Влияние полисахаридов кордицепса на почечное старение, вызванное D-галактозой.

Краткое содержание

Модель старения была установлена у мышей и HK-2-клеток с использованием D-галактозы. Влияние полисахаридов Cordyceps (CCP) на старение почек оценивалось с помощью западного блотинга и иммунофлуоресценции, при этом изменения митохондрий оценивались с помощью обнаружения реактивных видов кислорода и окрашивания JC-1.

Аннотация

Хроническая болезнь почек (ХБП) представляет собой серьёзную глобальную проблему для здоровья. Старение почечных трубчатых эпителиальных клеток (RTEC) нарушает регенерацию и восстановление почек, а также способствует прогрессированию ХБП через высвобождение секреторного фенотипа (SASP), ассоциированного с старением. Cordyceps sinensis, основными биоактивными компонентами которого являются полисахариды Cordyceps (CCP), включен в многочисленные клинические препараты для лечения ХБП и обладает продемонстрированными терапевтическими свойствами. Для изучения роли CCP в старении почек была разработана модель старения почек, индуцированная D-галактозой, у мышей с применением CCP в качестве вмешательства. Результаты лечения оценивались с помощью окрашивания, связанного с старением, и оценки функции почек. Была дополнительно установлена модель старения, вызванная D-галактозой, в клетках HK-2, для изучения лежащих в основе клеточных механизмов. Окрашивание JC-1 и обнаружение реактивных видов кислорода (ROS) использовались для оценки изменений митохондрий после обработки CCP в стареющих условиях. Для оценки влияния CCP на фосфорилирование MAPK, транслокацию ядра NF-κB и активацию инфламмасом NLRP3 проводили иммунофлуоресценцию, вестерн-блоттинг и количественное ПЦР (RT-PCR). Результаты показывают, что CCP ослабляет старение тубулоинтерстициальных клеток, повреждения почек и фиброз, одновременно улучшая функцию митохондрий как в клеточных и животных моделях старения, индуцированного D-галактозой. Эти эффекты связаны с модуляцией сигнального пути ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3.

Введение

Хроническая болезнь почек (ХБП) — одно из самых распространённых заболеваний почек и затрагивает большую часть населения по всему миру. Его появление тесно связано с^{возрастом 1}. Почечные канальцы являются основными функциональными единицами почек, а клеточное старение внутри трубчатых эпителиальных клеток почки (RTEC) является одним из основных факторов снижения функционального ухудшения^{почек 2}. Воздействие лекарств и другие стрессоры могут вызвать старение, связанное с трубочным стрессом, что приводит к прогрессирующей потере функции почек и в конечном итоге к терминальной стадии заболевания почек (ЭСКД). Поэтому целенаправленное старение в РТЭК может быть эффективной стратегией для задержки старения почек и профилактики или лечения ХБН.

Хроническое воспаление — отличительная черта^{возраста 3} лет и важный фактор многих возрастных заболеваний. Провоспалительный цитокин, выделяемый стареющими клетками, в совокупности известны как секреторный фенотип, ассоциированный со старением (SASP)⁴. SASP способствует длительному воспалению, вызывает старение в соседних клетках и способствует прогрессирующему снижению^{функционального ухудшения. 5}. Модель старения, индуцированной D-галактозой (D-gal), является одной из самых широко используемых экспериментальных моделей старения. Предыдущие исследования показали, что лечение D-gal приводит к внутриклеточному накоплению реактивных форм кислорода (ROS), дисфункции митохондрий, нарушению редокс-гомеостаза и индукции стрессовой клеточной^{старения 6}. По сравнению с моделями естественного старения, которые требуют много времени и демонстрируют высокую межиндивидуальную вариабельность, модель D-галактозы обладает преимуществами, такими как простота, быстрая индукция и относительно низкая внутригрупповая вариабельность. Эта модель применима как для in vivo, так и для in vitro исследований. Хотя он не полностью воспроизводит медленное, свободное от патологии естественное старение, он хорошо подходит для моделирования старения почек, учитывая высокую метаболическую активность почек и её восприимчивость к окислительному стрессу. С механистической точки зрения, D-галактоза способствует старению клеток главным образом за счёт окислительного стресса, что соответствует исследованиям, сосредоточенным на генерации ROS и дисфункции митохондрий во время старения.

Cordyceps sinensis — это традиционный китайский лекарственный гриб, широко используемый для лечения заболеваний, связанных^{с почками 7}. Он содержит множество биоактивных компонентов, включая полисахариды, аденозин, аминокислоты, кордицепин и эргостерол. Экстракты и ферментированные препараты Cordyceps sinensis обладают противовоспалительными, антиоксидантными и антивозрастными^{свойствами} 8,9,10,11. Например, было показано, что полисахариды Cordyceps снижают воспалительную инфильтрацию в модели астматических мышей, ингибируя сигнальный путь TGF-β1/^{Smad 12}. Кроме того, полисахариды кордицепса могут подавлять фосфорилирование пути MAPK и снижать экспрессию воспалительных цитокинов, таких как IL-6 и IL-1β, в клетках RAW264.7¹³. Предыдущие исследования показали, что полисахариды Cordyceps (CCP), основной биоактивный компонент Cordyceps sinensis, могут ослаблять старение в клетках трубчатого эпителия почек, регулируя аутофагию и подавляя выработку SASP. Однако молекулярные механизмы, с помощью которых CCP противодействует повреждениям, опосредованным ROS, остаются неполностью охарактеризованы.

В настоящем исследовании изучаются защитные эффекты CCP против старения почек у мышей и его влияние на воспаление, окислительный стресс и старение, используя D-галактозную модель старения почечных трубчатых эпителиальных клеток. Далее мы исследуем, регулирует ли CCP производство ROS, функцию митохондрий и нижние сигнальные пути, включая фосфорилирование MAPK, транслокацию ядра NF-κB и активацию инфламмасом NLRP3. В совокупности эта работа направлена на предоставление экспериментальных доказательств в пользу использования CCP в исследованиях старения почек и возрастных повреждений почек. Общий экспериментальный рабочий процесс и предлагаемый механизм изложены на рисунке 1.

Протокол

Все процедуры на животных проводились в соответствии с институциональными рекомендациями и утверждён Комитетом по этике животных Нанкинского университета китайской медицины (Этическое одобрение No 202108A006). Все отходы, образовываемые во время процедур культуры клеток и окрашивания, собирались в герметичные контейнеры и пакеты для биологической опасности и утилизировались лицензированной службой управления медицинскими отходами.

Модель животных и терапевтические вмешательства

Для минимизации межиндивидуальных вариаций 40 мышей были случайным образом распределены по пяти группам (n = 8 на группу) и подвергались следующим вмешательствам: (1) Контрольная группа: Внутрижелудочное введение 0,2 мл физиологического раствора на мышь; (2) Модельная группа: Получал ежедневные подкожные инъекции D-галактозы (250 мг/кг), вводилось в виде 0,2 мл раствора 25 мг/мл на мышь; (3) Группа низких доз CCP: получали инъекции D-галактозы в сочетании с внутрижелудочным введением CCP в дозе 50 мг/кг (0,2 мл раствора 5 мг/мл на мышь); (4) Группа с высокими дозами CCP: получали инъекции D-галактозы в сочетании с внутрижелудочным введением CCP в дозе 100 мг/кг (0,2 мл раствора 10 мг/мл на мышь); (5) Группа витамина E: получал инъекции D-галактозы в сочетании с внутрижелудочным введением витамина E в дозе 100 мг/кг (0,2 мл раствора 10 мг/мл на мышь). После 8 недель лечения мышей усыпили, а для последующих анализов были собраны образцы сыворотки, мочи и ткани почек.

Анализ функции почек

Функция почек оценивалась с помощью коммерческих тестовых наборов для измерения креатинина, мочевой кислоты и белка мочи согласно инструкциям производителя. Значения поглощения измерялись на 505 нм для креатинина, 510 нм для мочевой кислоты и 585 нм для белка мочи с использованием многофункционального считывателя микропластин.

Окрашивание тканевых срезов

Почечные ткани, вложенные с парафином, были разрезаны толщиной 4 мкм. Секции были депарафинированы, инкубированы гематоксилином в течение 5 минут, промыты проточной водой, дифференцированы кислотным спиртом 1% в течение 5 секунд и снова промыты. После 1-минутной промывки с физиологическим раствором с буфером фосфатом (PBS) секции были покрыты эозином в течение 3 минут, обезвожены и установлены. Для трихромной окрашивания Массона срезы были депарафинированы и окрашены гематоксилином, как описано выше, затем Ponceau S в течение 5 минут и анилин-синим в течение 5 минут. Затем секции были обезвожены и установлены.

Анализ жизнеспособности клеток

Ячейки HK-2 были засеяны в пластины с 12 лунками по 1 × 10⁵ ячейки на колодцу. После 24-часового воздействия D-галактозы и полисахаридов кордицепса в каждую скважину 14 добавляли 10% раствора CCK-8. После инкубации при 37 °C в течение 30 минут поглощение фиксировалось на 450 нм с помощью считывателя микропластин. Документация по контролю качества полисахаридов Cordyceps и STR-аутентификации элементов HK-2 приведены в дополнительном файле 1.

Обратная транскрипция, количественная полимеразная цепная реакция

После 24 часов культивирования среда была удалена, и вся РНК экстракцировалась с помощью экстракционного реагента. Концентрация РНК определялась с помощью микропластинного спектрофотометра, а целостность РНК проверялась с помощью 2% агарозного гелевого электрофореза. Геномная ДНК была удалена, а кДНК синтезирована с помощью обратной транскрипции. Последовательности праймеров приведены в Таблице материалов.

Измерение внутриклеточного уровня ROS

Ячейки HK-2 были засеяны в пластины с 12 лунками по 1 × 10⁵ ячейки на колодцу. При достижении слияния 60-70% клетки проходили предварительную обработку D-галактозой в течение 12 часов. После 24 часов воздействия лекарства среда была удалена, а клетки промывались один раз с помощью PBS. Внутриклеточная ROS была обнаружена инкубацией с помощью чувствительного к ROS флуоресцентного зонда при 37 °C в течение 20 минут, а изображения флуоресценции были получены на волнах возбуждения/излучения 488/525^{нм 15}.

Вестерн блот

Клеточные белки лизировали с помощью буфера RIPA и очищали центрифугированием при 13 000 × г в течение 15 минут при 4 °C. Белки денатурировались при кипячении в течение 10 минут, а равное количество белка (20 мкг на образец) подвергалось электрофоретическому разделению и переносилось на мембраны PVDF. После блокировки в течение 1 часа мембраны инкубировали ночью с первичными антителами. Последующие промывания PBST сопровождались инкубацией с использованием вторичных антител, конъюгированных с HRP, а обнаружение проводилось с использованием субстрата усиленной хемилюминесценции (ECL^{) 16}. Детали антител и идентификаторы реагентов приведены в Таблице материалов.

SA-β-гал старение окрашивания

Ячейки HK-2 были покрыты в пластинах с 12 лунками при плотности 1 × 10⁵ ячеек на каждую скважину. Когда слияние клеток достигало 60-70%, их предварительно обрабатывали D-галактозой в течение 12 часов. Окрашивание SA-β-гал проводилось согласно протоколу производителя, а окрашенные клетки наблюдались с помощью оптического^{микроскопа 17}.

Измерение потенциала мембраны митохондрий

Потенциал митохондриальной мембраны был оценён с помощью флуоресцентного зонда JC-1 в соответствии с инструкциями поставщика. Мономеры JC-1 были обнаружены на волнах возбуждения/излучения 490/530 нм, тогда как агрегаты JC-1 — на 525/590 нм. Изображения получались при обнаружении чётких красных или зелёных флуоресцентных сигналов.

Статистический анализ

Данные представлялись в виде барообразных или точечных диаграмм и анализировались с помощью указанного программного обеспечения. Интенсивность вестерн-блот-полосы была количественно измерена с помощью ImageJ. Данные анализировались с помощью анализа дисперсии (ANOVA) с последующим t-тестами для сравнений между группами. Статистическая значимость определялась как значение P < 0,05. Символы указывают на сравнения с контрольной группой (*) или D-gal группой (#) (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).

Результаты

D-галактоза была использована для создания модели старения у мышей, при этом витамин E служит широко используемым положительным антистареющим контролем. Стареющих мышей лечили разными дозами полисахаридов Cordyceps (CCP). У пожилых мышей наблюдалось значимое нарушение почек, что подтверждается повышенным уровнем белка в мочевыводящей системе, мочевой кислоты и креатинина (рисунок 2B-D). И витамин E, и приём CCP ослабляли эти нарушения. Окраш...

Обсуждение

Это исследование демонстрирует защитное действие полисахаридов Cordyceps на почечные трубчатые эпителиальные клетки и приводит доказательства того, что они ослабляют воспалительное старение в клетках HK-2, модулируя сигнальный путь ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3. Эти результаты дополнительно проясняют возможные механизмы, лежащие в основе эффектов соединений, полученных из Cordyceps sinensis, при лечении острых и хронических заболеваний почек, и служат ори...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Casepase1/pAb рассечаного кролика	WL03450	Ваньлэй, Шэньян, Китай
Комплект CCK-8	C0037	Бийотай, Шанхай, Китай
КПК	B21296	Юанье Био, Шэньян, Китай
Набор для тестирования креатинина	C011-2-1	Цзянчэн, Нанкин, Китай
Д-гал	HY-N0210	MCE, США
ERK Rabbit pAb	4695	CST, США	AB_390779
gapdh Rabbit pAb	ac033	Abclonal, Ухань, Китай
Набор для окрашивания H & E Набор для окрашивания	G1120	Соларбио, Пекин, Китай
Комплект JC-1	C2003S	Бийотай, Шанхай, Китай
Набор для окрашивания Массона	G1340	Соларбио, Пекин, Китай
NLRP3 Rabbit pAb	WLH3383	Ваньлэй, Шэньян, Китай
P21 Rabbit pAb	64016	CST, США	AB_2892063
p38 Кролик pAb	9212	CST, США	AB_330713
p50 pAb Rabbit	3035	CST, США	AB_330564
p65 pAb Rabbit	8242	CST, США	AB_10859369
p-ERK Rabbit pAb	4370	CST, США	AB_2315112
Фосфо-SAPK/JNK мАнтитело	4668	CST, США	AB_823588
p-p38 Кролик pAb	4511	CST, США	AB_2139682
Набор для окрашивания ROS	S0033S	Бийотай, Шанхай, Китай
Антитела SAPK/JNK	9256	CST, США	AB_2250373
SA-β-gal Kit	C0602	Бийотай, Шанхай, Китай
Набор для тестирования мочевой кислоты	C012-2-1	Цзянчэн, Нанкин, Китай
Набор для обнаружения белков мочевыводящих	C035-2-1	Цзянчэн, Нанкин, Китай
Витамин E	S27812	Юанье Био, Шэньян, Китай
Primer для PCR
Имя гена	Прямой грунт	Реверсная грунтовка
Caspase-1	5'-TACAGAAAGGGTGCTGAACAA-3'	5'-CGGAATAACGGAGTCAAAA-3'
GAPDH	5'-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3'	5'-AAAGGTGGGGGAGTGTGTCG-3'
NLRP3	5'-GATCTTCGCTGCGATCAACAG-3'	5'-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3'