Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Исследование гликолиза в первичной микроглии с помощью анализа внеклеточного потока

258 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69638

⸱

10 апреля 2026 г.

 , 
1Division of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Memorial University of Newfoundland

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает экономичный способ проведения стресс-теста на гликолиз для количественной оценки метаболического перепрограммирования в первичной микроглии мыши. После изоляции и воспалительной стимуляции скорость внеклеточного закисления (ЭКАР) измеряется с помощью свежеприготовленных реагентов с рекорректированной рН, после чего происходит нормализация белка для точной и воспроизводимой оценки гликолитических сдвигов.

Аннотация

Микроглия, резидентные макрофаговые клетки центральной нервной системы, динамически изменяют свои метаболические программы в ответ на физиологические и патологические сигналы. Понимание этих метаболических изменений крайне важно для разъяснения их роли в воспалении. Здесь мы представляем подробный протокол оценки гликолитического профиля первичной микроглии, выделенной из коры мозга мышей новорождённых, с помощью стресс-теста на гликолиз на внеклеточном анализаторе потока. Этот анализ позволяет в реальном времени измерять ECAR — индикатор гликолитической активности, связанной с низким pH, например, лактат. Наш подход включает лечение культивируемой микроглии в различных условиях для изучения того, как метаболические пути изменяются в ответ на различные стимулы, включая провоспалительные. Уникально то, что наша лаборатория готовит свежие растворы различных реагентов, включая глюкозу, олигомицин и 2-дезоксиглюкозу (2DG), чтобы воздействовать на различные аспекты пути, с тщательной корректировкой pH для каждого реагента для обеспечения точности и воспроизводимости экспериментов. Этот метод предоставляет надёжную платформу для изучения гликолиза первичной микроглии и даёт представление об их функциональном состоянии при воспалительных или связанных с болезнью состояниях.

Введение

Клетки центральной нервной системы изменяют способ выработки энергии в ответ на нормальные и болезненныеусловия 1,2. Среди основных метаболических путей гликолиз и окислительное фосфорилирование (OXPHOS) являются ключевыми путями, регулирующими функции иммунных клеток — они проходят либо для мощной и немедленной реакции на провоспалительные, так и противовоспалительные состояниясоответственно 3,4. Таким образом, иммунные клетки могут переключаться между метаболическими путями в ответ на воспалительные сигналы и функциональныесостояния 5. Микроглия, как и её миелоидные аналоги, метаболически связана со своими функциями и быстро адаптируется к разным путям в качестве альтернативного метаболического топлива, демонстрируя метаболическуюгибкость 6,7. Микроглия проходит быстрое метаболическое перепрограммирование во время воспаления, при этом усиленный гликолиз служит ключевым метаболическим признаком провоспалительныхсостояний 8. Таким образом, анализы, определяющие клеточную зависимость от метаболического фенотипа, позволяют исследовать их функциональные состояния при различных условиях. В текущем протоколе мы стремимся определить, зависит ли первичная микроглия от повышенного гликолиза при провоспалительных состояниях. Для этого мы регулярно проводим стресс-тесты на гликолиз. Хотя анализатор Seahorse XFe24 (внеклеточный анализатор потока) широко используется для измерения ECAR в увековеченных клеточных линиях и трансформированных клетках, первичная микроглия представляет собой уникальные технические задачи, включая ограниченный выход клеток, вариативные свойства присоединения и высокую чувствительность к условиям культуры, что может запутать метаболические измерения. Кроме того, он обеспечивает измерение ECAR в реальном времени, позволяя точно оценить гликолиз, вызванный лактатами, в нескольких временных точках, что невозможно зафиксировать только с помощью конечной лактатной анализы. Внеклеточное метаболическое профилирование на основе потока широко применяется в исследованиях метаболизма для характеристики клеточной биоэнергетики, что делает этот протокол отлично подходящим для исследований метаболических изменений в клетках во время активации, моделирования заболеваний или тестирования лекарств. Читатели могут определить пригодность на основе необходимости в динамических, высокоразрешающих гликолитических измерениях в первичных клетках.

Глюкоза метаболизируется в пируват через гликолиз, а затем либо превращается в лактат в цитоплазме, либо в CO₂ и воду в митохондриях. Превращение глюкозы в лактат приводит к высвобождению протонов во внеклеточное пространство, что приводит к закислению среды. Анализатор внеклеточного потока количественно определяет это закисление какECAR 9. В стресс-тесте на гликолиз клетки сначала инкубируются в среде без глюкозы и пируватов, и их базовый уровень ECAR фиксируется. Первая инъекция доставляет насыщенное количество глюкозы, которую клетки метаболизируют через гликолиз в пируват, производя АТФ, НАДГ, воду и протоны. Увеличение высвобождения протонов повышает уровень ECAR, отражая «гликолиз». Далее добавляется олигомицин для подавления синтеза митохондриального АТФ, заставляя клетки полагаться исключительно на гликолиз. Это изменение градиента протона дополнительно увеличивает ECAR и измеряется как максимальная гликолитическая ёмкость клетки. Наконец, вводится 2DG, аналог глюкозы. Он конкурентно ингибирует гексокиназу, блокируя гликолиз и снижая ЭКАР. Это падение подтверждает, что предыдущий ECAR был зависим от гликолиза. Разница между максимальной гликолитической ёмкостью и уровнем гликолиза определяет гликолитический резерв. Начальная ECAR до добавления глюкозы представляет собой негликолитическую кислотность в результате других клеточных процессов (рисунок 1).

Мы провели стресс-тест на гликолиз с использованием анализатора внеклеточного потока. Сырые значения ECAR экспортировались в Excel для анализа. Для каждого состояния мы определили временные точки, соответствующие базальному ECAR (до добавления глюкозы), гликолиза (после инъекции глюкозы) и гликолитической ёмкости (после терапии олигомицином). Усреднялись значения ECAR из соответствующих временных точек в каждой фазе и по четырём техническим репликам, а гликолиз рассчитывался как увеличение ECAR после добавления глюкозы. Гликолитическая ёмкость была рассчитана как увеличение ECAR после добавления олигомицина. Гликолитический резерв рассчитывался как снижение ECAR после инъекции 2DG. Эти средние значения затем использовались для сравнения метаболических реакций между группами.

С другой стороны, для оценки скорости потребления кислорода (OCR) и функции митохондрий стандартным подходом является митохондриальный стресс-тест (Agilent), который измеряет такие параметры, как базальное дыхание, АТФ-связанное дыхание, утечка протона, максимальное дыхание, запасная дыхательная ёмкость и немитохондриальное дыхание. Эти измерения получаются путём последовательного введения специфических митохондриальных ингибиторов: олигомицина (ингибитора АТФ-синтазы), FCCP (карбонилцианид-4 (трифторметокси) фенилгидразона), разъединителя, обеспечивающего максимальное дыхание, и ротенона/антимицина A (ингибиторы комплекса I/III), позволяющего количественно оценивать состояние митохондрий ибиоэнергетику 10,11,12,13 . Таким образом, анализы ECAR и OCR проводятся в разных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с животными проводились в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными и получили одобрение Комитета по уходу за животными Мемориального университета Ньюфаундленда по протоколу No 22-01-DK.

1. Подготовка перед началом экспериментов

  1. Подготовьте раствор для вскрытия, добавив 10 мМ HEPES к 1x HBSS без Ca2+ и Mg2+.
  2. Приготовьте раствор для пищеварения (на 2–3 мозга) путём смешивания 1 мл 2,5% трипсина (10x бульон, неразбавленный), 2 мл раствора вскрытия и 200 мкл ДНКазы I (1 мг/мл).
  3. Приготовьте смешанную глиа-среду, добавив DMEM 10% FBS, 1x глутамакс и 1x антибиотик/антимикотик.
  4. Подготовьте микроглию, добавив DMEM 10% FBS, 1x глутамакс, 1x MEM NEAA, 1x пируват натрия и 1x пенициллин/стрептомицин.

2. Обшивка смешанных глиальных культур (рисунок 2A)

  1. В первый день:
    1. Соберите щенков в день (P0)-P2 с мышей C57BL/6C, извлеките кортиксы с помощью стереомикроскопа и удалите мозговые клетки. Затем расчлените коры на мелкие кусочки в растворе для вскрытия и переместите их в коническую трубку объёмом 15 мл. Дайте тканям осеть на дне трубки.
    2. Декантуйте раствор вскрытия и замените его 3 мл раствора для пищеварения на 2–3 мозга. Аккуратно тритурируйте с помощью серологической пипетки объемом 2 мл для диссоциации ткани.
    3. Разместите трубки на роторе внутри инкубатора при температуре 37 °C и смешивайте, тритурируя с помощью серологической пипетки объёмом 2 мл каждые 8 минут, всего около 24 минут.
    4. После переваривания тканей центрифугуйте клетки при температуре 300 г в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Затем сбросьте супернатант и снова суспензируйте гранулу в 5 мл смешанной глиальной среды.
    5. Используя иглу 18 G в шприце объемом 5 мл, тритуруйте клетки, затем пропустите их через нейлоновый фильтр диаметром 70 мкм. Снова центрифугуйте собранные клетки при 300 г в течение 5 минут при RT.
    6. Сначала суспензировать гранулу в 1 мл смешанной глиа-среды и тритурировать несколько раз, чтобы убрать сгустки клеток, а затем снова суспензировать в большем объёме, получая до 12 мл в каждой колбе T75 (рекомендуется использовать 2–3 коры мозга на колбу)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие колбы поли-D-Лизином или другим реагентом не требуется.
  2. На второй день меняйте весь медиа и добавляйте свежую смешанную глию.
  3. На третий день замените примерно две трети материала на свежую смешанную глия. Дайте клеткам расти ещё семь дней, всего 10 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент можно наблюдать астроцитный слой.
  4. На 6-й день замените 2/3 медиа на свежие смешанные глиа-медиа. Подтвердите наличие слияющегося астроцитного слоя.

3. Получение чистой первичной микроглии (рисунок 2A)

ПРИМЕЧАНИЕ: Около 10-го дня видны маленькие круглые клетки, плавающие над слоем астроцита; это преимущественно микроглия (рисунок 2B).

  1. Встряхивайте флягу при 250 об/мин в течение 2 часов при 37 °C. Соберите весь материал с плавающими элементами в коническую трубку объемом 15 мл и центрифугуйте при 300 х г в течение 10 минут.
  2. Суспензировать гранулу в микроглиальной среде и разместить около 250 000 клеток на каждую скважину в микропластинках клеточной культуры внеклеточного анализатора потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из трёх колб T75 получается около 3–4 миллионов клеток на мл; покрытие пластин клеточной культуры поли-D-лизином или другими реагентами не является обязательным.
  3. Инкубировать микропластину при 5%CO2 в течение 30–45 минут. После этого снова замените среду, чтобы получить чистую культуру микроглии и удалить все олигодендроциты, которые ещё могут плавать. Клетки готовы к лечению уже на следующий день (рисунок 2C).
  4. Исключить из ячеек четыре колодца, обозначенные как «фоновые» контроли: по одной в каждой строке (рисунок 3C). Эти скважины получают пробирную среду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заполните неиспользованные скважины стерильной водой или PBS, чтобы предотвратить испарение среды, и покрывайте ячейки случайным образом, а не фиксированными рядами или колонками, чтобы минимизировать вариативность пластин.

4. Лечение первичной микроглии с помощью провоспалительных стимулов

  1. На 11-й день обрабатывайте клетки липополисахаридом 100 нг/мл (ЛПС) в течение 24 часов. Рандомизируйте контрольные и обработанные скважины, обработанные LPS, чтобы исключить любые позиционные эффекты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность обработки может варьироваться в зависимости от экспериментальных условий и требует предварительной оптимизации.

5. Подготовка к анализу внеклеточного потока за день до начала эксперимента

  1. На 11-й день добавьте буфер калибра 1 мл в калибровочную пластину (формат 24 лунки; набор для анализа внеклеточного потока) во всех скважинах. Держите пластину на ночь при 37 ° C безCO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровочная пластина состоит из 4 впускных скважин. Для стресс-теста на гликолиз глюкоза добавляется в порт A, олигомицин — в порт B, а 2DG вводится в порт C (см. рисунок 4A).
  2. Приготовьте растворы для глюкозы и 2DG
    1. Глюкоза — растворить 90 мг глюкозы в 2 мл внеклеточной жидкости для анализа потока (Таблица материалов). Изначально растворяйте примерно в 1,9 мл, чтобы при корректировке pH на следующий день с 1N NaOH конечный объём не превышал 2 мл, что критически важно для поддержания молярности.
    2. 2DG – растворить 328 мг в 2 мл внеклеточной среды анализа потока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните и глюкозу, и 2DG при 4 °C на ночь
  3. Аликвотируйте 30-40 мл пробирной среды в конической трубке объёмом 50 мл и храните при 4 °C для проведения анализов на следующий день.

6. Анализ внеклеточного потока (день 12)

  1. На 12-й день разогрейте предварительно сформированную глюкозу 2DG и цитируемую анализную среду до 37 °C. Скорректируйте pH глюкозы и 2DG, а также pH алицитируемой анализной среды до 7,4, добавляя 1N NaOH шагами (например, 5 мкл, затем 10 мкл).
  2. Короткое время вихрь для равномерного смешивания, пока pH не превысит 7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: для постоянного мониторинга pH рекомендуется использовать индикаторные полоски pH.
  3. Добавьте 2 мкл стандартного раствора 10 мМ олигомицина в 2 мл среды с корректировкой pH.
    1. Подготовка стандартного раствора олигомицина 10 мМл: восстановить флакон 10 мг олигомицина в 1 мл стерильного DMSO, с концентрацией 10 мг/мл, и хранить при -80 °C до дальнейшего использования.
  4. Вынимите клетки из инкубатора (начиная с шага 4) и соберите среду в микроцентрифугные трубки объемом 1,5 мл, а затем центрифугуйте при 300 x g в течение 5 минут.
  5. Соберите супернатант (сбросьте гранулу для удаления клеток и мусора) и храните его при -80 °C для измерения лактата, как указано в шаге 8.
  6. Очень аккуратно промывайте клетки 1 мл средой с регулировкой pH, чтобы не отрывать клетки.
  7. Отбросьте пробирную среду и добавьте 500 мкл тест-среды с регулировкой pH, инкубируя при 37 °C (безCO2) в течение 45 минут — 1 час.
  8. Тем временем добавьте все необходимые ингибиторы на калибровочную пластину внеклеточного анализатора потока в соответствующих портах — 55 мкл глюкозы в порт A в левом верхнем углу всех колодц, 60 мкл олигомицина в порту B в верхние правые ямы и 65 мкл 2DG в порту C в нижние левые ямы (включая фоновые ямы) (см. рисунок 4A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение объёма на каждом этапе необходимо для поддержания молярности, поскольку объём увеличивается при предварительном добавлении глюкозы и олигомицина.
  9. После добавления ингибиторов настройте тест на гликолиз с помощью программного обеспечения Agilent Seahorse Wave (см. рисунок 3). Затем запускайте калибровочную пластину, если появят предложение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите верхнюю крышку пластины и розовую крышку между пластинами перед установкой калибровочной пластины в машину. На этом этапе тестируются датчики pH иO2 , а также проверяется контроль качества.
  10. После завершения калибровки машина выскажет разгрузку калибровочной пластины и загрузит посевную пластину.
    1. Шаг I: Выберите шаблон анализа (рисунок 3A)
      1. Откройте программу Wave и в разделе «Шаблоны » выберите подходящий шаблон анализа для эксперимента.
      2. В этом случае выберите «XF гликолиз на стресс-тест» на внеклеточном анализаторе потока.
    2. Шаг II: Определить группы и стратегии инъекции (рисунок 3B)
      1. Перейдите на вкладку «Определения групп» и создайте экспериментальные группы (например, Background, Control и LPS).
      2. Определите стратегию инъекций , выбрав соединения для введения в каждый порт (например, глюкоза, олигомицин, 2DG для стресс-теста гликолиза; эти настройки по умолчанию заранее установлены программным обеспечением, проверьте соответственно).
    3. Шаг III: Назначить группы для отображения пластин (рисунок 3C)
      1. Откройте вид карты плит и назначьте ямы каждой группе, перетаскивая имена групп (например, Background = чёрный, Control = зелёный, LPS = красный) на раскладку пластин.
      2. Убедитесь, что пустые/фоновые ямы выделены для точной нормализации.
    4. Шаг IV: Настройка протокола (рисунок 3D)
      1. Во вкладке «Протокол » запрограммируйте циклы измерения и инъекции. Типичная последовательность стресс-теста на гликолиз включает: негликолитическая кислотность, инъекция глюкозы (порт A) → измерение гликолиза, инъекция олигомицина (порт B) → измеряет гликолитическую ёмкость, инъекция 2-DG (порт C) → измеряет гликолитический запас
      2. Определите количество циклов измерения после каждой инъекции и отрегулируйте время (например, 3 цикла по 3 минуты смешивания, 2 минуты ожидания, 3 минуты измерения).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для наших экспериментов мы используем настройки программного обеспечения по умолчанию.
      3. Просмотрите общее время анализа перед проведением теста.
    5. Шаг V: Нормализация (рисунок 3E)
      1. Нормализуйте данные с концентрациями белков, полученными в результате анализа бицинхониновой кислоты (BCA) в программном обеспечении Wave , используя встроенную опцию нормализации (например, по содержанию белка, номеру клеток или другим доступным методам). Измерения концентрации белка приведены в Таблице 1.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол выделения белка для анализа BCA после измерения ECAR описан в следующем шаге 7.

7. Сбор ячеек для количественной оценки и нормализации данных

  1. После завершения анализа внеклеточного потока вынимите посевную пластину и либо немедленно приступите к экстракции белка, либо храните её при -80 °C до готовности к извлечению белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Белковые анализы позволяют нормализовать значения в различных условиях лечения (это один из методов нормализации данных, а не единственный).
  2. Для немедленной изоляции белка удалите пробирочный материал из колодцев и промывайте один раз 500 мкл RT PBS (1x) (рекомендуется мягкое однократное промывка, чтобы минимизировать нарушение монослоя клетки).
  3. Для сбора клеток, которые могут отсоединиться в процессе, центрифугуйте пластину один раз при 300 × г в течение 5 минут, сбросьте PBS и снова суспензуйте полученную гранулу в буфере RIPA для обеспечения точных измерений общего белка.
  4. Добавьте около 75–100 мкл буфера RIPA в каждую скважину и поставьте пластину на шейкер (с низким или средним вращением) на 30 минут (RT). Затем перенесите содержимое в свежую микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед перемещением буфера RIPA в микроцентрифугальную трубку объёмом 1,5 мл тритурируйте и хорошо перемешайте в колодцах.
  5. Инкубировать трубку микроцентрифуги на ротаторе около 30 минут при RT для правильного лизисирования клеток. В это время предварительно охладите центрифугу до 4 °C.
  6. Центрифугуйте лизат клетки при 16 000 x г в течение 15 минут при 4 °C. Выбросьте гранулу, так как в ней будет содержаться клеточный мусор.
  7. Собирайте супернатант для количественного определения белка с помощью анализа BCA (или любого другого предпочтительного метода). Либо приступайте немедленно, либо храните лизаты после удаления всех пробиральных материалов при -20 °C (для краткосрочного хранения) или при -80 °C (для длительного хранения).
  8. При повторном запуске после хранения образцов при -20 °C или -80 °C их разморозить на льду примерно 20–30 минут, кратковременно выйти в вихрь/спин и продолжать по стандартному протоколу BCA.
  9. В качестве альтернативы подсчитайте клетки в каждой яме с помощью гемоцитометра или потокового цитометра и интегрируйте в стратегии нормализации. В таком случае добавьте около 100–200 мкл трипсина (предварительно нагретого до 37 °C) сразу после завершения анализа и удаления пробирального материала, и инкубировать при 37 °C в течение 5 минут. Собирайте клетки, добавляя 100–200 мкл 10% FBS для нейтрализации эффекта трипсина.
    1. Центрифугуйте клетки при температуре 300 г в течение 5 минут, удалите супернатант и снова суспензуйте гранулу примерно в 1 мл 10% FBS перед подсчётом с помощью гемоцитометра. В качестве альтернативы клетки можно фиксировать с помощью 4% PFA в течение 15 минут, прежде чем приступить к подсчёту клеток с помощью потоковой цитометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы начинаете подсчёт клеток сразу, фиксация на основе PFA не требуется.
  10. Нормализуйте значения ECAR с концентрацией белков из Step 7.8 или количеством клеток из Step 7.9.1 в каждой яме с помощью программного обеспечения Wave , как в шаге 6.10.5.1. Полученные значения — это нормированные значения для теста на гликолиз на стресс-тест.
  11. Сгенерируйте результаты и график с помощью опции «Экспорт», затем опции «Граф Пэд Призма» и «Таблица Excel» для каждого значения точки данных для количественной оценки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В клеточной культивной пластине выбор из четырёх выделенных пустых ямок гибок и может быть задан экспериментатором. По умолчанию расположение пустых мест показано на рисунке 3C.

8. Измерения лактата из культурных супернатантов

  1. Постепенно оттаивайте наднадземные аликвоты на льду, собранные на 12-й день и хранящиеся при −80 °C с шага 6.5.
  2. Определите концентрацию L-лактата с помощью набора L-лактатного анализа в флюорометрическом режиме согласно протоколу производителя.
    Примечание: Флюорометрический режим гораздо более чувствителен, чем колориметрический анализ.
  3. Подготовьте стандарты последовательно разбавлением предоставленного стандарта лактата, чтобы получить калибровочную кривую от 0 до 0,1 нмоль/скважину.
  4. Добавьте образцы и стандарты в прозрачную микропластину на 96 лунок в дубликате, затем добавьте реакционную смесь с лактатным ферментом и флуоресцентным зондом в каждую яму.
  5. Инкубировать на RT 30 минут, защищённый от света. Измеряйте интенсивность флуоресценции с помощью считывателя флуоресцентных микропластин с длинами волн возбуждения/излучения, установленными на 535/587 нм.
  6. Рассчитайте концентрацию лактата в образцах по стандартной кривой и выражайте их в pM. Уровни лактата из супернатантов необработанной (контрольной) и первичной микроглии, обработанной ЛПС, приведены в таблице 2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Стресс-тест на гликолиз на основе внеклеточного потока успешно измеряет гликолитический профиль первичной микроглии. Анализ измеряет базальный гликолиз, то есть гликолиз после инъекции глюкозы, гликолитическую ёмкость после инъекции олигомицина и ингибирование гликолиза при инъекции 2DG. В нашем эксперименте мы сравнивали контрольную (необработанную) и первичную микроглию, обработанную ЛПС. Мы наблюдали незначительные морфологические изменения между контрольной и микроглией, обработанной...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Микроглиальный ответ во время нейровоспаления сопровождается глубокой метаболической перестройкой, позволяющей этим клеткам удовлетворять энергетические и биосинтетические потребности их функционального состояния. Стресс-тест гликолиза на основе внеклеточного потока предлагает чувствительный и в реальном времени метод измерения гликолитического потока, позволяющий нам разобраться, как первичная микроглия адаптирует свой метаболизм в провоспалительных условиях. В этом исследовании мы испо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, чтобы заявлять.

Благодарности

Работа финансируется за счёт гранта CIHR для DKK. Высоко ценится рекомендация доктора Крейга Мура по анализатору XFe24 для анализа Seahorse.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1M HEPES решениеСигма ОлдричH0887
1X HBSSGibco   14175-079
2,5% трипсинаGibco   15090-046
2DGМногопорная сигма D6134
Антибиотик/антимикотик Gibco15240-062
D – (+)Глюкоза, безводная и безводная;Thermoscientific   A16828.36
DMEMGibco  11965-092
DNase IМногопорная сигма 11284932001- Рош
FBSФишербрандFB12999102
ГлутамаксGibco   35050-061
Набор L-LactateAbcamAB65330
LPS Сигма Олдрич  L4391
MEM NEAA Gibco   11140-050
Олигомицин АМногопорная сигма 495455
Пенициллин/стрептомицинGibco   15240-062
pH-индикаторные лентыФишербранд13-640-516
Seahorse XFe24Agilent TechnologiesН/ДОбщее название: Анализатор внеклеточного потока
Микропластины для культуры клеток Seahorse 24 V7 PSAgilent Seahorse100777-004Родовое название: микропластины внеклеточной культуры флюсов
Буфер калибра Seahorse assay XF (pH 7.4)Agilent Seahorse   100840-000Родовое название: Внеклеточный буфер калибровки потока
Анализ морского конька XF DMEM media (pH 7.4)Agilent Seahorse     103575-100Общее название: Внеклеточная жидкость для анализа потока
Набор для анализа внеклеточного потока SeahorseAgilent Seahorse 102342-100Общее название: Внеклеточная калибровочная пластина потока 
Пируват натрия Gibco   11360-070

Ссылки

  1. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179, 292-311 (2019).
  2. Tay, T. L., et al. Unique microglia recovery population revealed by single-cell RNAseq following neurodegeneration. Acta Neuropathol. Commun. 6, 87(2018).
  3. Wang, Z., et al. Glycolysis and oxidative phosphorylation play critical roles in natural killer cell receptor-mediated natural killer cell functions. Front. Immunol. 11, 202(2020).
  4. Soto-Heredero, G., Gómezde Las Heras, M. M., Gabandé-Rodríguez, E., Oller, J., Mittelbrunn, M. Glycolysis-a key player in the inflammatory response. FEBS J. 287, 3350-3369 (2020).
  5. O'Neill, L. A., Kishton, R. J., Rathmell, J. A guide to immunometabolism for immunologists. Nat. Rev. Immunol. 16, 553-565 (2016).
  6. Bernier, L. P., et al. Microglial metabolic flexibility supports immune surveillance of the brain parenchyma. Nat. Commun. 11, 1559(2020).
  7. Bernier, L. P., York, E. M., MacVicar, B. A. Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function. Trends Neurosci. 43, 854-869 (2020).
  8. Geric, I., et al. Metabolic reprogramming during microglia activation. Immunometabolism. 1, e190002(2019).
  9. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol. Cells. 47, 100095(2024).
  10. Zhang, Z., et al. Glutamine metabolism modulates microglial NLRP3 inflammasome activity through mitophagy in Alzheimer’s disease. J. Neuroinflammation. 21, 261(2024).
  11. Wang, L., et al. Glucose transporter 1 critically controls microglial activation through facilitating glycolysis. Mol. Neurodegener. 14, 2(2019).
  12. Lu, J., Zhou, W., Dou, F., Wang, C., Yu, Z. TRPV1 sustains microglial metabolic reprogramming in Alzheimer's disease. EMBO Rep. 22, e52013(2021).
  13. Orihuela, R., McPherson, C. A., Harry, G. J. Microglial M1/M2 polarization and metabolic states. Br. J. Pharmacol. 173, 649-665 (2016).
  14. Cheng, J., et al. Early glycolytic reprogramming controls microglial inflammatory activation. J. Neuroinflammation. 18, 129(2021).
  15. Kaushik, D. K., et al. Enhanced glycolytic metabolism supports transmigration of brain-infiltrating macrophages in multiple sclerosis. J. Clin. Invest. 129, 3277-3292 (2019).
  16. Hu, Y., et al. mTOR-mediated metabolic reprogramming shapes distinct microglia functions in response to lipopolysaccharide and. Glia. 68, 1031-1045 (2020).
  17. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Front. Cell. Neurosci. 14, 22(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ECAR
Исследование гликолиза в первичной микроглии с помощью анализа внеклеточного потока
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.