Процедуры идентификации ингибиторов входа SARS-CoV-2 как потенциальных противовирусных препаратов с использованием псевдовирусов на основе MLV

Краткое содержание

В этой статье описывается методология генерации псевдотипированных частиц SARS-CoV-2 с использованием системы репортера люциферазы и её применение для выявления ингибиторов входа. Эти протоколы демонстрируются с помощью двух различных ингибиторов входа: рекомбинантного человеческого белка слияния ACE2-Fc и маломолекулярного соединения арбидола.

Аннотация

Вирус SARS-CoV-2 — это возникающий зоонозный патоген, который с момента появления в 2019 году вызвал огромное количество болезней и смертности по всему миру. Безопасные и доступные платформы для оценки проникновения вируса и потенциальных противовирусных соединений остаются необходимыми для продолжающегося открытия лекарств против новых вариантов. В этой статье описывается высокооптимизированный протокол создания псевдотипированных частиц на основе вируса мышиного лейкоза (MLV), экспрессирующих шиповый белок SARS-CoV-2 и несущих репортерный ген люциферазы, что позволяет изучать проникновение вируса в условиях биобезопасности уровня 2. Описанные методы подробно описывают использование оптимизированных клеточных линий, высокую эффективность трансфекции с использованием экономичных реагентов, производство высокоэффективных псевдовирусов и титрирование инфекционной способности для определения минимального вирусного входа в скрининговые анализы. Репрезентативные результаты демонстрируют устойчивую активность люциферазы в инфицированных клетках по сравнению с неинфицированными контролями, тогда как контрольные безспайковые и VSV-G-псевдовирусы подтверждают специфичность анализа. Кроме того, система поддерживает скрининг соединений, количественно оценивая ингибирующие эффекты на проникновение вируса и оценивая цитотоксичность с помощью анализа жизнеспособности MTT. В целом, этот воспроизводимый и масштабируемый протокол предоставляет надежную платформу для средне- и высокопроизводительного скрининга новых ингибиторов вирусного входа, способствуя выявлению кандидатов в противовирусные препараты и продвижению исследований механизмов попадания SARS-CoV-2.

Введение

Появление тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2) в конце 2019 года привело к глобальной пандемии, которая привела к миллионам смертей по всему миру и продолжает представлять угрозу из-за новых вариантов с повышенной заразностью и потенциалом иммунного побега.¹. Как оболочённый РНК-вирус семейства Coronaviridae, SARS-CoV-2 использует свой тримерный спайковый гликопротеин (S) для опосредования проникновения клетки хозяина, связываясь с рецептором ангиотензин-превращающего фермент 2 (ACE2) и проходя протеолитическую активацию TMPRSS2 и другими протеазами^{хозяина 2,3}. Хотя было разработано несколько вариантов лечения для контроля симптомов COVID-19, продолжающаяся эволюция и быстрое развитие вирусных вариантов подчёркивают острую необходимость безопасных и масштабируемых систем для изучения проникновения вируса и оценки новых противовирусных соединений, нацеленных на этот ранний этап^{инфекции 4}.

Вирус SARS-CoV-2 по-прежнему классифицируется как биобезопасность уровня^{3 5} в некоторых регионах из-за высокого потенциала передачи. Поэтому любая лабораторная задача в репликации требует установки с высоким уровнем сдерживания BSL-3, что мешает большинству лабораторий проводить научные исследования с этим вирусом. Псевдотипированные вирусные системы, также известные как псевдовирусы (PV), предлагают практическую альтернативу, позволяющую проводить исследования проникновения вирусов в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL-2), расширяя доступность для глобальных^{исследований 6}. Псевдотипированные частицы, содержащие шиповый белок SARS-CoV-2, не размножаются, что делает их безопасным суррогатом для оценки проникновения вируса и скрининга на наличие ингибиторов малых^{молекул 7}. Эти частицы могут быть модифицированы для передачи гена люциферазы или флуоресцентного репортера, что позволяет быстро и количественно обнаруживать инфекцию путём измерения репортерного сигнала в инфицированных клетках. Системы, основанные на вирусе мышиного лейкоза (MLV) или лентивирусных основаниях, широко используются для изучения проникновения SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, вируса Эбола и^других 8,9,10,11.

В этих протоколах мы описываем генерацию PV на основе MLV с использованием трёхплазмидной системы, основанную на работах, опубликованных Миллетом и^{Уиттакером 8}. Используемые плазмиды включают упаковочную плазмиду, кодирующую основные гены MLV gag-pol (pCMV-MLVgagpol), трансферный вектор, кодирующей репортерный ген люциферазу (pTG-Luc), и плазмид, экспрессирующий спайковый гликопротеин SARS-CoV-2, соответствующий исходному варианту Wuhan-Hu-1. Кроме того, псевдовирусы также генерируются с использованием G-гликопротеина вируса везикулярного стоматита (VSV-G) для дальнейшего использования в качестве контрскрининга потенциальных попаданий. Псевдовирусы образуются в клетках, полученных от HEK293, и используются для заражения высокочувствительных клеток, стабильно экспрессирующих hACE2 и TMPRSS2. Эффективность трансфекции сначала оценивается с помощью плазмиды, экспрессирующей зелёный флуоресцентный белок (GFP). Затем, используя оптимизированные условия трансфекции, PV генерируются путём котрансфекции этих трёх плазмид, а затем титрирования полученных вирусов. Используя соответствующее количество ФВ, проводится анализ в пластинах с 96 лунками для скрининга соединений, способных подавлять проникновение вирусов. Этот протокол использует ветвлённый полиэтиленимин (ПЭИ) в качестве экономичного реагента для трансфекции, что облегчает реализацию процедур.

Протокол

1. Высокоэффективная трансфекция клеток, полученных из HEK293T, с использованием ветвённого полиэтиленимина (ПЭИ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы в шкафу для биобезопасности с использованием стандартной асептической техники и процедур BSL-2. Используйте клетки, полученные из HEK293T, для трансфекции и генерации псевдотипированных вирусов. В этом методе клетки трансфектируются в 6-колодцевых пластинах, обработанных с помощью клеточной культуры. Раствор PEI подготовлен так, как ранее описано Янгом и коллегами (2017)¹². Перед проведением тройной трансфекции для получения псевдовируса рекомендуется оптимизировать наилучшее соотношение ДНК ПЭИ-плазмиды для обеспечения высокой эффективности трансфекции (более 70-80%). Эта оптимизация должна осуществляться путём трансфекции плазмиды, экспрессирующей зелёный флуоресцентный белок (GFP), а затем проверки доли флуоресцентных клеток с помощью флуоресцентного микроскопа. Для этой оптимизации держите плазмидную ДНК постоянной на уровне 2,5 мкг на яме и тестируйте несколько уровней ПЭИ в диапазоне от 1 до 20 мкл. Вот лучшие условия для этих масс клеток и PEI, состоящих из 5 мкл раствора PEI (1 мг/мл) и 2,5 мкг плазмиды, экспрессирующей GFP, на одну скважину в пластине с 6 лунами.

1. Семя 7,5 x 10 клеток, полученных^из HEK293, на одну скважину в 6-луночной пластине для культивирования, в общем объёме 2 мл на каждую скважину полной среды (DMEM-C: Dulbecco's Modified Eagle's Medium, дополненная 10% терм-инактивированной сывороткой плода (FBS), 20 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES), 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) за 24 часа до трансфекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При посеве клеток избегайте кругового перемещения пластины культуры, так как это может привести к агрегации клеток в центре колодцев, что приведёт к неправильному распределению клеток и, следовательно, к снижению эффективности трансфекции. Одной пластины с 6 лунками достаточно для одного эксперимента, включая одну скважину в качестве контроля клеток (без трансфекции), а остальную часть пластины — для тестирования нескольких пропорций ДНК плазмиды ПЭИ.
2. Инкубировать клетки при 37 °C с 5% CO₂ за ночь. На следующий день убедитесь, что клетки соединяются примерно на 50-60%.
3. В день трансфекции подготовьте комплексы ДНК плазмиды PEI в стерильных пробирках для микроцентрифуг объёмом 1,5 мл.
   1. Для каждой скважины подготовьте пробирку раствора PEI с 5 мкл PEI (1 мг/мл) в 50 мкл восстановленной сывороточной среды и одну пробирку раствора ДНК с 2,5 мкг плазмиды, экспрессирующей GFP, в 50 мкл той же среды.
   2. Если нужно трансфектировать несколько скважин, решения могут быть масштабированы соответственно. Ненадолго перемешайте каждую трубку вихрем и опустите 5 секунд вниз. Инкубировать трубки при комнатной температуре (RT) в течение 10 минут.
4. Во время инкубации аккуратно удалять среду из каждой ямы пластины с 6 ячеями, чтобы избежать нарушения монослоя клетки. Аккуратно замените 1 мл/скважину полной трансфекционной среды (DMEM-T, то же самое, что и DMEM-C, но без антибиотиков).
5. Подготовьте комплекс трансфекции. После 10-минутной инкубации добавьте 50 мкл пробирки раствора ДНК в пробирку раствора PEI. Быстро перемешивайте, поднимая и опуская пипеты шесть раз, и инкубуйте на RT ровно 3 минуты. Немедленно переходите к добавлению комплекса по каплям к ячекам в каждой соответствующей яме.
6. Запечатайте края пластины парапленкой и центрифугой при 1000 x g на 30 минут при RT, без тормозов, используя поворотный ротор и ковш.
7. После центрифугирования аккуратно удалите парапленку и инкубируете пластину при 37 °C, 5% CO₂ в течение 3 часов.
8. После инкубации аккуратно удалите трансфекционную среду из каждой скважины и медленно заменяйте её 2 мл предварительно нагретого DMEM-C на каждую скважину.
9. Инкубировать трансфектированные клетки при 37 °C с 5% CO₂ в течение 48 часов.
10. Оценка эффективности трансфекции с помощью экспрессии GFP с помощью флуоресцентной микроскопии. Частота люминесцентных клеток должна быть выше 70-80% (рисунок 1). Это критически важно для эффективности следующего метода в разделе 2.

2. Генерация псевдовирусных частиц SARS-CoV-2 с шипами и VSV-G, которые относятся к спайкам и VSV-G,

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод использует ту же процедуру, что и в разделе 1, за исключением того, что вместо GFP-плазмиды клетки будут котрансфектироваться с тремя плазмидами, необходимыми для генерации псевдотипированных вирусов, используя оптимальные условия трансфекции для обеспечения высокой эффективности трансфекции. Протокол также использует клетки, полученные из HEK293T, в пластинах с шестью ямеками, что достаточно для следующих трёх необходимых условий: а) нетрансфектированные клетки (одна яма), б) клетки, трансфицированные только с упаковочной плазмидой MLV и переносным вектором люциферазы репортером (одна яма; псевдовирусы без шипов), и в) клетки, трансфектируемые этими двумя плазмидами и плазмидой с экспрессирующими шипы для генерации псевдотипированных вирусов SARS-CoV-2 (четыре ямы). Плазмида, экспрессирующая шипы, используется здесь, кодирует спайк штамма SARS-CoV-2, штамм Ухань, и содержит модификации последовательностей для эффективной презентации белка в ФВ. Псевдовирус без шипов будет необходим в качестве контроля позже во время инфекции, чтобы подтвердить спайк-зависимое проникновение в разрешительные клетки. Аналогично, VSV-G-PV генерируются с использованием той же экспериментальной конструкции для последующего использования в качестве контрскрининга потенциальных ингибирующих соединений. Если требуется больший объём псевдовируса, протокол может масштабироваться до двух пластин с 6 лунками, что также может быть удобно для этапа центрифугирования пластин.

1. За день до трансфекции клетки, полученные из семян, HEK293T в две пластины с 6 колодцами, как описано в разделе 1. Используйте одну пластину для генерации spike-PV, а другую — для VSV-G-PV.
2. В день трансфекции подготовьте смеси трансфекции, как показано в таблице 1, следуя шагу 1.3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: раствор PEI подготовлен, как сообщалось^{ранее 12}. Плазмиды pCMV-MLVgagpol и pTG-Luc были получены у Миллета и^{Уиттакера 8}. Плазмида pVSV-G была получена у Gee и др. 2020¹³. Все плазмиды должны быть подготовлены заранее как высококачественные препараты без эндотоксинов. Рекомендуется использовать коммерчески доступные наборы для максипреп, с последним этапом стерильной фильтрации через фильтр для шприца с низким уровнем связывания 0,2 мкм.
3. Перемешайте каждую трубку, как описано в разделе 1, и инкубуйте при RT в течение 10 минут.
4. Во время инкубации аккуратно удаляйте среду из каждой ямы пластин с шестью лунками, чтобы избежать нарушения монослоя клетки. Постепенно заменяйте на каждую скважину 1 мл предварительно подогреного DMEM-T материала, чтобы среда стекала по стенке скважины, а не прямо на ячейки.
5. Подготовьте трансфекционные комплексы, как описано в разделе 1, и трансфицируйте клетки по описанному ранее протоколу.
6. После 48-часовой инкубации после трансфекции соберите супернатанты, переместите их в стерильные конические центрифугные трубки объёмом 50 мл и центрифугуйте при 290 x g в течение 7 минут при 4 °C. Соберите безклеточный супернатант и отфильтруйте его с помощью поливинилиденфторида (PVDF), стерильного фильтра с крышей бутылки диаметром 0,45 мкм. Приготовьте аликвоты по 1 мл и храните их при -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Псевдотипированные частицы стабильны при -80 °C в течение нескольких месяцев. Избегайте повторяющихся циклов замораживания и оттаивания, чтобы сохранить инфекционность.

	Для SARS-CoV-2 с пиковыми фотоэлектрическими объектами (на скважину)	Для VSV-G-PV (на скважину)	Для фотоэлектрических объектов без шипов (на скважину)
Решение PEI:
PEI (1 мг/мл)1	5 мкл	5 мкл	5 мкл
Восстановленная сывороточная среда	45 мкл	45 мкл	45 мкл
Раствор плазмидной ДНК:2
pCMV-MLVgagpol	0,79 мкг	0,79 мкг	0,79 мкг
pTG-luc	0,92 мкг	0,92 мкг	0,92 мкг
pUNO1-шип	0,79 мкг	-	-
pVSV-G	-	0,79 мкг	-
Восстановленная сывороточная среда	до 50 мкл	до 50 мкл	До 50 мкл

Таблица 1: Подготовка трансфекционных смесей для генерации ФВ.

3. Титрование псевдотипированных частиц SARS-CoV-2 и VSV-G

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для подтверждения того, что образуемые псевдотипированные частицы являются инфекционными, и для определения минимального эффективного объёма, необходимого для последующих применений, таких как скрининг соединений. Титрование должно проводиться для каждой новой партии псевдовируса. Для этого клетки, высоковосприимчивые к заражению SARS-CoV-2 (HSI-клетки), инфицируются уменьшающимися количествами псевдотипированных вирусов. Проникновение псевдовирусов, опосредованное взаимодействием ACE2 между шипом и человеком, или VSV-G с другими клетковыми рецепторами, контролируется через 72 часа путем обнаружения активности люциферазы в люминесцентном анализе.

1. За день до трансдукции семена по 2,5 x 10⁴ HSI-клеток на каждую скважину в 96-колодцевой тканевой культурной пластине в 50 мкл полной среды (DMEM-C). Подготовьте три скважины для каждого количества псевдовируса для тестирования, включите их для заражения, также с псевдовирусами без шипов и для неинфицированных клеток. Инкубировать тарелку при 37 °C с 5% CO₂ на ночь.
2. В день трансдукции разморозите по одному аликвоту каждой партии псевдовируса, чтобы проверить на льду и аккуратно перемешать инверсией. Включите также один аликвот контроля без шипов. В каждую яме напрямую добавляют несколько доз препарата псевдовируса (100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5 и 0,8 мкл). Регулируйте объёмы всех скважин до 150 мкл с помощью DMEM-C.
3. Запечатайте пластину парапленкой и центрифугой при 2 500 × г на 45 минут на RT, без тормоза.
4. Снимите уплотнение парапленки и инкубируете пластину в течение 72 часов при 37 °C, 5% CO₂.
5. После инкубации подготовьтесь к анализу на люциферазу, следуя инструкциям производителя. Разморозить субстрат люциферазы (хранится при -80 °C) и 5-кратный буфер лизиса на люциферазу (хранится при -20 °C) и уравновесить при RT (10-15 минут).
6. Разведите буфер лизиса анализа люциферазы до 1 раза стерильной водой. Подготовьте не менее 3 мл.
7. Медленно и аккуратно аспирируйте и удаляйте надстройку каждой ямы с помощью многоканальной пипетки.
8. Добавьте в каждую скважину 30 мкл 1x лизисного буфера с помощью многоканальной пипетки. Поместите пластину в шейкер на 10 минут при 150 об/мин при RT. Проверьте полный лизис под перевёрнутым микроскопом (все клетки должны быть лизированы и не различимы при визуальном осмотре).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее подготовьте считыватель микропластин для немедленного обнаружения люминесценции после добавления подложки, чтобы обеспечить стабильность и избежать затухания сигнала.
9. Перенесите лизаты на непрозрачную белую пластину с 96 колодцами.
10. Добавьте 50 мкл субстрата люциферазы в каждую скважину и ненадолго перемешайте, двигая пластину по кругу. Поставьте пластину в люминометр и измерьте светящиеся.
11. Проанализируйте полученные данные.
    1. Проверьте, что регуляторы дают ожидаемые значения люминесценции. Убедитесь, что неинфицированные клетки дают очень низкие значения фоновой люминесценции.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, инфицированные псевдовирусом без шипов, должны давать значения на уровне неинфицированных клеток, а клетки, инфицированные уменьшающимся количеством псевдовируса, представляющего шипы, должны показывать высокие, зависящие от дозы значения люминесценции (рисунок 2). Значения люминесценции, генерируемые VSV-G-PV, обычно значительно выше, чем у spike-PV — примерно на один-два порядка.
    2. Для последующих скринингов выберите количество псевдовируса, которое генерирует сигнал не менее чем в сто до тысячи раз больше, чем у неинфицированных клеток.

4. Скрининг соединений на ингибирование псевдовирусного проникновения с помощью spike-PV

1. Семена 2,5 x 10⁴ HSI-ячеек на каждую скважину в 50 мкл полной среды (DMEM-C) в пластине на 96 лунок, как описано в разделе 3. Инкубировать на ночь при 37 °C, 5% CO₂.
   1. Рассмотрим дизайн пластин, включающий столбцы с 1 по 11 для соединений плюс псевдовирус, и столбец 12 для контроля. В столбце 12 выделите четыре скважины для контроля вирусов (только с псевдовирусом) и четыре для неинфицированных, необработанных клеток.
2. На следующий день подготовьте последовательные разбавления (1:3) соединений для тестирования, начиная с 50 мкм (конечные концентрации во время инфекций: 50, 16,6, 5,5, 1,8, 0,6, 0,2 и 0,06 мкм), в DMEM-C с содержанием 0,5% DMSO.
   1. Для удобства подготовьте разбавления в отдельной 96-колодной «пластине разбавления», где сначала делаются последовательные разбавления, а затем переносятся (50 мкл) на пластину с элементами.
   2. Если количество соединений очень велико, порядка сотен и более, уменьшите первую серию разбавления примерно до 4 пунктов, используя одну яме на каждую точку разбавления, и рассмотрите предварительные отборы. Затем повторно проверьте потенциальные попадания с помощью 7-точечных последовательных разбавлений, 1:3, с тремя репликами, начиная с той же концентрации 50 мкм.
3. Когда разбавления соединений готовы, аккуратно аспирируйте среду клеток с помощью многоканальной пипетки и добавьте 50 мкл соединений в соответствующие колодцы. Инкубировать 1 час при 37 °C, 5% CO₂. Для управления в столбце 12 добавьте только DMEM-C.
4. Не удаляя соединения, добавляйте в каждую яме заранее определённое количество псевдотипированного псевдовируса SARS-CoV-2 в объеме 50 мкл полной среды, содержащего соединения в одинаковых концентрациях. Запечатайте пластины парапленкой.
5. Центрифугуйте пластину при 2 500 × г в течение 45 минут при RT без тормоза, затем удалите парапленку и инкубируете при 37 °C, 5%_CO2 в течение 72 часа.
6. Приступайте к количественной оценке инфекционности на основе люциферазы, как описано в разделе 3.
7. Проводите анализ данных.
   1. Экспортировать значения люминесценции в таблицу для форматирования данных для последующего импорта в программное обеспечение для анализа и графиков.
   2. Подготовьте столбчатые графики, отображающие среднее значение каждой точки концентрации, включая стандартную ошибку средних баров. Также постройте значения, полученные из положительных (только PV) и отрицательных контролей (неинфицированных клеток).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты анализа считаются действительными, если 1) неинфицированные клетки показывают очень низкие значения, 2) контроли PV показывают высокие значения, 3) положительный контроль ингибирования (например, арбидола или hACE2-Fc) показывает ингибирование инфекции в зависимости от дозы (рисунок 3A, B).
   3. Затем наблюдайте значения, производимые неизвестными соединениями, чтобы оценить, есть ли ингибирование и есть ли эффект, зависящий от дозы. Если да, то подвергайте эти соединения дальнейшему подтверждающему анализу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для дальнейшего подтверждения возможных результатов следите за следующими шагами. Сначала повторно проверьте потенциальные соединения, как рекомендовано в шаге 4.2. Если эффект дозового ответа подтверждён, проведите противоположный скрининг с той же серией разбавления, но с инфекцией VSV-G-PVs. Этот тест важен для проверки, является ли ингибирование входа специфичным для взаимодействия спайка и ACE2, а не связано ли с помехами на каком-либо другом этапе производства люциферазы в инфицированных клетках (рисунок 3A, B). В этом случае положительное соединение не должно проявлять ингибирующую активность против VSV-G-PV. Если это так, то ту же серию концентраций следует проверять на цитотоксичность с помощью теста жизнеспособности клеток (MTT-анализ, показанный в разделе 5). В итоге, потенциальное поражающее соединение должно демонстрировать ингибирование SARS-CoV-2-spike-PV, отсутствие или меньшее ингибирование VSV-G-PV, а также отсутствие, или, по крайней мере, гораздо слабее ингибирование жизнеспособности клеток. Корректируя кривую доза-ответ с использованием данных люминесценции, можно оценить половину максимальной ингибиторной концентрации (IC₅₀) для ингибирования ПВ и половину максимальной цитотоксичной концентрации (CC₅₀) по тесту жизнеспособности. Соотношение CC₅₀ / IC₅₀ используется для расчёта индекса селективности (SI), который является важным индикатором потенциальной полезности положительного соединения. Для анализа кривых доза-ответа и оценки IC₅₀ и CC₅₀ описаны очень детальные^{процедуры 14}.

5. Анализ на жизнеспособность клеток на основе МТТ

1. Посеять 2,5 x 10⁴ HSI-ячеек в одну скважину в 50 мкл DMEM-C в пластине на 96 лунок. Инкубировать тарелку ночью при 37 °C, 5% CO₂. Убедитесь, что на следующий день клетки соприсоединяются примерно на 50%. Подготовьте достаточно скважин, учитывая все разные концентрации соединения для оценки, необработанные клетки и пустые колодцы, содержащие только среду, в тройном экземпляре. Проверьте потенциальные поражающие соединения в тех же концентрациях, что и в тесте ингибирования входа ФВ.
2. После инкубации аккуратно удалите среду и замените её 100 мкл полной среды с разными концентрациями соединения для оценки в 0,5% DMSO.
3. Центрифугуйте пластину при 2 500 × г в течение 45 минут при RT без тормоза и инкубируемые 72 часа при 37 °C, 5% CO₂. Этот этап включает точную обработку ячеек так же, как в предыдущем разделе, за исключением добавления PV.
4. Приготовьте раствор MTT с концентрацией 0,5 мг/мл с использованием DMEM. Стерилизуйте, фильтруя через 0,2 мкм, и храните в темноте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H-бромид тетразолия (MTT) чувствительн к свету. Её нужно держать замороженной, в темноте.
5. Аккуратно удаляйте среду из каждой скважины и заменяйте её раствором MTT 100 мкл. Инкубировать 2 часа при 37 °C, 5%_CO2.
6. Во время этой инкубации приготовьте растворительный раствор, содержащий 40 мМ HCl в изопропиловом спирте.
7. Аккуратно удалять раствор МТТ с помощью многоканальной пипетки, не нарушая кристаллы формазана на дне каждой ямы.
8. Добавьте в каждую скважину 100 мкл раствора растворителя. Обмотайте пластину алюминиевой фольгой и положите на встряхиватель при 150 об/мин на 15 минут.
9. Рекордное поглощение на 570 нм и 630 нм.
10. Проводите анализ данных.
    1. Используя исходные значения оптической плотности, вычтите значения, полученные на 630 нм, от тех, что получаются на 570 нм для каждой ямы. Затем усредняйте скорректированные значения необработанных клеточных ямак. Считайте эти необработанные клетки на 100% жизнеспособными.
    2. Затем нормализуйте значения обработанных клеток относительно ямоч необработанных клеток, используя формулу:
       Жизнеспособность (%) =
11. График процентов жизнеспособности в виде баров, обозначающих среднее значения репликаций ±± стандартной ошибке среднего. Провести дополнительный статистический анализ для сравнения групп с использованием процедур, реализованных в программном обеспечении для анализа данных и построения графиков, сравнивая жизнеспособность при разных концентрациях с контролем необработанных клеток.
12. Сравните средние значения каждой точки концентрации с показателями клеток, обработанных только с DMSO, с использованием непараметрического Крускаля-Уоллиса с посттестом Данна (различия считаются значительными при p-значениях < 0,05). Для построения графика кривой доза-ответ и оценки CC₅₀ из значений OD проверьте процедуру, указанную в^{остальном составе 14}.

Результаты

Несколько методов трансфекции были сообщены для получения PV, включая кальциев-фосфат-15, липидные^{методы 16} и PEI, как линейные, так и ветвлёвые. В этой статье показано, что трансфекция клеток HEK293T с разветвлённым PEI позволяет осуществлять высокоэффективную трансфекцию (рисунок 1), обычно сопоставимую с методами трансфекции с использованием коммерчески доступных липидных трансфекционных агентов (данные отсу...

Обсуждение

Эта универсальность системы MLV для генерации псевдотипов для других вирусов была зафиксирована и другими важными вирусами, такими как вирус^{Эбола 18}, MERS-CoV⁸, SARS-CoV¹⁹, вирус La^{Crosse 20}, Hantavirus²⁰, вирус^{Visna 21}, Arenavirus²², вирус^{гриппа 23} и другими. Эти псевдотипы оказались очень полезны ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0.2 и микро; m Фильтры для шприцев с низким содержанием белка	Thermo Scientific	720-1320	Фильтры для шприцев (0,2 и мю; m,13 мм, PES, стерильный)
0,25% раствор трипсина-EDTA 1X	Gibco	25200-056	Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенол красный
0,45 и микро; m PVDF фильтрующие блоки с крышкой бутылок	Avantor	514-1045	Системы вакуумной фильтрации с крышкой бутылки (PVDF, 250 мл, 50 мм, 0,45 и микро; m)
Стерильные микроцентрифугальные трубки объёмом 1,5 мл	Эппендорф	30123611	Сейф-замок и nbsp; Трубки
100 x раствор пенициллина стрептомицина	Корнинг	30-002-CI	Раствор пенициллина-стрептомицина в 100 раз
5 X буфер лизиса на анализе люциферазы;	Promega	E2650	часть системы анализа Promega Bright-Glo Luciferase
Стерильные конические трубки объёмом 50 мл	Corning	352070	50 мл высокопрозрачной центрифугной трубки PP, коническое дно, стерильная
Пластины для культивирования тканей с 6 лунками	Thermo Scientific	140675	Мультиблюда, обработанные клеточной культурой
96-колодцевые пластины для культуры тканей	Thermo Scientific	168055	Nunc™ MicroWell™ 96-скважинная, обработанная Nunclon Delta, плоскодонная микропластина
Арбидол гидрохлорид	Сигма-Олдрич	SML0860
Разветвлённый полиэтиленимин, 25 кДа	Сигма-Олдрич	408727
Конфокальный лазерный микроскоп и bbsp; (FV 3000)	Olympus Co.	SKU: FV3000
Диметилсульфоксид (DMSO)	Сигма-Олдрич	D8418
DMEM (модифицированная орлиная среда Dulbecco) с: высоким содержанием глюкозы, L-глутамин, фенол-красный, пируват натрия)	Gibco	11995-065
Сыворотка для плода быка (FBS)	Gibco	26140-079	Термоинактивирован (56&°; C, 30 мин)
Клетки, полученные из HEK293T (линия клеток Lenti-X 293T)	Takara Bio	632180	Высокотрансфективный субклон клеточной линии HEK293 и поддерживает высокий уровень экспрессии вирусного белка
Буфер HEPES	Gibco	15630-080
Клетки с высокой чувствительностью к инфекции (293T-ACE2. TMPRSS2 (mCherry) Cell Line)	Ресурсы BEI	NR-55293	HEK293T клеточная линия, модифицированная для стабильной экспрессии ACE2 и TMPRSS2
Соляная кислота	Сигма-Олдрич	H1758-500ML
Микроскоп с инвертированным фазовым контрастом	Olympus Co.	SKU: 2404040005
Изопропанол	Сигма-Олдрич	I9516-500ML
Субстрат люциферазы	Promega	E2650	часть системы анализа Bright-Glo люциферазы
Считыватель микропластин с обнаружением люминесценции	Agilent BioTek	BTH1MG
MTT [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид]	Сигма-Олдрич	M2128
Непрозрачные белые 96-колодцевые пластины	Корнинг	3917	96-колодчатые твердые белоснежные микропластины из полистирола, обработанного TC
Парафильм	Бемис	PM999
pcDNA3-EGFP плазмида	Addgene	13031	pcDNA3-EGFP был подарком от Дага Голенбока (плазмида Addgene # 13031 ; http://n2t.net/addgene:13031 ; RRID:Addgene_13031)
pCMV-MLVgagpol плазмида	-	-	Любезно пожертвовано доктором Гэри Уиттакером;
Фосфатно-буферный физиологический раствор без Ca2+ и Mg2+ (PBS)	Корнинг	21-040-CV	Фосфатно-буферный физиологический раствор, 1 раз без кальция и магния
Система максимрепа плазмиды Promega PureYield	Promega	A2393
Плазмида pTG-Luc	-	-	Любезно пожертвовано доктором Гэри Уиттакером;
плазмида pUNO1-SARS-CoV-2 Spike (Wuhan)	Invivogen	p1-шип
pVSV-G плазмида	Addgene	138479	pVSV-G был подарком от Акицу Хотты (плазмид Addgene # 138479 ; http://n2t.net/addgene:138479 ; RRID:Addgene_138479)
Рекомбинантный белок слияния человека ACE2-Fc	Invivogen	fc-hace2
Восстановленная сывороточная среда (Opti-MEM)	Gibco	31985-070	Опти-МЭМ редуцированная сывороточная среда