Методическая статья

Стандартизированные модели животных, вызванные нестабильностью, для доклинических исследований остеоартрита

467 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69612

⸱

23 декабря 2025 г.

 ,  , 
1Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University (Zhejiang Provincial Hospital of Chinese Medicine), 2The First School of Clinical Medicine, Zhejiang Chinese Medical University, 3Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Hematology, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University (Zhejiang Provincial Hospital of Chinese Medicine), 4Department of Orthopedic Surgery, the Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Orthopedics Research Institute of Zhejiang University, 6Key Laboratory of Motor System Disease Research and Precision Therapy of Zhejiang Province, 7Clinical Research Center of Motor System Disease of Zhejiang Province

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол направлен на создание подходящих животных моделей для исследования остеоартрита.

Аннотация

Будучи самым распространённым заболеванием суставов в мире, остеоартрит колена (ОА) представляет собой значительную глобальную нагрузку для здоровья, что побудило для обширных исследований его патогенеза и стратегий лечения. Несмотря на многочисленные исследования, стандартизированные методологии создания моделей по-прежнему отсутствуют. Таким образом, чтобы устранить этот пробел, мы предлагаем комплексные, воспроизводимые протоколы для разработки животных моделей остеоартрита, вызванных нестабильностью, в частности модели дестабилизации медиального мениска (DMM) у мышей и модели разрыва медиального мениска (MMT) у крыс. Кроме того, мы описываем простую и легко реализуемую процедуру оценки порогов боли после операции и стабильности пространственной походки, направленную на обеспечение методологической согласованности в доклинических исследованиях ОА. Гистологическая и поведенческая валидация подтвердила успех обеих моделей: результаты Международного общества исследований остеоартрита (OARSI) были заметно повышены, длина шага значительно изменилась, а механические пороги боли значительно снизились в группах DMM и MMT по сравнению с контрольными группами, что указывало на выраженную дегенерацию суставов и гиперчувствительность. Эти результаты валидации подчёркивают воспроизводимость и трансляционную значимость обеих моделей. Таким образом, предоставляя подробную видеодокументацию, эта работа способствует стандартизации процедур и способствует межлабораторной согласованности, тем самым повышая надёжность и сопоставимость результатов исследований ОА.

Введение

Остеоартрит (ОА) — это широко распространённое дегенеративное заболевание суставов и одна из ведущих причин инвалидности вовсём мире 1,2. Несмотря на обширные исследования, разработка эффективных препаратов, модифицирующих болезнь (DMOAD), шла относительномедленно 3. В настоящее время широко признано, что ОА — это многофакторное заболевание, включающее сложные патологические изменения в нескольких перисуставных тканях, включая суставный хрящ, подхондральную кость, сухожилия исиновиум 4,5. Эффективные доклинические исследования разнообразных патологических процессов ОА требуют использования чётко определённых и подходящих животных моделей. Хотя были установлены различные модели ОА и сообщили 6,7,8,9,10,11, во многих исследованиях продолжают использовать неподходящие модели животных, что ограничивает трансляционную значимость их данных. Для решения этой проблемы мы представляем стандартизированные модели ОА, вызванные нестабильностью, включая воспроизводимую дестабилизацию медиального мениска (DMM) и процедуры разрыва медиального мениска (MMT), в видеоформате, чтобы служить практическим ориентиром для доклинических исследований ОА и стандартизации моделей.

Как сообщалось в предыдущих исследованиях, нестабильность мениска является основным фактором, способствующим дегенерации коленного сустава в клинических случаях. Таким образом, хирургически индуцированная нестабильность мениска у мышей и крыс служит эффективным подходом для экспериментальной индукции ОА. В этом контексте мы представляем две репрезентативные модели OA, вызванных нестабильностью, включая модель DMM у мышей и модель MMT у крыс. Модель DMM у мышей особенно ценна для изучения молекулярных механизмов ОА, поскольку мыши подвержены трансгенной манипуляции, и эта модель демонстрирует постепенное и продолжительное развитие заболевания, близко имитируя человеческий ОА. Однако важно отметить, что модель DMM менее подходит для исследований, сосредоточенных на патологических изменениях подхондральной кости, где альтернативные модели могут обеспечивать лучшую трансляционную значимость.

Кроме того, мы установили модель MMT у крыс, чтобы дополнить модель мышиного DMM. Процедура ММТ вызывает более обширные структурные повреждения, затрагиваемые как суставного хряща, так и подхондральной кости, что лучше отражает развитые патологические особенности ОА, наблюдаемые в клинических условиях. Это делает модель MMT крыс особенно подходящей для биоинженерии и трансляционных исследований, включая оценку биоматериалов, регенеративных терапий и систем доставки лекарств, направленных на восстановление суставов. Хотя хирургические методы MMT и DMM уже были описаны в предыдущих исследованиях, по-прежнему не хватает комплексного, пошагового визуального протокола, который бы обеспечивал стандартизацию, воспроизводимость и техническую точность в исследовательских лабораториях. Поэтому, чтобы устранить этот пробел, мы разработали подробную видеодемонстрацию, иллюструющую каждый критически важный этап создания модели — от подготовки животных до послеоперационного ухода. Кроме того, мы вводим два широко используемых метода поведенческой оценки: один для оценки порога боли, другой для анализа пространственной стабильности походки, чтобы обеспечить единообразную основу для функциональной оценки после индукции ОА. Таким образом, интегрируя хирургические и поведенческие протоколы, эта рукопись направлена на продвижение методологической стандартизации в доклинических исследованиях ОА, тем самым повышая сопоставимость данных и трансляционную релевантность между исследованиями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по этике и благополучию животных Китайского медицинского университета Чжэцзяна и одобрены по протоколу IACUC-20251020-11. Для операции ДММ использовались самцы мышей C57BL/6 в возрасте 10-12 недель, а самцы крыс Спраг-Доули весом 200-225 г — для процедуры ММТ. Все животные содержались в определённых условиях, свободных от патогенов (SPF), и им предоставлялись недельный период акклиматизации перед экспериментами. Сохранялись стандартные условия содержания: корм, вода и подстилка менялись как минимум два раза в неделю для обеспечения благополучия животных и стабильности экспериментов.

1. Приготовление животных

  1. Назначить соответствующее обезболивающее (например, бупренорфин) перед операцией в соответствии с институциональными рекомендациями. Анестезируйте животное с помощью ингаляционного анестетика (например, 2% изофлурана при 0,4 л/мин при подаче свежих газов 4 л/мин в индукционной камере) и поддерживайте анестезию на протяжении всей процедуры через носовой конус. Подтвердите глубину анестезии, убедившись в отсутствии отмены педалей.
  2. Нанесите полоску смазывающей офтальмологической мази диаметром 2-3 мм в конъюнктивальный мешок нижнего века и аккуратно помассируйте веко, чтобы равномерно распределять мазь по поверхности глаза.
  3. Сбрийте шерсть вокруг правого коленного сустава и продезинфицируйте место операции с помощью трёхступенчатой процедуры очищения с помощью повидона-йода и 70% этанола. Положите животное на стерильный операционный стол.

2. Операция ДММ у мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура вызывает дестабилизацию сустава путём пересечения медиальной менискотитибиальной связки (MMTL), выделенной красным цветом на рисунке 1, которая обычно закрепляет медиальный мениск на большеберцовой плато.

  1. Расположите анестезированную мышь в положении на спине и сделайте небольшой медиальный парапателлярный разрез кожи (примерно 3-5 мм) над правым коленом.
  2. Аккуратно вскрытие мягких тканей, чтобы обнажить капсулу сустава. Сделайте разрез медиально от надколенника и аккуратно сместите надколенник в сторону, чтобы визуализировать коленный сустав. Подтвердите, что MMTL представляет собой тонкую, связочную полосу, соединяющую передний рог медиального мениска с большеберцовым плато. Используйте стереомикроскоп для улучшения визуализации и минимизации риска повреждения суставного хряща.
  3. Аккуратно перерезайте прикрепление большеберцовой кости MMTL с помощью микроножниц, скальпеля #11 или согнутой иглы для шприца. При использовании изогнутой иглы для шприца тупой край помогает защитить подлежащий суставный хрящ. Подтвердите успешное пересечение, наблюдая последующую дестабилизацию медиального мениска.
  4. Закройте разрезанную суставную капсулу с помощью 8-0 впитывающиеся швы, затем замыкание кожного разреза зажимами или швами 6-0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать прокола или повреждения суставного хряща при наложении швов, а также следите за правильной плотностью сустава при закрытии разреза.
  5. Дайте животному восстановиться на грелке и внимательно следите за ним, пока не восстановите полную подвижность.

3. Операция ММТ у крысы

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура вызывает ОА за счёт полного разрыва медиального мениска после пересечения медиальной коллатеральной связки (MCL), что приводит к нестабильности суставов и прогрессирующей дегенерации хряща.

  1. Правильно расположите анестезированную крысу и сделайте медиальный парапателлярный разрез длиной примерно 6-8 мм над правым коленом.
  2. Проведите тупую диссекцию, чтобы разделить мышечные слои и чётко обнажить MCL (рисунок 2).
  3. С помощью хирургических ножниц полностью перерезайте MCL в его середине.
  4. Аккуратно втяните перерезанный MCL, чтобы обнажить подлежащий медиальный мениск. С помощью тонких щипцов захватите мениск и проведите полнотолщинное сечение в самой узкой области, чтобы создать полный разрыв.
  5. Переместите мягкие ткани и закройте разрез слоями, используя 5-0 впитываемых швов для мышцы и фасции, затем зажимы для раны или 5-0 невасытывающихся швов для закрытия кожи.
  6. Дайте животному восстановиться, следуя той же процедуре, описанной в шаге 2.5.

4. Поведенческие оценки

  1. Проводите начальные оценки перед операцией и повторные оценки в определённые послеоперационные периоды (например, 2, 4 и 8 недель).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы минимизировать изменчивость между операторами, поведенческие тесты проводились тем же обученным оператором, который был ослеплен к экспериментальной группировке. Каждое измерение повторялось три раза на животное, и среднее значение использовалось для анализа.
    1. Упрощённый механический тест порога отъёма
      1. Разместите мышей в отдельные отсеки на приподнятой сетчатой платформе и дайте им акклиматизироваться не менее 30 минут перед тестированием. Механическая чувствительность к боли затем оценивается с помощью электронного анестезиометра фон Фрея.
      2. Используя нить фон Фрея, приложите зонд к подошвенной поверхности правой задней лапы мыши и постепенно увеличивайтесилу 12.
      3. Записывайте реакцию, отмечая, что положительная реакция обозначается внезапным отъёмом лапы, вздрагиванием или облизыванием. Оценивайте наличие или отсутствие последовательного ответа для оценки изменений чувствительности со временем.
    2. Анализ походки
      1. Используйте автоматизированную систему анализа походки для оценки.
      2. Позвольте животному добровольно пройти по стеклянной дорожке аппарата. Определите действительное испытание как такую, в которой животное движется ровным темпом без остановок. Дождитесь, пока системное ПО автоматически определит отпечатки лап и вычислит несколько параметров походки. Проанализируйте ключевые метрики для правой (управляемой) задней конечности, включая длительность фазы стойки, скорость замаха и давление лапы, и сравните их с показателями контралатеральной конечности и схемой управления с помощью поддельной конечности.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Все животные были акклиматизированы к тестовому оборудованию с ежедневными тренировками перед базовой оценкой. Для каждого животного было записано по три забега за каждую точку времени, и считались допустимыми только испытания, в которых животное сохраняло постоянную скорость без пауз. Все измерения проводились обученными операторами по двойной слепой схеме для минимизации изменчивости между операторами, а повторные запуски усреднялись для обеспечения воспроизводимости данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Характеристика и валидация модели мыши DMM OA
После 1-недельного периода акклиматизации была установлена модель остеоартрита, вызванного ДММ, у мышей по процедуре, показанной на рисунке 1. Патологические и поведенческие оценки проводились через две недели после операции. Как показано на рисунке 2A, наиболее выраженные дегенеративные изменения были локализованы в медиальном феморотибиальном суставе. Степень дегенерации хряща была дополнительно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол предоставляет стандартизированную основу для индукции и оценки двух широко используемых хирургических моделей ОА. Эти модели особенно ценны, поскольку они близко воспроизводят патофизиологические особенности посттравматического ОА человека, что обеспечивает высокую трансляционную значимость. Модель ДММ включает пересечение медиальной менискотитибиальной связки, тогда как модель ММТ предполагает прямой разрыв медиального мениска (ММТ). В нашей лаборатории процедура ДММ регул...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было финансово поддержано исследовательским проектом Чжэцзянского китайского медицинского университета (грант No 2025JKJNTZ09) и Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 32401092). Мы также выражаем искреннюю признательность компании Hangzhou Xinyao Biotechnology Co., Ltd. за предоставленные услуги по анализу походки, которые были необходимы для успешного завершения этого исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Система анализа походкиШанхайская Синь Жуань Информационные Технологии Ко., ЛтдXR-FP202
ЛипосикОфтальмологическая мазь
МышиНанкинский институт модельных животныхC57/BL6
Система тестирования болиШанхайская Синь Жуань Информационные Технологии Ко., ЛтдXR-XZDэлектронный анестезиометр фон Фрея
КрысаНанкинский институт модельных животныхS/D

Ссылки

  1. Barnett, R. Osteoarthritis. Lancet. 391 (10134), 1985(2018).
  2. Chen, S., et al. Epidemiological trends and characteristics of osteoarthritis in China during 1990-2021. J Orthop Translat. 17 (51), 218-226 (2025).
  3. Xingyan, A., Jiao, W., Ke, X., Robert Chunhua, Z., Jiacan, S. Perspectives on osteoarthritis treatment with mesenchymal stem cells and Radix Achyranthis Bidentatae. Aging Dis. 15 (3), 1029-1045 (2024).
  4. Konstantinos, H., et al. Translational genomics of osteoarthritis in 1,962,069 individuals. Nature. 641 (8065), 1217-1224 (2025).
  5. Samantha, A. Low-dose methotrexate fails to treat inflammatory knee osteoarthritis. JAMA. 334 (4), 295(2025).
  6. Zaki, S., Blaker, C. L., Little, C. B. OA foundations - experimental models of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 30 (3), 357-380 (2022).
  7. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  8. Parrish, W. R., et al. Intra-articular therapy with recombinant human GDF5 arrests disease progression and stimulates cartilage repair in the rat medial meniscus transection (MMT) model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 25 (4), 554-560 (2017).
  9. Thever, Y., Shen Xuanrong, M., Rong Chuin, T., BinAbd Razak T, H. R. Comparison of early-stage knee osteoarthritis induced by medial meniscus tear versus tibial osteotomy in the rat model. Cartilage. 15 (1), 19476035241292320(2024).
  10. Minghao, Q., et al. Pip5k1c Loss in Chondrocytes Causes Spontaneous Osteoarthritic Lesions in Aged Mice. Aging Dis. 14 (2), 502-514 (2023).
  11. Wakale, S. How are Aging and Osteoarthritis Related. Indira Prasadam Aging Dis. 14 (3), 592-604 (2023).
  12. Alicia, S., Eleri, L. F. M., Oakley, B. M., Elodie, N., Jeffrey, S. M. Normative preclinical algesiometry data on the von Frey and radiant heat paw-withdrawal tests: an analysis of data from more than 8,000 mice over 20 years. J Pain. 25 (7), 104468(2024).
  13. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
  14. McAlindon, T. E., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 22 (3), 363-388 (2014).
  15. Sharifah Zakiah Syed, S., et al. Comparison of bone and articular cartilage changes in osteoarthritis: a micro-computed tomography and histological study of surgically and chemically induced osteoarthritic rabbit models. J Orthop Surg Res. 16 (1), 663(2021).
  16. Zengfa, D., et al. IRF1-mediated upregulation of PARP12 promotes cartilage degradation by inhibiting PINK1/Parkin-dependent mitophagy through ISG15 attenuating ubiquitylation and SUMOylation of MFN1/2. Bone Res. 12 (1), 63(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи