Method Article

Выделение и количественная оценка аксональных мРНК с помощью пористых мембранных вставок и RTddPCR

DOI:

10.3791/69601

⸱

February 6th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Rutgers University- Newark, 2College of Arts & Sciences, Boston University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании представлен надёжный метод выделения аксональных мРНК с помощью пористых мембранных вставок, позволяющий полностью разделять нейроны и нейриты и очищать РНК. В сочетании с RTddPCR этот подход позволяет абсолютную количественную оценку транскриптов с низким уровнем копирования, облегчая исследования транспорта мРНК и локального перевода с высокой чувствительностью, воспроизводимостью и широкой экспериментальной применимостью.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пространственная динамика локализации и трансляции мРНК внутри нейронов необходима для различных механизмов функции нейронов, включая нейронную связность, синаптическую пластичность и реакцию на повреждения. Из-за экстремальной полярности нейронов многие из этих функций зависят от способности аксонов локально переводить определённые транскрипты. Однако количественная оценка этих субклеточных РНК популяций остаётся технически сложной. Здесь мы описываем воспроизводимый подход к получению отдельных соматических и аксонально обогащённых компартментов из культивированных нейронов грызунов, а также для количественной оценки специфической экспрессии мРНК. Первичные эмбриональные или взрослые нейроны грызуна культивировались на вставках с пористой мембраной размером 1–3 мкм. Эти мембраны допускают только аксоны, позволяя физически разделять соматический и аксональный компартменты. РНК затем отдельно изолировали из всего нейрона и фракций, обогащённых аксонами, которые затем использовались для цифровой ПЦР с каплями обратной транскриптазы (RTddPCR) с геноспецифическими праймерами. Эта система обеспечивает абсолютное количественное сравнение субклеточных компартментов, обеспечивая высокочувствительное обнаружение локализованных транскриптов. Этот подход измеряет количество устойчивого РНК и облегчает изучение изменений аксональной РНК со временем в ответ на нейротрофические факторы, стресс или модели травм. Сочетание физической компартментализации и анализа RTddPCR снижает перекрёстное загрязнение и даёт точное количество копий редких транскриптов, обеспечивая высокую чувствительность, воспроизводимость и обнаружение мРНК с низким числом копий, контролирующих рост и регенерацию аксонов. Этот метод также работает с последующим тестом, такими как измерение синтеза белка, изучение стабильности РНК и проведение экспериментов по возмущению с использованием siRNA или препаратов, блокирующих определённые белки. Важно, что эту технику можно адаптировать для различных подтипов нейронов, стадий развития или моделей травм. В целом этот подход является гибким, чувствительным и воспроизводимым способом изучения молекулярной основы локализации аксональной мРНК и того, как она влияет на функцию нейронов и механизмы заболевания.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейроны — одни из самых структурно сложных и поляризованных клеток в биологии. У них длинные процессы, которые иногда могут достигать расстояний более метра. Эта полярность усложняет клеточную коммуникацию и гомеостаз белков по-разному. Усовершенствованный подход к удовлетворению этих требований — транспортировать мРНК в удалённые компартменты, такие как аксоны и дендриты, что облегчает их трансляцию регулируемым образом в ответ на локализованныесигналы 1,2,3. Локальная трансляция позволяет акзонам синтезировать белки пространственно-временно. Этот процесс имеет решающее значение для развития аксонов, синаптической пластичности, регенерации после травмы и реакции на развивающиеся и внеклеточныестимулы 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Способность анализировать функции локализованных мРНК в аксонах имеет решающее значение для понимания их роли как в нормальной нейронной работе, так и в контексте патофизиологии. Дисрегуляция трансляции аксональной мРНК связана с различными нейродегенеративнымизаболеваниями 16, такими как боковой амиотрофический склероз (ALS)17,18,19, спинномозговая мышечная атрофия (SMA)20,21 и болезнь Альцгеймера (AD)22. Аксональная регенерация после повреждения во многом зависит от быстрого и точного перевода цитоскелетных белков, сигнальных молекул ирецепторов 3,23,24,25,26,27,28. Несмотря на эти новые концепции, дисциплина по-прежнему сталкивается с трудностями в эффективном количественном определении и захвате популяций мРНК, специфичных для аксонов.

Одна из задач аксональной транскриптомики — добиться чистого разделения сомы и аксонов. Поскольку большинство мРНК обогащены сомой, даже небольшое количество загрязнения организма клетки может повлиять на результаты оценки аксонального содержания конкретной мРНК. Традиционные методы, включая микрофлюидныекамеры 29, 30, 31, 32 или камерыКампено 33, обеспечивают направленный рост аксонов и чёткое разделение между двумя компартментами, но выход аксонов может быть слишком низким для биохимических исследований, таких как секвенирование объёмной РНК (RNA-seq), коиммунопреципитация РНК с последующим секвенированием РНК или количественная полимеразная цепная реакция (qPCR). Объёмные РНК-секвенции и qPCR, какими бы полезными ни были, часто не обладают достаточной чувствительностью для точного выявления малокопируемых транскриптов в аксонах, что приводит к неправильной оценке физиологически значимых видов.

Для решения этих проблем мы и другие использовали проницаемые мембранные вставки для физического разделения аксонов исомат 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41. Эти вставки позволяют нейронам развиваться на микропористой поверхности, и аксоны могут проникать в нижний компартмент через них, но не в сому. Эта базовая, но эффективная архитектура позволяет культивировать огромное количество нейронов с чётким физическим разделением сома и аксонов. Мембранный метод важен, поскольку он избегает технических проблем, связанных с микрофлюидными устройствами, и даёт большое количество аксонального материала, который можно использовать для молекулярных и биохимических исследований. Система вставок также простая в использовании при таких вещах, как механические повреждения, что делает её полезной во многих экспериментальных ситуациях, связанных с нейровосстановлением. Описанный здесь метод дополнительно оптимизирует выход и чистоту нейронов за счёт уточнения условий культуры, корректировки пор мембраны и внедрения цифровой ПЦР на основе обратной транскриптазы (RTddPCR) для образцов аксональных РНК с низким выходом.

Также важно убедиться, что аксональные фракции чисты. Мы извлекаем аксоны из нижней камеры только после аккуратного удаления остатков соматического материала с верхней поверхности. Валидация праймеров показывает сильное обогащение аксональных маркеров и отсутствие или незначительное соматическое количество маркеров. Молекулярное подтверждение подтверждает это различие: аксональные фракции обогащаются распознанными аксональными мРНК, такими как Gap43, и более низкой экспрессией Actγ42. Это показывает, что система вставки производит образцы аксонов с незначительным содержанием сомы, что хорошо подходит для дальнейшего изучения.

После выделения обогащённых аксональных фракций следующая задача — измерить мРНК, существующие в крайне малых количествах копий. Небольшой исходный материал из аксональных фракций и наличие мРНК с низким количеством копий в аксонах расширяют пределы чувствительности традиционной обратной транскриптазной количественной ПЦР (RT-qPCR), которая использует стандартные кривые для количественной оценки. Кроме того, RT-qPCR также не предоставляет абсолютные номера копий конкретной выписки. RTddPCR, напротив, разделяет образцы кДНК на тысячи капель, что помогает получить точное количество транскриптов с помощью статистики Пуассона. Это позволяет надёжно находить транскрипты, даже если в одном нанограмме общейРНК 5,6,7,43 может быть всего несколько копий транскриптов.

В этой рукописи мы предлагаем упрощённый подход, включающий методы культивирования различных взрослых или эмбриональных нейронов грызунов на вставках, выделения РНК из целых нейронных и аксонально обогащённых компартментов, проверку чистоты аксонов и абсолютную количественную оценку копий мРНК на основе RTddPCR. Эти методы можно использовать для определения уровней специфических мРНК, которые локализуются на аксоны при базальных условиях, а также для их изменения при аксотомии или в ответ на стимуляцию факторов роста или нейротоксичные сигналы. Комбинируя этот метод с белковыми ко-иммунопреципитациями, можно также оценить динамику рибонуклеарных белковых комплексов (RNP) в аксонах. Например, мы широко применяли этот метод для изучения мРНК, которые присутствуют в аксональных белко-связывающих белки 1 (G3BP1), активирующих Рас ГТПазу. G3BP1 является ключевым компонентомстресс-гранул 44, и наши предыдущие исследования показали, что он ингибирует синтез аксональных белков и, в свою очередь, блокирует как регенерацию аксонаЦНС 5, так и ЦНС. Кроме того, этот метод может быть использован для изучения роли дисрегуляции трансляции аксонов в различных патофизиологических состояниях, включая БАС, СМА и АД.

Цель данного исследования — создать и протестировать метод измерения аксональных мРНК, который был бы чувствительным, воспроизводимым и масштабируемым. Объединяя культуры на основе компартментированных вставок с количественной оценкой на основе RTddPCR, мы предлагаем этой области решение постоянных проблем аксональной транскриптомики. Эта методология не только позволит сделать важные открытия в области локального трансляции, но и создаст основу для трансляционных исследований, сосредоточенных на терапевтических вмешательствах в нейрорепарации и нейродегенерации.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка вставок для посева ячеек

  1. Разместите вставки с подходящим размером пор в пластину на 6 лунок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пору 1 мкм для разделения аксонов от сомы и 3 мкм для разделения всех нейритов (аксонов и дендритов) от сомы.
  2. Добавьте 100 мкг/мл поли-L-лизина (PLL) на пластину с 6 лунками так, чтобы она соприкасалась с нижней частью вставок и с верхней частью вставок (2 мл/скважина и 1 мл/вставку).
  3. Инкубировать ночь при 37 °C.
  4. Промывайте колодцы (снизу вставок) и верх стельков стерильной ультрачистой водой — 4 промывания × 5 минут.
  5. Только для нейронов дорсального корневого ганглия (DRG) добавьте 5 мкг/мл ламинина (2 мл/хорошо и 1 мл/вставку) и инкубировать не менее 1 часа при 37 °C. Убедитесь, что верхняя и нижняя части вставки равномерно покрыты.
  6. Промывайте стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) (pH 7,4), содержащим 100 U/mL пенициллина/стрептомицина — 2 промывания × 5 минут.
  7. Проведите диссекция и семя около 1 × 106 клеток/вставку для эмбриональныхкортикальных 5, гиппокампа45 и базальных холинергических нейронов переднегомозга 31,32. Для взрослых крыс DRG — пластинка 6-8 DRG/вставка 5,7 (рисунок 1).

2. Сбор нейронных субклеточных фракций из 6-колодцевых вставок

  1. Аликвот по 250 мкл TRIzol в микроцентрифугной трубке объёмом 1,5 мл на вставку и по одной яме/вставке пластины с 6 яками. Отложи это в сторону.
  2. В другую пластину с 6 лунками добавьте 2 мл на скважину стерильного PBS. Количество колодцев и пластин должно быть пропорционально числу вставок.
  3. Аспирировать посевные материалы сверху и снизу вставки и перенести её на пластину с 6 лунками с PBS.
  4. С помощью щипца аккуратно положите вставку и добавьте 2 мл PBS сверху вставку. Аспирировать среду сверху и снизу вставки и повторять. Всего постирайте дважды с помощью PBS и оставьте в свежем PBS (1 мл и 2 мл сверху и снизу вставки соответственно).
  5. Изоляция всей дроби нейрона
    1. Используя стерильный скребок для клеток, соскребьте всю фракцию нейрона (верхнюю часть вставки). Приложите ровно такое давление, чтобы клетки начали отходить, но мембрана не разрушалась (рисунок 1).
    2. Соберите весь нейрон из вставка и перенесите его в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл.
    3. Центрифугуйте трубку при 10000-15000 г на 2 минуты.
    4. Отбросьте супернатант и подвесьте лизат в 250 мкл тризола.
    5. Обозначите эту трубку как долю целого нейрона.
    6. Продолжайте сбор нейритных фракций.
  6. Выделение нейритной фракции
    1. Возьмите стерильную ватную палочку и одним концом очень медленно двигайтесь зигзагом сверху вниз по всей стороне нейрона. Поверните вставку на 90 градусов и повторите процесс с другим концом тампона (если используется двусторонний тампон, или новый тампон для одностороннего). Отбросьте этот мазок (рисунок 1).
    2. Используйте новый тампон и двигайтесь по концентрическим кругам, начиная с середины вставки и выходя наружу. Обязательно очистите стены (окружность).
    3. Переверните мембранную вставку (нейритная сторона вверх) и разрежьте мембрану новым стерильным лезвием скальпеля, удерживая щипцем. Обязательно оставляйте ~2-3 мм на периферии.
    4. Поместите разрезанную мембрану в пластину с 6 лунками, содержащую тризол, с нейритной стороной вниз. Убедитесь, что она погружена под воду.
    5. Соберите TRIzol с нейрит-лизатом из шести-луночной пластины и перенесите в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
  7. Для целых нейронов и нейритных лизатов приступайте к выделению РНК или сохраняйте лизаты при -80 °C для последующей обработки.

3. Изоляция и количественная оценка РНК

  1. Изоляция РНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой части всегда работайте в условиях без РНазы с специализированной, стерильной пластиковой посудой и перчатками.
    1. Добавьте 0,2 мл хлороформ на 1 мл ТРИзола, энергично встряхивайте 15 секунд и инкубируем 2-3 минуты при комнатной температуре. Центрифугу при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C для разделения на слои: органические, межфазные и водные (содержащие РНК).
    2. Перенесите верхнюю водную фазу в новую трубку, избегая межфазы. Чтобы осадить РНК, добавьте 1 объём изопропанола и аккуратно перемешайте. Инкубировать 10 минут при комнатной температуре (или дольше при -20 °C для большего урожая) для осаждения РНК. Центрифуга при 12 000 × г в течение 10 минут при 4 °C до гранулирующей РНК.
    3. Сбросьте супернатант и промой гранулы с 1 мл этанола 75%. Кратковременный вихрь и центрифуга при 7 500 × г в течение 5 минут при 4 °C.
    4. Растворение РНК: Аккуратно удалите этаноловую жидкость и сушите гранулы на воздухе в течение 5-10 минут, чтобы избежать полной сухости. Суспензируйте гранулу в небольшом объёме воды без РНазы или в 1x буфере Tris-EDTA (TE), инкубируйте при температуре 55-60 °C для полного растворения. Храните очищенную РНК при -80 °C.
  2. Количественная оценка РНК с помощью анализа RiboGreen
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ RiboGreen (ниже) использует флуоресцентный краситель, специфичный для нуклеиновых кислот, обеспечивающий более высокую чувствительность, специфичность и способность обнаруживать целую РНК по сравнению с методами поглощения УФ. Рассмотрите обработку ДНКазой, если существует проблема загрязнения ДНК.
    1. Подготовьте 1x TE буфер, разведите предоставленный 20x TE буфер в 20 раз водой без РНаз. Подготовьте рабочие растворы RiboGreen и защитите светочувствительный краситель фольгой. Разбавьте концентрированный краситель в 1:200 в 1x TE для высокодиапазонного анализа (10 нг/мл-1 мкг/мл) или 1:2000 в 1x TE для низкочастотного анализа (2,5 нг/мл-50 нг/мл). Подготовьте стандарты РНК последовательно разбавляя стандарт РНК из набора в 1x TE для покрытия ожидаемого диапазона выборок. Выпускайте стандарты в трёх экземплярах.
    2. Подготовьте образцы, разбавляя образцы РНК в 1x TE, чтобы соответствовать динамическому диапазону анализа. Запускайте образцы в три экземпляжа.
    3. Добавьте равные объёмы рабочего раствора RiboGreen и стандарт или образец РНК (например, по 100 мкл каждому). Инкубировать 2-5 минут при комнатной температуре, защищая от света. Измерять флуоресценцию с помощью соответствующих параметров (возбуждение ~500 нм, излучение ~525 нм). Измерьте и вычтите пустое измерение реагента (1x TE + краситель RiboGreen).
    4. Анализ и количественная оценка: постройте стандартную кривую, используя флуоресцентные значения стандартов по сравнению с их концентрациями. Используйте эту кривую для определения концентрации РНК в образцах (рисунок 2).

4. Синтез кДНК

  1. Разморозить все компоненты на льду. Аккуратно перемешайте каждую трубку, щёлкая и ненадолго прокрутив вниз перед использованием. В ПЦР-трубке на льду комбинируйте следующие компоненты для каждой реакции:
    RT мастер-микс (5x): 4 мкл
    Выборка РНК: переменная (до 1 мкг общего объёма РНК)
    Вода без нуклеаз: до 20 мкл общего объёма
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля без шаблонов (NTC) замените образец РНК на воду без нуклеаз.
  2. Аккуратно перемешайте и прокрутите трубки, чтобы собрать содержимое внизу, и запустите программу термоциклера.
    Отжиг грунтовки: 25 °C в течение 2 минут
    синтез кДНК: 55 °C в течение 10 минут
    Отключение тепла: 95 °C в течение 1 минуты

5. Проектирование и валидация грунтовки

ПРИМЕЧАНИЕ: Дизайн праймера RTddPCR обычно следует тем же принципам, что и количественная qPCR, но требует дополнительного внимания для чёткого разделения положительных и отрицательных капель. Используйте инструменты для проектирования грунтов от NEB, IDT или ThermoFisher для облегчения этого процесса. Успешный RTddPCR тест определяется высокой специфичностью и устойчивой амплификацией, что создаёт чёткое разделение между амплифицированными (положительными) и неамплифицированными (отрицательными) каплями. Для проектирования праймеров ПЦР использовались следующие идентификаторы доступа NCBI RefSeq:

Actg: NM_001127449.1
Вперед 1: CAGTCTAACAGGGGGGGAAAG
Обратная сторона 1: CCAACTCAAGGCAAGTAACAAC
Длина ампликона: 98
Вперед 2: GTAGTGATCTGTGCAGGGTATT
Реверс 2: GACTTTCCCCCCCCCTGTTAGAC
Длина ампликона: 118

Gap43: NM_017195.3
Форвард 1: GGAAATTCTTGCACTGTACCC
Реверс 1: GACTCCTCAGAACGGAACAT
Длина ампликона: 122
Вперед 2: CAGTCATCTTGGGAAATTCTTGC
Обратная сторона 2: CATTGCACACACACACTTGG
Длина ампликона: 116

  1. Разработайте праймер с рекомендуемой длиной 18-30 пар оснований и содержанием GC 40-60%. Убедитесь, что температура плавления (Tm) находится в диапазоне от 55 до 65 °C, а прямой и обратный праймеры находятся в пределах 2-5 °C друг от друга. Включите зажим GC, одну или две основы G или C в последние пять оснований на 3′-конце, чтобы повысить специфичность связывания, но избежать длинных серий G или C.
  2. Проверьте специфику праймера с помощью инструментов выравнивания, таких как базовый инструмент локального поиска (BLAST) Национального центра биотехнологической информации (NCBI), чтобы гарантировать, что праймеры связываются только с целевой последовательностью. Проектные ампликоны размером от 50 до 200 базовых пар, при этом ~100 базовых пар являются оптимальными, так как короткие продукты усиливаются эффективнее, оставаясь при этом отличаемыми от праймер-димеров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании короткие продукты ПЦР обычно усилены с более высокой эффективностью, чем более длинные при RT-ddPCR.
  3. Минимизировать праймерные димеры, проектируя праймеры с содержанием 50-60% GC, избегая вторичных структур и комплементарности 3'. Во время валидации праймера используйте электрофорез агарозного геля и всегда используйте контроль без шаблона для оценки праймерных димеров.
  4. Избегайте проектирования праймеров в областях шаблона с высокой вероятностью формирования вторичных структур, так как это может повлиять на эффективность усиления.

6. RTddPCR

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте систему QX200 ddPCR (Bio-Rad) для проведения RTddPCR согласно инструкциям производителя и как ранее описано Das et al. (2022)43, с некоторыми незначительными корректировками для повышения воспроизводимости анализа.

  1. Подготовьте реакции RTddPCR с универсальной смесью ddPCR с использованием соответствующих кДНК.
  2. Генерируйте капли с помощью генератора капель.
  3. Читайте флуоресценцию конечной точки с помощью считывателя капель и анализируйте данные с помощью встроенного программного обеспечения.
  4. Применять следующие меры контроля качества для обеспечения точной количественной оценки и воспроизводимого образования капель:
    1. Запускайте наборы праймеров последовательно в одной строке или столбце, чтобы минимизировать эффект пластин.
    2. Подготовьте мастер-миксы для уменьшения пипетирования небольших объёмов.
    3. Пипетки с низкой скоростью расхода для предотвращения пузырьков и использование многоканальных пипеток для равномерного разлива образцов.
    4. Аккуратно обращайтесь с пластинами после образования капель и сразу герметизируйте, чтобы предотвратить испарение.
    5. Готовьте все реакции на льду и избегайте повторяющихся циклов замораживания и оттаивания реагентов.
    6. Включите элементы контроля без шаблонов для каждого набора праймеров для мониторинга загрязнения.
    7. Исключить из анализа скважины, содержащие менее 10 000 допустимых капель.
    8. Выполните технические реплики для всех образцов для обеспечения воспроизводимости.
  5. Ручная проверка графиков амплитуды флуоресценции капель для проверки точности автоматического порогового определения.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичные кортикальные нейроны эмбрионального грызуна, гиппокамповые нейроны и BFCN, покрытые PLL-покрытыми вставками диаметром 1 мкм, надёжно прилипают и растягивают нейриты через мембрану на 5-7 дней in vitro (DIV). К 11 DIV культуры демонстрируют плотные сети. Для взрослых крысиных DRG нанесение слоя ламинина на вставки с покрытием PLL диаметром 3 мкм помогает достичь сопоставимого аксонального расширения на 5 DIV. Эти наблюдения подтверждают способность вставок поддерживать долгосрочный рост нейронов и обеспечивать достаточное количество аксонального материала для дальнейшей экстракции РНК. В случае необходимости масштабировать мы объединяем несколько вставок, чтобы обеспечить достаточно материала.

Экстракция TRIzol из отдельных вставок даёт достаточную РНК для обратной транскрипции и последующего ddPCR. Количественная оценка RiboGreen подтверждает стабильную выходность РНК из целых нейронных фракций (212,85 нг/вставку) и меньшие выходы из нейритных фракций (42,75 нг/вставку) (рисунок 2). Обычно мы получаем ~5-7-кратную РНК из всей нейронной фракции по сравнению с нейритно-обогащённой фракцией.

Все праймеры проходят валидацию перед экспериментами RTddPCR. Для каждого целевого транскрипта упорядочиваются и тестируются как минимум два набора праймеров с помощью обычной ПЦР на кДНК, полученной из тех же образцов нейронов. Для RTddPCR выбирается пара праймеров, дающая самый сильный и специфический диапазон (рисунок 3A). Например, мы выбрали набор праймеров 1 для Gap43. В случаях неоднозначных результатов, например, полученных для Actγ, мы проводим градиентное ПЦР для оптимизации температур отжига (рисунок 3B). Это гарантирует, что для абсолютной количественной оценки используются только хорошо проверенные праймеры, снижая вероятность артефактов при разделении капель.

Процедура соскребания и стирания мазков надёжно разделяет соматические и невритовые компартменты. РНК, выделенная из всех нейронных фракций, демонстрирует обогащение транскриптов, таких как Actγ 46,47,48,49 (рисунок 4). В отличие от этого, фракции аксон/нейритов дают значительно меньший общий объём РНК, что соответствует их ограниченному объёму, но демонстрируют обогащение транскриптов, известных локализацией на дистальных процессах, таких как Gap43 (рисунок 4). Минимальное перекрёстное обнаружение сомат-ограниченных транскриптов указывает на высокую компартментальную чистоту при аккуратном обращении с вставками и пластинами с оптимальной плотностью.

Положительные результаты характеризуются: (1) нетронутой морфологией нейронов с чётким аксональным расширением, (2) чистым разделением компартментов без разрыва мембраны, (3) валидированными праймерами, обеспечивающими чёткое разделение положительных и отрицательных капель, и (4) сильными RTddPCR-сигналами для аксонных транскриптов. Неоптимальные эксперименты приводят к низкой выходности РНК, перекрёстному загрязнению, подтверждаемому сома-маркерами в нейритных фракциях, или артефактам RTddPCR, таким как увеличение количества капель «дождя» из-за димеризации праймера. Эти проблемы чаще всего связаны с повреждением мембраны вставка, чрезмерным давлением скребка или недостаточной оптимизацией температуры отжига грунтовки.

Рисунок 1
Рисунок 1: Обзор отделения отделения РНК с использованием мембранных вставок. Грызуновые нейроны культивировались на полупроницаемых вставках с размером пор 1-3 мкм, что позволяет нейритному расширению при ограничении сомы. Для подготовки целого нейрона клетки из верхнего компартмента соскребли стерильным скребком, гранулировали, а затем лизировали в TRIzol для выделения РНК, синтеза кДНК и RTddPCR. Остатки клеточного обломка удалялись из мембраны вставки стерильной ватной палочкой. Для приготовления нейритов мембрана-вставка, теперь содержащая только нейриты, была перевернута и разрезана лезвием скальпеля и погружена непосредственно в TRIzol, после чего проводилась выделение РНК, синтез cDNA и RTddPCR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой рисунка.

Рисунок 2
Рисунок 2: Стандартная кривая концентрации РНК с использованием анализа RiboGreen. (A) Интенсивность флуоресценции измерялась с помощью количественного анализа РНК RiboGreen по серии разбавления стандартов РНК. Линейный регрессионный анализ выявил сильную корреляцию между концентрацией РНК и сигналом флуоресценции (R² = 0,9956). Значение R², близкое к одному, демонстрирует отличную линейность и надёжность анализа RiboGreen для точной количественной оценки РНК. (B) Используя уравнение (y=19,738x + 14,905) для наклона, полученного в A, была рассчитана общая РНК для каждой дроби. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Валидация праймера с помощью ПЦР и электрофореза агарозного геля. (A) Продукты амплификации ПЦР с использованием кДНК для Actγ и Gap43 были разрешены на 2% агарозном геле для оценки специфичности праймера. Для каждого гена тестировались два независимых набора праймеров (набор 1 и набор 2). Маркеры размера ДНК (лестницы) отображаются в соседних полосах с указанием молекулярных масс (10 кб, 0,5 кб, 0,1 кб). Отдельные отдельные полосы ожидаемого размера подтверждают успешное усиление и специфичность выбранных наборов праймеров. (B) ПЦР-амплификация проводилась с использованием праймера Actγ 2 по температурному градиенту (55-65 °C) для определения оптимальной температуры отжига. Амплифицированные продукты были выделены на 2% агарозном геле вместе с ДНК-лестницей (полоса 2, указанные размеры). В исследованном диапазоне наблюдались стабильные одиночные полосы ожидаемого размера, при этом самое сильное усиление было обнаружено при 55 °C, что указывает на оптимальную температуру для этого набора праймеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: RTddPCR-анализ выбранных транскриптов и количественная оценка копий мРНК. (A,B) Репрезентативные одномерные амплитудные графики, показывающие разделение капель для (A) Actγ и (B) Gap43. Каждая точка представляет собой одну каплю: синие капли указывают на положительное усиление, а серые — отрицательное. Ось Y обозначает амплитуду, а ось X — позицию ямы в пластине ddPCR. Чёткое разделение между положительными (синими) и отрицательными (серыми) капельями подтверждает надёжное обнаружение целевых транскриптов с указанными наборами праймеров. (C) Таблица, суммирующая количество копий/мкл и копий на приём общей РНК для транскриптов Actγ и Gap43 в целых нейронных и нейритных фракциях. Оценки количества копий были получены на основе абсолютной количественной оценки с использованием подсчёта капель ddPCR (показано в панелях A, B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для воспроизводимости решаются несколько шагов. Покрытие вставка должно быть однородным, чтобы способствовать адгезии нейронов; Неполное покрытие приводит к плохому росту невритов и аксонов. Плотность клеточного покрытия не менее важна, поскольку чрезмерная плотность увеличивает скрещивание дендритов, тогда как разрежённое покрытие даёт недостаток аксональной РНК. Последовательность соскребания и мазка должна выполняться с точностью: слишком малое давление оставляет соматическое загрязнение, а слишком большое давление рискует повредить вставку.

Валидация праймера представляет собой ещё один критический этап. Запуск двух независимых наборов праймеров для каждого транскрипта позволяет выбрать наиболее надёжную пару, а градиентная ПЦР может дополнительно уточнить температуры отжига. Эта практика снижает образование праймер-димеров, повышает прозрачность капель и обеспечивает воспроизводимую количественную оценку между биологическими репликами. Хотя этот подход обеспечивает высокую компартментальную чистоту, следовое загрязнение соматическими материалами полностью исключить нельзя. Выход аксональной РНК по своей природе низкий, что ограничивает область анализов, требующих больших затрат, таких как полное секвенирование транскриптома. Критическим ограничением этого метода является неспособность решить локализацию транскрипта внутри дистальных и проксимальных аксонов. Хотя при определённых условиях наблюдались глиальные или эндотелиальные расширения через поры мембраны, наша система культуры минимизирует эту возможность. Во взрослых культурах DRG добавление цитозина β-D-арабинофуранозида (Ara-C)5,7 и использование безсывороточных сред для других нейронных культур (корковых, гиппокампальных и BFCN)5,45 эффективно ограничивает пролиферацию глиальных и эндотелиальных клеток. Кроме того, жёсткие поликарбонатные или полиэтилентерефталатные (PC/PET) мембраны, используемые здесь, являются неэластичными и не пропускают активную миграцию клеток. Кроме того, мы используем вставки размером пор размером 3 мкм для культур DRG, чтобы обеспечить проход аксонов крупного диаметра. В отличие от этого, для кортикальных или BFCN-культур используются вставки размером 1 мкм пор, что дополнительно ограничивает миграцию глии. Эти свойства отличают нашу систему от микроустройств на базе PDMS, которые поддерживают миграцию эндотелий через гибкие поры. В соответствии с предыдущими отчетами 34,35,36,40, молекулярная валидация в данном исследовании подтверждает сильное обогащение аксональных транскриптов (например, Gap43) и незначительное обнаружение соматических маркеров (например, Actγ), что подтверждает нейронную специфичность материала, проходящего через мембрану. Поскольку физическое ограничение не полностью устраняет миграцию глии, исследователи также должны использовать Gfap как отрицательный маркер.

По сравнению с микрофлюидными устройствами, система вставок проще, масштабируема и совместима с рутинными рабочими процессами культуры. Он избегает специализированного оборудования, но при этом позволяет воспроизводить разделение аксона и сомы. Объединяя вставки с RTddPCR, этот метод обеспечивает как доступность, так и высокую чувствительность, позволяя абсолютную количественную оценку транскриптов, которые часто находятся ниже порогов обнаружения qPCR. Этот протокол хорошо подходит для изучения изменений в локализации аксонального транскрипта, оценки локальной трансляции в ответ на развивающиеся, нейротоксичные или травмирующие стимулы, а также для изучения дефектов транспорта РНК, связанных с нейродегенеративными заболеваниями или нейроразвитием. Будущие усовершенствования могут включать мультиплексированную RTddPCR для одновременной количественной оценки нескольких мРНК или интеграцию с низковходными методами секвенирования РНК для расширения покрытия транскриптома. Кроме того, адаптация этой системы для нейронов, полученных от iPSC, может расширить её применение для моделирования заболеваний и регенеративных исследований.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PKS обладает патентами США на использование пептида G3BP1 с проницаемым клетками для регенерации аксонов и нейродегенерации. Остальные авторы не заявляют о конфликте интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Центра периферической нейропатии и регенерации нервов Меркина (для P.K.S.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Вставки для клеточной культуры для пластин с 6 ячелинами, 1.0  μ m Размер пор, стерильныйКорнинг353102Расходные материалы
Вкладыши для клеточной культуры для пластин с 6 ячелинами, 3.0  μ m Размер пор, стерильныйCELLTREAT230603Расходные материалы
Клетка-лифтер с узким лезвиемVWR76036-006Расходные материалы
CELLSTAR с 6 колодцями Пластины для культуры тканейVWR82050-842Расходные материалы
ddPCR 96-Колодцевые пластины Био-радиация12001925Расходные материалы
ddPCR считыватель капель масло  Био-радиация1863004Реагенты
Картриджи DG8 для генератора капель QX200/QX100Био-радиация1864008Расходные материалы
ЛамининGibco/Fisher Scientific23017-015Реагенты
LunaScript RT SuperMix KitNEBE3010LРеагенты
Микропластины для флуоресцентных, 96-колодцевых, чёрныхТермо ФишерM33089Расходные материалы
Термоуплотнение ПЦР-пластины, фольга, проколываемаяБио-радиация1814040Расходные материалы
Поли-лизинSigmaP1274Реагенты
Термоциклер PTC Tempo 96Био-радиация12015382Оборудование
Программное обеспечение QuantaSoftБио-РадПрограммное обеспечение для анализа данных ПЦР
Количественный набор для анализа реагента RiboGreen и РНК-анализаТермо ФишерR11490Реагенты
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixБио-радиация1864034Реагенты
Масло для генерации капель QX200 для EvaGreenБио-радиация1864005Реагенты
Генератор капель QX200Био-радиация17005227Оборудование
Считыватель капель QX200Био-радиация17005228Оборудование
Реагент TRIzolИнвитроген15-596-026Реагенты

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Agrawal, M., Welshhans, K. Local translation across neural development: A focus on radial glial cells, axons, and synaptogenesis. Front Mol Neurosci. 14, 717170(2021).
  2. Dalla Costa, I., et al. The functional organization of axonal mRNA transport and translation. Nat. Rev. Neurosci. 22 (2), 77-91 (2021).
  3. Sahoo, P. K., Smith, D. S., Perrone-Bizzozero, N., Twiss, J. L. Axonal mRNA transport and translation at a glance. J. Cell Sci. 131 (8), (2018).
  4. Alber, S., et al. PTBP1 regulates injury responses and sensory pathways in adult peripheral neurons. Sci Adv. 9 (30), eadi0286(2023).
  5. Sahoo, P. K., et al. Disruption of G3BP1 granules promotes mammalian CNS and PNS axon regeneration. Proc Natl Acad Sci. 122 (9), e2411811122(2025).
  6. Sahoo, P. K., et al. A Ca2+-dependent switch activates axonal casein kinase 2α; translation and drives G3BP1 granule disassembly for axon regeneration. Curr Biol. 30 (24), 4882-4895.e6 (2020).
  7. Sahoo, P. K., et al. Axonal G3BP1 stress granule protein limits axonal mRNA translation and nerve regeneration. Nat Commun. 9 (1), 3358(2018).
  8. Terenzio, M., et al. Locally translated mTOR controls axonal local translation in nerve injury. Science. 359 (6382), 1416-1421 (2018).
  9. Van Erp, S., et al. Age-related loss of axonal regeneration is reflected by the level of local translation. Exp Neurol. 339, 113594(2021).
  10. Zahavi, E. E., et al. Repeat-element RNAs integrate a neuronal growth circuit. Cell. 188 (16), 4350-4365.e22 (2025).
  11. Rajgor, D., Welle, T. M., Smith, K. R. The coordination of local translation, membranous organelle trafficking, and synaptic plasticity in neurons. Front Cell Dev Biol. 9, 711446(2021).
  12. Oliveira, M. M., Klann, E. A deep dive into local mRNA translation in neurons. Proc Natl Acad Sci. 118 (45), e2117116118(2021).
  13. Sun, C., et al. The prevalence and specificity of local protein synthesis during neuronal synaptic plasticity. Sci Adv. 7 (38), eabj0790(2021).
  14. Castillo, P. E., Jung, H., Klann, E., Riccio, A. Presynaptic protein synthesis in brain function and disease. J Neurosci. 43 (45), 7483-7488 (2023).
  15. Younts, T. J., et al. Presynaptic protein synthesis is required for long-term plasticity of GABA release. Neuron. 92 (2), 479-492 (2016).
  16. Nagano, S., Araki, T. Axonal transport and local translation of mRNA in neurodegenerative diseases. Front Mol Neurosci. 14, 697973(2021).
  17. Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nat Commun. 12 (1), 6914(2021).
  18. Bar Avi, O., Perlson, E. Navigating the pathways: Tar-DNA-binding-protein-43 aggregation, axonal transport, and local synthesis in amyotrophic lateral sclerosis pathology. Neural Regen. Res. 20 (10), 2921-2922 (2025).
  19. Ionescu, A., Altman, T., Perlson, E. Looking for answers far away from the soma-the (un)known axonal functions of TDP-43, and their contribution to early NMJ disruption in ALS. Mol. Neurodegener. 18 (1), 35(2023).
  20. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: The role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
  21. Rehorst, W. A., et al. Muscle regulates mTOR dependent axonal local translation in motor neurons via CTRP3 secretion: Implications for a neuromuscular disorder, spinal muscular atrophy. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 154(2019).
  22. Twiss, J. L., Buchanan, C. N. Regulation of subcellular protein synthesis for restoring neural connectivity. Int J Mol Sci. 26 (15), 7283(2025).
  23. Gomes, C., et al. Axonal localization of neuritin/cpg15 mRNA is limited by competition for HuD binding. J Cell Sci. 130 (21), 3650-3662 (2017).
  24. Lee, S. J., et al. hnRNPs interacting with mRNA localization motifs define axonal RNA regulons. Mol Cell Proteomics. 17 (11), 2091-2106 (2018).
  25. Lee, S. J., et al. Selective axonal translation of the mRNA isoform encoding prenylated cdc42 supports axon growth. J Cell Sci. 134 (7), jcs251967(2021).
  26. Merianda, T. T., et al. Axonal amphoterin mRNA is regulated by translational control and enhances axon outgrowth. J Neurosci. 35 (14), 5693-5706 (2015).
  27. Patel, P., et al. Intra-axonal translation of Khsrp mRNA slows axon regeneration by destabilizing localized mRNAs. Nucleic Acids Res. 50 (10), 5772-5792 (2022).
  28. Smith, T. P., Sahoo, P. K., Kar, A. N., Twiss, J. L. Intra-axonal mechanisms driving axon regeneration. Brain Res. 1740, 146864(2020).
  29. Huang, N., Sheng, Z. H. Microfluidic devices as model platforms of CNS injury-ischemia to study axonal regeneration by regulating mitochondrial transport and bioenergetic metabolism. Cell Regen. 11 (1), 33(2022).
  30. Ionescu, A., Perlson, E. Microfluidic neuromuscular co-culture system for tracking cell-to-cell transfer and axonal transport of labeled proteins. Methods Mol Biol. 2431, 145-161 (2022).
  31. Dasgupta, S., et al. Cortical brain injury causes retrograde degeneration of afferent basal forebrain cholinergic neurons via the p75NTR. eNeuro. 10 (8), (2023).
  32. Dasgupta, S., Pandya, M. A., Friedman, W. J. Microfluidic cultures of basal forebrain cholinergic neurons for assessing retrograde cell death by live imaging. Bio-protoc. 15 (1), e5149(2025).
  33. Bi, J., Tsai, N. -P., Lin, Y. -P., Loh, H. H., Wei, L. -N. Axonal mRNA transport and localized translational regulation of κ-opioid receptor in primary neurons of dorsal root ganglia. Proc Natl Acad Sci. 103 (52), 19919-19924 (2006).
  34. Hirai, T., et al. Aberrant plasticity of peripheral sensory axons in a painful neuropathy. Sci Rep. 7 (1), 3407(2017).
  35. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
  36. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat Cell Biol. 10 (2), 149-159 (2008).
  37. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  38. Brown, K. C., et al. An experimental protocol for the Boyden chamber invasion assay with absorbance readout. Bio Protoc. 14 (15), e5040(2024).
  39. Willis, D. E., Twiss, J. L. Profiling axonal mRNA transport. Methods Mol Biol. 714, 335-352 (2011).
  40. Zheng, J. -Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21 (23), 9291-9303 (2001).
  41. Shigeoka, T., et al. On-site ribosome remodeling by locally synthesized ribosomal proteins in axons. Cell Rep. 29 (11), 3605-3619.e10 (2019).
  42. Sun, Y., Joyce, P. A. Application of droplet digital PCR to determine copy number of endogenous genes and transgenes in sugarcane. Plant Cell Rep. 36 (11), 1775-1783 (2017).
  43. Das, A., Das, D., Panda, A. C. Quantification of circular RNAs using digital droplet PCR. J Vis Exp. (187), e64464(2022).
  44. Desai, M., Gulati, K., Agrawal, M., Ghumra, S., Sahoo, P. K. Stress granules: Guardians of cellular health and triggers of disease. Neural Regener Res. 21 (2), 588-597 (2026).
  45. Agrawal, M., et al. Restoring DSCAM expression rescues neuronal morphology and axon guidance deficits in Down syndrome. bioRxiv. , (2025).
  46. Bassell, G. J., et al. Sorting of β-actin mRNA and protein to neurites and growth cones in culture. J Neurosci. 18 (1), 251-265 (1998).
  47. Moradi, M., et al. Differential roles of α-, β-, and γ-actin in axon growth and collateral branch formation in motoneurons. J Cell Biol. 216 (3), 793-814 (2017).
  48. Willis, D. E., et al. Extracellular stimuli specifically regulate localized levels of individual neuronal mRNAs. J Cell Biol. 178 (6), 965-980 (2007).
  49. Zhang, H. L., et al. Neurotrophin-induced transport of a β-actin mRNP complex increases β-actin levels and stimulates growth cone motility. Neuron. 31 (2), 261-275 (2001).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Axonal mRNA IsolationPorous Membrane InsertsDroplet Digital PCRNeuronal CompartmentalizationRNA QuantificationLocal Protein SynthesisNeurite FractionGrowth Cone AnalysisRNA LocalizationSynaptic Plasticity

Related Articles