Характеристика устьиц и эпидермальных признаков с помощью пилингов, очищения и анализа изображений на основе искусственного интеллекта

Краткое содержание

Этот протокол представляет сравнительный метод оценки черт устьица и эпидермии у двух различных видов с использованием эпидермальных пилингов, методов очищения и анализа изображений с помощью искусственного интеллекта. Цель — обеспечить высокопроизводительную и воспроизводимую количественную оценку клеточных структур, лежащих в основе функции устьица, для сельскохозяйственных применений и широких исследований растений.

Аннотация

Точная характеристика морфологии устьиц и окружающих признаков эпидермса крайне важна для понимания функции устьицы. Сравнительный протокол представлен с использованием двух комплементарных методов — эпидермального пилинга и очистки листьев — для оценки размера, формы и плотности клеток устьица и эпидермса у двух экологически различных видов двукратных видов — Fraxinus excelsior и Taraxacum officinale. Протокол включает подробные этапы подготовки образцов, визуализации и количественного определения признаков с использованием экономичных и трудозатратных ручных измерений (очищение тканей и шеллинг), а также анализа изображений с помощью искусственного интеллекта, что может способствовать выполнению высокопроизводительных приложений. Были оценены три инструмента сегментации — модель обнаружения устьица на базе YOLOv8, универсальный инструмент глубокого обучения для сегментации клеток и пиксельный классификатор — по точности и пригодности различных методов. Значительные различия в чертах устьиц и эпидермии постоянно наблюдаются между методами пилинга и очистки как в ручном, так и в ИИ-анализах. Инструменты искусственного интеллекта позволили воспроизводимую количественную оценку: модель обнаружения устьица на базе YOLOv8 (StoManager1) показала лучшие результаты для черт устьица, а универсальный инструмент глубокого обучения для сегментации клеток (Cellpose) — для сегментации эпидермиса. Обнаружение признаков на основе искусственного интеллекта было высоко стабильным у T. officinale , но ограниченным у F. excelsior; результаты всё равно расходились от ручных измерений, иллюстрируя, как видоспецифическая анатомия и качество изображения влияют на пригодность методов. Эти результаты свидетельствуют о том, что хотя анализ с помощью ИИ предоставляет полезную основу для количественной оценки черт устьица и эпидерми, экспертная валидация и пилотное тестирование остаются необходимыми перед более широким или пропускным применением.

Введение

Устьицы — это микроскопические поры эпидермиса, которые играют важную роль в регулировании газообмена и транспирации растений. Таким образом, понимание морфологических основ функционирования устьица является ключом к улучшению производительности^{культур 1}. Хотя большинство исследований структуры и функции устьица сосредоточены исключительно на морфологии устьиц, полное понимание отзывчивости устьица также требует характеристики размера и формы окружающих эпидермальных клеток. Точная количественная оценка этих признаков является фундаментальной для понимания структурно-функциональных отношений, лежащих в основе газообмена и улучшения культуры.

Поскольку улучшение культур всё больше зависит от современных методов редактирования генов, крайне важно понимать ключевые морфологические черты — такие как устьицы — которые влияют на фотосинтез, внутреннюю эффективность использования воды и прибавку углерода. Эта потребность особенно остра на фоне продолжающихся изменений окружающей среды, поскольку спрос на устойчивые культуры, сохраняющие как фотосинтетическую мощность, так и урожайность растет на фоне более частых засух и волн жары ^2,3. В результате существует острая потребность в стандартизированных протоколах визуализации и анализа. Пилинг устьица с помощью лака/лака для ногтей — самый простой способ получения отпечатков на поверхности листьев для измерения размера, формы и плотности устьица и ^{эпидермы 4,5,6}. Его процедура быстрая, неразрушительная, что позволяет быстро обрабатывать образцы. Метод очищения тканей является альтернативным подходом, позволяющим одновременно характеризуть сеть вен и, возможно, более комплексную характеристику гидравлики листьев.

Химическое очищение смягчает и делает ткани оптически прозрачными, позволяя на месте снимать устьицы и эпидермические клетки без механических нарушений. Очищение широко применимо для различных типов тканей, включая сухие или деликатные образцы, и может использоваться не только для визуализации устьиц, но и для визуализации венационных сетей, флуоресцентной визуализации и внутренних анатомических^{структур 7,8,9,10,11,12}, что позволяет анализировать черты устьица наряду с другими функциональными признаками. Существуют различные методы очистки, включая органические растворители, водные растворы, гипергидратацию или гидрогель-эмеддинг 13,14,15. Они различаются по длительности, совместимости с изображением и доступности реагентов. Используемый здесь протокол прост, экономичен и не требует специализированных навыков. Обе методы недороги и быстры по сравнению с более трудоёмкими, такими как световая микроскопия или сканирующая электронная микроскопия, которые требуют химической фиксации, вложения и сечения образцов.

Традиционные методы анализа характеристик устьица и эпидермсы часто основаны на ручной сегментации микроскопических изображений, что трудоёмко, требует времени и подвержено смещению наблюдателей, что ограничивает пропускную способность и снижает эффективность анализа. Кроме того, анатомические особенности, такие как трихомы и неправильные клеточные стенки, создают дополнительные трудности для количественного определения признаков. Хотя автоматизированные инструменты анализа изображений предлагают большие перспективы для высокопроизводительного извлечения данных, они оптимизированы для специфических растительных тканей и не поддаются легкой передаче между типами листьев и методами подготовки. Например, StoManager1 (дополнительный рисунок 1) обеспечивает высокую точность обнаружения устьица с использованием модели обнаружения объектов на базе YOLOv8, но специально обучен для признаков устьица. Cellpose (дополнительный рисунок 2) — это крупная, предварительно обученная, универсальная модель сегментации, которая хорошо показывает себя при похождении входных данных на её предварительно обученные модели (например, cyto, cyto2), изначально основанную на клетках животных и органеллах. Ilastik (дополнительный рисунок 3) — это инструмент классификации на основе пикселей, основанный на пользовательских аннотациях. И Cellpose, и Ilastik удобны в использовании, но каждый может потребовать переобучения или тонкой настройки для учёта вариаций качества изображения, артефактов фона и особенностей, специфичных для тканей.

Кроме того, устьица и эпидермальная морфология демонстрирует высокую вариабельность между^{видами 17}. Такие признаки, как плотность и размер устьица, особенно варьируются, однако они обычно обратно связаны и вместе определяют видовые различия в кинетике устьица. Крупные устьицы частично компенсируют низкую плотность, но обычно демонстрируют более медленную^{кинетику 5}, что может быть невыгодно при более частых волнах жары, когда быстрые реакции проможца критически важны для поддержания усвоения углерода и предотвращения чрезмерных потерь воды. В целом такая вариабельность усложняет измерение признаков устьица и может подорвать достоверность выбранного протокола и надёжность результатов на основе ИИ.

Этот протокол объединяет две классические методы подготовки — эпидермальные пилинги и химические очистки — с современными инструментами искусственного интеллекта (ИИ) и машинного обучения (ML) для сегментации и измерения признаков. Используя два распространённых светотребовательных вида двуплодных с противоположными экологическими стратегиями (F. excelsior и T. officinale), мы изучили вариабельность признаков устьица и эпидерми, чтобы оценить, как сравниваются три метода и где могут возникать возможные неточности. Оценивалась производительность трёх инструментов ИИ: StoManager1 (модель глубокого обучения на базе YOLOv8 для обнаружения устьица), Cellpose (универсальный инструмент сегментации глубокого обучения) и ilastik (пиксельный классификатор эпидермальных тканей). Такой интегративный подход позволяет воспроизводимую и высокопроизводительную количественную оценку черт устьица и эпидермиса, предлагая надёжную и масштабируемую основу для фенотипического анализа как в экологических, так и в сельскохозяйственных исследованиях. Однако анатомические особенности, такие как плотные трихомы, толстые кутикулы или низкий контраст между клеточными границами, могут снижать точность сегментации и должны учитываться при выборе методов пилинга и очистки, а также при применении количественной оценки на основе ИИ.

Насколько нам известно, это первый пошаговый протокол, который напрямую сравнивает методы очистки эпидермиса и химического очищения в сочетании с несколькими инструментами сегментации на базе искусственного интеллекта для количественного определения черт устьица и эпидерми. Объединяя классические микроскопические методы с доступными рабочими процессами машинного обучения, протокол снижает пользовательскую предвзятость, увеличивает пропускную способность и способствует воспроизводимому фенотипированию между видами. Это делает подход широко применимым для экологии, улучшения культур и исследований изменения климата, а также обеспечивает основу для постоянного расширения инструментов через переобучение моделей или трансферное обучение.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора листьев T. officinale и F. excelsior не требовалось специальных разрешений или разрешений, так как эти неохраняемые виды были взяты на общественно доступных садовых участках. Сбор всех образцов соответствовал институциональным и местным рекомендациям.

1. Сбор растительного материала

1. Выберите здоровые листья для сравнительного анализа. Для текущего эксперимента были отобраны здоровые, подвергающиеся солнцу зрелые листья двух видов дуетов с контрастным распространённым распространённым ростицем: гипостоматозное дерево F. excelsior, у которого устьицы есть только на нижней поверхности листьев, и многолетний амфистоматозный травянист T. officinale.
2. Для каждого типа или места образца возьмите 3-5 реплицированных листьев.
3. Отсоедините лист чистыми ножницами или лезвием бритвы. Немедленно поместите срезанный лист в воду, чтобы предотвратить обезвоживание.
4. После сбора полностью погрузите черешок в воду и храните при 4°C.
5. Выполните разделы 2 или 3 протокола в течение 48 часов.

2. Подготовка и просмотр отпечатков устьиц

ПРИМЕЧАНИЕ: Все химические отходы, образовавшиеся в ходе протокола очистки, были обработаны в соответствии с институциональными и местными нормами безопасности. Растворы, содержащие глутаральдегид, собирались отдельно и утилизировались как опасные химические отходы. Растворы гидроксида натрия (NaOH) нейтрализовались до pH 6-8 перед утилизацией, если это было разрешено. Разбавленные растворы отбеливателя и этанола сбрасывались в канализацию с большим количеством холодной воды в местах, разрешенных институциональными и муниципальными правилами. Растворы TBO собирались и утилизировались как химические отходы в соответствии с местными рекомендациями. Пользователям следует проконсультироваться с офисом безопасности в учреждениях для получения одобрения процедур утилизации.

1. При необходимости аккуратно промыйте выбранную поверхность листа водой, чтобы удалить пыль или мусор. Немедленно промокните поверхность листа, чтобы высушить фильтром или мягким бумажным полотенцем, чтобы удалить лишнюю влагу. Не сушите на воздухе, так как это может привести к уменьшению ткани и неточным измерениям размеров устьица и эпидермальных клеток.
2. Маркируйте микроскопическое стекло деталями образца (например, вид, сторона листа и дата приготовления) с помощью постоянного маркера, чтобы обеспечить прослеживаемость каждого образца во время визуализации, анализа и интерпретации данных, а также обеспечить надлежащее хранение образца для будущего использования.
3. Для видов с нежелезистыми (волосыми) трихомами удаляйте трихомы с поверхности листа бритвойным лезвием перед подготовкой кожуры, так как их присутствие может закрывать границы клеток и снижать качество изображения (рисунок 1).
4. С помощью маленькой кисти нанесите тонкий, ровный слой прозрачного, неудлинимого лака для ногтей (избегайте формул «растягивающихся» или «отслоивающихся») на целевую область. Всегда выбирайте центральную часть листа для приготовления кожуры, избегая кончика и основания.
5. Дайте лаку полностью высохнуть (обычно 2-5 минут при комнатной температуре). Длительное воздействие может вызвать изменение цвета тканей (например, красный оттенок на более мягких листьях), который может быть заметен в финальной кожуре и мешать дальнейшим анализам, требующим равномерной окраски.
6. После высыхания нанесите полоску прозрачной ленты на покрытый участок. Начните с одного края лака и постепенно наносите ленту по поверхности, аккуратно нажимая для хорошего прилипления и избегания пузырьков или складок. Используйте нитриловые перчатки, чтобы избежать отпечатков пальцев.
7. Аккуратно снимите ленту вместе с плёнкой лака для ногтей (эпидермальный отпечаток).
8. Поместите скотч (липкую сторону вниз) на чистый микроскопический стекло, избегая складок и перекрытий.
9. Храните подготовленные слайды при комнатной температуре, защищённые от пыли и прямого солнечного света.
10. Осмотрите стекло под микроскопом с компаундным световым микроскопом при увеличении в 400 раз. Сохраняйте изображения согласно программному руководству вместе с соответствующим масштабом.

3. Подготовка и просмотр очищенных участков

1. Отрежьте листовые кусочки примерно 1 см². Выполняйте все шаги в нитриловых перчатках и под вытяжкой для выпарения.
2. Перенесите образцы в маркированный флакон, покройте их фиксирующим раствором (4% глутарного альдегида в буфере 0,1 M фосфат, pH = 6,9) (ВНИМАНИЕ) и храните при 4°C в течение 24 часов (Таблица 1, для приготовления фиксирующего раствора).
3. Удалите фиксирующий раствор пипеткой и облейте образцы дистиллированной водой. Оставьте на 30 минут. Повторите три раза (рисунок 2A–C).
4. Удалите воду и закройте образцы раствором NaOH с 1 м (растворите 20 г NaOH в 0,5 л дистиллированной воды).
5. Во время очистки листьев раствор NaOH становится зелёным. Заменяйте раствор NaOH раз в день на свежий. Продолжайте в течение 3–4 дней, или пока образцы не станут бледно-жёлтыми и раствор NaOH не останется чистым (рисунок 2D-F).
6. Удалите раствор NaOH и покройте образцы отбеливателем (5% NaClO). Коммерческий бытовой отбеливатель с такой концентрацией подойдёт.
7. Инкубировать образцы в отбеливателе 1-2 минуты. Образцы становятся белыми и полупрозрачными (рисунок 2G-I).
8. Снимите предыдущий раствор и накройте образцы дистиллированной водой на 2 минуты. Сушить образцы с помощью серии сортированного дистиллированного водного этанола следующим образом: 75:25, 50:50, 25:75 и 100% этанола.
9. Удалите этанол и покройте образцы 3% спиртовым раствором толуидина синего O (TBO, растворите 3 г TBO в 100 мл 100% этанола). Уезжай на ночь.
10. Удалите раствор для окрашивания и накройте образцы 100% этанолом на 2 минуты. Повторите этот шаг с использованием серии градуированной дистиллированной воды-этанола следующим образом: 25:75, 50:50, 75:25, и, наконец, дистиллированная вода (рисунок 2J-L). См. рисунок 3 для распространённых ошибок и шагов устранения неполадок, связанных с процессом очистки.
11. Держите образцы в дистиллированной воде при 4°C до просмотра.
12. Перенесите образцы на стеклянный стекло, добавьте каплю дистиллированной воды и накройте стеклянную накладку для микроскопического осмотра и визуализации.
13. Осмотрите стекло под микроскопом с компаундным световым микроскопом при увеличении в 400 раз. Сохраняйте изображения согласно программному руководству вместе с соответствующим масштабом. См. таблицу материалов для получения дополнительной информации.

4. Анализ и измерения изображений

1. Используйте Fiji²³ (дистрибутив ImageJ, версия 1.54p) для обработки и анализа изображений.
2. Используя инструмент «Линия», нарисуйте линию над полосой масштаба, затем выберите «Анализировать» > «Установить масштаб», измените известное расстояние до длины полосы масштаба и измените единицу длины на μm.
3. Перейдите к анализу > набору измерений. Убедитесь, что параметры площади и диаметра ферета проверены.
4. Используйте инструмент выбора полигонов , чтобы обвести объект интереса. Запишите измерение, нажав клавишу M .
5. Измерьте следующие черты устьица и эпидермсы на Фиджи и рассчитайте как очищенные образцы, так и пилинги устьица (рисунок 3).
6. Вычислим количество устьиц (Ns).
   1. Определите среднюю область устьица (As).
   2. Определите среднюю ширину устьица (Ws): используя минимальный диаметр Ферета.
   3. Вычислим плотность устьица (SD) по следующей формуле:
      
      ; на единицу Ia (площадь листа, выбранная для измерений, мм²).
   4. Определите среднюю площадь эпидермальных клеток (Ae).
   5. Определите плотность эпидермальных клеток (ECD) по следующей формуле:
      

5. Статистика

1. Используйте пост-хок тест ANOVA и Tukey HSD для проверки различий между выборочными группами.
2. Проведите все статистические анализы в^{R 21}.
3. Проанализируйте в общей сложности 3 реплицированных листья на каждый вид и посмотрите по 3 кожуры каждого листа.

6. Анализ с помощью ИИ

1. Выберите инструменты машинного обучения для сегментации.
   1. Выберите подходящие инструменты сегментации на основе машинного обучения на основе целевой структуры (устьица или эпидермальные клетки), качества изображения и целей анализа.
   2. Используйте специфическую модель глубокого обучения, специфичную для стомат, для автоматического обнаружения и измерения черт устьица, а также универсальные инструменты глубокого обучения или сегментации на основе пикселей для сегментации эпидермальных клеток.
   3. См. раздел «Инструменты машинного обучения и программное обеспечение» для конкретных программных реализаций (дополнительный файл).
   4. Провести пилотное тестирование на подмножестве изображений перед масштабным анализом для оценки эффективности сегментации и выявления потенциальных источников ложноположительных результатов.
2. Подготовьте вычислительную среду.
   1. Используйте рабочую станцию с процессором на 8-12 ядер, не менее 32 ГБ оперативной памяти и видеокартой с поддержкой NVIDIA CUDA и минимум 24 ГБ видеопамяти.
   2. Используйте дисплей высокого разрешения (желательно 4K) для облегчения аннотации и визуального осмотра.
   3. Устанавливайте все выбранные программные инструменты в соответствии с инструкциями разработчиков и записывайте версии программного обеспечения для обеспечения воспроизводимости.
3. Подготовьте изображения для анализа машинного обучения.
   1. Импортируйте микроскопические изображения в форматах TIFF или PNG, используя 8- или 16-битные оттенки серого, когда это возможно.
   2. Убедитесь, что каждое изображение содержит видимую шкалу или было пространственно откалибровано перед анализом.
   3. Выберите интересующие области с минимальным количеством мусора, складок или пузырьков воздуха, равномерным освещением и чётко очерченными границами клеток.
   4. Исключайте изображения с размытыми краями, яркими тенями или низким контрастом, так как это снижает точность сегментации.
4. Выполните сегментацию устьица.
   1. Загрузите изображения в модель глубокого обучения, специфичную для стомат (дополнительный раздел файла 1).
   2. Настройте параметры обнаружения, включая ограничения размера объекта и пороги доверия, в зависимости от вида и разрешения изображения.
   3. Запускайте автоматическое обнаружение для сегментирования устьичных комплексов и извлечения выходных метрик, таких как количество устьица, площадь и диаметры Ферета.
   4. Экспортные сегментационные маски и таблицы измерений для дальнейшего анализа. Визуально осматривайте сегментационные наложения и при необходимости вручную исключайте неправильно обнаруженные объекты.
5. Проведите сегментацию эпидермальных клеток.
   1. Загрузите изображения в универсальный инструмент для сегментации глубокого обучения или пиксельный классификатор (разделы дополнительного файла 2–4).
   2. Обучите или тонко настройте модель с использованием репрезентативных изображений с вручную аннотированными примерами эпидермальных клеток, границ клеток и фона.
   3. Запустите сегментацию для генерации масок объектов и экспорта маски для постобработки в ImageJ/Fiji или аналогичном программном обеспечении для анализа изображений.
   4. Применяйте фильтрацию на основе размера или квантилов для удаления мелких ложноположительных объектов и проверки точности сегментации с помощью визуального осмотра перед извлечением метрик эпидермальных клеток, таких как площадь клетки и плотность клетки.
6. Документируйте параметры и проводите контроль качества.
   1. Записывайте все версии программного обеспечения, настройки параметров, пороги фильтрации и аппаратные характеристики, используемые при анализе.
   2. Сохраняйте репрезентативные наложения сегментации для качества сегментации.
   3. Визуально проверяйте автоматизированные результаты сегментации перед статистическим анализом или отчетностью по данным.
7. Подготовка изображений для всей обработки машинного обучения
   1. Образцовая визуализация
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку сегментация на основе машинного обучения основана на градиентах интенсивности, непрерывности рёбер и согласованной геометрии объекта, а не на биологическом контексте, предварительная обработка изображений и выбор региона критически определяют производительность модели и структуру ошибок.
      1. Снимайте высококачественные изображения очищенных или облупившихся поверхностей листьев с видимой полосой масштаба. Для эффективных рабочих процессов машинного обучения убедитесь, что измеряемые объекты чёткие, непрерывные и с высоким контрастом по всему изображению.
   2. Выбор региона и качество изображения
      ПРИМЕЧАНИЕ: После получения изображений в разделе 6.7.1 изображения визуально осматриваются, а если позволяет масштаб изображения, для дальнейшей сегментации вручную выбираются области интереса без артефактов. Выбранные области интереса с минимальным количеством артефактов (например, мусор, складки, пузырьки воздуха, неравномерное освещение). Для устьичных моделей (например, StoManager1) отдавайте приоритет четкой видимости пор и чётко очерченному силуэту защитной ячейки. Для эпидермальных моделей (например, Cellpose, ilastik) обеспечьте стабильные градиенты интенсивности вдоль контуров клеток; Разрывные или низкоконтрастные края значительно снижают производительность сегментации. Изображения с плохо определёнными границами следует исключать или перерабатывать до сегментации.
   3. Формат файла
      Сохраняйте файлы в форматах TIFF или PNG (рекомендуется 8- или 16-битные оттенки серого для сегментации).
   4. Опциональное улучшение изображения
      1. Увеличьте контраст или уберите фон в ImageJ/Fiji, если границы слабы.
      2. Сосредоточьтесь на геометрии рёбер, так как она может создавать ложные градиенты, интерпретируемые как границы ячеек.
      3. Применяйте такие корректировки последовательно ко всем изображениям в наборе данных.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Особое внимание следует уделять геометрии краёв, поскольку тени, ореоли или неровные фоновые градиенты могут создавать искусственные переходы интенсивности, которые модели машинного обучения могут ошибочно интерпретировать как границы ячеек.
8. StoManager1 (версия GUI v1.0.0)
   ПРИМЕЧАНИЕ: StoManager1 обеспечивает автоматизированное высокопроизводительное обнаружение, измерение и анализ устьица листьев растений с помощью сверточных нейронных сетей (YOLOv8-seg-x). Инструмент количественно оценивает ключевые метрики устьица (площадь, плотность, соотношение пор/защитных клеток, индексы агрегации и др.) из различных типов изображений, снижая ручные усилия и смещения, а также способствуя проведению крупномасштабных экологических и физиологических исследований. Доступно удобное приложение для Windows, не требующее навыков программирования, кроме необязательной постобработки (Дополнительный файл, раздел 1)²³.
   1. Запуск StoManager1: установка и настройка
      1. Доступ через GitHub (https://github.com/JiaxinWang123/StoManager1) или отдельное приложение Windows ((Дополнительный раздел файла 1)(https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.7686022)²³.
      2. Обеспечить совместимость версий библиотек (зависимости Python); конфликты могут возникать, если установлена другая программная программа для машинного обучения или образов.
   2. Запустите StoManager1 через GUI или командную строку.
   3. Выберите папку ввода, содержащую изображения листьев.
   4. Выбор модели; Проверьте модель YOLOv8-seg-x для более подробных метрик на основе сегментации. Не отмечайте для модели ограничивающих рамок (YOLOv3), меньше метрик.
   5. Настройка параметров; Регулируйте пороги обнаружения, разрешение изображения, расширение маски и лимиты размера объекта в зависимости от вашего метода/вида изображения. Пожалуйста, используйте стандартные параметры, когда некоторые объекты стомат остаются необнаруженными, главным образом (1) снижайте порог доверия к обнаружению для восстановления большего количества истинных устьица при проверке ложноположительных результатов; и (2) увеличивает разрешение изображения, поскольку большее значение может улучшить обнаружение мелких устьица за счёт большей вычислительной нагрузки.
   6. Сегментация забегов:
      1. Нажмите « Начать процесс», чтобы обнаружить, сегментировать и измерить устьицы и целую устьицу.
      2. Нажмите «Статистический анализ», чтобы обработать статистику на уровне группы.
   7. Собирайте результаты. Выход сохраняется в YOUR_OUTPUT_PATH/Predict-output/Output_csv/ (режим сегментации) или напрямую в YOUR_OUTPUT_PATH (режим ограничивающей коробки). CSV-файлы содержат метрики для каждого объекта и сводные показатели; Также создаются маски и изображения результатов.
   8. Запустить пакетную обработку.
   9. После завершения соберите выходные данные: маски сегментации и файлы результатов CSV для каждого изображения. Результаты на каждом изображении включают: количество устьица и площадь устьица, диаметр ферета (макс/мин), метрики защитной клетки, индексы агрегации/равномерности/дивергенции и соотношение пор/защитных клеток.
   10. Просмотрите результаты в Excel, R или Python для получения дополнительной статистики и визуализации.
   11. Контроль качества; Визуально осматривайте маски и наложения. При необходимости удалять выбросы по размеру, форме или ручной кураторской обработке (см. ниже).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные протоколы и этапы постобработки для Cellpose и ilastik приведены в дополнительном файле. Для оптимальной производительности с большими наборами данных и сложными изображениями мы рекомендуем систему с процессором 8-12 ядер, не менее 32 ГБ оперативной памяти и видеокартой с поддержкой NVIDIA CUDA и минимум 24 ГБ видеопамяти. Для эффективной аннотации и визуализации также настоятельно рекомендуется большой дисплей высокого разрешения (желательно 4K).

Результаты

Сравнение результатов между очисткой и очисткой

И T. officinale , и F. excelsior демонстрировали вариабельность в чертах устьица и эпидермии в зависимости от того, были ли образцы очищены или очищены (рисунок 4). Очищенные образцы обычно обеспечивали более чёткие границы клеток и более чёткое визуализирование формы защитной клетки и отверстия пор, хотя перекрывающиеся слои ткани иногда скрывали мелкие устьицы и смещили оценки размера вверх. У F. excelsior средняя площадь устьиц и ширина промица были значительно выше в очищенных образцах, чем в пилингах, тогда как у T. officinale существенных различий не наблюдалось. Плотность устьица была значительно выше в очищенных образцах F. excelsior, в то время как эффект метода у T. officinale не был обнаружен. Площадь эпидермальных клеток не различалась между методами ни у одного из видов, но плотность эпидермальных клеток была немного выше в очищенных образцах F. excelsior.

В целом, различия, зависящие от метода, были специфичны по признакам и виду, что свидетельствует о том, что очистка является надёжным вариантом измерений устьиц, особенно если размер устьица варьируется (например, в развивающихся листьях), а эпидермальные признаки в основном не затронуты (см. рисунок 5).

Результаты ИИ и их связь с методами очистки и очистки

Специфическая для стомат модель StoManager1 более надёжно обнаружила устьицы на отслоенных изображениях (рисунок 6), тогда как производительность заметно снизилась на очищенных образцах (рисунок 7). Для дальнейшей оценки эффективности StoManager1 в различных методах подготовки мы сравнили обнаружение черт устьица у T. officinale и F. excelsior , используя как пилинги, так и очищенные изображения (рисунок 8). В T. officinale модель надёжно обнаружила присутствие и плотность устьица в различных методах приготовления. Однако полученные значения значительно отличались от ручных измерений (Таблица 2 и рисунки 5 и 8). Большинство признаков устьица значительно различались (p < 0,05) между очищенными и очищенными образцами (рисунок 8), что указывает на высокую чувствительность конвейеров для обнаружения ИИ к методам подготовки и требует тщательной валидации перед масштабным применением. В отличие от этого, у F. excelsior обнаружение ограничивалось абаксиальной поверхностью из-за отсутствия адаксиальных устьица, а в очищенных образцах обнаружение было непоследовательным, с частыми ложноположительными результатами (см. рисунок 8). Эти результаты подчёркивают сильное влияние видоспецифических анатомических особенностей и качества изображения на эффективность анализов на основе искусственного интеллекта. Универсальные инструменты машинного обучения, такие как Cellpose (рисунок 9A) и Ilastik (рисунок 9B), более эффективно сегментировали эпидермальные клетки на очищенных изображениях, чем на очищенных. Однако оба инструмента дали множество ложноположительных результатов при обеих методах подготовки (шелинг и очистка), особенно при условиях низкоконтрастного контраста или при размытии контуров клеток. В таких случаях нечеткие контуры устьица или эпидермса часто были чрезмерно сегментированы на несколько крошечных объектов, ошибочно классифицированных как отдельные эпидермальные клетки (см . рисунок 10). В результате постобработка необходима не только для удаления выбросов, но и фильтрации по верхним квантилям, чтобы надежно идентифицировать клетки.

Рисунок 1: Кожурные кожуры устьица листьев F. carica до и после удаления трихомы с помощью лезвия бритвы. Крупные трихомы могут оставлять отпечатки на кожуре, образуя воздушные карманы, которые вызывают неровные поверхности и мешают равномерной фокусировке (видимыми крупными серыми точками). F. carica был включён в исключение для расширения протокола на волосатые листья. (A) При увеличении 200x изображение перед удалением трихомы частично заблокировано отпечатками трихома. (B) Качество изображения улучшается после удаления трихом. (C) При увеличении изображения до 400-кратного увеличения удаление трихома в большинстве случаев блокируется отпечатками трихома. (D) Непроходимость минимальна на изображении после удаления трихомы лезвием бритвы. Масштабные планки 100 мкм (A, B) и 50 мкм (C, D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Последовательные этапы протокола очистки. Репрезентативные изображения T. officinale, F. excelsior и F. carica иллюстрируют последовательные этапы протокола очистки. (Кондиционер) Свежие листья. (Д-Ж) уходит после согласования с NaOH. (G-I) уходит после отбеливания NaClO. (J-L) уходит после нанесения толуидиновой синей O. Этот наглядный пособие показывает ожидаемый вид образца перед переходом к следующему этапу и подчёркивает изменчивость протокола между видами. F. carica был включён в список исключений для демонстрации применимости протокола к более широкому спектру морфологий листьев и жилок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Примеры измерений устьиц и эпидермальных признаков. Измеренные признаки показаны на изображении следующим образом: As = устьица; Ls = длина устьица; Ws = ширина устьица; Ae = площадь эпидермальных клеток. Плотность устьиц и эпидермальных клеток рассчитывались в отмеченной области, как описано в протоколе. Изображение с увеличением в 400 раз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Сравнение изображений, полученных с помощью протокола очистки и процедуры очистки. Репрезентативные изображения T. officinale и F. excelsior , сравнивающие изображения очищения и пилинга, показывающие видимость и вариабельность размера и плотности клеток устьица и эпидермиса. Масштабная полоса 50 мкм, изображения сделаны при увеличении 400x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Различия в результатах ручного измерения признаков между протоколами очистки и очистки. Коробочные диаграммы, показывающие различия в чертах устьиц и эпидермии между методами очищения и эпидермального шеления у T. officinale и F. excelsior. (A) средняя площадь устьица (B) средняя ширина устьица (C) плотность устьица (D) средняя площадь эпидермальных клеток и (E) плотность эпидермальных клеток. Звёздочки указывают уровни статистической значимости (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,001). Статистическая значимость оценивалась с помощью одностороннего ANOVA, после чего следовал пост-хок тест Тьюки с HSD. Размер выборки по группе: n = 3-5. Сокращения: As = устьица; Ws = ширина устьица; SD = плотность устьица; Ae = площадь эпидермальных клеток; ECD = плотность эпидермальных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Пример результатов сегментации с использованием модели обнаружения устьица на образце пилинга. Результат сегментации StoManager1 для очищенного образца T. officinale (нижняя сторона зрелого листа, подвергшегося тени), показал хорошую точность обнаружения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Пример результата сегментации с использованием модели обнаружения устьица на очищенном образце. Результат сегментации StoManager1 для очищенного образца T. officinale (нижняя сторона зрелого листа, подвергшённого теню), показал более низкую точность обнаружения по сравнению с очищенными образцами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8: Различия в результатах измерения признаков с помощью ИИ между протоколами очистки и очистки. Квадратные графики, показывающие измерения анатомических черт устьица, полученные с помощью ИИ, полученные по изображениям, обработанным StoManager1 в T. officinale и F. excelsior. К признакам относятся область устьица (As), ширина устьица (Ws), длина устьица (Ls) и плотность устьица (Ds). Единицы как на рисунке 5. Статистическая значимость оценивалась с помощью одностороннего ANOVA, после чего следовал пост-хок тест Тьюки с HSD. Звёздочки указывают уровни статистической значимости (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,001). Размер выборки по группе: n = 3-5. Сокращения: As = устьица; Ws = ширина устьица; Ls = длина устьица; Ds = плотность устьица. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 9: Скриншоты сегментации с помощью универсального инструмента глубокого обучения и пиксельного классификатора. Сегментации образца F. excelsior (абаксиальная поверхность листа) с помощью (A) универсального инструмента глубокого обучения (Cellpose (cyto2)) и (B) пиксельного классификатора (ilastik). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 10: Сегментационная маска Ilastik для очищенного образца F. excelsior (абаксиальная сторона листа), с многочисленными ложноположительными результатами. Крошечные точки ошибочно классифицируются как отдельные эпидермальные клетки. Во время постобработки требуется ручная (визуальная) проверка для установления порогов на основе размера и эффективной фильтрации ложных срабатываний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Решение	Приготовление	Последний том
Основание для буфера 1	7,12 г (Na 2HPO4 *2H2O) на 200 мл дист. H2O	200 мл
База для буфера 2	7,12 г Na2HPO 4 *2H2O) в 200 мл дист. H2O	200 мл
Фосфатный буфер	Смешайте 36 мл основания 1, 14 мл основания 2 + 50 мл дист. H2O	100 мл
Фиксирующее решение	Смешайте 9,25 мл 5% глутаральдегида с 12,5 мл фосфатного буфера и 28,25 мл дист. H2O	50 мл

Таблица 1: Рецепт фиксирующего раствора²⁴. Состав растворов, использованных в этом исследовании.

Виды	Бок	Метод	Мужчина (As)	ИИ (AS)	Мужчина (Ws)	AI (Ws)	Мужчина (L)	ИИ (L)
Фраксин	Абаксиальный	Пил	177.43	9.32	12.71	2.85	17.58	3.58
Тараксакум	Абаксиальный	Очищено	408.09	18.84	20.1	4.19	26.14	5.39
Тараксакум	Абаксиальный	Пил	262.54	13.93	15.18	3.47	22.2	4.68
Тараксакум	Адаксиальный	Очищено	414.48	14.91	20.11	3.44	26.09	5.71
Тараксакум	Адаксиальный	Пил	258.72	11.37	15.72	3.3	21.15	4.08

Таблица 2: Индикативные сравнения ручных измерений и ИИ. Масштабируемые результаты ML (StoManager1). Человек и ИИ соответственно указывают на результаты ручного и ИИ (StoManager1). Единицы как на рисунке 5. Ручные и искусственно-интеллектные измерения существенно различаются. Некоторые сравнения недоступны по разным причинам, включая отсутствие устьица (например, адаксиальный F. excelsior) или неудачное обнаружение (например, устьицы было сложнее обнаружить в очищенных образцах из-за более размытых контуров клеток).

Дополнительный рисунок 1: Примеры распространённых ошибок, возникающих при расчистке листьев, влияющих на результаты. Изображения, показанные для устранения неполадок: (A) неравномерное окрашивание из-за неполной регидратации образца в разделе 3.10; (B) механические повреждения, вызванные неправильным обращением с химически обработанным очень хрупким образцом; (C) зелёный оттенок в центре образца из-за неполного удаления хлорофилла в разделе 3.5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту фигурку.

Дополнительный рисунок 2: Пример пользовательского интерфейса StoManager1. Скриншот пользовательского интерфейса StoManager1, показывающий таблицу настройки ввода и результатов (слева), а также микрофотографии с оригинальными изображениями (вверху справа) и наложением обнаружения устьица (внизу справа, адаксиальная поверхность отшелённого образца T. officinale ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту фигурку.

Дополнительный рисунок 3: Пример пользовательского интерфейса Cellpose. Скриншот сегментации Cellpose в процессе через графический интерфейс с регулируемыми параметрами (например, выбор модели — рекомендуемая предварительно обученная модель Cyto2 или специально обученная модель, пороги и калибровка диаметра ячейки). Контролируемое ручное аннотирование эпидермальных клеток выделяет каждую ячейку уникальным цветом для направляющей калибровку модели. Наложение показывает сегментацию абаксиального эпидермального шелья F. excelsior . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту фигурку.

Дополнительный рисунок 4: процесс сегментации Ilastik. Наложение иллюстрирует классификацию на основе пикселей на изображениях абаксиального эпидермиального пилинга F. excelsior . (A) Скриншот сегментации иластика в процессе, показывающий контролируемое обучение с вручную маркированными классами: эпидермальные клетки (жёлтый), контуры клеток (синий) и неэпидермальный фон, такой как трихомы (красный). (B) Скриншот, показывающий только класс эпидермиса (жёлтый), иллюстрирующий, как классификатор изолирует отдельные эпидермальные клетки. Обратите внимание на наличие множества ложноположительных «крошечных» обнаружений, особенно в областях с низким контрастом или неравномерным освещением. (C) Скриншот, показывающий только контурный класс (синий), иллюстрирующий, как классификатор изолирует границы клеток от окружающей эпидермальной ткани. Обратите внимание, что некоторые контуры являются прерывистыми, и возникают многочисленные ложноположительные «крошечные» обнаружения, особенно в областях с низким контрастом или неравномерным освещением. (D) Скриншот с фоновым классом. Маска выделяет устьичные комплексы, железистые трихомы и различные остатки (красные), исключая тела эпидермальных клеток. Многочисленные небольшие ложноположительные «крошечные» обнаружения видны в эпидермических областях, возникающие из-за артефактов в оттенках серого и неправильной классификации по текстуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту фигурку.

Дополнительный рисунок 5: Настройки тренировки для клетки . Пример настроек обучения Cellpose (GUI) для очищенного образца T. officinale (обе поверхности листа), показывающих стандартные параметры модели до корректировки. Выбирается предварительно обученная модель cyto2 с скоростью обучения 0,1 и 100 обучающих эпох (значения по умолчанию), которые определяют скорость обновления весов модели и количество проходов обучения соответственно. Эти стандарты обычно модифицируются (например, скорость обучения = 0,15; эпохи = 12) для сокращения времени обучения и адаптации модели к морфологии эпидермии растений; однако более низкие эпохальные показатели могут снизить эффективность обнаружения и увеличить количество ложноположительных результатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту фигурку.

Дополнительный рисунок 6: Маска «меток» клеточной позы. Применение маски Cellpose «метки» для обложенного образца F. excelsior (поверхность абаксиального листа), показывающего результат контролируемой тренировки, при которой каждому сегментированному объекту присваивается уникальный идентификатор. Эпидермальные клетки (отмеченные как e) доминируют, а также обнаруживаются пары защитных клеток устьица (отмечены g). Ложноположительные результаты проявляются там, где трихомы ошибочно классифицируются как эпидермальные клетки (верхний левый) или устьицы (нижний центр), а также ложноотрицательные случаи, когда эпидермальные клетки остаются немаркированными на некоторых участках изображения. Этот тип маски используется для дальнейшей количественной оценки и уточнения контролируемых моделей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту фигурку.

Дополнительный рисунок 7: Количественная оценка сегментированных эпидермальных клеток в ImageJ/Fiji. Скриншоты, показывающие количественную оценку сегментированных эпидермальных клеток после классификации пикселей ilastik для облупленного образца F. excelsior (абаксиальная поверхность листа). (A) В экспортированной маске каждый обнаруженный кластер пикселей соответствует отдельной частице, что позволяет автоматически извлекать метрики на уровне объекта (например, площадь, периметр, диаметры Фере). Окно Results (внизу) отображает исходные измерения для тысяч объектов; Обратите внимание на исключительно большое количество мелких частиц, возникающих из-за «крошечного» точечного шума и фрагментарных контуров, что указывает на наличие множества ложноположительных результатов. Эти артефакты требуют последующего биологически обоснованного фильтрирования для выделения истинных эпидермальных клеток перед следующим статистическим анализом. (B) Фильтрация по площади эпидермических объектов, сегментированных иластиком, в ImageJ/Fiji. Мелкие фрагменты и шум исключаются при применении минимального порога площади 150–350 мкм², что уменьшает количество обнаруженных частиц примерно на порядок (десятикратно) относительно нефильтрованной маски в панели A. Хотя этот этап фильтрации существенно удаляет крошечные ложноположительные результаты, несовершенная классификация сохраняется: фрагментированные контуры и остаточные неэпидермические элементы остаются и требуют дополнительной доработки, такой как порог круговой формы или биологически обоснованное постскрининговое тестирование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту фигурку.

Дополнительный рисунок 8: Постобработка маски «меток» Cellpose в ImageJ/Fiji. Используя плагин Labels to ROIs для отложенного образца F. excelsior (поверхность абаксиального листа), каждый сегментированный объект в маске преобразуется в область интереса (ROI), что позволяет проводить индивидуальный осмотр и измерение эпидермальных клеток и комплексов клеток защиты устьица. ROI наложены на оригинальную микрофотографию (слева), а окно Results (внизу справа) отображает метрики на уровне клеток (например, площадь, диаметры Фере, периметр). Этот этап позволяет биологически обоснованно курировать, позволяя пользователям проверить, соответствует ли каждый ROI истинной эпидермальной клетке, и избавиться от артефактов, таких как трихомы или неправильно сегментированные устьицы, сохраняющиеся после пороговой фильтрации, тем самым информируя последующие этапы анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту фигурку.

Обсуждение

Для согласованных измерений устьица следует брать кожуру из центральной пластинки для получения стандартизированных результатов, избегая крупных жилок, так как плотность устьица демонстрирует сильное изменение внутри листьев, уменьшающееся к основанию, кончику и краям^{листа 25,26}. Свежие листья дают самые надёжные очистки, при условии, что для предотвращения искажений или артефактов используются неусадкивые, прозрачные лаки и высококачественная прозрачная лента. Задержки свыше ~12 ч снижают чёткость контуров за счёт обезвоживания. Поскольку пилинги временно устанавливаются и могут удерживать воздух, рекомендуется раннее обследование, но качество остаётся приемлемым и после месяца.

Существуют различные методы очистки для определённых типов тканей, целей визуализации и вопросов безопасности^{13, 14 и 15}. Химическая очистка проводилась с использованием водного протокола на базе NaOH для обеспечения доступности, низкой токсичности и широкой применимости для всех типов листьев. Поскольку реакции тканей различаются у разных видов, требуется тестирование и оптимизация. Склерофиллические листья могут потребовать ≥2 недели, а остаточная зелёная ткань может мешать окрашиванию и скрывать анатомические особенности (дополнительный рисунок 1C). Для более быстрого очищения концентрацию NaOH можно увеличить до 2,5 м или 5 м. Мягкие листья становятся хрупкими после отбеливания (раздел 3.7; Дополнительный рисунок 1B), а чрезмерное воздействие гипохлорита натрия (NaClO) может разрушать ткани или вызывать отделение эпидермальных слоёв. Хотя для большинства мягких листьев достаточно 30–2 минут отбеления, более выносливым видам может потребоваться до 1^{часа 27} часов. Хотя очистка идёт медленнее, чем подготовка кожуры, требует ~5 дней и не требует специализированной подготовки, её можно скорректировать для различных видов. Очищенные и окрашенные образцы можно хранить в дистиллированной воде при 4°C, при длительном сохранении рекомендуется постоянное крепление^15,27.

StoManager1, специфичный для устьиц, надёжно обнаружил устьичные комплексы на большинстве типов изображений (дополнительный рисунок 2), при этом результаты обнаружения в целом совпадают с ручной аннотацией для методов на основе пилинга. Однако измерения площади устьица систематически отличались от ручных измерений (Таблица 2), что требовало калибровки на основе небольшого ручного измерения подмножества (например, 10–20 устьица на вид) перед крупномасштабным анализом. StoManager1 значительно увеличивает пропускную способность, при этом требуется ручная проверка в нестандартных случаях.

Одновременная сегментация устьица и эпидермиса сложна, поскольку оптимальная резкость различается, а гетерогенность морфологии и прозрачности мембраны приводит к ошибке сегментации. Точно так же обучение на больших наборах изображений (например, адаксиальные/абаксиальные поверхности, очищенные/очищенные) теряет специфичность. Заранее обученная модель Cellpose для эпидермиса растений не существует; Стандартные модели «Cyto» и «Cyto2», обученные преимущественно на животных клетках, показывают слабые результаты на эпидермальных изображениях. Поэтому для надёжности требуется индивидуальное обучение (Дополнительный раздел 2). Даже после обучения чрезмерная сегментация и ложноположительные результаты остаются обычным явлением, особенно на изображениях с низким контрастом или неочищенными изображениями (дополнительный рисунок 3).

В ilastik (дополнительный раздел 3, дополнительный рисунок 4) маски объектов должны генерироваться для целевых классов клеток (например, класс 1 для эпидермиса), сохраняя маски классов для аудита и ручной коррекции. Пакетная обработка и последующие рабочие процессы ImageJ/Fiji могут сэкономить время и снизить ручные ошибки. Постоянная фильтрация по площади, стандартным отклонениям или квантилам необходима для подавления шума и ошибочных обнаружений. После фильтрации медианные площади и количество ячеек приближаются к ручным значениям. Бенчмаркинг с ручными измерениями и альтернативными инструментами машинного обучения (Weka, RootPainter) остаётся необходимым для настройки параметров и оценки качества сегментации. Пакетная обработка машинного обучения требует больших ресурсов. Стабильное обучение и крупномасштабная пакетная сегментация требуют видеокарты с поддержкой NVIDIA CUDA и ≥32 ГБ оперативной памяти. На системах среднего класса (например, 16 ГБ оперативной памяти с интегрированной графикой) контролируемое обучение обычно занимает ~5-10 минут для <10 изображений и часто вылетало при использовании нескольких классов аннотации или гетерогенных типов изображений. CUDA увеличил скорость обработки данных в ~10–20 раз по сравнению с выполнением процессора или интегрированной видеокарты.

Различия в производительности между Cellpose, ilastik и StoManager1 связаны с их разными представлениями признаков. Cellpose предсказывает векторные поля потока к центрам объектов и чувствителен к оптическим галонам и резким преломляющим границам, которые нарушают поток и создают скопления ложноположительных результатов у очищенного F. excelsior. Ilastik, как классификатор пикселей, управляемый человеком, пересегментирует высокорельефные стены или гало асфальта, если это не обозначено как фон. StoManager1 обнаруживает языковые комплексы с помощью форм на уровне объекта (парные защитные клетки с центральной поре) и хорошо работает на препаратах для пилинга, включая F. excelsior²⁸; однако гало-индуцированное размытие влияет на видимость пор при очистке, приводя к ложноотрицательным результатам, а не неправильной классификации (дополнительные разделы 1 и 3). Соответственно, Cellpose и StoManager1 работают как автоматизированные сегментеры, тогда как ilastik — как классификатор, управляемый человеком (раздел дополнительного файла 1-3)^28.

Архитектура клеток, специфическая для видов, регулирует производительность ИИ. У T. officinale гладкие, эллиптические края защитных клеток совпадают с распределением обучения StoManager1, что позволяет обнаруживать обнаруживать отшелённые образцы (дополнительный рисунок 2), тогда как универсальные инструменты часто путали защитные и покрытые клетки. У F. excelsior углублённые устьицы и клетки покрытия с высоким рельефом приводят к ложным отрицательным результатам на очищенных изображениях. Эти расхождения отражают геометрию визуализации, зависящую от вида и подготовки. Систематические различия между ручными и ИИ измерениями связаны с двумя причинами: отсутствием масштабного кодирования изображения ИИ и оптическими артефактами, вызванными подготовкой. Стратегии смягчения включают визуальную сортировку размытостей и ореолов при подготовке тканей, предпочтительное использование пилингов в условиях, описанных выше, ручную калибровку с линейной коррекцией на небольшой подгруппе устьица (ручной = a + b × AI). Дополнительные стратегии включают таксон-специфическое дополнение и проектирование вспомогательных классов для обучения (однако собственные обученные модели, скорее всего, останутся ниже заранее обученных моделей на крупных, разнообразных наборах данных), а также фильтрацию верхних квантилей после сегментации.

Поскольку ошибки сегментации ИИ систематически и не случайны, постобработка необходима. Диагностика качества изображения может следовать простому дереву решений. Начните с проверки контраста и резкости эпидермиса: если резко, переходите к ложноположительным результатам; Если размытые, ожидайте небольшие высокочастотные артефакты и регулируйте фильтры. Если ложноположительных результатов (например, точек, мусора) минимально, обычно достаточно фильтрации ±2-3 SD-выбросов. Если мелкие артефакты доминируют, используйте квантильную фильтрацию. Затем сравните распределение признаков (например, медиана Ae) с биологическими ожиданиями или ручными данными. Уточняйте пороги по мере необходимости — сохранение только верхних 10-50% квантилов в наборах данных с артефактами обеспечивает значимые результаты (дополнительныерисунки 7 и 8). Из-за высокого уровня ложноположительных результатов, производимых эпидермическими ML-инструментами, надёжные оценки плотности устьица не могли быть получены автоматически, тогда как StoManager1 предоставлял точные измерения^{устьица 28} при чётких границах (см. рисунки 6 и 7). Для эпидермальной медианы Ae оказался устойчивым, менее чувствительным к небольшим ложноположительным результатам, чем средний.

Выбор метода влиял на обнаружение признаков. Шелинг превосходил очистку по плотности устьица, полностью обнажая устьицы (рисунок 3), тогда как очищение часто скрывало мелкие устьицы в слоистых или пигментированных тканях, несмотря на то, что иногда лучше сохраняла форму^{устьица 27}. Среди инструментов искусственного интеллекта StoManager1 стабильно обеспечивал надёжные измерения устьица с минимальным курированием, особенно на препаратах для^{пилинга 23}, а шелинг также улучшил измерения эпидермиса, увеличив правильно идентифицированные клетки и покрытие изображения². Будущие достижения, скорее всего, будут получены благодаря крупным, таксономически разнообразным заранее обученным моделям для интеграции в автоматизированные конвейеры визуализации для экофизиологии и улучшения культур.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Дезинфицирующий жидкий очиститель NaClO < 5%	Доместос, Великобритания	H000023244	Ожоги на коже
Дигидрат дигидрата водородофосфата (Na2HPO4. 2H2O)	PENTA, CZ	10028-24-7	NA
Этанол, абс. 100% а.р.	Chem-Lab NV, BE	CL00.0505.1000	Сильно воспламеняющийся
Стеклянный флакон объёмом 2 мл	VWR Life Science, США	548-0045
Глутаральдегид 50% раствор	VWR Life Science, США	23H2856331	Смертельно при вдыхании. Токсично, если проглотить.  Надевайте защитные перчатки и nbsp; одежда,   Очки.
Микроскопические стекли	Нормакс, Пенсильвания	5470308A	NA
Топовое покрытие для ухода за ногтями быстро сохнет	BK (ИНЕЗА), лейтенант	LT-02244	NA
Nikon Eclipse E600 и Nikon DS0Fi1 5 МП	Корпорация Nikon, JP	https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-e600	NA
Наконечники пипеток и пипетки	Thermo Scientific, FI	KJ16047	NA
Однолезные стальные лезвия	Оксфордские инструменты	51-1625-0182	NA
Дигидрофосфат натрия (2PO4 . 2H2O) чистый	PENTA, CZ	13472-35-0	NA
Гранулы гидроксида натрия (NaOH) чистые	Merck KGaA, DE	1310-73-2	Тяжёлые ожоги.
Прозрачная лента для канцелярских товаров	ФОРОФИС, LV	91231	NA
Толуидин синий, универсальный класс	ThermoFisher Scientific, Великобритания	2045836	NA