Методическая статья

Выделение альвеолярных эпителиальных клеток типа II из лёгких новорождённых, ювенильных и взрослых мышей, адаптируемых к инфекционным экспериментальным условиям

772 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69581

⸱

19 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Infection Immunology Research Group, Institute of Medical Microbiology and Hospital Hygiene, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 2Immune Regulation Research Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 3Flow Cytometry and Cell Sorting Platform, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Experimental Immunology Department, Helmholtz Centre for Infection Research

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе представлен метод на основе проточной цитометрии для выделения жизнеспособных альвеолярных эпителиальных клеток II типа (AECII) из лёгких новорождённых, ювенильных или взрослых мышей (инфицированных или неинфицированных). Этот подход позволяет проводить молекулярные и/или функциональные исследования AECII в дальнейшем направлении для выявления их роли во время воспаления и инфекции лёгких.

Аннотация

Альвеолярные эпителиальные клетки типа II (AECII) критически вносят вклад в иммунную регуляцию легких и, таким образом, являются ключевыми элементами, координирующими гомеостаз лёгких. Эти функции делают AECII особенно актуальным в контексте инфекции респираторными вирусами, которые поражают нижний эпителий дыхательных путей и нарушают целостность альвеол. Доклинические модели мышей являются важным инструментом для выяснения роли AECII в контексте воспаления лёгких и/или инфекций. Этот протокол представляет собой подробный и воспроизводимый конвейер для выделения жизнеспособных и сильно очищенных AECII из мышиных лёгких на неонатальной, ювенильной и взрослой стадиях. Методология сочетает механическую диссоциацию, ферментативное расщепление и последующее флуоресцентно-активное сортирование клеток (FACS) для получения высокообогащённых популяций AECII, которые доказали свою пригодность для молекулярных и функциональных анализов на следующих этапах. Для приложений, связанных с патогенными вирусами, протокол включает опциональный этап фиксации параформальдегидов (PFA), что обеспечивает безопасное обращение при более низких условиях биобезопасности без ущерба целостности РНК. Благодаря оптимизированному восстановлению клеток на всех этапах развития, обеспечивающей до 1,0 × 106 клеток AECII на взрослое лёгкое, этот протокол поддерживает доклинические исследования, например, патогенез вирусов, функции эпителия и регенеративной способности.

Введение

Благодаря многогранной роли в развитии лёгких, физиологии, иммунитете и процессах восстановления, эпителиальные клетки альвеолярного типа II (AECII) жизненно важны для поддержания и восстановления гомеостаза после повреждения лёгких. Поскольку AECII являются основными клеточными мишенями для пандемических вирусов, таких как вирус гриппа А (IAV) или SARS-CoV-2, их судьба и функции находятся в центре внимания исследований биологии инфекций. В этом контексте предыдущие исследования сообщали, что внутренние (например, генетическийстатус 1,возраст 2,3 года), а также внешние (например, микробныестимулы 4) сигналы оказывают значительное влияние на фенотипы AECII и их реакцию на воздушные триггеры, такие как воздушно-капельные патогены. Примечательно, что воспаление лёгких приводит к устойчивым изменениям в транскриптомном, протеомном и эпигенетическом статусеAECII 5,6. Сложные клеточные взаимодействия AECII внутри лёгких, а также вклад различных биотических и абиотических факторов в биологию AECII подчёркивают важность подходящих in vivo моделей, позволяющих более детально изучать эти клетки.

FACS представляет собой современный золотой стандарт для обогащения и очистки первичных клеток из человеческих и животных тканей, поскольку позволяет одновременно реализовывать мультипараметрический отбор (или исключение) и представляет собой единственный метод, при котором клеточные свойства, такие как размер, гранулярность или автофлуоресценция, могут быть надежно интегрированы в рабочий процесс отбора/исключения. На сегодняшний день несколько опубликованных протоколов предлагают методологии для выделения первичного мышиного AECII на основе FACS. Синха и Лоуэлл представили метод выделения AECII у взрослых мышей, который использует схожий процесс обработки тканей и потоковой цитометрии, а также обогащение AECII до FACS с помощью магнитного истощения на основе шариков на нецелевыхклетках 7. Другой протокол описывает использование магнитной изоляции клеток легких с положительными EpCAM или использование трансгенных мышей, что позволило выделить AECII на основе FACS на основе идентификации SPC-положительных (GFP+) клеток с помощью условной репортерноймыши модели 8. Хотя экспрессия SPC надёжно идентифицирует AECII в мышиных лёгких, эта методика применима только в сочетании с выделенным репортёрным штаммом для мышей, что исключает выделение AECII, например, у диких мышей. Важно, что, хотя сообщались о схожих показателях и чистоте AECII, ни один из этих протоколов не обеспечивал адаптаций для изоляции AECII от неонатальных, ювенильных или инфицированных хозяев.

С этой целью текущий протокол включает набор адаптированных рабочих процессов для выделения высокочистых и жизнеспособных AECII у мышей с помощью ферментативного переваривания в сочетании с FACS. Эта передовая методология основана на ранее разработанном протоколе изоляции AECIIна базе FACS 9 и содержит важные усовершенствования, повышающие чистоту AECII за счёт добавления дополнительных маркеров идентификации и исключения. Важно, что этот обновлённый протокол включает получение AECII с помощью стратегий сортировки «прикасаемых» и «нетронутых». Кроме того, поскольку послеродовое развитие лёгких связано с существенными изменениями в составе клеток и структурной реорганизации, этот протокол включает адаптации для оптимизации извлечения AECII из неонатальных, ювенильных и взрослых легких. Это позволяет изучать биологию AECII во время онтогенеза, например, в контексте созревания лёгких или биологических исследований инфекций. Этот подход может быть использован для получения жизнеспособных AECII для последующего экс виво культивирования и заражения IAV. Кроме того, этот протокол включает процедуру фиксации с использованием химического фиксационного параформальдегида (PFA). Этот этап требует инактивации различных респираторных патогенов (например, SARS-CoV-2, IAV) в суспензиях лёгких клеток, что, в свою очередь, позволяет последующее обращение с образцами (включая выделение AECII на основе FACS) в учреждениях с более низкими биоограничениями. Хотя фиксация на основе PFA исключает последующее культивирование AECII ex vivo для функциональных исследований, она позволяет извлекать значительные количества целостной РНК для транскриптомического профилирования AECII с целью прояснения их биологической роли в контексте респираторных инфекций.

Протокол

Все животные были выведены и содержались в животноводческом центре Центра исследований инфекций имени Гельмгольца в условиях без специфических патогенов (SPF) и в соответствии с национальными и институциональными рекомендациями. Эвтаназия наивных мышей для последующего выделения AECII проводилась в соответствии с национальными рекомендациями Общества лабораторных животных (GV-SOLAS, Gesellschaft für Versuchstierkunde). Использовались самцы мышей с генетическим фоном C57BL/6 в возрасте 2 дней (неонатальный), 3 недели (ювенильные) или 8-12 недель (взрослые). Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка лёгких мыши

  1. Пожертвуйте мышь (следуя официально утверждённым протоколам):
    1. Для взрослых и ювенильных мышей: введите передозировку анестезией (например, кетамином/ксилазином) через внутрибрюшинную инъекцию.
    2. Для новорождённых мышей: обезглавливайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте вывиха шейки матки у взрослых и молодых мышей, так как эта процедура может повредить трахею.
  2. Простерилизуйте шерсть мыши этанолом 70% (v/v).
    ВНИМАНИЕ: Воспламеняющаяся жидкость. Раздражитель глаз. Держитесь подальше от жара. Держите контейнер плотно закрытым и сделайте вентральный средний разрез, чтобы обнажить внутренние органы.
  3. Аккуратно удалите кожу и брюшину.
  4. Эксгвинация мыши, перерезав обе яремные вены и полую вену, позволяя крови оттекать из тела.
  5. Аккуратно удалите диафрагму, чтобы открыть сердце и лёгкие.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить лёгкие. Перфорация легкой ткани значительно затруднит эффективность последующего ферментного переваривания лёгких.
  6. Откройте рёбра ножницами.
  7. Введите канюлю в правый желудочек сердца и введите в неё физиологический раствор, буферированный холодным фосфатом (PBS), пока остаточная кровь не выведет лёгкие и ткань лёгких не станет бледной:
    1. Для взрослых мышей: используйте канюлю на 26 G и перфузируйте лёгкое 10 мл PBS.
    2. Для новорождённых мышей: используйте канюлю на 30 G и перфузируйте лёгкое 1 мл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не перфузируйте лёгкие молодых мышей, чтобы избежать разрыва альвеолярной структуры из-за чрезмерного давления в лёгочных кровеносных сосудах. Перфузия может быть менее эффективна при воспалённых лёгких, а изменение цвета в тканях лёгких может быть менее выраженным. При необходимости перед следующим этапом у взрослых и молодых мышей может быть проведена бронхоальвеолярная промывка.

2. Ферментативное переваривание лёгких тканей

  1. Взрослые и молодые мыши:
    1. Обнажите трахею, удалив слюнные железы и окружающую мышцу.
    2. Введите в трахею канюлю объемом 22 G, уберите иглу и переместите пластиковый катетер к лёгким.
    3. Надёжно обвяжите обе части пряжи вокруг трахеи и катетера, чтобы удерживать её на месте.
    4. Подготовьте ткань лёгких, введя дисспаз.
      ВНИМАНИЕ: Может вызвать аллергию, астму, а также затруднённое дыхание при вдыхании. Избегайте дыхания пылью. Носите защиту для дыхания. Утилизировать содержимое/контейнер на одобренный завод по утилизации отходов.) Через катетер, введённый в трахею:
      1. Для взрослых мышей: вставьте 2 мл диспаза.
      2. Для молодых мышей: вставьте 500 мкл диспазы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте шприц с соединением Luer Slip для облегчения обмена шприцев между шагами 2.1.4 и 2.1.5. Для эффективного ферментативного переваривания ткани легких крайне важно обеспечить полное заполнение бронхоальвеолярных пространств ферментами.
    5. Обменяйте шприц и повторяйте это с низкорасплавленным агарозой (1% (w/v), 45 °C, чтобы сохранить структуру во время обработки.
      1. Для взрослых мышей: используйте 500 мкл агарозы с низким содержанием расплавления.
      2. Для молодых мышей: используйте 200 мкл агарозы с низким содержанием плавления.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать обратного потока жидкости, оставьте шприц прикреплённым.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием: растворите агарозу с низким уровнем расплавления на температуре (95 °C), дайте раствору агарозы остыть до 45 °C, например, в термоблоке.
    6. Накройте лёгкое лабораторной папиросной бумагой и добавьте лед, чтобы агароза затвердела на 2 минуты.
    7. Удалите лёд, папиросную бумагу, шприц и катетер.
    8. Завяжите пряжу, чтобы закрыть трахею, чтобы фермент оставался в нижних дыхательных путях.
    9. Удалите сердце и тимус.
    10. Разрежьте трахею над пряжей и удалите целый лёгкий из груди.
    11. Переместите лёгкое в трубку объёмом 15 мл с предварительно нагретым диспазом (37 °C) и инкубуйте ткань легких в диспазе в течение 45 минут при комнатной температуре (20-25 °C).
      1. Для взрослых мышей: инкубировать лёгкое с дискурсом 2 мл.
      2. Для молодых мышей: инкубировать лёгкое с диспаузой 1,5 мл.
  2. Неонатальные мыши
    1. Собирайте и измельчайте отдельные доли лёгких тонкими ножницами в крышке трубки объемом 2 мл.
    2. Добавьте 500 мкл диспаза, закройте крышку и переверните трубку, чтобы вся ткань была покрыта диспазом.
    3. Инкубировать ткань лёгких в диспейсе при комнатной температуре в течение 45 минут.

3. Подготовка легкой ткани

  1. Для взрослых и молодых мышей:
    1. Извлеките лёгкое из диспанзии и вскрыть доли лёгких от бронхиального стебля.
    2. Поместить доли лёгких в чашку Петри (диаметр: 8,5 см), содержащую 7 мл DMEM + HEPES, 1 мкг/мл (конечная концентрация) анти-CD16/32 блокирующего антитела и 100 мкл ДНКзы (конечная концентрация ~600 единиц Куниц).
      ВНИМАНИЕ: Может вызвать аллергию, астму, а также затруднённое дыхание при вдыхании. Избегайте дыхания пылью. Носите защиту для дыхания. Утилизировать содержимое/контейнер на одобренный завод по утилизации отходов.
    3. Дезинтегрировать ткань лёгких с помощью щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения эффективного ферментативного переваривания лёгких тканей крайне важно обеспечить тщательное механическое разрушение тканей.
    4. Инкубировать 10 минут при комнатной температуре, слегка покачивая при 200 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейку можно хранить при 4 °C до следующего шага, если потребуется.
  2. Для неонатальных мышей:
    1. Переместить диспаз, включая переваренную ткань, в чашку Петри (диаметр: 5,4 см), содержащую 3 мл DMEM + HEPES, 1 мкг/мл (конечная концентрация) анти-CD16/32 блокирующие антитела и 100 мкл ДНКзы (конечная концентрация ~ 600 единиц Куниц).
    2. Инкубировать 10 минут при комнатной температуре, слегка покачивая при 200 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейку можно хранить при 4 °C до следующего шага, если потребуется.
  3. Продолжайте для всех возрастных групп:
    1. Фильтруйте суспензию ячейки через серию нейлоновых сита с уменьшением размера пор (100 мкм - 70 мкм - 40 мкм) для удаления мусора и крупных заполнителей.
    2. Тщательно промывайте сита и трубки клеток, чтобы минимизировать потерю клеток. Если образцы объединяются, клетки мышей из той же группы могут быть проложены через одни и те же клеточные сита.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае закупорки замените сита ячейки.
    3. В зависимости от объёма, отфильтрованную суспензию ячейки перенесите на одну или несколько трубок по 15 мл и центрифугайте суспензию ячейки в течение 12 минут при 140 x g при 4 °C.
    4. Отбросьте супернатант и снова суспензуйте клеточную гранулу в буфере лизиса эритроцитов (ACK-буфер).
      1. Для взрослых и молодых мышей: используйте 2 мл буфера для лизиса эритроцитов и инкубировать в течение 2 минут.
      2. Для новорождённых мышей: используйте 3 мл буфера лизиса эритроцитов и инкубировать в течение 3 минут.
    5. Остановить лиз эритроцитов, заполнив 15 мл трубку DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS и снова центрифугировать на 12 минут при 140 г при 4 °C.

4. Окрашивание антител для сортировки клеток, активируемых флуоресценцией

  1. Суспензировать клетки в растворе для окрашивания антител, содержащем анти-F4/80, анти-CD93, анти-CD11c, анти-CD19, анти-CD31, анти-CD11b, анти-CD16/32, анти-CD45, анти-CD24 и анти-CD326, связанные с фторхромом, в ДМЭМ + HEPES + 10% (v/v) FBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального результата окрашивания используйте только заранее титированные антитела. Если для сортировки клеток необходимо не трогать AECII, не включайте анти-CD326 в раствор для окрашивания антител.
    1. Для взрослых мышей: используйте раствор антител 600 мкл на лёгкое.
    2. Для молодых мышей: используйте раствор антител 400 мкл на лёгкое.
    3. Для новорождённых мышей: используйте раствор антител 200 мкл на лёгкое.
  2. Инкубировать суспензию клетки с помощью антител в течение 10 минут при 4 °C в темноте.
  3. После инкубации промыйте клетки, заполнив пробирку DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS.
  4. Центрифуга на 12 минут при 140 x g при 4 °C.
  5. Подвесьте клетки DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS:
    1. Для взрослых мышей: повторное суспендирование в 300 мкл на лёгкое.
    2. Для молодых мышей: ресуспендировать в 200 мкл на лёгкое.
    3. Для новорождённых мышей: повторная суспензия в 100 мкл на лёгкое.

5. Сортировка AECII

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка приборов: установите сопло диаметром 100 мкм для сортировки AECII с помощью устройства FACS.

  1. Непосредственно перед сортировкой фильтруйте клетки через сито 50 мкм. Промывайте сито с помощью DMEM, дополненного HEPES и 10% (v/v) FBS, чтобы предотвратить чрезмерную потерю клеток:
    1. Взрослые мыши: Промывайте ситечко клетки 300 мкл на лёгкое.
    2. Молодые мыши: Промывайте ситечко клетки 200 мкл на лёгкое.
    3. Неонатальные мыши: Промывайте сито клетки 100 мкл на лёгкое.
  2. Подвесьте клетки с помощью вихря непосредственно перед сортировкой.
  3. Гейт для AECII, определяя события, которые I) имеют высокий боковой рассеяние (SSC высокий), II) отрицательные для фторохромов линии и III) положительные на CD326 фторохром, связанный с антителом к CD326.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте флуорохромы с индексами яркости от высоких до очень высоких (например, APC, PE и BV785) для облегчения различия между не-AECII и AECII. Для неиспользованного подхода сортировки (исключение анти-CD326 в растворе для окрашивания) AECII определяются как клетки с отрицательной линией,SSC с высоким уровнем иаутофлуоресцентными положительными/высокими клетками. Автофлуоресценция AECII может быть выявлена в детекторах зелёного света, например, в детекторах FITC или GFP.
  4. Исключайте дублеты или агрегаты, используя высоту прямого рассеяния по сравнению с ( FSC-H против FSC-A) и боковую высоту рассеяния по сравнению с площадь ( SSC-H против SSC-A).
  5. Соберите отсортированные клетки в пробирку с DMEM, дополненной HEPES и 10% (v/v) FBS и центрифугой для дальнейшего анализа или культуры.

6. Изоляция РНК от фиксированного AECII с PFA (опционально)

ПРИМЕЧАНИЕ: Если AECII необходимо изолировать из мышей, инфицированных, например, респираторными вирусными патогенами, выделение AECII необходимо проводить в условиях BSL2 или BSL3, в зависимости от патогена. Если у экспериментатора нет доступа к сортировке клеток при соответствующих условиях безопасности, AECII, выделенный по описанному выше протоколу, может быть исправлен с помощью PFA после окрашивания антителами. Этот этап инактивируетпатогены 10,11, и поэтому при условиях BSL1 может проводиться последующий цитометрический сортировочный процесс AECII. Хотя клетки больше не могут использоваться для функциональных тестов из-за процесса фиксации, они подходят для молекулярного анализа.

  1. Для инактивации вирусов фиксируйте отдельные суспензии с меткой антителами в 500 мкл 4% (w/v) PFA.
    ВНИМАНИЕ: Горючая твёрдая. Вреден при проглатывании или вдыхании. Вызывает раздражение кожи, серьёзное повреждение глаз. Может вызвать аллергическую кожную реакцию, раздражение дыхательных путей и рак. Подозревается в причинении генетических дефектов. Держитесь подальше от жара. ЕСЛИ ПРОГЛОТИЛИ: Позвоните в ЦЕНТР ОТРАВЛЕНИЯ/врача, если чувствуете себя плохо. ЕСЛИ ВДОХНУТЬ: Выведите человека на свежий воздух и обеспечьте ему комфорт для дыхания. Если почувствуете себя плохо, позвоните в ЦЕНТР ОТРАВЛЕНИЯ или врача. ЕСЛИ В ГЛАЗА: Осторожно промывайте водой несколько минут. Удалите контактные линзы, если они есть и их легко сделать. Продолжайте промывать. ЕСЛИ ВЫ ВОЗДЕЙСТВУЕТЕ ИЛИ БЕСПОКОИТЕСЬ: получите медицинскую консультацию или помощь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с рекомендациями 3R в этом исследовании использовались AECII от неинфицированных мышей. AECII фиксировались на 10 минут при комнатной температуре. Длительность фиксации должна быть измерена индивидуально для каждого патогена, представляющего потенциальную угрозу для человека и окружающей среды. Последующая сортировка при условиях S1 требует предварительной проверки в лаборатории BSL2 или BSL3, что после фиксации PFA нет репликируемого вируса.
  2. После фиксации промывайте клетки с помощью DMEM и центрифугой в течение 15 минут при 140 x g.
  3. Суспензировать клетки в 300 мкл DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS и пропустить суспензию клетки через сито 100 мкм.
  4. Промывайте сито дополнительно 300 мкл DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS-среды, чтобы предотвратить чрезмерную потерю клеток.
  5. Сортируйте клетки, как описано на шаге 5. "Сортировка AECII".
    ПРИМЕЧАНИЕ: После обязательной экспериментальной проверки того, что любой вирус был инактивирован лечением 4% (w/v) PFA, AECII можно сортировать в условиях BSL1.
  6. Для выделения РНК из клеток, фиксированных PFA, используйте набор RNeasy FFPE.
    ВНИМАНИЕ: Этот набор содержит опасные химикаты. Следуйте инструкциям производителя. Обратите внимание на прилагаемый технический лист с соответствующими изменениями:
    1. После сортировки центрифугайте ячейки в течение 15 минут при 140 x g при 4 °C.
    2. Суспензировать клетки в буферном PKD на 150 мкл и перенести в трубку на 1,5 мл.
    3. Добавьте 10 мкл протеиназы K и инкубируем при 56 °C в течение 15 минут, затем инкубировать при 80 °C до 15 минут, в зависимости от количества клеток (см. таблицу 1).
  7. Продолжить процесс изоляции РНК согласно протоколу, включая обработку ДНКазой, этапы промывки и окончательное разведение в воде без РНазы объемом 30 мкл.

Результаты

Описанный здесь протокол представляет собой оптимизированный и детальный метод выделения и анализа AECII из ткани лёгких мышей на различных этапах развития — от неонатальных до ювенильных и взрослых мышей. Методология включает механическую и ферментативную диссоциацию лёгких в сочетании с оптимизированным рабочим процессом цитометрической сортировки клеток потока, используя индивидуальные протоколы, подходящие для обработки образцов от инфицированных животных для последующего сортировки потока в условиях BSL1.

Экспериментальные данные выявили высокую эффективность этой процедуры изоляции (суммированной на рисунке 1) при получении жизнеспособных и высокочистых (>95%) популяций AECII. Сортировка потока породила чистые популяции AECII, при этом анализ после сортировки подтвердил почти 100% специфичность установленных клеточных маркеров (см. рисунок 2). Количественная оценка образцов клеток после сортировки показала высокую выходность от 0,15 × 106 жизнеспособных AECII из неонатальных лёгких и 1,0 × 106 клеток из взрослых образцов на целый препарат лёгких (рисунок 3A). Изолированные AECII сохраняли типичную морфологию (рисунок 3B) и целостность клеток на протяжении всего процесса изоляции (рисунок 3C). Кроме того, применимость протокола для функциональных исследований была подтверждена успешной экс-виво инфекцией с использованием мышиного IAV (H1N1, штамм A/Puerto Rico/8/34), экспрессирующего репортерный белок mCherry (IAV-mCherry12), с демонстрацией способности клеток поддерживать вирусную репликацию (рисунок 4).

Для поддержки экспериментальных рабочих процессов, требующих фиксации образцов, протокол включает специализированный подход к экстракции РНК с использованием фиксации PFA. Тщательное изучение качества РНК из фиксированного ПФА-фиксированного AECII в разные периоды обработки показало, что высококачественная РНК, пригодная для молекулярного анализа, может быть надёжно извлечена из фиксированных образцов (Таблица 1). Качество экстракционной РНК показало прямую связь с продолжительностью термической обработки при 80 °C во время процедуры экстракции, что даёт чёткие рекомендации по оптимизации, основанные на конкретных экспериментальных потребностях (Таблица 1, Рисунок 5). Валидация с помощью количественного анализа обратной транскрипции ПЦР (qRT-PCR) показала успешную амплификацию как домашних генов (рибосомный белок S9, Rps9), так и специфичных для AECII маркеров (поверхностно-активный белок C, Sftpc) с помощью PFA-фиксированных образцов и свежих контрольных препаратов (рисунок 6).

figure-results-1
Рисунок 1: Схематический рабочий процесс выделения AECII из лёгких новорождённых, ювенильных и взрослых мышей с использованием ферментативного переваривания тканей и цитометрической сортировки клеток потоком. Диаграмма иллюстрирует систематическую обработку лёгких мышей разных возрастных групп. Эвтаназия мышей и удаление лёгких сопровождаются многоступенчатой ферментативной пищеварением с диспаузой для распада тканей. После механических нарушений клетки очищаются через серию этапов фильтрации с уменьшением размера пор. Впоследствии эритроциты подвергаются лизированию. Специфическое обогащение AECII достигается за счёт отрицательного отбора с использованием маркировки антител против гемопоэтических маркеров (CD45, CD11b, CD11c, F4/80, CD19, CD16/32), эндотелиального маркера CD31, тромбоцитного маркера CD93 и бронхиального эпителиального клеточного маркера CD24, положительного отбора эпителиальных клеток с использованием метки антител против CD326 и последующего потокового цитометрического сортирования на основе характерноговысокого SSC профиль гранулированного AECII. Этот протокол позволяет выделить высокочистые (≥ 95%) жизнеспособные первичные AECII для дальнейших функциональных и молекулярных анализов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Репрезентативная стратегия гейтинга, используемая для выделения AECII у взрослых мышей. (A) Суспензии лёгких были окрашены антителами против следующих антигенов: F4/80, CD93, CD11c (в связи с APC), а также CD19, CD31, CD11b, CD16/32, CD45, CD24 (в связи с PE) и CD326 (в связи с BV785). (B) повторный анализ (A) для анализа чистоты. Отсортированные AECII были повторно проанализированы для подтверждения чистоты 97,2% AECII. (C) Репрезентативные флуоресцентные микроскопические изображения AECII после сортировки. Ядра были окрашены DAPI (синим цветом). Внутриклеточное окрашивание проводилось с использованием первичного антитела против SPC (вид: кролик), а вторичное окрашивание — с использованием козьего противокроличьего IgG, соединённого с Alexa 594 (красный). AECII, окрашенные только с DAPI и вторичными антителами, а спленоциты с первичными и вторичными антителами служили соответствующими контрольными элементами, указывая на специфическое связывание анти-SPC, а также анти-rabbitAlexa 594. Шкалы: 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигурки.

figure-results-3
Рисунок 3: Выход, морфология и жизнеспособность AECII после сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. (A) Общее количество жизнеспособных AECII на лёгкое, полученное от неонатальных, ювенильных и взрослых мышей. (B) Изображение световой микроскопии сортировки после сортировки AECII. Шкала: 75 мкм. (C) жизнеспособность AECII наблюдается при окрашивании трипана синим после сортировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Экс виво инфекция сортированного AECII IAV-mCherry. Клетки AECII, выделенные из взрослых мышей, культивировались ex vivo в тканевых пластинах с покрытием матригеля на ночь для обеспечения прикрепления. Впоследствии клетки были заражены IAV-mCherry (множественность инфекции 2) в течение 8 часов. Наблюдалось временно-зависимое увеличение интенсивности сигнала mCherry. Шкала масштаба: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: Целостность РНК от 4% PFA фиксирована AECII. Репрезентативные РНК-профили PFA фиксировали и отсортировали AECII после выделения РНК с помощью комплекта Qiagen FFPE RNeasy с модификациями. Специфические пики для 18S и 28S рРНК вместе с числом качества РНК (RQN) отражают целостность и качество РНК для целостных изолированных РНК из фиксированного AECII с PFA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 6: Кривые амплификации гена Rps9 для поддержания и специфического для AECII гена Sftpc из контрольных (нелечённых) и фиксированного AECII с 4% PFA.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

ОбразецВремя инкубации при 80 °C28S/18SRQNРНК конк. [ng/μ]
Управление 0,5x106-2105.8
Управление 1x106-1.91012.3
PFA фиксирован 0,5x106526.45.5
PFA фиксирован 0,5x106101.98.13.7
PFA фиксирован 0,5x106151.88.22.76
PFA фиксировал 1 x106528.26.26
PFA фиксировал 1 x106101.18.45.12
PFA фиксировал 1 x106150.98.55

Таблица 1: Качество РНК, выделенная из 4% фиксированного AECII с PFA — влияние различных времени фиксации. РНК из AECII была выделена согласно протоколу производителя (FFPE RNeasy Kit) с модификациями, описанными на шаге 6. Фиксированные клетки инкубировали при 80 °C в течение 5 минут, 10 или 15 минут для элюции РНК из образца. Целостность РНК была определена с помощью анализатора фрагментов от Agilent

Обсуждение

Оптимизированный протокол, изложенный здесь, обеспечивает надёжный и воспроизводимый подход к выделению и анализу AECII из ткани лёгких мышей в неонатальном, ювенильном и взрослом возрасте. Кроме того, он предоставляет опциональный этап фиксации PFA перед сортировкой, что позволяет отсортировать AECII от мышей в условиях BSL1, даже если они ранее были инфицированы респираторными патогенами. Благодаря сочетанию тщательно проведённого воздействия лёгких и перфузии, а также внутритрахеального введения ферментов и низкоплавящей агарозы в легкое, сохраняется структура тканей, что позволяет восстанавливать высококачественные одноклеточные суспензии для дальнейшего анализа. Добавление потоковой цитометрической сортировки по свойствам бокового рассеяния, отрицательной линии и положительного отбора для CD326-положительных клеток привело к удивительно чистым популяциям AECII. Такая чистота имеет особое значение для того, чтобы молекулярные и функциональные анализы в дальнейшем были характерны для внутренней биологии AECII и не были запутаны загрязнением типов клеток, что повышает интерпретацию исследований экспрессии генов и взаимодействия вируса с хозяином.

Вышеупомянутый протокол предусматривает исключение не-AECII с использованием широкого спектра флуоресцентно маркированных антител, направленных против лейкоцитарных и нелейкоцитарных антигенов, а также последующее положительное отбор AECII через свойства бокового рассеяния и экспрессию специфической для эпителиальной клетки молекулы CD326. Хотя было показано, что эта методология приводит к высокочистым популяциям AECII (с использованием SPC, характерного маркера AECII), чистота полученных популяций до сих пор подтверждается только с помощью постсортировки внутриклеточного окрашивания. Этот протокол может применяться для изоляции AECII от лёгких, инфицированных вирусом SARS-CoV-2 и гриппа, где AECII в первую очередь являются нацелением на вирус и демонстрируют характерные клеточныеадаптации 1. Однако этот метод может быть неуместен для выделения мышиного AECII в рамках биологических исследований рака легких, поскольку EpCAM (CD326) также экспрессируется раковыми клетками лёгких у мышей ичеловека 13. Для этих исследований использование трансгенных штаммов мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки под транскрипционным контролем промотора Spc , может стать более подходящим подходом к надёжному выделению первичного AECII.

Выход 0,15 × 106 жизнеспособных AECII на лёгкое новорождённого и до 1,0 × 106 клеток на взрослое лёгкое иллюстрирует эффективность и масштабируемость протокола. Серьёзным препятствием для успешного выделения больших количества AECII является неэффективное ферментное пищеварение и механическая дезинтеграция ткани лёгких. Поэтому крайне важно обеспечить полное заполнение бронхоальвеолярных пространств ферментом на шаге 2.1.4 и аккуратно провести механическую дезинтеграцию тканей на шаге 3.1.3. Эффективное ферментативное расщепление приводит к мутной суспензии клетки с минимальным вкладом видимых агрегатов, которые обычно можно расщепить с помощью поршня на следующих этапах фильтрации. Крупные агрегаты, которые не могут пройти через клеточное сито, обычно образуются из-за недостаточного ферментативного переваривания. Обратите внимание, что не рекомендуется продлевать время ферментативного пищеварения, так как это может негативно повлиять на последующее иммунное окрашивание14 и, следовательно, на точность выделения AECII на основе FACS.

Помимо эффективности ферментативного и механического распада тканей, генетический фон может влиять на выход AECII. Для этого протокола использовались мыши на фоне C57BL/6. В соответствии с сообщенными различиями по специфике штаммовв развитии 15,иммунологических 16 ифизиологических 17, 18, 19, можно предположить, что использование других лабораторных штаммов мышей (например, BALB/c, DBA) может приводить к различным показателям AECII. Кроме того, выход AECII из воспалённых лёгких (инфекционных или неинфекционных) может значительно снижаться. Это может быть результатом косвенной (воспалительной) или прямой (патогенно-опосредованной) клеточной гибели AECII, которые являются основными мишенями, например, дляIAV 20,21 и SARS-CoV-2 22,23,24.

Сохранение целостности клеток во время механической диссоциации, ферментативного переваривания и сортировки потоков также является ключевым для молекулярных и/или функциональных анализов на следующих этапах. Поэтому жизнеспособность AECII и функция клеток оценивались после сортировки. AECII способны придерживаться Matrigel и поддерживать характерную ламеллярную тело-насыщенную морфологию как минимум 24 часа, что указывает на функциональную компетентность после изоляции и пригодность для экс виво культуры (включая инфекционные модели).

Эффективное заражение отсортированного AECII вирусом IAV-mCherry репортером12 и наблюдение сильной репликации вируса подтверждают эту систему как надёжную платформу для выявления эпителиально-внутренних противовирусных ответов. Поскольку AECII регулируют ключевые процессы, участвующие в биосинтезе ПАВ, регенерации альвеолы и врожденномиммунитете 25,26, возможность изучать кинетику репликации IAV и транскрипционные ответы хозяина в очищенных популяциях AECII даст информацию, недоступную для смешанных клеточных препаратов.

Ключевым новшеством этого протокола является внедрение процедуры фиксации, позволяющей проводить параллельный анализ свежих и инактивированных образцов. Фиксация PFA и адаптированные процессы экстракции FFPE РНК сохраняют целостность РНК в степени, совместимой с последующим транскриптомическим анализом, что подтверждается успешным количественным обратным транскрипционным ПЦР (qPCR).

Время фиксации PFA может повлиять на качество окрашивания и, соответственно, на восстановление AECII с помощью FACS. Кроме того, выход и качество РНК обычно зависят от процессов фиксации. В зависимости от используемой модели инфекции in vivo , эти аспекты необходимо учитывать для экспериментального проектирования. Рекомендуется избегать длительного времени фиксации и вместо этого оптимизировать продолжительность лечения PFA, чтобы использовать минимально необходимое время, что экспериментально доказано как полное инактивирование соответствующего вируса.

Оценка количества рибосомной РНК (рРНК) с помощью микрофлюидического инструмента служит суррогатом для оценки качества мРНК в биологических образцах. Описанный протокол фиксации AECII/изоляции РНК позволяет выделить целую РНК с достаточным качеством для дальнейших транскриптомических анализов, что подтверждается соотношением рРНК 28S/18S >1 и числом качества РНК (RQN) >8. Важно отметить, что этап инкубации при температуре 80 °C критически снижает выход и качество РНК. Адаптация времени термической обработки может быть дополнительно применена для повышения выхода и качества РНК для последующих применений.

В совокупности эти методологические улучшения предоставляют обширный набор инструментов для изучения биологии AECII в контексте здоровья, инфекционных заболеваний и развития (от новорождённого до взрослого). Высокий выход и чистота AECII, выделенных таким подходом, позволяют проводить мультиомическое профилирование, охватывающее транскриптомные, протеомные и хроматиновые тесты доступности, а также функциональные анализы (например, ex vivo инфекция) для дальнейшего анализа релевантных механизмов AECII in vivo.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Татьяне Хирш и Фридерике Крузе за их экспертную техническую помощь, Лизу Хёнике и Жюстин Смут за полезные обсуждения, а также Ёсихиро Каваоку за предоставление вируса IAV-mCherry для репортёров. Это исследование было профинансировано Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) — TRR 359 — проект номер 491676693 (для Д.Б. и Дж.Х.), инициативой COVIPA (KA1-Co-02, Ассоциация Гельмгольца; для Д.Б.) и грантом от Немецкого исследовательского фонда (BO 7036/1-1; J.D.B.). Мы признаём поддержку от Фонда открытого доступа медицинского факультета Университета Отто-фон-Герике в Магдебурге.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ACK буфер--8,29 г NH4Cl, 1 г KHCO3, 200 & micro; L от 0. 5 млн EDTA, добавьте 1000 мл Milli-Q, отрегулируйте pH до 7,2–7,4
антимышиный CD11beBioscience12-0112-83клон M1/70; Сцепленная PE
антимышиный CD11cБиолегенда117310клон N418; Сцепленная БТР
антимышиный CD16/32BD Biosciences553141клон 93; очищен
антимышиный CD16/32BD Biosciences561727клон 2.4G2; Сцепленная PE
антимышиный CD19Биолегенда115508клон 6D5; Сцепленная PE
антимышиный CD24Биолегенда101808клон M1/69; Сцепленная PE
Антимышиный CD31Биолегенда102408клон 390; Сцепленная PE
антимышиный CD326Биолегенда118245клон G8.8; BV785 сцепленная
антимышиный CD45BD Biosciences553081клон 30-F11; Сцепленная PE
антимышиный CD93eBioscience17-5892-82клон AA4-1; Сцепленная БТР
противомышиный F4/80Биолегенда123116клон BM8; Сцепленная БТР
против мышей SPC AbcamAB211326вид-хозяев: кролик; клон: EPR19839; очищен
Aria-FusionBD BiosciencesСортировщик ячеек
Aria-II SORPBD BiosciencesСортировщик ячеек
Бляшка Биозим АгарозаBiozym8401011 % (без победы) в H2O
Клеточное сито (100 и микро; m, 70 и микро; m, 40 и микро; m)BD Falcon352360, 352350, 352340
CellTrics (50 & micro; m)Sysmex04-004-2327
Дезоксирибонуклеаза I из поджелудочной железы крупного рогатого рогатого рогатого скота, 2000 единиц Kunitz/флаконСигма-ОлдричD4263свежерастворимое 1 флакон в 330 и микро; L DMEM
Dispase, 100 мл (5000 казинолитических единиц)Корнинг354235Проведение стерильной фильтрации (размер пор 0,22 и микро; m), подготовить 4 мл аликвоты в трубках по 15 мл, хранить при -20 и градусах; C
DMEMGibco31885-049низкий уровень глюкозы с пируватом добавляют HEPES (конечная концентрация 25 мМ)
FACS DivaBD BiosciencesПрограммное обеспечение для сортировки
FlowJoПрограммное обеспечение для оценки данных FACS
Козла против кроликаAlexa 594 сцепленная
Стационарная канюля Introcan 22GБраун4252098B
Комплект RNeasy FFPEЦягэн73504
Symphony S6 SEBD BiosciencesСортировщик ячеек

Ссылки

  1. Stegemann-Koniszewski, S., et al. Alveolar type II epithelial cells contribute to the anti-influenza A virus response in the lung by integrating pathogen- and microenvironment-derived signals. mBio. 7 (3), (2016).
  2. Kumova, O. K., et al. Severity of neonatal influenza infection is driven by type I interferon and oxidative stress. Mucosal Immunol. 15 (6), 1309-1320 (2022).
  3. Angelidis, I., et al. An atlas of the aging lung mapped by single-cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nat Commun. 10 (1), 963(2019).
  4. Cleaver, J. O., et al. Lung epithelial cells are essential effectors of inducible resistance to pneumonia. Mucosal Immunol. 7 (1), 78-88 (2014).
  5. Boehme, J. D., et al. Epigenetic changes and serotype-specific responses of alveolar type II epithelial cells to Streptococcus pneumoniae in resolving influenza A virus infection. Cell Commun Signal. 23 (1), 278(2025).
  6. Worrell, J. C., et al. Lung structural cells are altered by influenza virus leading to rapid immune protection following re-challenge. Nat Commun. 16 (1), 7061(2025).
  7. Sinha, M., Lowell, C. A. Isolation of highly pure primary mouse alveolar epithelial type II cells by flow cytometric cell sorting. Bio Protoc. 6 (22), (2016).
  8. Chen, Q., Liu, Y. Isolation and culture of mouse alveolar type II cells to study type II to type I cell differentiation. STAR Protoc. 2 (1), 100241(2021).
  9. Gereke, M., et al. Flow cytometric isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells for functional and molecular studies. J Vis Exp. (70), e4322(2012).
  10. Avelin, V., Sissonen, S., Julkunen, I., Österlund, P. Inactivation efficacy of H5N1 avian influenza virus by commonly used sample preparation reagents for safe laboratory practices. J Virol Methods. 304, 114527(2022).
  11. Jureka, A. S., Silvas, J. A., Basler, C. F. Propagation, inactivation, and safety testing of SARS-CoV-2. Viruses. 12 (6), (2020).
  12. Fukuyama, S., et al. Multi-spectral fluorescent reporter influenza viruses (Color-flu) as powerful tools for in vivo studies. Nat Commun. 6, 6600(2015).
  13. Hanssen, A., Loges, S., Pantel, K., Wikman, H. Detection of circulating tumor cells in non-small cell lung cancer. Front Oncol. 5, 207(2015).
  14. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
  15. Soutiere, S. E., Mitzner, W. Comparison of postnatal lung growth and development between C3H/HeJ and C57BL/6J mice. J Appl Physiol. 100 (5), 1577-1583 (2006).
  16. Alberts, R., et al. Gene expression changes in the host response between resistant and susceptible inbred mouse strains after influenza A infection. Microbes Infect. 12 (4), 309-318 (2010).
  17. Kida, K., Fujino, Y., Thurlbeck, W. M. A comparison of lung structure in male DBA and C57 black mice and their F1 offspring. Am Rev Respir Dis. 139 (5), 1238-1243 (1989).
  18. Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
  19. Soutiere, S. E., Tankersley, C. G., Mitzner, W. Differences in alveolar size in inbred mouse strains. Respir Physiol Neurobiol. 140 (3), 283-291 (2004).
  20. Koerner, I., Matrosovich, M. N., Haller, O., Staeheli, P., Kochs, G. Altered receptor specificity and fusion activity of the haemagglutinin contribute to high virulence of a mouse-adapted influenza A virus. J Gen Virol. 93 (Pt 5), 970-979 (2012).
  21. Weinheimer, V. K., et al. Influenza A viruses target type II pneumocytes in the human lung. J Infect Dis. 206 (11), 1685-1694 (2012).
  22. Youk, J., et al. Three-dimensional human alveolar stem cell culture models reveal infection response to SARS-CoV-2. Cell Stem Cell. 27 (6), 905-919.e10 (2020).
  23. Ziegler, C. G. K., et al. SARS-CoV-2 receptor ACE2 is an interferon-stimulated gene in human airway epithelial cells and is detected in specific cell subsets across tissues. Cell. 181 (5), 1016-1035.e19 (2020).
  24. Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904.e8 (2020).
  25. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: Defender of the alveolus revisited. Respiratory Res. 2 (1), 33(2001).
  26. Mason, R. J. Biology of alveolar type II cells. Respirology. 11 (Suppl), S12-S15 (2006).

Перепечатки и разрешения

Теги

IIC
Выделение альвеолярных эпителиальных клеток типа II из лёгких новорождённых, ювенильных и взрослых мышей, адаптируемых к инфекционным экспериментальным условиям
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.