Методическая статья

Кровь клещей, подаваемая через искусственную мембрану на 3D-печатной камере в исследованиях иксодидных клещей

796 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69606

⸱

20 марта 2026 г.

 , 
1Department of Entomology, University of Arizona, 2Department of Entomology, Kansas State University

В этой статье

Краткое содержание

Этот метод характеризует разработку системы кормления кровью клещей in vitro , включающей камеру на 3D-принтере и лабораторно изготовленную силиконовую мембрану. Система позволяет искусственно кормить клещей, легко отбирая пробы на различных этапах кормления и используя небольшие объёмы крови, что является бесценным инструментом для изучения иксодидовых клещей.

Аннотация

В этой работе представлен подробный протокол системы кормления клещей через искусственную силиконовую мембрану с использованием 3D-печатной камеры, созданной из высокоразрешающей фотополимерной смолы. Метод включает проектирование камеры кормления, подготовку силиконовой мембраны, сборку системы и оптимизацию условий для кормления клещей. Клещи являются одними из ведущих переносчиков заболеваний в Соединённых Штатах и во всём мире. Исследования клещей необходимы для разработки эффективных стратегий профилактики и снижения заболеваемости клещами. Как обязательные гематофагные эктопаразиты, клещи должны питаться кровью, чтобы выживать и таким образом передавать болезни, что делает кормление кровью фундаментальным процессом при изучении взаимодействия переносчика и хозяина, передачи патогенов, а также биологии, физиологии и анатомической морфологии клещей. Системы кормления клещей с силиконовой мембраной широко используются и совершенствуются за последние несколько десятилетий. Однако многие существующие системы адаптированы под один вид клещей, жизненный этап или определённый набор условий. Система питания клещей, описанная в этом протоколе, успешно использовалась для получения как частично кормленных, так и полностью набухших образцов из нескольких важнейших видов переносчиков клещей в США, включая Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis и Rhipicephalus sanguineus . Система показала успех в начале кормления взрослых особей Dermacentor variabilis и нимфальной A. americanum, при этом самые высокие показатели кормления (>85%) наблюдались у взрослых особей A. americanum. В результате пищевая камера, разработанная в этом исследовании, адаптирована для использования с небольшим объёмом разной крови, до 100 мкл, что имеет решающее значение для передачи патогенов и токсикологических исследований. Прозрачная крышка с минимальной высотой камеры облегчала наблюдение за клещами в течение длительного кормления клещей.

Введение

Клещи — это облигатные эктопаразиты, питающиеся кровью, которые могут переносить и передавать широкий спектр патогенов, включая бактерии, вирусы и паразитов, вызывающих болезни у животных и людей по всемумиру 1,2,3,4. Будучи ведущим переносчиком заболеваний в США, уступая только комарам востальном мире (2,3,5), несколько видов клещей могут передавать патогенно-ассоциированные заболевания, а другие виды также известны тем, что вызывают неинфекционные заболевания, такие как синдром альфа-гал (AGS, также известный как аллергия на красное мясо), о котором в последние годы всё чаще сообщают по всему миру 6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Исследования, направленные на понимание биологии, физиологии, генетики и компетенции переносчиков клещей, необходимы для разработки стратегий по снижению экономической и общественной нагрузки как инфекционных, так и неинфекционных заболеваний, передающихся клещами. Изучение взаимодействия клещей и хозяина часто требует частично кормления или полностью набутых клещей для решения конкретных исследовательских вопросов. Это можно достичь с помощью кормления живыми животными, позволяя клещам пройти полный жизненныйцикл 17. Хотя использование живых животных для кормления клещей очень эффективно для развития и содержания колонийклещей (18,19), реализация может быть сложной и может быть неприменима ко всем исследовательским гипотезам из-за ограничений по доступности хозяев и регулирования объектов. Самое главное — успешная реализация систем кормления клещей in vitro помогает сократить использование живых животных, что является важной целью в исследованиях в рамках программы «Альтернатива использования животных (3R)» (замена, сокращение, уточнение)20.

Существует множество преимуществ использования искусственных систем кормления клещей с помощью мембраны в исследованиях, предоставляющих широкие возможности для решения широкого круга научных вопросов. Их можно обобщить в три группы; (1) оценка влияния на вариацию крови хозяина и взаимодействие между переносчиком и хозяином с использованием различных источников крови, таких как производство альфа-гал клещей во времякормления 21, (2) оценка токсичности акарицида через доставку соединений вместе скровью 22 и восстановление соединений, выделяемых клещами при кормлениикровью 23, (3) оценка компетентности переносчика через доставку патогенов путем естественного приобретения во время кормлениякровью 24, 25, 26, 27 и другие. Кроме того, особенность системы искусственного мембранного кормления позволяет проводить масштабные испытания различных методов обработки и концентраций без внесения вариаций, связанных с хозяином, в малых масштабах и объёмах, что снижает потребность в живых животных.

Системы питания клещей через искусственные мембраны широко используются в исследованиях и для поддержки разведения клещей 19,28,29, в некоторых случаях позволяя завершить длительный жизненный цикл клеща 30,31. Было представлено множество протоколов по оптимизации систем кормления клещей и их материалов для различных видовклещей 32,33,34. Тем не менее, хорошо известно, что питание клещей in vitro может сильно варьироваться в зависимости от состояния системы, используемых материалов и, что важнее всего, от видов истадий 34 клещей. Кроме того, многие системы зависят от больших объёмов крови, например, системы непрерывногопотока 27, которые очень эффективны, но могут быть дорогими из-за значительных объёмов крови. Этот протокол описывает искусственную систему питания клещей на основе мембраны, которая доказала свою эффективность на взрослых стадиях пяти различных видов переносчиков клещей в США. Сюда входят Amblyomma americanum, A. maculatum, Ixodes scapularis, Rhipicephalus sanguineus и Dermacentor variabilis.

Протокол

Эксперименты с кормлением клещей проводились с использованием коммерчески доступной дефибринированной бычьей крови (Hemostat Laboratories, Калифорния, США) и дефибринированной человеческой крови (Bioivt, CA, USA), которая собирает и обрабатывает кровь в соответствии с протоколами и рекомендациями Institutional Care and Use Site Care and Use (IACUC) и Institutional Review Board (IRB). В этом исследовании не использовались живые позвоночные животные для кормления клещей. Все клещи, используемые в этом протоколе, были приобретены в центре по разведению клещей Университета штата Оклахома. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Камеры кормления клещей

  1. Спроектировать камеры с помощью бесплатного 3D-программного обеспечения для установки на чашку Петри размером 35 мм x 10 мм. Размеры печатных деталей (рисунок 1A) следующие: корпус камеры (часть i) 25 мм (внутренний диаметр) x 20 мм (высота), толщина стенки у основания 3 мм и толщина стенки у верхнего кольца крышки 6 мм (часть ii), 30 мм (внутренний диаметр) x 5 мм (высота) и толщина стенки 3,5 мм; наружное кольцо (часть iii) 31 мм (внутренний диаметр) x 5 мм (высота) и толщина стенки 3 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кольцо крышки включает четыре круглых отверстия диаметром 3 мм на 2 мм (высота) сверху для размещения магнитов. Верхняя часть камеры также имеет отверстия такого же размера для крепления магнитов (рисунок 1B). Дизайн 3D-модели следует сохранять в формате .stl — самом распространённом формате 3D-печати. Файлы с 3D-дизайном, используемым в этом протоколе, будут предоставлены по запросу.
  2. Печатайте камеры с помощью 10" 14K LCD 3D-принтера с серыми или белыми фотополимерными смолами (рисунок 1A) или другим высококачественным 3D-принтером/сервисом, который печатает 3D-модели из .stl-файла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использовал услуги печати и смолы Университета Аризоны. Использование смол высокого разрешения обеспечивает создание детализированных и долговечных камер.
  3. Используя перчатки, убедитесь, что на деталях нет остатков смолы перед сборкой, промывая и, при необходимости, аккуратно отшлифуйте мелкой наждачной бумагой (зернистость 180–200). Убедитесь, что плоское дно части i (рисунок 1A) гладкое. Это обеспечивает правильную адгезию силиконовой мембраны, снижая риск утечки.
  4. Подвергните все сухие детали ультрафиолетовому излучению в течение 10 минут, чтобы обеспечить полную полимеризацию смолы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство сервисов 3D-печати, использующих токсичные смолы для печати, используют ультрафиолетовый свет для отверждения смолы (закалка моделей и снятие токсичности смолы); однако иногда он остаётся «не полностью затвердевшим». Неполностью затвердевшая модель останется слегка липкой на ощупь и может содержать неполяризованную смолу, которая может быть токсичной или вызывать раздражение при обращении. Дополнительное воздействие ультрафиолетового света обеспечит полное затвердевание смолы.
  5. Приклейте круглые магниты размером 3 мм x 2 мм к щелям в верхней части камер и кольца крышек с помощью прозрачного эпоксидного клея. Дайте высохнуть на ночь при комнатной температуре (20–25 °C/минимум 16 часов). Убедитесь, что полюса магнитов расположены в одном направлении, чтобы совпадать с притяжением полюсов к магнитам в верхней части кольца крышки (рисунок 1A, часть II).
  6. Соберите все детали для модели, чтобы обеспечить правильную посадку всех компонентов, как показано на рисунках 1A–C.

2. Подготовка мембраны

  1. Положите кусок пластиковой плёнки размером 30 см x 30 см на чистую поверхность и убедитесь, что он не сморщён, натянув его на ровную поверхность и закрепив края скотчем (рисунок 2Ai).
  2. Положите 4–5 отдельных листов бумаги для чистки линз на длинный пластмассовый лист пластиковой плёнки, расположенный на расстоянии 5 см друг от друга (рисунок 2Aii).
  3. Подготовьте силиконовую мембрану, используя приведённые ниже компоненты и количества.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количества достаточно, чтобы подготовить мембраны диаметром 4–5 (7 см × 12 см), каждая из которых вмещает до 5–6 кормовых камер, всего 20–30 камер.
  4. Приготовьте силиконовую смесь, смешав 15 г прозрачного силиконового герметика (жёсткость Shore A 20–25) и добавив 4,5 г силиконового масла (30% от общего силикона) и 2,9 г гексана (19,3% от общего силикона). Положите ингредиенты в пластиковую весовую лодку и аккуратно перемешайте лопаткой (рисунок 2Aiii).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пузырьки не возникают, аккуратно перемешивая ингредиенты.
  5. Нанесите 2–3 г силиконовой смеси вдоль меньшего края линзовой бумаги, чтобы закрепить её на пластиковой пленке. Дайте силикону 5–10 секунд, чтобы просочиться через линзовую бумагу (рисунок 2Aiv).
  6. Равномерно распределяйте силиконовую смесь по листу бумаги с помощью инструмента с прямым краем, таким как крышка, линейка или лопатка. Убедитесь, что используемый объект покрывает всю площадь бумаги для объектива (рисунок 2Av). Это обеспечивает покрытие силикона одним ударом, предотвращая взъерошение и рябь мембраны по краю объекта.
  7. Убедитесь, что вся силиконовая смесь используется в мембране, вернув инструмент для наращивания в исходное положение для намазки. Поскольку на инструменте для наращивания сохраняется силиконовая смесь, возврат инструмента для её сбора гарантирует, что весь силикон используется для предотвращения щелей (рисунок 2Avi).
    ПРИМЕЧАНИЕ: мембрана должна выглядеть равномерно прозрачной без рябь (рисунок 2B).
  8. Сначала подготовьте мембраны разной толщины, добавив больше или меньше силиконовой смеси, так как толщину нельзя измерить, пока мембраны не высохнут.
  9. Дайте мембранам высохнуть на воздухе ночью при комнатной температуре (минимум 20–25 °C/минимум 16 часов).
  10. Измеряйте толщину мембраны с помощью цифрового внешнего микрометрового измерительного инструмента. Для взрослых клещей применяется разная толщина перепонок — от коротких частей рта (толщина мембраны 70 мкм) до более длинных ротовых органов (толщина мембраны 200 мкм).
  11. Удалите все детали из ранее собранных камер и нанесите силиконовый клей на нижний край камер. Для точного размещения клея используйте шприц объёмом 1 мл и заполните его силиконовым клеем (рисунок 2Ci).
  12. Положите наконечник пипетки объёмом 200 мкл на кончик шприца (вместо иглы) для нанесения клея (рисунок 2Cii) и прикрутите его к концу шприца, как с наконечником иглы (рисунок 2Ciii). Это позволит наносить тонкий клей на нижний край каждой камеры (рисунок 2Civ).
  13. Разместите камеру над мембраной (рисунок 1, часть i) с утяжелённым предметом для обеспечения оседания. Оставьте на ночь при комнатной температуре (20–25 °C/минимум 16 часов) (рисунок 2D, E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте любой плоский утяжелённый объект. В этом протоколе использовался кусок акрила весом 2,5 кг (рисунок 2E).
  14. Излишки мембраны из камер вырезают изогнутыми ножницами (рисунок 3A).
  15. Перед использованием камеры для кормления клещей снимите оставшуюся пластиковую плёнку (где подготовлена мембрана (шаг 2.1) (рисунок 3B).
  16. Соберите части камер вместе, добавьте чашку Петри размером 35 мм x 10 мм внизу и используйте крышки тарелок в качестве крышек камер, переворачивая их и размещая между магнитами (рисунок 3C,D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте крышки перевернутыми, так как кольцо держателя крышки идеально подходит к крышке, если перевернуто (см. описания деталей на рисунке 3C,D).
  17. Замочите мембрану камеры в дистиллированной воде, используя нижнюю часть чашок Петри размером 35 мм x 10 мм. Оставьте мембрану в воде на ночь при комнатной температуре (минимум 20–25 °C/минимум 16 часов). Поскольку мембрана изначально гидрофобна, замачивание её в воде перед добавлением крови поможет уменьшить образование застрявших пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие пузырьков подтверждает, что гидрофобность была устранена.

3. Кормление клещей и подготовка крови

  1. Сделайте 2–3 маленьких дыхательных отверстия в крышках каждой камеры (из чашек Петри размером 35 мм x 10 мм) (часть IV на рисунке 1A), упомянутых в шаге 2.16 (рисунок 3E). Используйте нагретый металлический скальпель или тонкую металлическую лопатку, чтобы проколоть дыхательные отверстия на крышке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дыхательные отверстия позволяют влаге поглощаться внутри корпуса камеры.
  2. Добавьте кровь гентамицинсульфатом в конечной концентрации 50 мкг/мл. Добавляйте антибиотики только в кровь, предназначенную для применения, в течение 1 недели, и храните при 4 °C. Держите бычью кровь (или любую другую кровь животных) при 4 °C до и после добавления антибиотиков.
  3. Поместите 2–3 мл крови в чистую чашу Петри размером 35 мм x 10 мм, затем поставьте камеру туда. Отрегулировать высоту камеры для увеличения или уменьшения количества расходуемой крови в камере, поворачивая регулировочное кольцо (часть iii из рисунка 1A). Отрегулировать высоту камеры, оставляя пространство 1–2 мм от нижней части чашки Петри до мембраны. См. пурпурные стрелки на рисунке 4A для справки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция регулировочного кольца камер позволяет контролировать объём используемой крови. то есть большее пространство между дном чашки Петри и мембраной потребует большего объёма для заполнения пространства.
  4. Поместите некормаемых клещей в камеры в равном числе самцов и самок. Убедитесь, что оба пола всегда включены в камеру, так как это может повлиять на кормление (на рисунке 4B показаны 4 самца и 4 самки взрослой A. americanum внутри камеры). Максимум 10–15 клетов на камеру (для взрослой стадии) используется для облегчения обращения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с незрелыми стадиями количество клещей выше (20–50 нимф на камеру, не указано в этом протоколе).
  5. Поместите камеры в крытые сухие ванны при 37 °C ± 1 °C с источником влажности (например, стаканами с водой), который поддерживает относительную влажность 63% ± 2% (рисунок 4C) при фотопериоде светло-тёмный интервал 12:12.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти требования могут различаться в зависимости от вида клещей и лабораторных условий; При необходимости попробуйте другие параметры влажности и оцените оптимальную для лаборатории.

4. Замена крови и камер

  1. Подготовьте две бутылочки с растворами, которые будут использоваться для промывания мембраны между изменениями крови. В одну бутылку добавьте 0,005% раствора нистатина в дистиллированную воду; Во вторую бутылку добавьте дистиллированную воду.
  2. Через 12–16 часов приготовьте новые чаши Петри со свежей кровью и поместите их в сухую ванну при 37 °C перед установкой камеры.
  3. Пока свежая кровь нагревается, вынимите камеру из использованной части и прополосните нижнюю часть мембраны дистиллированной водой в течение 3–5 секунд, затем раствором нистатина 0,005% 3–5 секунд, чтобы предотвратить грибковое заражение. Снова промыйте мембрану дистиллированной водой, чтобы удалить остатки нистатина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс занимает менее 5 минут и не влияет на питание клещей, прикреплённых к мембране на верхней поверхности.
  4. Сбросьте всю использованную кровь и воду для промывания в контейнер с раствором 0,5% натрия гипохлорита (10% отбеливателя). Отходы крови утилизируются в соответствии с институциональным протоколом безопасности.
  5. После промывания поместите камеру в новую чашу Петри с кровью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте камеры до 2–3 месяцев перед стиркой, при условии, что нет загрязнений и протечек. Камеры и мембраны загрязняются и подвержены риску загрязнения сверх 3 месяцев без промывки. Это приводит к снижению уровня кормления клещами. Используйте камеры повторно на срок до 1,5 года (~10 циклов мойки).
  6. Используйте камеры повторно: поместите их в раствор гипохлорита натрия с 0,5% (10% отбеливателя) до 30 минут, затем промыйте с средством мытья посуды для посуда. Не подвергайте камеры воздействию отбеливателя длительное время (>30 минут), так как запах снижает скорость прикрепления и со временем может ослабить целостность смолы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие отбеливателя делает камеру гибкой в влажном состоянии и хрупкой при высыхании, что приводит к повреждениям. Это позволяет камере не служить дольше 4–5 циклов промывки на основе повторных наблюдений. Постоянное использование одной и той же камеры без мытья (до 3 месяцев) приводит к более быстрому прикреплению клещей (через 1–3 дня после установки в камеру) по сравнению с недавно промытой камерой (часто >7 дней на прикрепление). Вероятно, это связано с запахом фраса и других феромонов от клещей, питающихся в камере, которые могут стимулировать питаниеклещей 35,36.

Результаты

Толщина мембраны для каждого вида клещей.
Самые высокие показатели кормления клещей наблюдались при следующих характеристиках толщины мембраны для каждого взрослого вида клещей: Amblyomma americanum 100–200 мкм; A. maculatum 100–250 мкм; Rhipicephalus sanguineus 70–100 мкм; Ixodes scapularis <150 мкм, Dermacentor variabilis <150 мкм. Все виды клещей содержались при одинаковых условиях влажности и температуры во время кормления (63% влажности и 37 °C) (Таблица 1).

Клещи и источники крови, используемые в этом протоколе
Все клещи были получены в центре по разведению клещей Университета штата Оклахома и поддерживались при относительной влажности >90% при 20 °C, при фотопериоде светло-тёмной температуры 12:12. Все клещи питались дефибринированной бычьей или человеческой кровью в рамках исследовательского проекта по изучению уровня альфа-гал (αGal) у различных видов клещей. В этом исследовании сравнивались эффекты питания на различные источники крови в рамках более широкого проекта альфа-галового синдрома (АГС), проведённого исследовательской группой. Большинство описанных здесь образцов клещей были вскрыты до полного наполнения для проведения количественного анализа αGal у частично кормленных клещей (2–5 дней кормления). Только подмножество клещей Amblyomma americanum (тех, что не требуются для количественного измерения αGal) могли питаться до насыщения. Хотя подробные сравнения между темпами кормления клещей, кормленными бычьим скотом и человеком, здесь не приводятся, примечательно, что полное насыщение (то есть успешное кормление) было достигнуто чаще у клещей, питаемых бычьей кровью. Среди клещей, которым позволили оставаться в кормушках длительное время (n = 35), 15 достигли полного нарастания, что составляет 42,8% успешного кормления. Из них 9 были откормлены бычьей кровью и 6 — человеческой (60% — бычьим кормом по сравнению с 40% человеческим кормом).

Частота кормления клещей и успешность их кормления
Скорость кормления клещей в этом исследовании определялась на основе приобретения частично кормленных клещей (2–5 дней кормления), тогда как успех кормления определялся как полное нарастание, обычно обозначенное изменением окраски аллоскутума самки (данные доступны только для Amblyomma americanum). Темпы кормления самцов определялись как непрерывное кормление более 2 дней (2–5 дней). Общие нормы кормления рассчитывались путём объединения данных клещей, питаемых бычьей и человеческой кровью, и расчёта процентов клещей, достигших 2–5 дней кормления или полного разрастания клещей, помещённых в камеры. Клещи, которые не прикрепились или погибли после <2 дней прикрепления, рассматривались для расчёта скорости кормления. Хотя количественные данные о влиянии источника крови на частоту кормления клещей не представлены, эти наблюдательные данные свидетельствуют о том, что для большинства видов клещей скорость прикрепления и кормления не существенно различаются между бычьей и человеческой кровью в течение 2–5-дневного периода кормления. Исключение было зафиксировано для Rhipicephalus sanguineus, которая демонстрировала более низкие нормы кормления человеческой кровью с 3 по 5 день по сравнению с бычьей кровью. Нормы кормления всех видов клещей, которые достигли частичного питания и полного нарастания с использованием этой системы питания клещей in vitro , приведены в Таблице 1.

Самка Amblyomma americanum по весу и классификации стадии кормления
Частично кормленные самки A. americanum классифицировались по дням кормления как: (1) некормленная, (2) 2–3 дня частично, (3) 4–5 дней частично кормленная и (4) набухшая (Рисунок 5). Стадия набухшего кормления включала клещей в начале фазы быстрого набывания (вес варьировался от 48,9 мг до 109 мг) и полностью набухших клещей (вес варьировался от 272,7 мг до 348,7 мг).

figure-results-1
Рисунок 1: Камера кормления клещей — 3D-модель и печатная сборка с мембраной. Взорванная 3D-модель и финальная собранная камера с отдельными компонентами: (i) корпус камеры (корпус для клеща), (ii) кольцо держателя крышки, (iii) кольцо регулировки высоты, (iv) крышка чашки Петри 40 мм x 10 мм и (v) дно чашки Петри размером 40 мм x 10 мм с кровью (A). Сборка 3D-печатной модели и отдельных размеров деталей, показанных в мм (B). Собранная камера, напечатанная серой смолой (C) с разрешением 8K. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Подготовка силиконовой мембраны и сборки камеры. (i) пластиковую пленку шириной 30 см × 30 см, закреплённую скотчем, чтобы не было видимых складок, (ii) отдельные листы бумаги для чистки линз, накладенные на пленку, расположенные примерно на расстоянии 5 см друг от друга, (iii) аккуратное смешивание силиконовых компонентов лопаткой круговыми движениями, (iv) каждый лист бумаги для линз, закрепляемый 1–2 г силиконовой смеси по краям, (v) силиконовая смесь равномерно распределяется по бумаге линзы с помощью прибора с прямым краем, большего размера бумаги (на изображении показан край стеклянной крышки), (vi) обратите внимание на уменьшение количества силиконовой смеси во время нанесения, оставшийся силикон на инструменте возвращается и распределяется для обеспечения равномерного покрытия (A). Правильно развернутые мембраны не показывали пузырьков или зазоров (B). Подготовка шприца для нанесения клея: (i) шприц объемом 1 мл, наполненный силиконовым клеем, (ii) наконечник пипетки объёмом 200 мкл, вставленный в наконечник шприца, (iii) наконечник пипетки, прикрученный для обеспечения герметичного уплотнения, и (iv) нанесение клея на нижний край части i (C). Камера размещается на высохшей мембране (D), а сверху размещается утяжелённый предмет (толстый акриловый блок весом 2,5 кг; пурпурная стрела) для обеспечения прочного сцепления (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Финальные этапы подготовки камеры и мембраны перед использованием. Обрезка краёв мембраны, окружающей камеру, с помощью изогнутых маленьких ножниц (A), снятие пластиковой пленки перед использованием камеры (B), окончательная сборка модели (C), размещение камеры в чашке Петри размером 40 мм x 10 см с водой, а также использование llid чашки Петри в качестве крышки камеры (D) (цифры i-v обозначают детали, указанные на рисунке 1A), и крышки камер с отверстиями для дыхания (обозначенными пурпурными наконечниками стрел) (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Система кормления кровью и размещение клещей. Камера помещается в чашу, наполненную кровью, с выделенным кольцом для регулировки высоты (пурпурные стрелки) (A). Внутренний вид камеры с одинаковым количеством самцов и самок клещей (B). Камеры для клещей расположены в сухих ваннах с источником влажности, где относительная влажность (RH) составляет 63% ± 2% и температура 37 °C ± 1 °C (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: Вариации размера и веса Amblyomma americanum во время кормления. Показаны размер некормленных клещей и средний вес частично кормленных клещей. Изображения представляют собой типичные примеры, соответствующие среднему весу, зафиксированному на каждом интервале кормления. Прилагаемая таблица содержит средние веса, стандартные отклонения, количество анализируемых клещей, медиану и квартили 1 и 3 для каждой точки времени кормления. Клещи, кормленные в течение 2–3 дней, имели диапазон веса от 7,4 мг (минимум) до 19,2 мг (максимум). Клещи, кормленные в течение 4–5 дней, варьировались от 20,6 мг до 44,8 мг. Клещи в начале фазы быстрого нарастания и полностью набухшие клещи весили от 48,9 мг до 348,7 мг. Изображение прикреплённых самок A. americanum , кормящихся 4-5 дней (жёлтый наконечник стрелы), и полностью набухшей самки (пурпурный наконечник стрелы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Виды и пол клещейКоличество кормленных тиков / Общее количество клеков, помещённых в камеры (Количество погибших клещей)Частота кормления (клещи прикреплены 2–5 дней)Средний вес (мг) (SD)Используемая толщина мембраны (мкм)
Самки A. americanum85/97 (12)87.60%37.3 (54.40)*100 - 200
Самцы A. americanum19/22 (2)86.30%Не записано100 - 200
Самки A. maculatum45/66 (21)68.20%122.4 (141.65)100 - 250
Самцы A. maculatum36/47 (11)76.60%Не записаноНе записано
Самки R. sanguineus34/60 (26)56.60%Не записано70 - 100
Самки I. scapularis15/23 (8)65.20%Не записано<150
*Уровень успешности кормления, оценённый у подгруппы взрослых клещей с Аа, откормленных крупным рогатым скотом, составляет (n=35) — 42,8%

Таблица 1: Частоты кормления клещей и средний вес.

Дополнительный рисунок 1: Низкообъёмное (100 мкл) кормление отдельных клещей, уже прикреплённых к месту 3D-камеры. Небольшая ПЦР-трубка, прикреплённая к дну искусственной мембраны силиконовым клеем, заполняется 100 мкл крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Системы кормления с искусственными мембранами для клещей являются высокоэффективными инструментами для исследований клещей и широко используются во многих исследовательских лабораториях как жизнеспособная альтернатива кормлению живых животных28,29. Основная ценность этих систем заключается в их способности доставлять или восстанавливать различные агенты через кровяную муку, включая патогены, акарициды, соединения, полученные из клещей, и другие модулирующиемолекулы 22,23,25,27. Оптимизация систем кормления с помощью искусственной мембраны может способствовать развитию устойчивого разведения клещей, тем самым снижая зависимость от живых животных.

Система питания клещей in vitro, описанная в этом протоколе, оказалась особенно успешной у взрослых Amblyomma americanum и Ixodes scapularis. Процент успешного кормления клещей определяется как доля (или процент) клещей, которые успешно завершают кормление до полного нарастания. Однако частично кормленные клещи (обычно через 3–4 дня после начала кормления) часто бывают достаточными для рассмотрения конкретных экспериментальных гипотез, рассматривающих биологию или физиологию клещей. В этом протоколе системы питания с помощью искусственной мембраны, а также для достижения конкретных исследовательских целей проекта альфа-гал (αGal), термины «частота кормления клещами» использовались для обозначения приобретения частично кормленных клещей (2–5 дней кормления), а «успех кормления клещей» — для полного наполнения у A. americanum. Самые высокие показатели кормления наблюдались у самок A. americanum (87,6%), за ними следовали самцы A. americanum (86,3%), самки A. maculatum (68,2%), самцы A. maculatum (76,6%), самки I. scapularis (65,2%) и самки R. sanguineus (56,6%), тогда как успешность питания A. americanum составляла 42,8% (Таблица 1). Частично накормленные самки A. americanum классифицировались по дням кормления в 4 категориях (фазы кормления), модифицированных из предыдущих публикаций следующимобразом: (1) некормленная, (2) 2–3 дня частично кормленая, (3) 4–5 дней частично кормлена, и (4) набухшая (Рисунок 5). Стадия набухшего кормления включала клещей в начале быстрой фазы нарастания (вес варьировался от 48,9 мг до 109 мг) и полностью набухшихся клещей (вес варьировался от 272,7 мг до 348,7 мг) (рисунок 5). Эта искусственная система питания клещей через мембрану позволила провести множество исследований в одной исследовательской группе и соавторах, позволив генерировать частично кормленных клещей на крови крупного рогатого скота, которые впоследствии использовались для заражения мышей и проверки гипотезы передачи альфа-галового синдрома (AGS), аллергии на красное мясо, вызванной укусом клещей, а также для исследования по N-гликомике11,21, 37. Удобство индивидуальной установки позволяло использовать различные источники крови, а прозрачная крышка и минимальная высота камеры позволяли визуализировать клещей во время периода кормления под стереомикроскопом с достаточной рабочей дистанцией.

Недавние изменения влажности (от водяной бани с 90% относной влажности до сухой ванны, 63% ± 2% влажности), температуры (от 37 °C до 35 °C и обратно до 37 °C) и толщины мембран (Таблица 1) позволили успешно кормить несколько видов клещей. Хотя температура и относительная влажность (RH) являются важными переменными для контроля питания клещей in vitro, толщина и прочность мембраны являются ключевыми факторами, обеспечивающими успешное кормление у разных видовклещей 33,38. Важно учитывать, что клещи с короткими ротовыми частями, такие как Rhipicephalus sanguineus и Dermacentor variabilis, нуждаются в более тонкой мембране, чем у клещей с длиннымиротовыми органами 39, например, Amblyomma spp и Ixodes spp. Самые высокие показатели кормления клещей были у Amblyomma americanum и A. maculatum при толщине перепонки 100–200 мкм; Rhipicephalus sanguineus толщиной от 70 до 100 мкм; Ixodes scapularis толщиной <150 мкм, и Dermacentor variabilis <150 мкм (Таблица 1). Ключевой фактор при кормлении клещей через искусственную мембрану — колебания частоты кормления всё ещё происходят. В этой системе небольшое изменение температуры, то есть с 37 °C до 35 °C и обратно до 37 °C через пару дней, часто усиливает или восстанавливает скорость кормления клещами. Кроме того, переход от сухой ванны к водяной бане даёт схожие результаты для Amblyomma spp. и Ixodes scapularis, однако этот эффект не наблюдался у Rhipicephalus sanguineus, который более эффективно питается при 63% ± 2% влажности в сухих ваннах.

Другие искусственные системы кормления клещей, такие как те, что были адаптированы из пятичастной системы непрерывного потока, разработанные Уети, М. и др. (USDA-ARS) и позднее модифицированные для дополнительных видов клещей Ямасаки, Й. и др., показали высокую эффективность, обеспечивая стабильно высокие показатели успешного кормленияклещей — 27,40. Однако исследования, требующие частого доступа к системе для вскрытия частично кормящихся клещей, делают такие схемы менее подходящими, так как многократное открытие и закрытие камеры для клещей может быть громоздким. 3D-печатная камера, описанная в этом протоколе, оснащена магнитной надёжной крышкой и отдельными чашками Петри, что позволяет легко обращаться с ней и визуально осматривать кормление клещей, не нарушая процесс. Прозрачная крышка обеспечивает визуальный мониторинг без помех и надёжно крепится к камере с помощью встроенных магнитов, в отличие от самых распространённых систем кормления клещей, таких как оптимизированные по оригинальному проекту Kröber andGuerin 22,29, где индивидуальная визуализация невозможна без удаления кормовой камеры из крови, так как все кормовые единицы интегрированы в одну пластину, а методы предотвращения побега клещей невозможны Не позволяйте визуализации. Кроме того, система питания клещей in vitro может быть дополнительно усовершенствована для доставки меньших, специфичных для места объёмов крови. Например, после прикрепления самок клещей к определённым местам кормления, нижняя чашка Петри может быть заменена миниатюрными резервуарами, такими как верхняя часть ПЦР-трубки объемом 100 мкл, содержащая менее 100 мкл крови, расположенная непосредственно под зоной прикрепления (дополнительный рисунок 1). Такой подход к кормлению с низким объёмом позволит провести детальные исследования по получению и передаче патогенов, а также изучать влияние токсикантов клещей и антител, полученных от хозяина. Этот протокол доказал свою эффективность в получении частично кормленных клещей различных взрослых видов клещей. Для целей этого исследования показатели откладки яиц и полного наполнения не оценивались в этом протоколе; однако проводится дальнейшая оптимизация с целью получения потомков клещей, что можно добиться с помощью Amblyomma americanum и Ixodes scapularis на основе предварительных наблюдений. Возможно, самой инновационной особенностью этой системы является её гибкость для небольших экспериментальных манипуляций, позволяющая контролировать разнообразие обработок и условий окружающей среды, а также поддерживать применения разведения колоний.

Питание клещей in vitro — ценный инструмент для исследователей, изучающих биологию, физиологию и компетентность клещей. Однако искусственное кормление клещей мембраной — это трудоёмкая и трудоемкая задача. Этот протокол, включающий 3D-печатную камеру с системой надёжного замка и простую лабораторно изготовленную мембрану, обеспечивает простую настройку после печати камер и подготовки мембран, что позволяет использовать их длительно. Кроме того, регулируя толщину мембраны, система может быть эффективно адаптирована к различным видам клещей. Дальнейшая оптимизация, включая размер камеры и толщину мембраны, позволяет применять её на различных стадиях жизни клещей.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о материальных финансовых интересах, связанных с исследованием, описанным в этой статье.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность усердной работе студентов бакалавриата и сотрудников — Каре Голден, Сидни Ингем и Омайме Джадду Наджма, которые помогали с кормлением клещей и установкой камеры и мембраны клещей.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприц Luer-Lok объёмом 1 млBD309628Luer-Lok Tip
Advanced Clear Silicon  General Electric2810435Прозрачный силиконовый герметик. Этот герметик образует водонепроницаемый барьер после отверждения.
Прозрачный эпоксидный клейДжей Би Уэлд-Клир‎ B009EU5ZM0Номер продукта Amazon
Прозрачная пищевая обёртка (клеечная упаковка)РадCLO00020
Дефибринированная бычья кровьЛаборатории HemostatDBB100
Дефибринированная человеческая кровьBioIVT
Одноразовые лопаткиLevGo, Inc.17211Номер продукта Amazon
Инкубаторы для сухих ваннONiLAB ScientificHB120-SНомер продукта на Amazon. Нагревательный блок переворачивается для получения ровной поверхности.
Соль гентамицина сульфатаМиллипор СигмаG3632-5G
Бумага для чистки линзТиффенEK1546027T
Наконечники микропипетки, 200 и мю; L Biotix uTIP63300057Для шприца. Силиконовый апликатор для герметика
Нитриловые перчаткиInspireCOBALT-OGНомер продукта Amazon
НистатинБиореагенты FisherBP2949-5
Чашка Петри 35 мм x 10 ммFalcon351008
Смоляный принтер Phrozen Sonic MEGA 8K V2FrozenB0F9NBXVVTОбъём сборки 320 x 175 x 300 мм. Можно приобрести на Amazon, если предпочитаете собственную печать
Pro 8K фотополимер и bbsp; Смола Аква СерыйFrozenЧерез Университет АризоныНизкая усадка. Высокое качество и чрезвычайно сложные 3D-модели с разрешением 8K.
Круглые магниты размером 3 мм x 2 ммМеалосB08NZTN426Номер продукта Amazon
RPG фотополимер Resin Smoke WhiteFrozenЧерез Университет АризоныВысокое качество и Чрезвычайно сложные 3D-модели. Отличная гибкость с впечатляющим изгибом.
Силиконовое маслоМиллипор Сигма378321-250 мл
Дизайн бесплатного 3D-программного обеспечения TinkercadTinkercadН/Дhttps://www.tinkercad.com
Весовые лодки (ёмкость 100 мл)Пура ПонтаMDO-AZOC-1030

Ссылки

  1. De La Fuente, J., Estrada-Pena, A., Venzal, J. M., Kocan, K. M., Sonenshine, D. E. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Front Biosci. 13, 6938-6946 (2008).
  2. Gubler, D. J. In vector biology, ecology and control. Atkinson, P. W. , Springer. Netherlands, Dordrecht. 39-62 (2010).
  3. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. In biology of ticks. 1, Oxford University Press. Cary. 3-17 (2013).
  4. A global brief on vector-borne diseases. , World Health Organization. 1-54 (2014).
  5. Mullen, G. R., Durden, L. A. In medical and veterinary entomology. , Academic Press. Amsterdam. 517-558 (2002).
  6. Choudhary, S. K., et al. Tick salivary gland extract induces alpha-gal syndrome in alpha-gal deficient mice. Immun Inflamm Dis. 9 (3), 984-990 (2021).
  7. Van Nunen, S. A., O'Connor, L. R., Clarke, L. R., Boyle, R. X., Fernando, S. L. An association between tick bite reactions and red meat allergy in humans. Med J Aust. 190 (9), 510-511 (2009).
  8. Fischer, J., et al. Spatial distribution of alpha-gal in Ixodes ricinus – A histological study. Ticks Tick Borne Dis. 11 (5), 101506(2020).
  9. Hamsten, C., et al. Identification of galactose-α-1,3-galactose in the gastrointestinal tract of the tick Ixodes ricinus; possible relationship with red meat allergy. Allergy. 68 (4), 549-552 (2013).
  10. Chinuki, Y., Ishiwata, K., Yamaji, K., Takahashi, H., Morita, E. Haemaphysalis longicornis tick bites are a possible cause of red meat allergy in Japan. Allergy. 71 (3), 421-425 (2016).
  11. Maldonado-Ruiz, L. P., Boorgula, G. D., Kim, D., Fleming, S. D., Park, Y. Tick intrastadial feeding and its role on IgE production in the murine model of alpha-gal syndrome: The tick “transmission” hypothesis. Front Immunol. 13, 1-11 (2022).
  12. Commins, S. P., et al. Delayed anaphylaxis, angioedema, or urticaria after consumption of red meat in patients with IgE antibodies specific for galactose-α-1,3-galactose. J Allergy Clin Immunol. 123 (2), 426-433 (2009).
  13. Commins, S. P., Jerath, M. R., Cox, K., Erickson, L. D., Platts-Mills, T. Delayed anaphylaxis to alpha-gal, an oligosaccharide in mammalian meat. Allergol Int. 65 (1), 16-20 (2016).
  14. Crispell, G., et al. Discovery of alpha-gal-containing antigens in North American tick species believed to induce red meat allergy. Front Immunol. 10, 1056(2019).
  15. Park, Y., et al. Alpha-gal and cross-reactive carbohydrate determinants in the N-glycans of salivary glands in the lone star tick, Amblyomma americanum. Vaccines. 8 (1), 95(2020).
  16. Sharma, S. R., Karim, S. Tick saliva and the alpha-gal syndrome: Finding a needle in a haystack. Front Cell Infect Microbiol. 11, 680264(2021).
  17. Sonenshine, D. E. In biology of ticks. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. Vol 1, New York. 51-66 (1991).
  18. Narasimhan, S., et al. Laboratory management of mammalian hosts for Ixodes scapularis host–pathogen interaction studies. Comp Med. 74 (4), 235-245 (2024).
  19. Allan, S. A. Tick rearing and in vitro. feeding. Biology of ticks. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. , Oxford University Press. New York. 445-473 (2013).
  20. Costa-Da-Silva, A. L., Carvalho, D. O., Kojin, B. B., Capurro, M. L. Implementation of artificial feeders in hematophagous arthropod research cooperates with the vertebrate animal use replacement, reduction and refinement (3Rs) principle. J Clin Res Bioeth. 5 (2), 1-3 (2014).
  21. Maldonado-Ruiz, L. P., et al. High levels of alpha-gal with large variation in the salivary glands of lone star ticks fed on human blood. Sci Rep. 13 (1), 21409(2023).
  22. Kröber, T., Guerin, P. M. An in vitro. feeding assay to test acaricides for control of hard ticks. Pest Manag Sci. 63 (1), 17-22 (2007).
  23. Stone, B. F., Commins, M. A., Kemp, D. H. Artificial feeding of the Australian paralysis tick, Ixodes holocyclus, and collection of paralysing toxin. Int J Parasitol. 13 (5), 447-454 (1983).
  24. Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: a tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
  25. Oliver, J. D., et al. Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae.) by membrane feeding. J Med Entomol. 53 (2), 409-415 (2015).
  26. Vimonish, R., et al. Isolation of infectious Theileria parva sporozoites secreted by infected Rhipicephalus appendiculatus ticks into an in vitro. tick feeding system. Parasit Vectors. 14 (1), 616(2021).
  27. Vimonish, R., et al. Quantitative analysis of Anaplasma marginale acquisition and transmission by Dermacentor andersoni fed in vitro. Sci Rep. 10 (1), 470(2020).
  28. Kröber, T., Guerin, P. The tick blood meal: From a living animal or from a silicone membrane. Altex. 24, 39-41 (2007).
  29. Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends Parasitol. 23 (9), 445-449 (2007).
  30. Waladde, S. M., Ochieng, S. A., Gichuhi, P. M. Artificial-membrane feeding of the ixodid tick, Rhipicephalus appendiculatus, to repletion. Exp Appl Acarol. 11 (4), 297-306 (1991).
  31. Khoo, B., Cull, B., Oliver, J. D. Tick artificial membrane feeding for Ixodes scapularis. J Vis Exp. (189), e64553(2022).
  32. Krull, C., Böhme, B., Clausen, P. H., Nijhof, A. M. Optimization of an artificial tick feeding assay for Dermacentor reticulatus. Parasit Vectors. 10 (1), 60(2017).
  33. Garcia Guizzo, M., et al. Optimizing tick artificial membrane feeding for Ixodes scapularis. Sci Rep. 13 (1), 16170(2023).
  34. Rochlin, I., et al. Optimization of artificial membrane feeding system for lone star ticks, Amblyomma americanum (Acari: Ixodidae), and experimental infection with Rickettsia amblyommatis (Rickettsiales: Rickettsiaceae). J Med Entomol. 61 (2), 442-453 (2023).
  35. Barré, N., Garris, G., Lorvelec, O. Field sampling of the tick Amblyomma variegatum (Acari: Ixodidae.) on pastures in Guadeloupe: Attraction of CO and/or tick pheromones and conditions of use. Exp Appl Acarol. 21 (2), 95-108 (1997).
  36. Norval, R., Peter, T., Sonenshine, D., Burridge, M. Responses of the ticks Amblyomma hebraeum and A. variegatum. to known or potential components of the aggregation-attachment pheromone. III Aggregation. Exp Appl Acarol. 16 (3), 237-245 (1992).
  37. Park, Y., et al. Alpha-gal and cross-reactive carbohydrate determinants in the N-glycans of salivary glands in the lone star tick, Amblyomma americanum. Vaccines. 8 (1), 1-18 (2020).
  38. Trentelman, J. J., Kleuskens, J. A., Van De Crommert, J., Schetters, T. P. A new method for in vitro feeding of Rhipicephalus australis (formerly Rhipicephalus microplus.) larvae: A valuable tool for tick vaccine development. Parasit Vectors. 10 (1), 153(2017).
  39. Kemp, D. H., Stone, B. F., Binnington, K. C. In physiology of ticks. Obenchain, F. D., Galun, R. , Pergamon. 119-168 (1982).
  40. Yamasaki, Y., Singh, P., Vimonish, R., Ueti, M., Bankhead, T. Development and application of an in vitro. tick feeding system to identify Ixodes tick environment-induced genes of the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi. Pathogens. 13 (6), 1-13 (2024).

Перепечатки и разрешения

Теги

3D
Кровь клещей, подаваемая через искусственную мембрану на 3D-печатной камере в исследованиях иксодидных клещей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.