Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Интравитальная двухфотонная визуализация морфологии сенсорных аксонов при прикосновении в коже мыши

846 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69589

⸱

30 декабря 2025 г.

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании представлен метод in vivo двухфотонной визуализации структуры концев аксонов низкопорогового механорецептора (LTMR) в коже передней лапы мышей. Используя повторяющуюся высококачественную визуализацию отдельных аксонов, этот метод предоставляет новую платформу для изучения структуры и функции кожной сенсорной цепи во время развития и у взрослых.

Аннотация

Низкопороговые механорецепторы (LTMR) — это соматосенсорные нейроны, которые обнаруживают безобидные лёгкие стимулы прикосновения, такие как вибрация, отклонение волос и давление. Они образуют аксональные терминалы, специфические для подтипа, на периферии и проецируют аксоны, расположенные в центре к спинному мозгу, передавая тактильную информацию. Современное понимание развития и организации LTMR основано на фиксированных тканях, которые не могут раскрыть динамические и временные процессы аксонального соединения и ремоделирования. Здесь представлен метод двухфотонной визуализации морфологии аксона LTMR в передней лапе мыши во время развития и у взрослых. Двухфотонная микроскопия позволяет получить высококачественную визуализацию внутри целой кожи, что позволяет многократно снимать одни и те же аксоновые терминалы в послеродовых временных точках. Двухфотонная визуализация может сочетаться с новыми генетическими инструментами мышей для выявления развития аксонов с подспецифичностью к подтипу. Хроническая визуализация LTMR позволяет изучать сборку и восстановление схем после травмы. Эти подходы обеспечивают систему in vivo , которая даст новые знания о клеточных механизмах, регулирующих развитие и регенерацию соматосенсорных аксонов.

Введение

Прикосновение — это самое раннее развитое чувство, которое играет центральную роль в том, как организмы воспринимают и реагируют на физический мир. Прикосновение обнаруживается низкопороговыми механорецепторами (LTMR), которые являются подтипами нейронов дорсального корневой ганглии (DRG), обнаруживающих безобидные механические стимулы, включая вмятины, вибрацию и отклонение волос 1,2. LTMR являются псевдоуниполярными и распространяют периферические аксоны в периферические ткани, формируя специфические для подтипа терминалы. Их центральные аксоны передают тактильную информацию центральной нервной системе, формируя синаптические связи с нейронамиспинного мозга 3. Однако способы создания и обслуживания сенсорных цепей плохо изучены.

Более ранние фундаментальные исследования на кошках в 1960-х и 1970-х годах впервые выявили эти функционально отличающиеся механорецепторы и их ответные свойства в волосатой коже 4,5. Подтипы LTMR классифицируются по их уникальной морфологии, скорости проводимости и свойствамотклика 2. Основные подтипы LTMR — это Aβ быстро адаптирующиеся (RA) и медленно адаптирующиеся (SA) LTMR, Aδ-LTMR и C-LTMR 2,6,7. Aβ RA-LTMR, Aδ-LTMRs и C-LTMR образуют продольные ланцетные комплексы вокругволосковых фолликулов 2. Aδ-LTMR образуют поляризованные ланцетные окончания вокруг волосяных фолликулов с хвостовой стороны, что является необходимым для их селективных реакций на отклонение волос7. Аксональные окончания в ланцетных комплексах тесно выровнены с волосковыми стержнями и покрыты пальцевидными отростками терминальных клеток Шванна, которые обеспечивают трофическую поддержку и влияют на аксональныйморфогенез 8,9,10. В голой коже аксоны Aβ RA-LTMR заканчиваются корпускулами Мейснера — яйцевидными структурами, расположенными внутри дермальных сосочков, настроенными на движение по коже 2,11.

Организация аксональных терминалов LTMR регулируется как внутренними программами, так и кожно-зависимыми сигналами в процессеразвития 12,13. При повреждении дисфункция LTMR связана с патологическими состояниями, такими как механическаяаллодиния 12,14. Тем не менее, механизмы развития и поддержания LTMR в целостной коже остаются неясными. Многое из того, что известно об их развитии, связано с фиксированными тканями, которые не могут охватить динамические процессы, происходящие invivo 6,15,16,17,18. Например, Aβ RA-LTMRs и Aδ-LTMR проявляют активную иннервацию вокруг волосяных фолликулов и аксональную обрезку в раннем постнатальномразвитии 19. Как достигается иннервация и поддержание волосяных фолликулов in vivo — остаётся неизвестным.

Двухфотонная лазерно-сканирующая микроскопия — передовая методика визуализации, позволяющая визуализировать флуоресцентно маркированные структуры в живых тканях — позволила осуществлять высококачественную in vivo визуализацию динамических физиологическихпроцессов 20,21. Во время двухфотонной съёмки короткие импульсы ближнего инфракрасного света возбуждают флуорофоры только в фокальной плоскости, ограничивая сигнал небольшим объёмом и минимизируя размытуюфлуоресценцию 21,22. Такое удержание значительно снижает фототоксичность и позволяет проводить трёхмерное, пространственно разрешённое изображение структур 20,23,24. Кроме того, длинные длины волн возбуждения, используемые в двухфотонной микроскопии, меньше рассеиваются внутри тканей, что позволяет глубже проникать и снижать уровень шума в сложныхусловиях 20,25,26. Например, двухфотонная визуализация выявила структурную синаптическую пластичность и нейронную активность в нейронах дорсального рогаспинного мозга 27,28,29. Кроме того, хроническая двухфотонная визуализация волосяных фолликулов in vivo выявила данные об их гомеостазе в коже ушеймыши 23. Поэтому двухфотонная микроскопия хорошо подходит для изучения структур LTMR в коже in vivo, особенно при повторении длительной визуализации для отслеживания изменений в развитии и хронических процессах.

В сочетании с генетически модифицированными линиями мышей, экспрессирующими флуоресцентные репортеры, двухфотонная микроскопия может выявить морфологию нейронов в коже3. В соматосенсорной системе жёлтый флуоресцентный белок (YFP), экспрессируемый под контролем промотора thy1 (Thy1-YFP30), селективно маркирует ланцетные комплексы Aβ-LTMR в волосатой коже и мейсснеровские корпускулы в голой коже30,31. У мышей Thy1-YFP маркированные аксоны положительно выражают миелиновый базовый белок и нейрофиламент, которые являются маркерами миелинизированных Aβаксонов 30,31. Кроме того, TrkBCreER, в котором тамоксифен-индуцируемая Cre рекомбиназа (CreER) обусловлена экспрессией гена TrkB (тропомиозин-рецепторкиназа B), селективно маркирует Aδ-LTMR в процессеразвития 7. В коже двухфотонная микроскопия наиболее эффективна для визуализации LTMR у анестезированных мышей, поскольку движение мыши влияет на получение изображения с высоким разрешением. Визуализация флуоресцентных белков на аксональных концах после экспрессии, вызванной CreER, требуется время, и необходимо определить минимальный период ожидания для каждой трансгенной линии. В целом эта методология может применяться для визуализации LTMR у мышей всех стадий развития и у взрослых.

Этот протокол объясняет процедуры использования двухфотонной микроскопии для изучения морфологии аксонов LTMR на волосатой и голой коже развивающихся и взрослых мышей с высоким разрешением. Протокол включает несколько советов по оптимальной высококачественной и хронической визуализации. Этот интегративный подход позволяет исследовать клеточные механизмы, управляющие сборкой и пластичностью сенсорных аксонов прикосновения in vivo.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с институциональными нормами по уходу за животными и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Вандербильта. Для безопасности экспериментаторов все процедуры проводились с использованием лабораторных халатах, стерильных перчаток и масок. Все инструменты тщательно стерилизовались перед использованием, а все экспериментальные поверхности очищались 70% этанолом до и после каждого эксперимента. Мыши, использованные в этом исследовании, были подростками и взрослыми животными обоих полов и были получены из штаммов Thy1-YFP, TrkB, CreER и Ai140. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка инструментов

  1. Включи лазер. Дайте лазеру достаточно времени на прогрев. В этой работе использовался лазер Chameleon Discovery NX с длительностью импульса 100 фемтосекунд (fs) и частотой повторения 80 ± 0,5 мегагерц (МГц).
  2. Включите двухфотонный микроскоп и откройте программное обеспечение управления и сбора на компьютере.
  3. Включите грелку и установите температуру на 37 °C, чтобы избежать гипотермии во время анестезии.

2. Подготовка анестезии и предней лапы для визуализации

  1. Для индуцирования анестезии поместите мышь в индукционную камеру и установите систему на 3,5% изофлуран до тех пор, пока мышь не потеряет рефлекс выпрямления и не проявит ровное, равномерное дыхание (согласно утверждённым институциональными протоколами). Комнатный воздух используется как носитель и должен быть настроен на 1,0 литра в минуту (л/мин).
  2. Положите мышь на грелку на платформе для визуализации и уменьшите уровень изофлурана до 1,5%, а кислород — до 0,5 л/мин. Изофлуран должен подаваться через носовой конус. Для мышей младше 20-го дня после рождения изофлуран устанавливается на уровне 2-4% для поддержания анестезии. Контролируйте глубину анестезии каждые 10 минут, оценивая потерю педальных и пальпебральных рефлексов, частоту и глубину дыхания, а также общий мышечный тонус.
  3. Чтобы минимизировать артефакты движения во время визуализации, включая дыхательные движения, мышь следует размещать на отдельной сцене от лапы. Для этого протокола тело мыши лежит на платформе, непосредственно прилегающей к платформе, но не касающейся её, где установлена лапа.
  4. Нанесите глазную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время визуализации.
  5. Аккуратно нанесите депиляционный крем на лапу ватной палочкой, чтобы удалить волосы. После того как она постояла на коже минуту, снимите крем и затем очистите лапу мыши 70% этанола и воды.
  6. Аккуратно растяните кожу, чтобы стабилизировать поверхность. Используя стерильную иглу на 30 G и чёрные чернила, аккуратно проколите кожу и сделайте татуировку двумя соседними точками по обе стороны от нужной области изображения. Убедитесь, что точки расположены примерно на расстоянии 2 миллиметров (мм) друг от друга. После завершения татуировки правильно утилизируйте иглу в контейнер для острого изделия.
  7. На стеклянном микроскопическом стекле нанесите четыре точки вакуумной смазки по углам и поместите небольшой кусочек глины (например, DAS Air-Cardening Modeling Clay) толщиной примерно 1 мм в центр затвора. Поместите затвор под объективную линзу и центрируйте лапу мыши прямо на кусочке глины (рисунок 1A,B). Аккуратно прокативайте лапу мыши по слайду, чтобы расплющить её, и вдавить в глину. Аккуратно положите накладку 22 мм x 60 мм поверх лапы, чтобы закрепить затвор. Регулируйте угол наклона кожи мыши, слегка давя на каждый из углов ковлскольза, пока поверхность и кожа не станут параллельны плоскости изображения. Использование мягкой силы во время визуализации помогает предотвратить возможные повреждения кожи.
  8. Для съёмки голой кожи поместите затвор под объективную линзу и центрируйте лапу мыши на затворе, как описано в шаге 2.7. Используйте пинцет, чтобы повернуть лапу так, чтобы гладкая кожа была обращена вверх. Используйте плоский конец пинцета, чтобы аккуратно вдавить лапу в глину. Когда лапа выпрямилась, положите покрытие сверху и нажмите вниз, как описано в шаге 2.7.

3. Двухфотонная микроскопическая визуализация морфологии LTMR

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие параметры можно корректировать в зависимости от конкретного эксперимента. Для этого эксперимента использовался объектив с погружением в воду 20x с числовой диафрагмой 1 и рабочим расстоянием 2,00 мм. Шаги 3.1-3.6 описывают конкретные параметры, используемые для правой передней лапы мышей Thy1-YFP , которые могут служить ориентиром.

  1. Капните каплю дистиллированной воды на каплю, прямо на лапу мыши.
  2. Опустите объективную линзу, пока не образовается водяной столб.
  3. Когда объективная линза находится по центру над лапой мыши, закройте коробку микроскопа и используйте светодиодный экран для фокусировки на образце через контроллеры X, Y и Z. Светодиодный экран показывает живое изображение, подсвечиваемое встроенным светодиодом микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Режим светодиода используется для подтверждения того, что объектив сосредоточен в интересуемом поле перед переходом в двухфотонный режим. Светодиодное изображение показывает поверхностные элементы, такие как кровеносные сосуды и волосяные фолликулы, служа визуальным ориентиром для выравнивания и нацеливания. Татуировки на лапе мыши выглядят чёрными пятнами на LED-экране. Используя эти ориентиры, найдите и сфокусируйтесь на области между чёрными пятнами. Это обеспечивает повторное изображение одной и той же области лапы мыши.
  4. Когда образец найден, выключите светодиодный экран. Для проведения двухфотонной визуализации ткани переключите микроскоп с режима зеркала на дихроическую режим, перевернув рычаг на верхней правой стороне микроскопа.
  5. Закройте занавески и включите детектор, чтобы визуализировать YFP.
  6. Используя Prairie View, откройте затвор и переключите программное обеспечение в режим изображения. Для визуализации Thy1-YFP включите настраиваемый лазер, установленный на 960 нанометров (нм) с усилением 700-800. При визуализации GFP установите настраиваемый лазер на 920 нм.
    1. Для мышей на 10-й день или младше установите начальную мощность лазера на 50, увеличивая до достижения желаемой интенсивности сигнала. Такая низкая начальная мощность лазера минимизирует проникновение света и риск фотоповреждения. После того как длина волны, усиление и мощность лазера установлены, начинайте сканирование.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для захвата изображения с высоким разрешением 1,00x поля зрения или изображения корпускул Мейснера на голых кончиках пальцев рекомендуется использовать изображение размером 1024 x 1024 с полем обзора 601,9 мкм x 601,9 мкм и пикселем 0,588 мкм x 0,588 мкм. Для изображения ланцетных концов вокруг волосяных фолликулов рекомендуется иметь размер изображения 1024 x 1024 при увеличении 8,00x, поле зрения 75,2 мкм x 75,2 мкм и пиксель 0,147 мкм x 0,147 мкм. Важно отметить, что поле зрения изображения и размер пикселя меняются в зависимости от настройки масштабирования.
  7. Используйте контроллеры X, Y и Z, чтобы найти поле изображения, отрегулировать масштаб по необходимости и начать захват изображений. Оптимальное изображение обычно получается в исходном положении примерно на 10-20 мкм под поверхностью кожи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение волосатой кожи с высоким разрешением обычно имеет шаг 1 мкм или 2 мкм с примерно 40-120 срезами. В то же время высокоразрешающее изображение голой кожи обычно имеет шаг от 2 мкм до 4 мкм с примерно 80-100 срезами. Это приводит к типичному z-диапазону 100–250 мкм, а общая максимальная глубина изображения составляет примерно 300 мкм.
  8. Сеанс визуализации будет ограничен 25 минутами, чтобы минимизировать длительность воздействия изофлурана и снизить риск побочных эффектов, связанных с анестезией, для животного. Лишний изофлуран поглощается баллоном для угольного фильтра для анестезии, который можно выбросить в обычный мусор.

4. Послеоперационный уход

  1. Уберите лапу мыши из стеклянного затвора и верните мышь в клетку для восстановления.
  2. Держите клетку для мыши тёплой на грелке, пока она полностью не восстановится после анестезии.
  3. Поместите мышь обратно в домашнюю клетку, наблюдая за ней ещё 30 минут, чтобы убедиться, что мышь интегрируется с соседями по клетке.

5. Хроническая визуализация морфологии LTMR in vivo

  1. Поместите мышь под двухфотонный микроскоп, следуя шагам 2.4-3.3.
  2. С помощью светодиодного экрана найдите чернильные точки с предыдущей сессии съёмки. Ориентируйте экран между точками, чтобы убедиться, что нужная область будет зафиксирована. Во время режима сканирования на микроскопе проверяйте ориентиры, такие как крупные нервы или узоры волосяных фолликулов, чтобы определить одну и ту же область.
  3. После обнаружения области изображения следуйте шагам 3.4-3.6, чтобы продолжить съёмку.
  4. Проверьте качество и интенсивность изображений, а также морфологию основных аксонов, полученную двухфотонным возбуждением кожи. Убедитесь, что поля изображения сопоставимы с теми, что были сделаны во время предыдущей сессии съёмки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этой работе использовалась двухфотонная микроскопия для визуализации аксональных структур Aβ RA-LTMR и Aδ-LTMR в коже во время развития и у взрослых. Зрелые ланцетные окончания, встречающиеся у мышей примерно на 20-й день и старше, полностьюразвиты 19,32. Общая организация концев аксона в волосатой коже взрослых мышей была показана в проекции максимальной интенсивности (рисунок 2A). Глубину и форму этих терминалов аксонов можно оце...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это исследование демонстрирует использование двухфотонной микроскопии для изучения морфологии LTMR на целой коже новорождённых и взрослых мышей. Этот продольный подход к визуализации преодолевает ограничения фиксации тканей и позволяет в реальном времени наблюдать аксональные структуры целостных тканей. Аксональные морфологии Aβ RA-LTMR и Aδ-LTMR, визуализированные с помощью двухфотонной визуализации, соответствуют наблюдениям из предыдущих фиксированных PFAтканей...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не сообщают о релевантных раскрытиях.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить доктора Ханну Элам, доктора Снигду Мукерджи, Рашель Лариви и доктора Теги Дж. Вадаккан за всю их поддержку и помощь в ходе этого исследования. Благодарим Райана Майкла Нуэру за помощь в организации системы изофлурана. Эта работа поддерживается стипендией Ханны Грей Медицинского института Говарда Хьюза (грант# GT17518).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
объектив 20x объектив и приборная панель; Super NA 1.0Олимп1-U2B965Двухфотонный микроскоп
Скольжение крышки 22x60VWR16004-330Двухфотонный микроскоп
Аэрозатвердевающая глина для моделированияDASДвухфотонный микроскоп
Воздушный насос для анестезии (HF), 110 ВRWD Life Science Inc.R510-30Система Изофлуран
Концентрическая маска для анестезииRWD Life Science Inc.R510-MСистема Изофлуран
Камера для индукционной анестезии и панель; Мышь и крысаRWD Life Science Inc.V105Система Изофлуран
Bruker Ultima Investigator плюс лазерный сканирующий микроскопBruker Nano, Inc. Двухфотонный микроскоп
Бабочковые иглыFisher Scientific1484041Двухфотонный микроскоп
Chameleon Discovery NX с TPC: DualКогерентный1385777Двухфотонный микроскоп
Конусная маска с трубками для неонатальных мышейRWD Life Science Inc.68680Система Изофлуран
Двойные эмиссионные фильтры (et525/70m и et595/50m) и t565lpxr  Дихроический расщепитель лучаNikonINVP-01Двухфотонный микроскоп
Набор эпифлуоресцентного фильтра ET-GFP ET470/40x и ET252/50m; дихроичный T495LPXR Nikon518065Двухфотонный микроскоп
ЭтанолDecon Laboratories Inc.Двухфотонный микроскоп
Подогревающая площадка для дальнего инфракрасного диапазона с контроллером (питание переменного тока)Кент СайентификRT-0515Двухфотонный микроскоп
Детекторы GaAsp (2) Hamamatsu Photonics HED-UP-2 Двухфотонный микроскоп
Канистры газовых фильтровRWD Life Science Inc.R510-31-6Система Изофлуран
Смазка с высоким вакуумомСигма ОлдричZ273554Система визуализации
Изофлуран, USP (250 мл)Пирамаль в центре критической терапии6679-017-25Система Изофлуран
Лазерная крышка и bbsp;Teco TechnologyСистема визуализации
Мыши: B6.129S6(Cg)-Ntrk2tm3.1(cre/ERT2)Ddg/JJAX27214
Мыши: B6. Cg-Igs7tm140.1(tetO-EGFP,CAG-tTA2)Hze/JJAX30220
Мыши: B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/JРека Чарльз3709
Крем для удаления волос NairAmazon28001Двухфотонный микроскоп
Исходные файлы данныхЗенодо10.5281/zenodo.17370834
Жёсткая подставка с большим прямоугольным держателем для вставокТорлабыMP15MДвухфотонный микроскоп
Платформа для анестезии мелких животныхRWD Life Science Inc.R510-PGLСистема Изофлуран
Мазь для глаз с смазкой успокаивающаяБауш + ЛомбДвухфотонный микроскоп
Микроскопические стекли Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15Двухфотонный микроскоп

Ссылки

  1. Abraira, V. E., Ginty, D. D. The sensory neurons of touch. Neuron. 79 (4), 618-639 (2013).
  2. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  3. Meltzer, S., Santiago, C., Sharma, N., Ginty, D. D. The cellular and molecular basis of somatosensory neuron development. Neuron. 109 (23), 3736-3757 (2021).
  4. Burgess, P. R., Petit, D., Warren, R. M. Receptor types in cat hairy skin supplied by myelinated fibers. J Neurophysiol. 31 (6), 833-848 (1968).
  5. Iggo, A., Muir, A. R. The structure and function of a slowly adapting touch corpuscle in hairy skin. J Physiol. 200 (3), 763-796 (1969).
  6. Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
  7. Rutlin, M., et al. The cellular and molecular basis of direction selectivity of Aδ-LTMRs. Cell. 159 (7), 1640-1651 (2014).
  8. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
  9. Handler, A., et al. Three-dimensional reconstructions of mechanosensory end organs suggest a unifying mechanism underlying dynamic, light touch. Neuron. 111 (20), 3211-3229 (2023).
  10. Yamamoto, T. The fine structure of the palisade-type sensory endings in relation to hair follicles. J Electron Microsc (Tokyo). 15 (3), 158-166 (1966).
  11. Cauna, N., Ross, L. L. The fine structure of Meissner's touch corpuscles of human fingers. J Biophys Biochem Cytol. 8 (2), 467-482 (1960).
  12. Olson, W., Dong, P., Fleming, M., Luo, W. The specification and wiring of mammalian cutaneous low-threshold mechanoreceptors. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (3), 389-404 (2016).
  13. Koutsioumpa, C., et al. Skin-type-dependent development of murine mechanosensory neurons. Dev Cell. 58 (20), 2032-2047 (2023).
  14. Duan, B., Cheng, L., Ma, Q. Spinal circuits transmitting mechanical pain and itch. Neurosci Bull. 34 (1), 186-193 (2018).
  15. Botchkarev, V. A., Eichmüller, S., Johansson, O., Paus, R. Hair cycle-dependent plasticity of skin and hair follicle innervation in normal murine skin. J Comp Neurol. 386 (3), 379-395 (1997).
  16. Peters, E. M. J., et al. Developmental timing of hair follicle and dorsal skin innervation in mice. J Comp Neurol. 448 (1), 28-52 (2002).
  17. Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3 (4), 389-395 (2003).
  18. Liu, Q., et al. Molecular genetic visualization of a rare subset of unmyelinated sensory neurons that may detect gentle touch. Nat Neurosci. 10 (8), 946-948 (2007).
  19. Meltzer, S., et al. A role for axon-glial interactions and Netrin-G1 signaling in the formation of low-threshold mechanoreceptor end organs. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (43), e2210421119(2022).
  20. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  21. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  22. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  23. Pineda, C. M., et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nat Protoc. 10 (7), 1116-1130 (2015).
  24. Kamei, R., Urata, S., Maruoka, H., Okabe, S. In vivo chronic two-photon imaging of microglia in the mouse hippocampus. J Vis Exp. (185), e64104(2022).
  25. Rompolas, P., Mesa, K. R., Greco, V. Spatial organization within a niche as a determinant of stem-cell fate. Nature. 502 (7472), 513-518 (2013).
  26. Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 23 (12), 3139-3149 (2006).
  27. Ahanonu, B., Crowther, A., Kania, A., Rosa-Casillas, M., Basbaum, A. I. Long-term optical imaging of the spinal cord in awake behaving mice. Nat Methods. 21 (12), 2363-2375 (2024).
  28. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760(2012).
  29. Matsumura, S., Taniguchi, W., Nishida, K., Nakatsuka, T., Ito, S. In vivo two-photon imaging of structural dynamics in the spinal dorsal horn in an inflammatory pain model. Eur J Neurosci. 41 (7), 989-997 (2015).
  30. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  31. Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 88 (10), 582-595 (2012).
  32. Luo, W., Enomoto, H., Rice, F. L., Milbrandt, J., Ginty, D. D. Molecular identification of rapidly adapting mechanoreceptors and their developmental dependence on Ret signaling. Neuron. 64 (6), 841-856 (2009).
  33. Neubarth, N. L., et al. Meissner corpuscles and their spatially intermingled afferents underlie gentle touch perception. Science. 368 (6497), eabb2751(2020).
  34. Bai, L., et al. Genetic Identification of an Expansive Mechanoreceptor Sensitive to Skin Stroking. Cell. 163 (7), 1783-1795 (2015).
  35. Griffin, J. W., Thompson, W. J. Biology and pathology of nonmyelinating Schwann cells. Glia. 56 (14), 1518-1531 (2008).
  36. Tsai, P. F., Chou, F. P., Yu, T. S., Lee, H. J., Chiu, C. T. Depilatory creams increase the number of hair follicles, and dermal fibroblasts expressing interleukin-6, tumor necrosis factor-α, and tumor necrosis factor-β in mouse skin. Korean J Physiol Pharmacol. 25 (6), 497-506 (2021).
  37. Bourane, S., et al. Low-threshold mechanoreceptor subtypes selectively express MafA and are specified by Ret signaling. Neuron. 64 (6), 857-870 (2009).
  38. Jung, Y., Ng, J. H., Keating, C. P., Senthil-Kumar, P., Zhao, J. Comprehensive evaluation of peripheral nerve regeneration in the acute healing phase using tissue clearing and optical microscopy in a rodent model. PLoS One. 9 (4), e94054(2014).
  39. Gangadharan, V., et al. Neuropathic pain caused by miswiring and abnormal end organ targeting. Nature. 606 (7912), 137-145 (2022).
  40. Huang, S., Rompolas, P. Two-photon microscopy for intracutaneous imaging of stem cell activity in mice. Exp Dermatol. 26 (5), 379-383 (2017).
  41. Meleshina, A. V., et al. Multimodal label-free imaging of living dermal equivalents including dermal papilla cells. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 84(2018).
  42. Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

LTMRin vivo
Интравитальная двухфотонная визуализация морфологии сенсорных аксонов при прикосновении в коже мыши
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.