Методическая статья

Серийный анализ убийства с использованием продольного импеданса измерения жизнеспособности опухолевых клеток — полезный метод оценки эффективности Т-клеток

DOI:

10.3791/69623

⸱

30 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Clinical Pharmacology, LMU University Hospital, 2Department of General, Visceral and Transplantation Surgery, LMU University Hospital, 3German Cancer Consortium (DKTK), Partner Site Munich, a partnership between the DKFZ and the University Hospital of the LMU, 4German Center for Lung Research (DZL), 5Einheit für Klinische Pharmakologie (EKLiP), Helmholtz Zentrum München - German Research Center for Environmental Health Neuherberg

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет импедансный анализ в реальном времени для количественной оценки способности и устойчивости серийного уничтожения CAR T-клеток при хронической стимуляции антигенами, включая метод промывания пластин для экономичного повторного использования пробных пластин.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Терапия клеточными рецепторами химерных антигенов (CAR) произвела революцию в лечении специфических гематологических злокачественных опухолей. Однако значительная часть пациентов испытывает рецидив из-за потери антигена, снижения регуляции антигена или истощения Т-клеток. Эти задачи подчёркивают необходимость функциональных анализов, которые могут оценить способность к уничтожению и устойчивость CAR T-клеток при хронической стимуляции антигенами. Серийные тесты на уничтожение, которые измеряют способность CAR Т-клеток многократно устранять опухоли, дают ценные данные о долговечности и эффективности ответов CAR T-клеток.

Здесь мы представляем импедансный анализ с использованием системы анализа клеток в реальном времени (RTCA) для количественной оценки серийного убийства, опосредованного CAR T-клетками, in vitro. Опухолевые клетки многократно засеиваются и даются прилипать к специфическим для анализа Е-пластинам перед добавлением CAR Т-клеток при определённых соотношениях эффектора к целевой (E:T). Платформа непрерывно контролирует жизнеспособность опухолевых клеток без меток, фиксируя динамическую цитотоксичность с высоким временным разрешением. Основные показатели включают кинетику индекса клеток (ДИ), скорость уничтожения опухолевых клеток и время до устранения цели. Постепенное снижение способности к уничтожению, наблюдаемое при повторных контактах с опухолями, служит маркером дисфункции приобретённых Т-клеток CAR, часто называемой истощением Т-клеток. Вместе эти метрики позволяют точно оценить функцию CAR T-клеток при различных соотношениях E:T и напрямую сравнивать различные конструкции CAR T-клеток или совместные методы лечения с течением времени.

Для повышения экономической эффективности мы разработали процедуру промывания пластин, которая позволяет повторно использовать анализные E-пластины без ущерба для производительности анализов или целостности данных. Оптимизированный рабочий процесс снижает стоимость анализа, сохраняя при этом аналитическую надёжность. Такой подход позволяет проводить доступную и масштабируемую доклиническую оценку функции CAR T-клеток, способствуя улучшению проектирования клеточной терапии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Терапия химерными антигенными рецепторами (CAR) Т-клеточной терапией произвела революцию в иммунотерапии рака с выдающимся клиническим успехом в различных гематологических опухолях, таких как хронический лимфоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, крупноклеточная B-клеточная лимфома и множественнаямиелома 1,2,3,4,5. С момента первых регуляторных одобрений количество продуктов CAR T-клеток и леченных пациентов стабильноросло 6. В зависимости от конкретного продукта и клинических показаний, типичные дозы инфузии варьируются примерно от 2 × 106до 5 × 108CAR+ Т-клеток напациента 7. Высокие дозы инфузии необходимы для эффективного удаления опухоли и долгосрочного контроля заболеваний, но связаны с клиническими и практическими трудностями. Большое количество клеток может увеличивать риск серьёзных побочных эффектов, таких как синдром высвобождения цитокинов (CRS) и синдром нейротоксичности, ассоциированный с иммунными эффекторами клеток (ICANS), оба из которых могут зависеть отдозы 8. Кроме того, производство достаточного количества функциональных CAR Т-клеток вызывает трудности для пациентов с интенсивной предварительной обработкой или лимфоделетами, и этот процесс может быть логистически сложным и дорогостоящим для лечебныхцентров 9.

Несмотря на эти трудности, терапии CAR T-клеток, направленные на CD19, достигают 70%-90% полной ремиссии у пациентов с рецидивом или рефрактерными В-клеточными злокачественными опухолями, демонстрируя трансформационный клиническийэффект 10,11,12. Однако терапия CAR T-клетками сталкивается с актуальными трудностями, ограничивающими её долгосрочную эффективность. Ключевые препятствия включают потерю или снижение регуляции антигенов, недостаточную устойчивость CAR T-клеток и функциональноеистощение 9. Истощение Т-клеток CAR — характеризующееся снижением пролиферативной способности, снижением противоопухолевой активности и плохой персистентностью — является жизненно важной причиной отсутствия ответа ирецидива 13. Истощённые Т-клетки CAR сопровождаются сниженной эффекторной функцией, устойчивой экспрессией ингибирующих рецепторов и нарушением выработки цитокинов из-за хронического воздействия антигена и иммуносупрессивных опухолевыхмикроокружений 14. Клинические исследования показали, что потеря функциональной персистенции Т-клеток CAR связана с повышенным рискомрецидива 11,15,16,17. Поскольку длительная in vivo активность, по-видимому, является важным предиктором терапевтического успеха, понимание долговечности и устойчивой способности CAR T-клеток является важной целью как в доклинических, так и в трансляционных исследованиях. Особый интерес представляет способность Т-клеток CAR многократно распознавать и лизировать опухолевые клетки в течение длительного времени — так называемое «серийное уничтожение» — поскольку это свойство обеспечивает функциональную меру устойчивости и устойчивости кистощению 18.

В этой статье представлен подробный протокол проведения серийных тестов с использованием платформы импеданса xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA), включая опциональную процедуру промывки, позволяющую повторно использовать пробные пластины, далее называемые E-пластинами, что повышает экономическую эффективность без ущерба для эффективности анализа. Обоснование разработки такого протокола связано с ограничениями традиционных анализов цитотоксичности, которые обычно содержат только статические конечные показатели. Распространённые методы, такие как высвобождение хрома-51, анализы лактатдегидрогеназы (ЛДГ) или анализы жизнеспособности на основе проточной цитометрии, требуют маркировки, включают трудоёмкие рабочие процессы и ограничены определёнными временнымиточками 18,19. Что ещё важнее, они не могут легко зафиксировать динамическую кинетику убийства при длительной стимуляции или нескольких циклах воздействия антигена, что напрямую связано с персистентностью CAR Т-клеток и функциональнымистощением 18.

Платформа xCELLigence RTCA устраняет эти пробелы, обеспечивая кинетический мониторинг жизнеспособности целевых ячеек без маркировки в реальном времени с помощью электрическогоимпеданса 20. Клеточные мишени опухолевых целей засеиваются на Е-пластинах, покрытых золотыми микроэлектродами, где их прикрепление и пролиферация увеличивают измеренный импеданс, сообщаемый как Клеточный индекс (CI)21. При уничтожении CAR T-опосредованной целевые клетки уничтожаются и отсоединяются, что приводит к быстрому снижениюимпеданса 20. Этот показатель в реальном времени позволяет непрерывно оценивать цитотоксичность в течение часов или дней без необходимости дополнительных маркировк илиреагентов 22. Т-ячейки CAR, будучи неадхеренсными, не участвуют в сигнале импеданса, что позволяет чисто разделить показания эффектора имишени 23. Поскольку данные записываются непрерывно, исследователи могут проводить многократные протоколы стимуляции, при которых CAR Т-клетки многократно переносятся и подвергаются воздействию свежих целевых клеток опухоли, что позволяет напрямую измерять эволюцию убийственной способности современем 24. Это имитирует повторяющиеся контакты с антигенами, которые испытывают CAR T-клетки in vivo , и даёт функциональный отчёт их цитотоксических способностей.

Этот тест серийного уничтожения на основе импеданса идеально подходит для исследователей, оценивающих функцию CAR T-клеток в доклинических условиях, включая оптимизацию конструкций, функциональные сравнения и тестирование потенции. Для этого протокола требуется система xCELLigence RTCA и использование E-Plate 96. Хотя он широко применим к моделям адгерентных опухолей, он не подходит напрямую для суспензионных культур без иммобилизации или стратегий привязки. Поскольку одни измерения импеданса отражают только прикрепление и жизнеспособность целевой клетки, рекомендуется проводить дополнительные анализы, такие как проточная цитометрия или анализы цитокинов для полной характеристики динамики активации, пролиферации и истощения CAR-Т-клеток. Протокол включает специальные этапы, позволяющие собирать клетки и супернатанты для этих дополнительных показаний, что позволяет более комплексно оценить функциональность CAR T-клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для E-Plate 96 и требует системы xCELLigence RTCA. Клеточные опухолевые клетки заранее засеиваются за ночь, чтобы достичь логарифмической фазы роста в момент добавления CAR T-клеток. В зависимости от линии опухолевых клеток и плотности посева этот интервал может быть сокращен до 6–9 часов, что позволяет добавлять эффектор в тот же день. Если выполняется последний рабочий процесс, номинальная графика, описанная в протоколе, изменяется, и пользователи должны адаптировать расписание соответственно. Ко-культуры поддерживаются в течение 48 часов, после чего CAR Т-клетки переносятся на свежепластинированные опухоли, требуя двух положений пластин на инструменте xCELLigence и чередуя покрытие опухолевых клеток и добавление эффектора через день. Т-клетки CAR должны генерироваться в соответствии с институциональными СОПами или установленными протоколами. Кратко: периферические Т-клетки отделяются по утверждённым этическим стандартам, трансдуцируются при соответствующих условиях биобезопасности и оцениваются на эффективность и жизнеспособность трансдукции с помощью проточной цитометрии или аналогичных анализов контроля качества. xCELLigence не следует проводить при эффективности трансдукции CAR ниже 20%, так как низкая эффективность может привести к увеличению фонового и неспецифического уничтожения нетрансдуцированными клетками, что может искажать кривые роста опухоли. Вся обработка клеток должна выполняться в стерильных условиях в ламинарной вытяжке. Носители могут использоваться по стандартам лаборатории или по рекомендации поставщика. Если не указано иное, клетки инкубируются при 37 °C в увлажнённой атмосфере с содержанием 5% CO₂. Хотя этот метод оптимизирован для CAR T-ячей, он также может применяться к другим эффекторным ячейкам на основе подвески и адгерирующих целях.

1. Подготовка и заготовка (День 1)

  1. Подготовка тарелки
    1. Добавьте 50 мкл опухолевой среды на дно каждой ямы E-пластины 96.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не поцарапать дно колодца, так как это может повредить пластину.
    2. Поместите E-образную пластину в инкубатор, разместив её в том же слоте для измерений.
    3. Инкубировать E-Plate в течение 30 минут при 37 °C, чтобы довести её до нужной температуры и pH.
  2. Настройка приборов
    1. Тем временем запустите RTCA Software Pro (версия 2.6.1) и выберите путь к файлу, чтобы сохранить эксперимент.
    2. Введите название эксперимента в поле «RTCA Operator» и сохраните.
    3. Выберите скважины для измерения.
    4. Назначьте имена ячеек во вкладке «Ячейки », а типы лечения — во вкладке «Лечение ».
  3. График измерений
    1. Настройте расписание следующим шагом:
      Название шага = пустое место; Свипы = 1 ; Интервал = 1 ; Продолжительность = 0:00
      Название шага = опухолевые клетки ; Свипы = 250-300 ; Интервал = 15 мин; Длительность = минимум 24 часа
      Название шага = Лечение ; Свипы = до 2500 ; Интервал = 5 мин; Длительность = минимум 72 часа
    2. Нажмите Apply и убедитесь, что Auto не выбрано ни для одного шага.
  4. Шаг заглушивания
    1. После 30-минутной инкубации E-Plate при 37 °C нажмите PLAY/RUN , чтобы запустить пустой шаг.
    2. Подождите, пока программа не пометит шаг ВЫПОЛНЕННЫЙ (примерно 1-2 минуты).
    3. Разблокируйте колыбель и снимайте E-пластину только тогда, когда будете готовы приступить к посеву клеток.

2. Раунд 1: Посев опухолевых клеток (День 1)

  1. Посев опухолевых клеток
    1. Подготовьте суспензию опухолевых клеток в 50 мкл соответствующей среды на каждую скважину.
    2. Вынимите E-пластину из инкубатора и засейте клетки в три экземпляры.
  2. Начальное измерение
    1. Немедленно верните E-образную пластину в машину и зафиксируйте люльку.
    2. Подождите 5–10 минут до первого измерения, чтобы уравновесить температуру и pH E-пластинки, затем нажмите кнопку PLAY/RUN , чтобы начать измерение (Шаг 2 графика = Опухолевые клетки).
    3. Инкубировать E-пластину ночью, чтобы клетка могла прикрепиться. Отслеживайте ненормализованный клеточный индекс (ДИ). Когда CI переходит в лог-фазу роста, переходите к следующему этапу. Эта фаза зависит от используемой клеточной линии и может зависеть от количества засеянных ячеек. Клетки BxPC3 (ATCC CRL-1687) были засеяны по 20 000 клеток на скважину, при этом рост в логарифмической фазе обычно достигался после 6–18 часов.

3. Раунд 1: Лечение Т-клетками CAR (День 2)

  1. Подготовка и посев Т-клеток
    1. Подготовьте необходимое количество CAR T-клеток в 100 мкл/скважину в человеческой Т-клеточной среде без экспансионных цитокинов (например, IL-2, IL-7, IL-15 и др.).
      ПРИМЕЧАНИЕ: эффективность трансдукции CAR измеряется один раз в начале эксперимента. Желаемое соотношение эффектора к мишени (E:T) устанавливается в зависимости от количества CAR⁺ Т-клеток относительно первоначально покрытых опухоли. Например, при соотношении E:T 1:1 с 50 % CAR⁺ Т-клеток и 20 000 опухолевых клеток BxPC3 необходимо покрыть 40 000 Т-клеток. Таким образом, соотношение E:T относится к начальному состоянию в начале серийного убийства; если не будут проведены дополнительные измерения, изменения E:T в последующих раундах остаются неизвестными. Изменения в пролиферации или выживаемости Т-клеток со временем, а значит и в соотношении E:T, считаются частью показателя серийного уничтожения. Если Т-ячейки делятся между раундами, коэффициент E:T пересчитывается пропорционально (например, разделение 1:1 после третьего раунда уменьшает начальное соотношение E:T до 1:1 в четвертом раунде). Если динамика E:T между раундами представляет интерес, по желанию можно покрыть дополнительные скважины для промежуточных измерений CAR % или функции эффектора. Удаление анти-CD3/CD28 Т-клеток с помощью магнитного разделения помогает снизить неспецифическое уничтожение. Также рекомендуется использовать Т-клетки в логарифмической фазе роста (обычно от 5 до 20 дней после стимуляции) и расширять клетки цитокинами как минимум за два дня до анализа, а не за день до процедуры.
    2. Скорректируйте эффективность трансдукции CAR между экспериментальными группами до минимального общего процента, смешивая их с нетрансдуцированными Т-клетками на основе анализа эффективности трансдукции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если у всех групп равная эффективность трансдукции, корректировка не требуется. Если проценты CAR⁺ различаются, количество Т-клеток на пластине рассчитывается так, чтобы каждая группа начиналась с одинакового эффективного количества CAR⁺ и CAR-ячеек . Это делается путем умножения желаемого количества клеток CAR⁺ (на основе соотношения E:T и опухолевого засеяння) на 100 и деления на измеренный процент CAR⁺ для каждой группы, а затем добавления нетрансдуцированных Т-клеток при необходимости для совпадения общего числа Т-клеток. Например, если в одной группе 50% CAR⁺ Т-клеток, покрыто 40 000 Т-клеток (20 000 CAR⁺ + 20 000 CAR⁺), а группа с 60% CAR⁺ Т-клеток покрыта 33 333 Т-ячейками, чтобы получить 20 000 CAR⁺ ячеек, добавляя 6 667 нетрансдуцированных Т-клеток для соответствия общему числу Т-ячеек первой группы (всего 40 000).
    3. По желанию, если нужно исследовать обработку цитокином или соединением, добавьте 20 мкл раствора, состоящего из человеческой Т-клеточной среды, и желаемого цитокина или соединения в 11-кратной конечной концентрации. Этот объём добавляется поверх стандартных 200 мкл, уже присутствующих в каждой яме (50 мкл для заполнения, 50 мкл для засевания опухолевых клеток и до 100 мкл для добавления Т-клеток). По данным производителя, E-Plate 96 поддерживает максимальный объём 243 мкл ± 5 мкл на колодцу, что делает общий объём 220 мкл приемлемым для таких опциональных обработок.
  2. Посев и измерение Т-клеток
    1. Снимайте E-образную пластину, открывая люльку только тогда, когда будете готовы добавить Т-элементы.
    2. Семя подготовил Т-клетки непосредственно на опухоли.
    3. Зафиксируйте люльку внутри измерительного устройства и отмените Шаг 2 в программном обеспечении RTCA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если шаг 2 не отменен, система продолжит измерять предыдущий шаг и останавливается только после его завершения, что приводит к потере точек данных.
    4. Дождитесь, пока шаг 2 будет отмечен как ГОТОВО.
    5. Нажмите кнопку PLAY/RUN, чтобы начать шаг 3 (Лечение) и подтвердить подсказку, нажав OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставление 15-30 минут равновесия после обработки (например, после посева или переноса клеток) перед началом следующего этапа измерения (до этапа 3.2.5) помогает минимизировать начальное отклонение, вызванное колебаниями температуры или pH в кривых роста.

4. Раунд 2: Посев опухолевых клеток (День 3)

  1. Подготовьте новую электронную пластину xCELLigence с 96 лунками, как описано в шагах 1.1 и 1.4.
  2. Семена свежих опухолевых клеток, как описано на шаге 2.
  3. Инкубировать E-пластину ночью, чтобы клетка могла прикрепиться.

5. Раунд 2: Перенос T-клетки CAR на вторую E-пластину (День 4)

  1. Переместить содержимое каждой скважины в соответствующую скважину с 96-колодной пластиной U-образного дна с помощью многоканальной пипетки. Будьте осторожны, чтобы не касаться электродов внизу E-пластины.
  2. Центрифуга при комнатной температуре 400 × г на 5 минут.
  3. При необходимости аккуратно аспирируйте супернатант и сохраняйте его для ферментно-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA).
  4. Суспензировать клеточную гранулу в 100 мкл свежей среды без расширяющихся цитокинов.
    ПРИМЕЧАНИЕ (по желанию): Т-ячейки теперь можно разделять (например, 50 мкл = 1:2) и использовать для дальнейшего анализа, например, для проточной цитометрии. Расщепление Т-клеток корректирует их пролиферацию во время анализа убийства xCELLigence. Это помогает сократить необходимое количество циклов до тех пор, пока усталость не станет очевидной. Рекомендуется проверять коэффициенты разделения между 2 и 4.
  5. Добавьте 100 мкл/скважиных Т-клеток в Е-пластину опухоли второго круга (50 мкл при разделении 1:2), обеспечивая полное пополнение среды и, если применимо, цитокина/соединения.

   

6. Продолжение анализа серийных убийств (дни 5–10 и далее)

  1. Повторяйте шаги 4 и 5 для дополнительных раундов убийств с интервалом в 48 часов.
  2. Отслеживайте убийственную активность и устойчивость Т-клеток на каждом этапе с помощью показаний xCELLigence и дополнительных анализов, таких как ИФА или потоковая цитометрия.

7. Сбор данных и обработка электронных пластин

  1. После желаемого срока измерения нажмите STOP в программном обеспечении.
  2. Экспортные данные нормализуются до точки добавления эффекторных элементов и не усредняются для точного построения среднего ± SEM в программном обеспечении анализа (R, GraphPad Prism и др.). Экспортируйте усреднённый набор данных, если хотите.
  3. Откройте и снимите E-образную пластину. Выпустите эксперимент в программном обеспечении.
  4. Очистить или хранить E-пластину в инкубаторе для дополнительных анализов (например, супернатант для ИФП или сбор клеток для проточной цитометрии).

8. По желанию: мойка электронных пластин для повторного использования

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот дополнительный шаг позволяет повторно использовать e-пластины xCELLigence для снижения экспериментальных затрат. Повторное использование рекомендуется только в том случае, если электрические свойства E-пластины остаются стабильными в экспериментах и до тех пор, пока отдельные скважины не попадут в допустимый базовый диапазон. Соблюдайте все меры безопасности, особенно при работе с гидроксидом натрия (NaOH). Визуально осмотрите E-пластины после промывки для выявления возможных неисправностей электродов.

  1. Выбросьте всё содержимое E-пластины, не касаясь её дна.
  2. Промыйте каждую колодцу три раза деионизированной водой по 200 мкл.
  3. Добавьте в каждую скважину по 200 мкл 0,1 млн NaOH.
    ВНИМАНИЕ: NaOH — коррозийный. Следите за соблюдением местных правил безопасности. Наденьте перчатки, пальто и защитные очки. Держите 1 M NaOH в защитном шкафу. Сбросьте отходы NaOH в раковину с течением воды для правильного разбавления. Никогда не смешивайте концентрированные кислоты и щелочки. Не добавляйте воду в кислоту; Только кислота к воде.
  4. Инкубировать E-тарелку при комнатной температуре в течение 5 минут.
  5. Промыйте каждую скважину не менее трёх раз деионизированной водой, чтобы удалить весь остаточный NaOH.
  6. Высушите E-пластину, аккуратно постукая ею по салфетке, затем сушите на воздухе.
  7. Простерилизуйте E-образную пластину под ультрафиолетовым светом внутри шкафа для биобезопасности не менее 1 часа или под УФ-облучением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите E-образную пластину так, чтобы колодцы были обращены прямо вверх. УФ-свет не проникает через пластиковые дна.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешное выполнение протокола даёт воспроизводимые импедансные показатели, отражающие жизнеспособность опухолевых клеток и цитотоксичность CAR T-клеток со временем. Рост клеток и цитотоксичность оценивались с помощью коммерческой системы RTCA. Данные экспрессировались в виде нормированного клеточного индекса (NCI), рассчитанного путём деления CI в каждой точке времени на CI в выбранное время нормализации. Время нормализации устанавливается непосредственно перед добавлением эффекторных ячеек. Время до зазора определяется ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод оценки цитототоксичности, опосредованной CAR T-клетками, в течение нескольких циклов воздействия антигена с использованием платформы xCELLigence RTCA. Позволяя продольно измерять жизнеспособность опухолевых клеток с помощью импеданса, этот подход фиксирует повторяющиеся цитотоксичные реакции — называемые серийным убийством — в формате без меток и непрерывно. Протокол разработан для мониторинга изменений функции эффектора Т-клеток со временем в ответ на после...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SK получил гонорары от Plectonic, TCR2 Inc., Miltenyi, Galapagos, Cymab, Novartis, Regeneron, BMS и GSK. СК является изобретателем нескольких патентов в области иммуноонкологии. SK получила лицензионные сборы от TCR2 Inc и Carina Biotech. SK получила исследовательскую поддержку от TCR2 Inc., Tabby Therapeutics, Catalym GmbH, Plectonic GmbH и Arcus Bioscience за работу, не связанную с рукописью. Все остальные авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TT, SM и NTTN получили гранты от фонда Else-Kröner Fresenius Stiftung (IOLIN). NTTN получил дополнительные гранты от Friedrich-Baur-Stiftung и Немецкой онкологической помощи (AvantCAR.de). MPT поддерживается Фондом Моники Кутцнер и Европейским исследовательским советом (MSCA Fellowship 101106951). SK поддерживается международной докторской программой «i-Target: иммунотаргетинг рака» (финансируемой Elite Network of Bavaria), Баварским центром исследований рака (BZKF) (TANGO to S.K.), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, номер гранта: KO5055-2-1 и KO5055/3-1), Альянсом исследований меланомы (грантовый номер 409510), Учебной сетью Marie Sklodowska-Curie по оптимизации терапии Т-клеточной терапии рака (финансируется программой Horizon 2020 Европейского Союза; грант 955575), Сеть обучения Марии Склодовской-Кюри по отслеживанию и контролю терапевтических иммунных клеток при раке (финансируется программой Horizon ЕС, грант 101168810), Фонд Эльзе Крёнер-Фрезениус (IOLIN), Немецкая онкологическая помощь (AvantCAR.de), Фонд Вильгельма Зандера, Фонд Эрнста Юнга, Институциональная стратегия LMU Excellent при LMU Мюнхен (в рамках Инициативы немецкого превосходства), инициатива Go-Bio, премия m4 Министерства экономических дел Баварии, Bundesministerium für Bildung und Forschung, EUROSTAR-Programm, Европейский исследовательский совет (Стартовый грант 756017, PoC Grant 101100460 и CoG 101124203), SFB-TRR 338/1 2021-452881907, Фонд Фрица-Бендера, Немецкий фонд Хосе Каррераса Leukämie Stiftung, Фонд Гектора, Баварский исследовательский фонд (BAYCELLATOR), Фонд Моники-Куцнер, Фонд Бруно и Хелены Йёстер (360° CAR), Фонд доктора Рурайнски и Фонд Бригитты и доктора Констанце Вегенер

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BxPC3ATCCCRL-1687
E-Plate 96Agilent 300600910
RTCA software Pro (Basic) Agilent Н/ДВерсия 2.6.1
xCELLigence RTCA MP - (Несколько номеров)Agilent Н/Д

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  2. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. N Engl J Med. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  3. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  4. Brudno, J. N., et al. T cells genetically modified to express an anti-B-cell maturation antigen chimeric antigen receptor cause remissions of poor-prognosis relapsed multiple myeloma. J Clin Oncol. 36 (22), 2267-2280 (2018).
  5. Gauthier, J., et al. Phase 1 study of CD19 CAR T-cell therapy harboring a fully human scFv in CAR-naïve adult patients with B-ALL. Blood Adv. 9 (8), 1861-1872 (2025).
  6. Mitra, A., et al. From bench to bedside: The history and progress of CAR T-cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  7. Rotte, A., et al. Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies. J Immunother Cancer. 10 (12), e005678(2022).
  8. Foster, M., et al. Cross-study safety analysis of risk factors in CAR T-cell clinical trials: An FDA database pilot project. Mol Ther Oncolytics. 27, 182-194 (2022).
  9. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  10. Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B-cell ALL patients. J Clin Invest. 126 (6), 2123-2138 (2016).
  11. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).
  12. Cappell, K. M., et al. Long-term follow-up of anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy. J Clin Oncol. 38 (32), 3805-3815 (2020).
  13. Zugasti, I., et al. cell therapy for cancer: Current challenges and future directions. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 210(2025).
  14. Tao, Z., et al. Impact of T-cell characteristics on CAR-T cell therapy in hematological malignancies. Blood Cancer J. 14 (1), 213(2024).
  15. Wittibschlager, V., et al. T-cell persistence correlates with improved outcome in patients with B-cell lymphoma. Int J Mol Sci. 24 (6), 5688(2023).
  16. Myers, R. M., et al. Humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR) T cells in CAR-naive and CAR-exposed children and young adults with relapsed or refractory acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol. 39 (27), 3044-3055 (2021).
  17. Gardner, R. A., et al. Intent-to-treat leukemia remission by CD19 CAR T cells of defined formulation and dose in children and young adults. Blood. 129 (25), 3322-3331 (2017).
  18. Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
  19. Peper, J. K., et al. An impedance-based cytotoxicity assay for real-time and label-free assessment of T-cell-mediated killing of adherent cells. J Immunol Methods. 405, 192-198 (2014).
  20. Cerignoli, F., et al. In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis. PLoS One. 13 (3), e0193498(2018).
  21. Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol In Vitro. 20 (6), 995-1004 (2006).
  22. Lee, E. H. J., et al. Antigen-dependent IL-12 signaling in CAR T cells promotes regional to systemic disease targeting. Nat Commun. 14 (1), 4737(2023).
  23. Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Evaluation of CAR-T cell cytotoxicity: Real-time impedance-based analysis. Methods Cell Biol. 167, 81-98 (2022).
  24. Sahoo, P., et al. Mathematical deconvolution of CAR T-cell proliferation and exhaustion from real-time killing assay data. J R Soc Interface. 17 (162), 20190734(2020).
  25. Li, N., Zhang, W. Calculation principles of Agilent xCELLigence RTCA software. , Agilent Technologies. (2022).
  26. Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. J Vis Exp. (157), e60400(2020).
  27. Brezinger-Dayan, K., et al. Impact of cryopreservation on CAR T production and clinical response. Front Oncol. 12, 1024362(2022).
  28. Foulke, J. G., et al. Optimizing ex vivo CAR-T-cell-mediated cytotoxicity assay through multimodality imaging. Cancers (Basel). 16 (14), (2024).
  29. Cadinanos-Garai, A., et al. High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing. Mol Ther. 33 (5), 2291-2309 (2025).
  30. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-Plate cell sensor arrays in the xCELLigence real-time cell analyzer. Biotechniques. 61 (3), 117-122 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CAR TE

Похожие статьи