Рассеянный склероз и гематологические злокачественные опухоли: двустороннее менделевское рандомизационное исследование

Summary

Это двунаправленное исследование с двумя выборками менделевской рандомизации использовало европейский GWAS для оценки причинно-следственных связей между рассеянным склерозом (РС) и гематологическими злокачественными опухольми (ГМ). Генетическая склонность к РС была связана с более высокой вероятностью развития лимфомы Ходжкина и неопределённой лейкемии; Нет ассоциаций с другими подтипами или в обратном анализе.

Abstract

Наблюдательные исследования сообщали о связи между рассеянным склерозом (РС) и гематологическими злокачественными опухольями (ГМ), но результаты остаются непоследовательными. Мы провели двунаправленный двухвыборный менделевский рандомизационный анализ (MR) с использованием общедоступных общегеномных сводных ассоциативных статистических данных для МС (n = 115 803) и HM (n = 218 792). Первичные причинно-следственные оценки были получены с помощью оценки с обратной дисперсией (IVW), дополненные заранее заданными анализами чувствительности на гетерогенность и плейотропию. Генетически проксиированная ответственность к РС была связана с более высокой вероятностью развития лейкемии (неопределённый подтип) (отношение шансов [OR] 1,311, 95% доверительный интервал [ДИ] 1,002-1,716, P = 0,048) и лимфомы Ходжкина (HL) (ОР 1,224, 95% ДИ 1,052-1,425, P = 0,009), при отсутствии доказательств других лейкемии, лимфомы или плазматических новоклеточных подтипов (все P > 0,05). Тесты не выявили значительной гетерогенности или направленной плейотропии для анализов лейкемии (неуточнённого подтипа) или HL. Эти результаты предоставляют генетические данные, соответствующие повышенному риску отдельных подтипов ГМ у людей с большей генетической подсклонностью к РС; однако сигналы следует интерпретировать осторожно и проверять в более крупных, многородовых наборах данных и с дополнительными причинно-следственными рамками.

Introduction

Рассеянный склероз (РС) — это хроническое аутоиммунное заболевание центральной нервной системы, характеризующееся воспалительным демиелинизацией и рецидивно-ремиттирующим процессом, что может привести к инвалидности и значительному социальному и семейному^{бременю 1}. Гематологические злокачественные опухоли (ГМ) включают гетерогенные новообразования гемопоэтического или лимфоидного происхождения и составляют примерно 6,5% всех опухолей в^{мире 2}. Хотя таргетная и иммунотерапия улучшила результаты для многих пациентов, прогноз остаётся плохим для подгруппы³. Взаимосвязь между РС и ХМ исследуется десятилетиями с разными^{результатами 4,5}. В норвежском исследовании, включавшем 6 883 случая РС и 37 919 совпадающих контрольных групп, статистически значимой связи между риском рассеянного склероза и гематологического рака не было обнаружено. Аналогично, датское исследование зафиксировало лишь маргинальное, статистически незначимое повышение заболеваемости РС среди пациентов с РС по сравнению с популяционными контролями. Для сравнения, некоторые когортные исследования указывали на более высокие риски в конкретных контекстах или подтипах: корейское проспективное исследование зафиксировало в 4,52 раза более высокую частоту заболеваемости лимфомой среди лиц с^{РС 6}, а большой когортный анализ (29 617 РС против 296 164 не-РС) выявил более высокий общий риск ГМ в^{группе 7} с РС. Однако другие исследования не выявили повышенного риска неходжкинской лимфомы (NHL) или HL у пациентов с установленным^{РС 8,9}. В совокупности доказательства существования ассоциации — особенно на уровне подтипов HM — остаются неопределёнными.

Менделевская рандомизация (МР) использует генетические варианты зародышевой линии в качестве прокси для модифицируемых воздействий на основе принципа, что распределение аллелей фактически случайно относительно многих окружающих^{факторов 10}. Используя генетические инструменты, тесно связанные с конкретным воздействием, МР может усилить причинно-следственный вывод и уменьшить смещение, вызванное смешиванием или обратной^{причинностью 11}.

Здесь мы применяем двунаправленную двухобразную структуру МР для оценки потенциальных причинно-следственных связей между РС и основными классами ГМ — лейкемией, лимфомой и множественной миеломой (ММ) — с генетической точки зрения. Заявление об оригинальности: Насколько нам известно, это первый двунаправленный MR, который систематически исследует специфические для подтипов MS-HM взаимосвязи с заранее заданными рабочими параметрами (пороги приборов, скопление LD, гармонизация и диагностика чувствительности) для обеспечения полной воспроизводимости.

Protocol

В этом исследовании анализировались статистические данные по общегеномному исследованию ассоциаций (GWAS) на уровне деидентифицированной идентичности, которые являются общедоступными. В соответствии с политикой репозитория и одобрениями, полученными первоначальными исследователями, для этого вторичного анализа не требовалось новое одобрение институционального контрольного совета или дополнительное индивидуальное информированное согласие. Все участники GWAS сообщили о процедурах одобрения этики и согласия в своих публикациях источников. Все анализы проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами и Хельсинкской декларацией.

Обзор и обоснование

В исследовании была реализована двухнаправленная модель менделевской рандомизации (МР), ограниченная сводной статистикой европейского происхождения, для оценки возможных причинно-следственных связей между рассеянным склерозом (РС) и гематологическими злокачественными опухолиями (ГМ). Дизайн соответствует трём основным предположениям MR: релевантности инструмента, независимости от смешивателей и ограничениям на исключение. Таким образом, рабочий процесс включает (i) доступ к набору данных и кураторство, (ii) выбор инструментов с геномной значимостью с сгруппированием дисбаланса связи (LD), (iii) скрининг смешения с помощью PhenoScanner, (iv) гармонизацию аллелей с явной обработкой палиндромных вариантов, (v) оценку направленности с помощью теста Steiger¹², (vi) первичную МР-оценку с помощью дополнительных методов, (vii) полный набор диагностики чувствительности и (viii) стандартизированную генерацию рисунков и таблиц под Многократное тестирование контроля. Каждый из этих шагов подробно описан в последующих подразделах протокола, а обзор конвейера представлен на рисунке 1.

Материалы, программное обеспечение и RRIDs

Анализы проводились в версии R 4.3.1 (RRID:SCR_001905) с использованием RStudio/Posit 2023.12+ (RRID:SCR_000432). Локальное объединение LD использовало PLINK версии 1.9 (сборка 2.3; RRID:SCR_001757)¹³. Оценка и извлечение данных MR использовали пакет R TwoSampleMR v0.5.7 ¹⁰; Поиск инструментов для потенциальных объединяющих инструментов использовал Phenoscanner версии 1.0; обнаружение и коррекция выбросов использовали MRPRESSO v1.0. Точные версии приводятся для пакетов без RRID.

Источники данных и доступ

Сводные статистические данные по РС были получены из метаанализа Международного консорциума по генетике рассеянного склероза, включающего 47 429 случаев РС и 68 374 контрольных группы с гармонизированным контролем качества в 15 когортах. Сводные статистические данные HM были получены из FinnGen (общий n = 218 792; >16 миллионов вариантов) и включали лимфома Ходжкина (HL), диффузную крупно-B-клеточную лимфому (DLBCL), фолликулярную лимфому (FL), зрелые T/NK-клеточные лимфомы (MTNKL), другие или неуточнённые неходжкинские лимфомы (NHL), лимфоидный лейкоз, миелоидный лейкоз, лейкоз неопределённого типа клеток и множественные миеломы/плазматические^{опухоли 14}. Доступ к наборам данных осуществлялся через портал IEU OpenGWAS с использованием задокументированных идентификаторов^{доступа 15}. Все анализы в данном исследовании были основаны исключительно на этих общедоступных сводных наборах данных GWAS; Не использовались и не генерировались внутренние данные о когорте учреждения или пациентов на индивидуальном уровне. Поскольку мы не выявили дополнительные GWAS с гармонизированными определениями MS и гематологических злокачественных опухолей, которые позволяли бы полное воспроизведение конвейера, независимая внешняя валидация с использованием отдельного набора данных не проводилась и признана как ограничение. Протокол написан так, чтобы его можно было напрямую повторно применять к будущим наборам данных GWAS для независимой проверки.

Выбор инструментов и скопление LD

Для каждого воздействия были отобраны однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) с геномной значимостью (P < 5 × ^10-8) с использованием функции extract_instruments в TwoSampleMR, применённой к наборам данных OpenGWAS. Для обеспечения независимости инструментов LD затем выполнялось на европейской эталонной панели с использованием либо внутренних утилит для скопления TwoSampleMR, либо локально с PLINK, с порогом r² 0,001 и физическим окном 10 000 килобаз. При использовании PLINK параметры командной строки устанавливались на порог первичной значимости 5 × ^10-8, r² = 0,001, и окно 10 Мб, чтобы скопленные инструменты точно соответствовали этим критериям. Прочность прибора оценивалась с использованием F-статистики, полученной из оценки эффекта воздействия и её стандартной ошибки (F ≈ β²/SE²); варианты с F < 10 были исключены из окончательных наборов приборов, а оставшиеся SNP были перенесены на скрининг PhenoScanner.

Скрининг с помощью PhenoScanner

Для минимизации горизонтальной плейотропии с учётом известных факторов риска каждый кандидат-инструмент был запрошён в PhenoScanner V2 по каталогу GWAS с использованием корпуса феносканера R (v1.0)^16,17. Для каждого SNP мы запросили все зарегистрированные ассоциации в P < 1 × 10⁻⁵ и вручную проверяли полученные признаки. Ассоциации, указывающие на связи с установленными факторами риска гематологического злокачественного развития — такими как воздействие курения, ожирение/антропометрические признаки (например, индекс массы тела, окружность талии и показатели жира в организме) — или прямые связи с фенотипами гематологической злокачественности побудили исключить соответствующий SNP из набора^{инструментов 18}. Категории признаков, считающиеся исключающими, основывались на предыдущих данных, связывающих ожирение и курение с риском лейкемии, лимфомы или^{миеломы} 18,19,20. Запросы использовали общие ключевые формулировки (например, дым, сигарета, ИМТ, ожирение, талия, ожирение, гематологическая злокачественность, лимфома, лейкемия, миелома). Все удаления фиксировались в таблице отслеживания вместе с чертой PhenoScanner, вызывающей исключение, а очищенные списки инструментов затем передавались на этап гармонизации.

Гармонизация и палиндромная обработка

Аллели эффекта для каждого SNP были гармонизированы между наборами данных экспозиции и результатов с помощью функции harmonise_data в пакете TwoSampleMR (v0.5.7, R). Мы выровняли все аллели исхода с аллелем эффекта экспозиции так, чтобы положительные бета-коэффициенты всегда соответствовали одному и тому же аллелю в обоих наборах данных. Палиндромные варианты (A/T или C/G) с промежуточными частотами эффектных аллелей (0,42-0,58) в панели отсчёта OpenGWAS рассматривались как неоднозначные по цепи и автоматически удалялись путём настройки гармонизации на отброс неоднозначных SNP. Палиндромные SNP с частотами эффектных аллелей вне этого диапазона сохранялись и выравнивались с использованием указанных аллелевых частот. Поскольку доступность аллелей и палиндромный статус немного различались между результатами FinnGen, гармонизация проводилась отдельно для каждого фенотипа HM, а окончательное количество инструментов, входящих в анализ, специфичный для результата, извлекалось из гармонизированных R-объектов и отражалось в таблицах.

Оценка направленности (фильтрация по Штайгеру)

Направленность оценивалась с помощью подхода Штайгера, реализованного в функции steiger_filtering TwoSampleMR. Для каждого SNP функция сначала рассчитывала дисперсию, объяснённую (R²) в воздействии и результате по бета-коэффициенту GWAS, стандартной ошибке и размеру выборки. В исследовании были удалены инструменты, для которых R² был выше по результату, чем в воздействии, что указывало на возможное обратное направление эффекта. Фильтрация Штайгера применялась отдельно для каждого набора результатов, а оставшиеся инструменты (ряды с steiger_dir == TRUE) сохранялись и использовались в последующих MR-анализах. Подсчёты приборов после Steiger были зафиксированы для каждого результата и представлены вместе с оценками MR.

Первичная оценка МР и многократное тестирование

Первичные причинные оценки были получены с помощью МР с обратной дисперсией (IVW) в модели фиксированных эффектов с использованием функции mr в TwoSampleMR, с методами, обозначенными как «mr_ivw», «mr_egger_regression» и «mr_weighted_median». Для каждого результата HM в mr передавались гармонизированные и фильтрованные по Штайгеру инструменты, а логарифмические коэффициенты шансов и стандартные ошибки извлекались и экспоненциированы для получения коэффициентов шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI) для бинарных^{признаков 21}. Для изучения устойчивости к незначительным нарушениям предположения о отсутствии плейотропии мы также применили взвешенные медианные оценки и регрессионные оценки^{MR-Egger 22,23}, реализованные в том же пакете. Когда тест Q Кокрана (начиная с mr_heterogeneity года) показал значительную гетерогенность (P < 0,05), исследование также соответствовало мультипликативным моделям случайных эффектов IVW и предоставило результаты как фиксированных, так и случайных эффектов. Семейная ошибка по девяти исходам ХМ контролировалась с помощью коррекции Бонферрони при α = 0,05/9 = 5,56 × ^10-3; ассоциации с P-значениями ниже этого порога считались статистически значимыми, тогда как ассоциации с 0,0056 ≤ P < 0,05 интерпретировались как наводящие и описывались осторожно.

Диагностика чувствительности: гетерогенность, плейотропия и исключения

Статистика Q Кокрана использовалась для оценки гетерогенности между инструментами для моделей IVW и MR-Egger, реализованная через функцию mr_heterogeneity в TwoSampleMR. Направленная горизонтальная плейотропия оценивалась с помощью теста перехвата MR-Egger (mr_pleiotropy_test) и глобального теста в пакете^{MR-PRESSO 24}. ^{MR-PRESSO 24} был запущен с рекомендованными настройками в R (NbDistribution ≥ 5 000, SignifThreshold = 0,05) для выявления влиятельных выбросов и количественной оценки потенциальных искажений путём сравнения оценок IVW до и после удаления^{выбросов 25}. Для каждой пары экспозиции-результат были проведены анализы с оставленным выездом (mr_leaveoneout), чтобы определить, влияет ли какой-либо отдельный SNP непропорционально на общую оценку. Для прозрачности и воспроизводимости все диагностические выходы экспортировались из R и отчитывались вместе с соответствующим количеством приборов после гармонизации, фильтрации по Штайгеру и удаления выбросов MR-PRESSO.

Прочность прибора и оценка NOME

Сила прибора для MR-Egger была количественно измерена с помощью статистики^I2GX, вычисленной как 1 минус среднее квадрата стандартных ошибок ассоциаций воздействия SNP, делённого на их дисперсию между^{инструментами 26}. Значения, близкие к 1, указывают на лучшее соответствие предположении «Ошибка без измерения» (NOME); более низкие значения указывают на возможное регрессионное разбавление и быстрое осторожное толкование результатов MR-Egger. Для каждого анализа, специфичного для результата, был рассчитан и представлен I²GX.

Обратная менделевская рандомизация

Полный конвейер повторялся в обратном направлении, рассматривая каждый подтип HM как экспозицию, а MS — как результат. Когда значимые инструменты, охватывающие весь геном, были недостаточны для данного воздействия HM, допускался ослабленный порог отбора P < 5 × ^10-6 при сохранении тех же параметров скупления LD, скрининга с помощью PhenoScanner, процедур гармонизации, фильтрации по Steiger и диагностики чувствительности. Анализы с использованием ослабленных порогов чётко отмечались в соответствующих таблицах и легендах рисунков.

Визуализация и экспорт фигур

Графики рассеяния, леса, воронки и «оставляя один раз» были созданы с легендами, расположенными под панелями, а размеры шрифтов были отрегулированы, чтобы метки не скрывали отображённые данные. Границы осей были стандартизированы для сопоставимых результатов для облегчения визуального сравнения. Фигурки экспортировались с минимальной скоростью 300 dpi в форматах без потерь, таких как TIFF или PNG. Все отмеченные числовые значения были перекрёстно сверены с представленными оценками для обеспечения согласованности текста, таблиц и рисунков.

Воспроизводимость и обмен данными

Случайные семена фиксировались там, где это было применимо, записывались версии программного обеспечения, а скрипты анализа вместе с промежуточными объектами архивировались для повторного запуска всех шагов. Идентификаторы доступа к набору данных и определения фенотипов были задокументированы, а списки инструментов на каждом этапе фильтрации — после группировки, после гармонизации, после фильтрации Штайгера и после MR-PRESSO — были подготовлены для загрузки в виде файлов таблиц в соответствии с руководящими принципами журнала.

Results

Выбор инструментальных вариантов

Используя геномный порог значимости P < 5×10^⁻8, изначально было извлечено 22 466 SNP для РС. После скупления LD в PLINK (r² < 0,001, окно 10 000 кб) 72 SNP остались инструментами, и каждый имел F > 10 (диапазон 30-1 044). Для минимизации плейотропии через известные пути риска были удалены 11 SNP, связанных с потенциальными факторами смешивания ГМ (например, индекс массы тела, окружность талии, вес, окружность бедра, процент ...

Discussion

Это исследование с двумя выборками менделевской рандомизации (МР) в популяции европейского происхождения предоставляет генетические данные, подтверждающие более высокий риск ходжкинской лимфомы (HL) и лейкемии неопределённого типа клеток у людей с большей генетической подверженностью рассеянному склерозу (РС), при этом не демонстрируя убедительной связи с другими подтипами лейкемии, неходжкинской лимфомой (НХЛ) или множественными миеломами/плазматлетическими^{новообразова...}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Коррекция Бонферрони (α = 0.0056)	Справочник статистического метода	BC-0056	Метод коррекции множественных тестов для контроля уровня ложноположительных результатов
Статистика Q Кокрана	Cochran, 1954	Q-001 (https://www.jstor.org/stable/2334368)	Используется для оценки гетерогенности между МР-приборами
F-статистика	Документация TwoSampleMR	F-049 (https://cran.r-project.org/web/packages/TwoSampleMR/vignettes/perform_mr.html)	Метрика для оценки прочности прибора в МР
Сводная статистика HM (GWAS)	FinnGen	https://www.finngen.fi/en	Геномные данные по гематологическим злокачественным опухоли (n = 218 792), включая лимфому Ходжкина (HL), неходжкинскую лимфому (NHL), лейкемию и др.
Статистика I2GX	Bowden и др., 2016	I2GX-074 (https://academic.oup.com/ije/article/44/2/512/753845)	Статистика для оценки соответствия предположении «ошибки без измерения»
Параметры скупления LD	PLINK	https://www.cog-genomics.org/plink/1.9	Параметры скопления LD для обеспечения независимости генетических инструментов
MR-PRESSO v1.0	MR-PRESSO	1445 (https://github.com/rondolab/MR-PRESSO)	Программное обеспечение для обнаружения и коррекции неоднородности и выбросов
Сводная статистика магистратуры (GWAS)	Международный консорциум по генетике MS	https://imsgc.net	Геномные данные по рассеянному склерозу (РС) (n = 115 803), из европейской когорты
PhenoScanner V2	PhenoScanner	1550 (http://www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk)	База данных для скрининга генетических инструментов на ассоциации с известными факторами смешения (например, курение, ИМТ)
PLINK v1.9	PLINK	SCR_001757 (https://www.cog-genomics.org/plink/1.9)	Программное обеспечение для анализа ассоциаций на уровне генома и скупления с дисбалансом связей (LD)
R версия 4.3.1	Фонд R	SCR_001905 ( https://www.r-project.org)	Открытое программное обеспечение для статистических вычислений
Тест Штайгера	Методология TwoSampleMR	STG-001 (https://cran.r-project.org/web/packages/TwoSampleMR)	Статистический тест на направленность в менделевской рандомизации
TwoSampleMR v0.5.7	RStudio / CRAN	1134 (https://cran.r-project.org/package=TwoSampleMR)	Пакет R для анализа менделевской рандомизации (MR) из двух выборок
Взвешенная медиана и MR-Egger	Менделевские методы рандомизации	WM-026 (https://cran.r-project.org/package=MendelianRandomization)	Альтернативные оценщики для анализа чувствительности в МР