корональные срезы диаметром 2 мм с помощью охлаждённой крысиной мозговой матрицы. Во время нарезки соблюдайте следующие меры предосторожности
   1. Держите всю процедуру на льду при температуре 0–4 °C; Собрать мозг в течение 90 секунд и расположить его в предварительно охлаждённую матрицу.
   2. Используйте острое лезвие, чтобы сделать одиночные чистые разрезы для точных корональных срезов шириной 2 мм, собирая каждый срез в ростро-каудальном порядке в ледяной PBS.
   3. Немедленно очистите матрицу и лезвие 75% этанолом между животными, чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение.
3. После предварительного прогрева 2% TTC до 37 °C полностью погрузите ломтики и инкубируете в темноте 20 минут, аккуратно перемешивая каждые 5 минут по 20 минут.
4. Быстро прекратите реакцию, промывая три раза с 4 °C PBS. Затем зафиксируйте 4% параформальдегид при 4 °C на ночь.
5. При 300 dpi фотографируйте обе стороны каждого ломка по одному разу.
   1. Используйте фиксированное освещение на белом фоне, чтобы устранить тени и отражения.
   2. Размещайте срезы ровно без перекрытия, добавляя в каждом кадре планку масштаба и ID-метку. Держите камеру перпендикулярно к секциям и поддерживайте постоянное фокусное расстояние и баланс белого на протяжении всего участка.
6. Количественно определите объём инфаркта с помощью ImageJ.
   1. Импортируйте изображение с разрешением 300 dpi (формат RGB) и конвертируйте в 8-битные оттенки серого (Image > Type > 8-битный).
   2. Примените авто-порог Оцу (Image > Adjust > Auto Threshold > выберите Otsu), чтобы отделить инфаркт (белый) от жизнеспособной ткани (красный).
   3. Используйте инструмент свободного выбора , чтобы обвести границу ипсилатерального полушария.
   4. Измерьте площадь (Анализировать > Измерять) и записывать количество пикселей.
   5. Вычислите объём инфаркта: Σ (площадь инфаркта × толщины среза [2 мм]) × (объём контралатерального полушария/ипсилатерального полушария), выраженного в процентах от противоположного полушария.

10. Статистический анализ

1. Представляйте данные в виде среднего ± стандартного отклонения (SD) или медианы [межквартильного диапазона], в зависимости от необходимости.
2. Проведите сравнения между группами с использованием непарного t-теста Студента или теста Манна-Уитни для ненормально распределённых данных.
3. Установите статистическую значимость в P < 0,05. Проводите все анализы с помощью соответствующего программного обеспечения для статистического анализа.

Результаты

Животные случайным образом распределялись на группы выживаемости после 24 часа (n = 10) или 72 часа (n = 10) для послереперфузионного окрашивания TTC. Ещё 4 крысы прошли MCAO, но умерли до запланированного окончания (уровень смертности 12,5%). Группа SHAM состояла из n = 6. Таким образом, общее количество использованных животных составило 30 (24 MCAO + 6 SHAM).

Крысы проходили 60-минутный MCAO для индуцирования церебральной ишемии (рисунок 1). Реперфузия начиналась путем удаления внутрилюминального филамента и освобождения проксимальной лигатуры в ЭКА. Из 24 крыс MCAO 3 погибли в течение 72 часов; один показал обширный инфаркт при посмертном окрашивании TTC в течение 24 часов, а другой умер по неустановленным причинам в течение 72 часов. Две дополнительные крысы были исключены из-за неудачного моделирования (неврологические показатели не соответствовали критериям, а окрашивание TTC не выявило инфаркта). Таким образом, уровень смертности за 72 часа составил 12,50%. Мы определили успешное создание модели как выживаемость в течение 24 часов плюс балл Лонги 1–3, и уровень успешного моделирования достиг 87,50%.

Неврологическая функция оценивалась через 24 и 72 часа после начала инсульта (до измерения объёма инфаркта). Три наиболее часто используемых шкалы, описанные в литературе — Зеа-Лонга, Бедерсон и модифицированный Гарсия — были использованы для всесторонней оценки (рисунок 2). Через 24 часа крысы (n = 20) получили 2,02 ± 0,41 по шкале Зеа-Лонга, 2,80 ± 0,41 по шкале Бедерсона и 8,15 ± 1,18 по модифицированной шкале Гарсии; эти дефициты оставались выраженными на уровне 72 h (Зеа-Лонга: 1,65 ± 0,59; Бедерсон: 1,93 ± 0,38; модифицированный Гарсия: 11:00 ± 1:34). Объём инфаркта, выраженный в процентах от противоположного полушария, составлял 37,61% ± 2,81% через 24 часа после MCAO и снизился до 28,32 ± 4,18% через 72 часа.

Рисунок 1: Схематическая схема физиологии левой шейно-мозговой артерии и эмболии средней церебральной артерии у крысы. Схематическая диаграмма (A) анатомии шейно-мозговой артерии, (B) предустановки, (C) послевведения, и (D) неправильного расположения филамента в крылово-небной артерии. CCA: общая сонная артерия; ИКА: внутренняя сонная артерия; ЭКА: наружная сонная артерия; ППА: крыловонебная артерия; MCA: средняя мозговая артерия. «Чёрный треугольник»: место разреза; Синяя линия: Филамент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Измерение инфарктного объёма и неврологическая поведенческая оценка после окклюзии церебральной артерии у крыс. (A) Окрашивание срезов мозга при заклинании. (B) Объём инфаркта на 72 часа меньше, чем на 24 часа. (C,D) Оценки Зеа-Лонги и Бедерсона на 72 часа ниже, чем на 24 часа. (E) Модифицированные оценки Гарсии на 72 часа выше, чем на 24 часа. ****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Проявление	Счёт / очки
Неврологического дефицита нет	0
Контралатеральная передняя конечность согнулась и отклонилась во время подвешивания хвоста (легкий неврологический дефицит)	1
Спонтанное кружение к противоположной стороне при ползании (умеренный неврологический дефицит)	2
Падение на противоположную сторону при стоянии или ходьбе	3
(тяжёлый неврологический дефицит)
Нет спонтанных движений, сопровождаемых нарушением сознания	4

Таблица 1: Оценка Зеа-Лонга^.

Проявление	Счёт/очки
Возьмите хвост животного и поднимите его так, чтобы тело было подвешено на 10 см над скамейкой. У обычных крыс обе передние конечности остаются вытянутыми к полу. Крысы с неврологическими нарушениями могут проявлять следующие поведения:
Неврологического дефицита нет	0
Паретическая передняя конечность согнута и прижимается к животу, а неповреждённая конечность вытянута к скамью	1
В дополнение к поведению, описанному в 1, сопротивление боковому толчку в сторону паретической стороны заметно снижается, когда животное лежит на скамейке	2
В дополнение к поведению, описанным в 1 и 2, животное кружит в сторону паретической стороны во время ходьбы	3

Таблица 2: Оценка ^{Бедерсона.}

Предмет	Проявление	Счёт/очки
a) Спонтанное движение	Нормальная активность	3
(Наблюдайте за активностью крысы в её домашней клетке в течение 5 минут)	Слегка ослабленные	2
	Умеренные нарушения	1
	Без спонтанных движений	0
b) Симметричное движение конечностей	Симметричная осанка	3
	Асимметричная осанка	2
	Гемиплегия	1
в) Растяжение передних конечностей	Симметричный	3
(Схватите хвост и подведите передние конечности к краю стола; обратите внимание на выпрямление передней лапы)	Слегка асимметричная	2
	Заметно асимметричны	1
	Гемиплегия	0
г) Сцепление и способность к лазанию	Сильно поднимается с крепким сцеплением	3
	Наблюдается односторонний дефицит	2
	Невозможность лазать или делать круги	1
e) Двусторонний тактильный рефлекс на теле	Симметричны с обеих сторон	3
	Медленная реакция с одной стороны	2
	С одной стороны нет ответа	1
f) Двусторонний ответ на прикосновение вибриссы	Симметричный	3
	Асимметричный	2
	Ответа не было	1

Таблица 3: Модифицированный балл Гарсии. Общий счёт: 0–18 очков; Более высокие показатели указывают на улучшение неврологической функции.

Обсуждение

Важно уточнить, что основной целью этого исследования была методологическая стандартизация, а не биологическое открытие. Разработка стандартизированного протокола MCAO крайне важна для снижения межлабораторной вариабельности и повышения воспроизводимости в исследованиях ишемического инсульта. Этот протокол повышает процедурную прозрачность за счёт строгих мер контроля качества и устраняет распространённые технические недостатки моделирования MCAO, включая стандартизированную вставку филаментов, регуляцию температуры и гистологическую обработку.

Хотя наблюдаемое уменьшение объёма инфаркта с 24 до 72 часов и частичное неврологическое восстановление являются ожидаемыми патофизиологическими явлениями у временного MCAO, вклад этого исследования заключается в установлении временной надёжности этих конечных точек с помощью строго стандартизированной процедуры. Обеспечивая детальную, поэтапную техническую основу, этот протокол гарантирует, что будущие механистические исследования — будь то нейровоспалительные каскады, апоптотические пути или терапевтические вмешательства — будут строиться на воспроизводимых и сопоставимых исходных данных. Мы явно позиционируем эту работу как технический ресурс, соответствующий сфере деятельности JoVE, предоставляющий основу для стандартизированных доклинических исследований инсульта, а не для продвижения механистических инсайтов.

Несколько этапов этого протокола особенно важны для обеспечения стабильной ишемии и реперфузии. Во-первых, точное продвижение линии окклюзии до появления небольшого сопротивления крайне важно для достижения воспроизводимой MCAO, так как небольшое отклонение глубины введения может привести к неполной окклюзии или субарахноидальному кровоизлиянию^20,21. Во-вторых, поддержание строгой нормы внутриоперационной температуры тела (37 ± 0,5 °C) и послеоперационного контроля температуры крайне важны, так как слишком низкая или слишком высокая температура тела могут существенно повлиять на инфарктную область и неврологический^{исход 12,22}. В-третьих, быстрое удаление мозга в течение 90 секунд и выполнение охлаждения в ледяной ванне могут минимизировать аутолиз и сохранить целостность тканей, обеспечивая точность окрашивания и анализа объема TTC²³. Если эти шаги будут последовательно реализованы, они значительно улучшат достоверность и сопоставимость моделей между исследованиями.

Мы усовершенствовали традиционный метод MCAO, чтобы повысить его воспроизводимость и удобство использования. Использование предварительно охлаждённых форм для срезов мозга и стандартизированных протоколов нарезки позволило снизить количество человеческих ошибок и артефакты среза. Кроме того, внедрение трёхмасштабной (Зеа-Лонга, Бедерсон и модифицированный Гарсия) неврологической оценки двумя слепыми исследователями повысило устойчивость и чувствительность функциональной^оценки 17,18,19. Благодаря подробным стандартным операционным процедурам, охватывающим каждый этап программы, он помогает выявлять распространённые проблемы, такие как неправильное расположение филамента, преждевременная реперфузия или послеоперационная гипотермия. Рекомендации по устранению распространённых осложнений включают: (1) Неправильное расположение линии окклюзии (вход PPA), выявленное отсутствием сопротивления на расстоянии 10–12 мм и немедленным неврологическим улучшением — при обнаружении немедленно втянуть нить, повернуть голову животного на 30° к противоположной стороне и снова продвинуться с небольшим медиальным углом к основанию черепа; (2) Преждевременная реперфузия, обнаруживаемая внезапным неврологическим улучшением во время окклюзии — убедитесь, что силиконовая пробка надёжно закреплена на пне ЭКА, проверьте, что диаметр филамента соответствует размеру артерии (0,35–0,40 мм для крыс весом 240–270 г), и рассмотреть возможность использования более длинной нити (увеличить силиконовое покрытие на 0,5 мм), если смещение сохраняется; и (3) Послеоперационная гипотермия (ректальная температура <36ºC) — повышение температуры грелки до 38 °C, установка тепловой лампы на высоте 30 см над животным и введение тёплого стерильного физиологического раствора (0,5 мл, внутрибрюшинно, 37ºC).

Несмотря на эти достижения, у этого протокола есть несколько ограничений. Во-первых, техника требует значительной кривой обучения (10–15 операций) для достижения стабильных показателей успеха, и индивидуальные вариации в сосудистой анатомии крыс могут влиять на расположение^{филамента 21,24}. Во-вторых, настоящий протокол основан на пост-хок верификации (неврологическое оценивание и окрашивание TTC), а не на интраоперационный мониторинг кровотока в мозге (LDF или LSCI), что ограничивает контроль качества во время операции и исключает раннее исключение животных с неполной^{окклюзией 25}. В-третьих, валидация ограничивалась молодыми самцами крыс типа Спраг-Доули, что ограничивало обобщаемость самоками, пожилыми животными и сопутствующими^{моделями 26,27}. Будущие исследования должны включать: (1) обоих полов, чтобы рассматривать пол как биологическую переменную; (2) пожилых крыс (12–18 месяцев) с сопутствующими сопутствующими заболеваниями; и (3) мониторинг CBF в реальном времени для повышения воспроизводимости в исследованиях лекарственных вмешательств.

Этот метод особенно ценен в доклиническом скрининге лекарств, поскольку последовательность и трансляционная значимость его результатов имеют решающее значение. Стандартизированный протокол, описанный в этой статье, обладает большим потенциалом для повышения строгости и воспроизводимости исследований ишемического инсульта. Будущие применения этого протокола включают: (1) доклинический скрининг нейропротекторных препаратов, вводимых в реперфузионное окно; (2) механистические исследования ишемии-реперфузионного повреждения с использованием временных точек 24 и 72 часа; (3) исследование нейропластичности после инсульта и функционального восстановления; и (4) валидация терапевтических мишеней в сочетании с генетическими или фармакологическими вмешательствами. Предоставляя подробную и подкреплённую видео SOP, наша цель — способствовать широкому внедрению этого метода в лабораториях различных профессиональных уровней, что в конечном итоге способствует более надёжным и клинически значимым исследованиям доклинического инсульта.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2% TTC раствор окрашивания	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T8170	25 г/бутылка, ≥98 % чистоты
4% PFA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	P1110	500 мл готовый к использованию
Рассасывающийся шов	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	VCP345H	5-0 Vicryl
Зажимы Адсона	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11010	1×2 зубца, 12 см
Изгибанные зажимы Dumont	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-11052	11 см длина, 0,05 мм тонкий кончик
Оборудование для обратного отопления	Shenzhen Reward Life Science & Technology Co., Ltd.	69001	37 ± 0,3 °C замкнутый контур
ImageJ	National Institutes of Health	версия 1.53k
Ножницы для разрезания радужки	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14060	Изгибанный кончик, 10 см
Микрососудистые зажимы	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	JD-16010	1,5 см изогнутый зажим
Нерасасывающийся шёлковый шов	Shanghai Pudong Jin-Huan Medical Products Co., Ltd.	S-2304	6-0 Чёрный шёлковый нить
ПО PASS	NCSS, LLC, Kaysville, UT, USA	версия 15.0	Программное обеспечение для расчёта размера выборки
Матрица головного мозга крысы	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	68610	Корональные слоты 2 мм
Силиконопокрытый нилоновый филамент	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	60-1250	0,35 мм НВ, 30 мм силиконовая насадка, EO-стерильный
Машина для анестезии малых животных	Shenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.	R500IE	Изофлуранный вапоризатер, включая камеру для индуцирования и маску
SPSS	IBM Corp., Armonk, NY, USA	версия 26.0	Программное обеспечение для статистического анализа
Микроножницы Vannas	Shanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.	JD-14058	Изгибанный кончик, 8 см