Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Индукция ферроптоза в глиоме кальцеориозидом A посредством модуляции пути PI3K/Akt/Nrf2

469 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69643

⸱

30 декабря 2025 г.

 ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, Qilu Hospital of Shandong University, 2Department of Pediatric Surgery, Weifang Peoples Hospital, 3Department of Burn, Weifang Peoples Hospital

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

В данном исследовании рассматривается терапевтический потенциал кальцеориозида А при глиоме, демонстрируя его способность ингибировать сигнализацию PI3K/Akt и способствовать деградации Nrf2, тем самым вызывая ферроптоз и подавляя прогрессирование опухоли как in vitro , так и in vivo.

Аннотация

Этот протокол демонстрирует экспериментальный рабочий процесс, используемый для изучения влияния кальцеориозида A (CaA) на индукцию ферроптоза и модуляцию пути фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K)/протеинкиназы B (Akt)/ядерного фактора эритроида-2 (Nrf2) в моделях глиомы. Процедуры включают серию клеточных анализов в линий глиомы человека U251 и U87 для оценки жизнеспособности клеток, пролиферации и химиочувствительности после лечения CaA. Изменения, связанные с ферроптозом, оцениваются путём измерения реактивных видов кислорода (ROS), глутатиона (GSH), малондильдегида (MDA) и уровня лабильного железа, а также экспрессии белков, связанных с ферроптозом, таких как глутатион пероксидаза 4 (GPX4), субъединица цистеина/глутамата антипортера (xCT) и ферритин через вестерн блот. Для оценки вовлечённости путей протокол подробно описывает qRT-PCR, western blot и иммунопреципитационные анализы на экспрессию Nrf2 и убиквитинирование. Для подтверждения его роли в регуляции ферроптоза включены эксперименты по гиперэкспрессии Nrf2. Протокол дополнительно демонстрирует использование модели ксенотрансплантата на мыши, при которой клетки U87 имплантируются подкожно, а затем внутрибрюшинное введение CaA для оценки роста опухоли in vivo и токсичности. Гистологический анализ основных органов проводится для оценки системной безопасности. Кроме того, молекулярное стыкование используется для прогнозирования прямого связывания между CaA и субъединицей PI3K p110α (PIK3CA). Вместе эти процедуры обеспечивают воспроизводимую основу для изучения механизмов ферроптоза и терапевтической эффективности природных соединений в исследованиях глиом.

Введение

Глиомы, особенно высокостепенные глиобластомы, представляют собой одну из самых смертоносных форм опухолей мозга, характеризующуюся быстрым размножением, устойчивостью к лечению и плохимпрогнозом 1. В последние годы были изучены различные антиглиомные препараты, включая традиционные химиотерапевты, такие как темозоломид, и ряд природных соединений, таких каккуркумин-2,ресвератрол-3 и эпигаллокатехингаллат-4. Эти агенты действуют через множество механизмов, включая индукцию апоптоза, ингибирование ангиогенеза и модуляцию путей окислительного стресса. Однако многие из этих соединений сталкиваются с такими ограничениями, как низкая биодоступность или неполная механистическая характеристика. Это подчёркивает критическую необходимость комплексных методологий, которые не только подтверждают противоопухолевую активность, но и систематически анализируют основные фармакологические механизмы. Создание таких механистических рабочих процессов особенно важно для ускорения разработки новых антиглиомных соединений от открытия до доклинической валидации.

Для поддержки этой цели всё больше исследований интегрируют передовые вычислительные и экспериментальные инструменты для повышения механистического разрешения 5,6. Модели дизайна лекарств на основе структуры и искусственного интеллекта (ИИ) — такие как AlphaFold3 и молекулярное стыкованное соединение — способствуют выявлению перспективных взаимодействий лекарств и мишени с беспрецедентной скоростьюи точностью 7,8. Эти инструменты дополняют экспериментальные методы, предсказывая аффинности связывания и выявляя потенциальные молекулярные цели до лабораторной валидации. В то же время появление функциональных тестов, основанных на путях, живых клеток визуализации и высокоразрешающих протеомных методов позволяет исследователям оценивать клеточное воздействие новых соединений по нескольким регуляторным осям, включая окислительный стресс, каскады сигнальной передачи и методы клеточной гибели, такие как ферроптоз 9,10,11.

Среди сигнальных путей, участвующих в биологии глиом, особенно интересны пути фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K)/протеинкиназы B (Akt) и ядерного фактора эритроид-2 (Nrf2), связанных с фактором 2 (Nrf2), из-за их роли в росте опухоли, редокс-гомеостазе и устойчивости к терапии12,13. Сигнализация PI3K/Akt способствует выживаемости, размножению и метаболической адаптации в клетках глиомы, в то время как Nrf2 выступает главным регулятором антиоксидантного ответа, подавляя ферроптотическую гибельклеток 14. Постоянное активирование этих путей способствует уклонению от лечения, делая их привлекательными мишенями для фармакологическоговмешательства 15. Традиционные методы исследования путей включают western blotting для полного и фосфорилированного белка, а также qRT-PCR для анализа экспрессии генов. Однако углублённый анализ сигнализации Nrf2 требует дополнительных анализов, оценивающих стабильность белка, ядерную транслокацию и посттрансляционные модификации, такие как убиквитинация. Эти многогранные стратегии обнаружения необходимы для понимания того, как определённые соединения нарушают или усиливают редокс-регуляцию и ферроптотический контроль.

Кальцеориозид A (CaA), производный гидроксициннамовой кислоты, обладает двойным механизмом, одновременно ингибируя сигнализацию PI3K/Akt и способствуя протеасомному разложению Nrf2, тем самым повышая ферроптотическую чувствительность. Эта стратегия двойного таргетинга может повысить воспроизводимость и механистическую глубину по сравнению с существующими агентами, такими как эрастин или RSL3, которые действуют после антиоксидантной защиты. Этот протокол представляет интегрированный экспериментальный подход к изучению фармакологического механизма CaA, включающий молекулярное докирование для выявления сайтов связывания PI3K, иммуноблоттинг и иммунопреципитацию для выявления экспрессии и убиквитинации Nrf2, а также ферроптозные маркеры, такие как реактивные кислородные формы (ROS), глутатион (GSH) и малондиальдегид (MDA). Кроме того, для оценки терапевтической эффективности и системной безопасности CaA используется модель ксенотрансплантата мыши. Этот комплексный рабочий процесс предоставляет воспроизводимую и информативную платформу для изучения механизма действия противораковых препаратов с акцентом на интеграцию модуляции сигнальных путей и регуляции гибели клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Культивирование и обработка клеток
Мышиные нейронные клетки HT22 и человеческие глиомы U87 и U251 были культивированы в среде Modified Eagle Medium компании Dulbecco, дополненной сывороткой из 10% плода и 4 мМ L-глутамина, в увлажнённых условиях при 37 °C с 5% CO₂. Для упрощения экспериментальной согласованности все методы лечения клеток были стандартизированы и описаны здесь. В этом разделе описываются конкретные состояния, используемые в каждой группе лечения, а также соответствующие анализы на последующих этапах.

Лечение CaA:
Клетки HT22 обрабатывались с увеличением концентраций CaA (0, 0,1, 0,5, 1, 10, 50, 100, 250 и 500 мкм) в течение 72 часа. Глиомные клетки U87 и U251 обрабатывались CaA в концентрациях 5, 20 или 50 мкм в течение 24 часов для большинства экспериментов, или с 50 мкм в течение 0, 6, 12 или 18 часов для исследований с течением времени. Эти методы лечения использовались в следующих анализах: вестерн-блоттинг для субъединицы цистеина/глутамата антипортера (xCT), глутатион пероксидаза 4 (GPX4), ферритин (FTH1), глутаминазу и PI3K/Akt/млекопитающую мишени рапамицина (mTOR)/эукариотического фактора инициации 4B (EIF4B) (общий и фосфорилированный уровень); количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (RT-qPCR) для белков, ассоциированных с Nrf2 и Кельха-подобного ECH 1 (Keap1); измерение ROS с использованием 2′,7′-дихлордигидрофлуоресцеинового диацетата (DCFH-DA); Количественная оценка GSH и MDA; обнаружение Fe2 + на основе FerroOrange; пролиферационный анализ на 5-этинил-2′-дезоксиуридин (EdU); Анализ формирования колоний; Анализ жизнеспособности клеток 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (MTT).

Совместное лечение липрокстатином-1 (Lip1):
Клетки предварительно обработали 50 нМ Lip1 в течение 2 часов перед добавлением 50 мкм CaA. Эти условия применялись в MTT-анализе (0, 24, 48, 72 часа); анализ формирования колоний; EdU анализ; Анализ апоптоза Annexin V/PI (с/без цисплатина 20 нм).

Совместное лечение MG132:
Клетки обработали 10 мкм MG132 самостоятельно или в сочетании с 50 мкм CaA в течение 24 часов. Это применялось к вестерн-блоттингу для стабилизации белка Nrf2 (общего и ядерного); Иммунопреципитационные (IP) анализы для убиквитинированных Nrf2 и Keap1.

Совместное лечение цисплатином:
Клетки обрабатывали 20 нМ цисплатином отдельно или в сочетании с 20 мкм CaA в течение 24 часов. Эти методы использовались в апоптозном анализе Annexin V/йодид пропидия (PI).

Гиперэкспрессия Nrf2 :
Клетки были трансфектированы плазмидой сверхэкспрессии Nrf2 с 2,5 мкг или пустым вектором с использованием трансфекционного агента в течение 18 часов, затем обработаны 50 мкм CaA в течение 24 часа. Это состояние использовалось при западном блотинге для xCT, GPX4, FTH1 и глутаминазы; ROS, MDA, GSH анализы; FerroOrange окрашивание для внутриклеточного железа.

Диаграмма рабочего процесса (дополнительный рисунок S1) суммирует вышеуказанные экспериментальные условия и соответствующие анализы. Этот рисунок визуально связывает каждый протокол лечения с его конкретными последующим анализом для повышения прозрачности и воспроизводимости.

Оценка жизнеспособности клеток
Жизнеспособность клеток оценивалась с использованием традиционного колориметрического метода MTT, как описаноранее 16. Клетки HT22, U251 и U87 были покрыты в культивированные пластины с 96 лунками и инкубированы ночью для обеспечения прикрепления. После завершения периода обработки в каждую скважину вводилось по 15 мкл раствора MTT, а пластины инкубировали в течение 4 часов при 37 °C. Затем среда отбрасывалась, и для растворения образованных кристаллов формазана добавляли 150 мкл диметилсульфоксида (DMSO). Поглощение впоследствии фиксировалось на 490 нм с помощью считывателя микропластин. Более высокие значения поглощения свидетельствуют о большей жизнеспособности клеток, тогда как снижение поглощения указывает на цитотоксические эффекты.

Инкорпорный анализ EdU
Для оценки синтеза ДНК и пролиферации клеток были проведены инкорпорационные анализы EdU с использованием EdU Imaging Kit, как описановыше 17. Кратко времени клетки глиомы U251 и U87 были посеяны в пластины с 24 лунками. После обработки клетки инкубировали с EdU (конечная концентрация 10 мкм) и культивировали ещё 24 часа. После инкубационного этапа клетки фиксировались с помощью 4% параформальдегида, затем пермеабилизировали с помощью 0,5% тритона X-100 и окрашивались согласно инструкциям комплекта. Процент EdU-положительных клеток (пролиферирующих клеток) был количественно измерен флуоресцентной микроскопией и нормализован до общего количества ядер, окрашенных 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI).

Анализ формирования колоний
Для анализа формирования колонии клетки глиомы U251 и U87 были покрыты в пластинах диаметром 3,5 см при низкой плотности (по 500 клеток на чашу). После обработки культурная среда была заменена на свежую, безлекарственную среду, и клетки поддерживались ещё 14 дней для формирования колонии, при этом замена среды проводилась каждые три дня. Полученные колонии затем фиксировались с помощью 4% параформальдегида, окрашены 0,1% кристаллической фиолетовой и подсчитывались вручную под микроскопом. Скопления диаметром более 75 мкм были отмечены как колонии. Каждый эксперимент проводился в тройном экземпляре и повторялся три раза. Этот анализ соответствовал общепринятым протоколам оценки долгосрочной пролиферативнойспособности 18. Колонии должны выглядеть как плотные, круглые скопления; Меньшее количество и меньшие колонии свидетельствуют о снижении пролиферационной способности.

Оценка клеточного апоптоза
Апоптотическая клеточная смерть оценивалась с помощью набора для обнаружения апоптоза FITC-Annexin V, как было описаноранее 16. Глиомные клетки U87 и U251 обрабатывались цисплатином 20 нМ при наличии или отсутствии 20 мкм CaA в течение 24 часов до окрашивания. Для экспериментов с ингибированием ферроптоза клетки предварительно обрабатывали 50 нМ Lip1 в течение 2 часов, затем совместно лечили 20 мкм CaA и 20 нМ цисплатина в течение дополнительных 24 часов. После указанных обработок клетки были собраны (300 × г, 5 минут) и окрашены Annexin V-FITC и PI согласно инструкции производителя. После маркировки образцы исследовались на проточном цитометре. Сбор данных проводился с использованием каналов FL1 (FITC) и FL2 (PI), с применением компенсационных настроек для минимизации спектрального перекрытия. Впоследствии была рассчитана доля клеток Annexin V-положительных для определения степени апоптоза.

Вестерн-блот анализ
Вестерн блоттинг проводился согласно установленнымпроцедурам 19,20. Кратко, после назначенных методов лечения, клетки лизировали в буфере RIPA с ингибиторами протеазы и фосфатазы, а уровни белка определялись с помощью анализа Брэдфорда. Для экспериментов по оценке субклеточного распределения Nrf2 ядерные и цитоплазматические белки экстракцировались с помощью коммерческого комплекта для ядерной экстракции согласно инструкциям производителя.

В общей сложности 40 мкг белка из каждого образца растворялось на 10% геле SDS-PAGE и затем переносилось на мембраны PVDF. Мембраны блокировались 5% обезжиренным молоком, приготовленным в PBST (PBS с 0,1% Tween-20) в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего проводилась ночная инкубация с первичными антителами при 4 °C. После промывания в течение 1 часа при 37 °C применялись вторичные антитела, сопряжённые с HRP (1:5 000), а сигналы обнаруживались с помощью системы усиленной хемилюминесценции (ECL).

Уровни экспрессии xCT, глутаминазы, GPX4 и FTH1 измерялись с использованием глицеролдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) в качестве контроля нагрузки. Фосфорилированные белки (p-PI3K, p-Akt, p-mTOR и p-EIF4B) были количественно измерены относительно их общего уровня белка, тогда как общие белки нормализовались относительно GAPDH. Ядерный NRF2 был нормализован до Lamin B. Ожидаемые результаты включают дозозависимое и временно-зависимое снижение Nrf2 и p-PI3K/Akt/mTOR/EIF4B, а также снижение уровня маркеров, связанных с ферроптозом, в клетках, обработанных CaA.

Для убиквитинационных тестов клетки обрабатывали MG132 (10 мкм) с CaA или без него (50 мкм) в течение 24 часов. После лизиса белковые комплексы иммунопреципитировали с помощью анти-Nrf2 или анти-Keap1; обычный кроличий IgG использовался как отрицательный контроль. Иммунопреципитаты затем исследовали антиубиквитиновым антителами для обнаружения убиквитинированных форм, а полные лизаты также исследовали на уровень белка Nrf2 и ECH-ассоциированного с Kelch-подобным белком 1 (Keap1) для подтверждения входных данных.

Экстракция РНК и количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)
Экстракция РНК и qRT-ПЦР проводились по стандартнымпротоколам 21. Кратко, клетки глиомы U87 и U251 обрабатывались с содержанием 50 мкм CaA или без него в течение разных периодов (6 и 18 часов). Общая РНК была выделена и преобразована в кДНК посредством обратной транскрипции. Количественное ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) проводилось с использованием SYBR Green qPCR Master Mix на платформе реального времени PCR. Относительная экспрессия генов была определена с помощью расчёта 2-ΔΔCt. Последовательности праймеров, используемые для Nrf2, Keap1 и домашнего гена GAPDH, были следующими:

Nrf2 форвард, 5′-CACATCCAGTCAGAAACCAGTGG-3′;
Nrf2 реверс, 5′-GGAATGTCTGCCCAAAAGCTG-3′

Keap1 вперед, 5′-CAACTTCGCTGAGCAGATTGGC-3′;
Keap1 реверс, 5′-TGATGAGGGTCACCAGGGCA-3′

GAPDH вперед, 5′-CGGAGTCAACGGGGTTGGGG-3′;
GAPDH реверс, 5′-AGCCTTCTACATGGTGGTGAAGAC-3′

Трансдукция NRF2
Клетки глиомы U251 и U87 временно трансфектировались либо с помощью плазмиды Nrf2 с переэкспрессией, либо с соответствующим пустым контрольным вектором с использованием липидного трансфекционного реагента; Процедура основывалась на традиционных методах переходнойтрансфекции 22. Кратко время клетки сеяли в пластины с 6 колодцями с плотностью 3 × 10⁵ клеток на скважину и культивировали за ночь для достижения примерно 70-80% слияния на момент трансфекции. Для каждой скважины 2,5 мкг плазмидной ДНК разбавлялось в 125 мкл восстановленной сывороточной среды и смешивалось с 5 мкл трансфекционного реагента. Отдельно 3,75 мкл трансфекционного реагента было разведено ещё в 125 мкл восстановленной сывороточной среды. Разбавленные смеси ДНК и трансфекционных реагентов затем комбинировали, аккуратно смешивались и инкубировали в течение 10–15 минут при комнатной температуре для формирования комплекса. Полученные трансфекционные комплексы (общий объём 250 мкл) добавлялись по капли в каждую яму, содержащую клетки в свежей полной среде.

После 18 часов инкубации при 37 °C в CO₂-инкубаторе среда заменялась свежей культурной средой. Затем клетки были проведены последующие анализы, включая вестерн-блотинг, анализ ROS, количественную оценку MDA/GSH и исследования накопления железа. Этот протокол следует широко признанным процедурам экспрессии временных генов и обеспечивает устойчивую экспрессию Nrf2 в течение 24-48 часов после трансфекции.

Измерение внутриклеточного железа
Внутриклеточные уровни Fe2+ измерялись с помощью флуоресцентного индикатора FerroOrange. Кратковременные глиомные клетки U251 и U87 были засеяны в пластины с 24 лунками и обработаны различными концентрациями CaA (5, 20 и 50 мкм). Для оценки влияния сверхэкспрессии Nrf2 на ферроптоз клетки U87 и U251 были трансфектированы плазмидой экспрессии Nrf2 или пустым вектором. Через 18 часов среда была заменена, и клетки обработаны 50 мкм CaA в течение 24 часов. Впоследствии клетки подвергались воздействию 1 мкм FerroOrange в безсывороточной среде и инкубировали при 37 °C в течение 30 минут перед анализом. После инкубации клетки промывали и наблюдали под флуоресцентным микроскопом с использованием фильтра TRITC (возбуждение ~543 нм, эмиссия 560-600 нм), где повышенная интенсивность оранжевой флуоресценции указывает на более высокий уровень лабильного Fe2+, обычно локализованного в цитоплазме. Этот метод был адаптирован из проверенных анализов железа на основе флуоресцентныхзондов 23.

Измерение GSH и MDA
Внутриклеточные уровни GSH и MDA были определены в соответствии со стандартизированными протоколами оценки окислительногостресса 24. Кратковременные глиомные клетки U251 и U87 были засеяны в пластины с 24 лунками и обработаны различными концентрациями CaA (5, 20 и 50 мкм). Для оценки влияния сверхэкспрессии Nrf2 на ферроптоз клетки U87 и U251 были трансфектированы плазмидой экспрессии Nrf2 или пустым вектором. Через 18 часов среда была заменена, а клетки обработаны 50 мкм CaA в течение 24 часов. Впоследствии клетки лизировали в буфере RIPA, а общие концентрации белка измерялись с помощью набора для количественной оценки белков BCA. Содержимое GSH и MDA впоследствии анализировалось с помощью коммерческих наборов для обнаружения в соответствии с протоколами производителей.

ROS-анализ
Внутриклеточная генерация ROS оценивалась с помощью флуоресцентного зонда DCFH-DA в соответствии с установленнымипротоколами 25. Кратковременные глиомные клетки U251 и U87 были засеяны в пластины с 24 лунками и обработаны различными концентрациями CaA (5, 20 и 50 мкм). Для оценки влияния сверхэкспрессии Nrf2 на ферроптоз клетки U87 и U251 были трансфектированы плазмидой экспрессии Nrf2 или пустым вектором. Через 18 часов среда была заменена, а клетки обработаны 50 мкм CaA в течение 24 часов. Впоследствии клетки обработали 5 мкм dcfh-da при 37 °C в течение 1 часа, после чего проводили промывки PBS для удаления излишков красителя. Флуоресцентные сигналы визуализировались с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, оснащённого FITC-фильтром (возбуждение 488 нм, излучение 525 нм), а изображения были сделаны для анализа. Повышенная интенсивность зелёной флуоресценции соответствует повышенному внутриклеточному уровню ROS.

Эксперименты на животных
Все эксперименты на животных проводились строго в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здоровья. Протокол был утверждён Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Народной больницы Вэйфан под номером одобрения [2025SDL579]. Для создания модели ксенотрансплантата глиомы 2 × 106 клеток U87 были ресуспендированы в 0,2 мл PBS и подкожно инъекциированы в левый бок 4-недельного самца BALB/c голых мышей. После развития опухолей в течение 7 дней мыши были случайным образом распределены по трём группам (n = 8 на группу): нелеченая контрольная, CaA-обработанная (2,5 мг/кг) и CaA (2,5 мг/кг) в сочетании с Lip1 (10 мг/кг). Лечение проводилось с помощью ежедневной интрабрюшинной инъекции в течение 14 последовательных дней. Размеры опухоли измерялись каждые 3 дня с помощью суппортов, а объёмы — по формуле: объём = (длина × ширина²) / 2. На 21-й день всех мышей усыпили, опухоли удаляли и фотографировали для дальнейшего анализа.

Секвенирование РНК и анализ путей KEGG
Секвенирование РНК проводилось для профилирования транскрипционных изменений после воздействия CaA. Целостность РНК была подтверждена с помощью микрообъёмного УФ-ВИС-спектрофотометра и капиллярной электрофорезной системы перед секвенированием на платформе Illumina. Чистые считывания были сопоставлены с человеческим референсным геномом (GRCh38) с HISAT2, а экспрессия гена количественно оценивалась как FPKM. Дифференциально экспрессированные гены были идентифицированы с помощью DESeq2 (FDR < 0,05, |log₂FC| ≥ 1), а функциональное обогащение оценивалось с помощью анализа путей KEGG (скорректированный P < 0,05).

Анализ молекулярного стыковки
Молекулярное стыкование использовалось для прогнозирования взаимодействия между CaA и путём PI3K/Act. Кристаллическая структура человеческой каталитической субъединицы PI3K p110α (PIK3CA) была получена из Белкового банка данных (PDB ID: 8BFU). Структура CaA была извлечена из PubChem и минимизирована с помощью программного обеспечения для молекулярного моделирования. С помощью программного обеспечения для подготовки молекулярного стыковки все молекулы воды и несущественные лиганды были удалены из структуры PIK3CA, а также добавлены атомы водорода. Стыковочная сетка была определена вокруг активного участка PIK3CA (на основе известных координат точки связи), а для выполнения стыковки использовался алгоритм стыковки. Позы связывания CaA с наивысшими баллами были отобраны по аффинности связывания (ккал/моль) и исследованы на ключевые взаимодействия. Взаимодействия белков и лигандов, такие как водородные связи и гидрофобные контакты, были визуализированы с помощью программного обеспечения для молекулярной визуализации и 2D-картирования взаимодействий.

Безопасность и утилизация отходов
Все эксперименты с использованием химических реагентов, таких как DMSO, флуоресцентные красители (DCFH-DA, FerroOrange) и фиксативные средства, проводились в выхлопной вытяжке с соответствующими средствами индивидуальной защиты (СИЗ), включая перчатки и защитные очки. DMSO и флуоресцентные зонды использовались с осторожностью из-за их способности проникать через кожу и возможной цитотоксичности. Загрязнённые материалы, включая наконечники пипеток, культиваторные пластины и перчатки, были захвачены в специально отведённых контейнерах для опасных отходов. Ткани и туши животных рассматривались как биологически опасные отходы и сожжгли или автоклавировались в соответствии с институциональными нормами биобезопасности и местными экологическими нормами.

Статистический анализ
Все результаты представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). Различия между двумя группами оценивались с помощью двухстороннего t-теста Student. Для анализов с участием нескольких групп применялся односторонний ANOVA с соответствующими пост-хок сравнениями (например, тест Тьюки). p-значение ниже 0,05 считалось показателем статистической значимости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Подавление пролиферации и повышенная хемочувствительность клеток U251 и U87 in vitro с помощью CaA
Рисунок 1A иллюстрирует структуру CaA. Сначала мы оценили цитотоксическое влияние CaA с помощью MTT-анализа на нормальные мышиные нейронные клетки HT22 и человеческие глиомы U251 и U87. По сравнению с необработанными клетками (0 мкм CaA), CaA оказывал минимальное влияние на жизнеспособность клеток HT22 при концентрациях ниже 100 мк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

CaA демонстрирует убедительный противоопухолевой эффект при глиобластоме, уникально регулируя два критически важных оси выживаемости: путь PI3K/Akt/mTOR и защитный механизм от Nrf2-ферроптоза. Путь PI3K/Akt часто гиперактивируется при мультиформной глиобластоме (GBM, изменяется в ~88-90% случаев) из-за потери PTEN или активации RTK, что вызывает пролиферацию и устойчивость к терапии26. Тем не менее, только таргетирование этого пути привело к ограниченному апоптозу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Agilent 2100 Bioanalyzerсистема электрофореза на капиллярах
Annexin V-FITC Apoptosis KitRoche Diagnostics11858777001N/A
AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina)программное обеспечение для подготовки молекулярного докирования (алгоритм докирования)
Calceolarioside A (CaA)Sigma-AldrichSMB00246N/A
Chem3Dпрограммное обеспечение для молекулярного моделирования
cDNA Synthesis KitVazyme BiotechR223N/A
DCFH-DASigma-AldrichD6883N/A
DMEMThermo Fisher Scientific11965092N/A
DMSOMerckD8418N/A
FerroOrange probeDojindoF374N/A
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF2442N/A
Flow cytometerBD BiosciencesFACSAriaIII Flow CytometryИнструмент для анализа окрашенных аннексином V клеток
Fluorescence microscopeOlympusIX73Инструмент для наблюдения флуоресценции FerroOrange и DCFH-DA
FTH1 antibodyAbcamab75973AB_1310150
GAPDH antibodyAbcamab8245AB_2107448
GLS antibodyAbcamab93434AB_10563527
GPX4 antibodyAbcamab125066AB_10972289
HT22 murine neuronal cell lineAddexBioC0011008CVCL_0321
jetPRIME transfection reagentPolyplus-transfection114-07реагент для трансфекции на основе полимера
Keap1 antibodyAbcamab139729AB_2732852
L-Glutamine (200 mM)Thermo Fisher Scientific25030081N/A
LigPlot+инструмент для картирования 2D-взаимодействий
Lipofectamine 3000Thermo Fisher Scientificреагент для трансфекции на основе липидов
Liproxstatin-1SelleckS7699N/A
MG132SelleckS2619N/A
Microplate readerThermo Fisher ScientificH1MИнструмент для измерения абсорбции в анализе MTT (при 490 нм)
MTTSigma-AldrichM5655N/A
NanoDropспектрофотометр UV-Vis для малых объемов
Nrf2 antibodyAbcamab62352AB_945626
Nude BALB/c miceVital River, ChinaN/AIMSR_CRL:028
OptiMeM reduced serum medium
PyMOLпрограммное обеспечение для молекулярной визуализации
QuantStudio 5 Real-Time PCR System
SYBR Green Master MixVazyme BiotechQ711N/A
TRIzol ReagentThermo Fisher15596026N/A
U251 human glioma cell lineCLS Cell Lines Service300385CVCL_0021
U87 human glioma cell lineATCCHTB-14CVCL_0022
Ubiquitin antibodyAbcamab7780AB_306981
xCT/SLC7A11 antibodyAbcamab175186AB_2715513

Ссылки

  1. Bajwa, M. H., Anis, S. B., Yousaf, I., Shah, M. A. A 10-year survival-trend analysis of low-grade glioma and treatment patterns from an LMIC. Asian J Neurosurg. 18 (3), 533-538 (2023).
  2. Su, X., Chen, S., Lu, H., Li, H., Qin, C. Study on the inhibitory effect of curcumin on GBM and its potential mechanism. Drug Des Devel Ther. 15 (1), 2769-2781 (2021).
  3. Karkon-Shayan, S., et al. Resveratrol as an antitumor agent for glioblastoma multiforme: targeting resistance and promoting apoptotic cell deaths. Acta Histochem. 125 (6), 152058(2023).
  4. Kuduvalli, S. S., et al. A combination of metformin and epigallocatechin gallate potentiates glioma chemotherapy in vivo. Front Pharmacol. 14 (1), 1096614(2023).
  5. Abdul Raheem, A. K., Dhannoon, B. N. Automating drug discovery using machine learning. Curr Drug Discov Technol. 20 (6), 79-86 (2023).
  6. Yang, J., et al. Automating biomedical literature review for rapid drug discovery: leveraging GPT-4 to expedite pandemic response. Int J Med Inform. 189 (1), 105500(2024).
  7. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  8. Desai, D., et al. Review of AlphaFold 3: transformative advances in drug design and therapeutics. Cureus. 16 (7), e63646(2024).
  9. Reinis, J., Reicher, A. Monitoring subcellular protein localization at scale in live cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (9), 673(2024).
  10. Kwon, Y. W., et al. Application of proteomics in cancer: recent trends and approaches for biomarkers discovery. Front Med (Lausanne). 8 (1), 747333(2021).
  11. Wang, X., Liu, Z., Ma, L., Yu, H. Ferroptosis and its emerging role in tumor. Biophys Rep. 7 (4), 280-294 (2021).
  12. Glaviano, A., et al. PI3K/AKT/mTOR signaling transduction pathway and targeted therapies in cancer. Mol Cancer. 22 (1), 138(2023).
  13. Hoxhaj, G., Manning, B. D. The PI3K-AKT network at the interface of oncogenic signalling and cancer metabolism. Nat Rev Cancer. 20 (2), 74-88 (2020).
  14. Liu, Y., et al. Protein kinase B (PKB/AKT) protects IDH-mutated glioma from ferroptosis via Nrf2. Clin Cancer Res. 29 (7), 1305-1316 (2023).
  15. Su, H., Peng, C., Liu, Y. Regulation of ferroptosis by PI3K/Akt signaling pathway: a promising therapeutic axis in cancer. Front Cell Dev Biol. 12 (1), 1372330(2024).
  16. Song, L., Li, D., Gu, Y., Li, X., Peng, L. Let-7a modulates particulate matter (≤2.5 µm)-induced oxidative stress and injury in human airway epithelial cells by targeting arginase 2. J Appl Toxicol. 36 (10), 1302-1310 (2016).
  17. Liu, H., et al. Activation of PI3K/Akt pathway by G protein-coupled receptor 37 promotes resistance to cisplatin-induced apoptosis in non-small cell lung cancer. Cancer Med. 12 (19), 19777-19793 (2023).
  18. Song, L., et al. miR-144-5p enhances the radiosensitivity of non-small-cell lung cancer cells via targeting ATF2. Biomed Res Int. 2018 (1), 5109497(2018).
  19. Song, L., et al. The Legionella effector SdjA is a bifunctional enzyme that distinctly regulates phosphoribosyl ubiquitination. mBio. 12 (5), e0231621(2021).
  20. Luo, J., et al. Acinetobacter baumannii kills fungi via a type VI DNase effector. mBio. 14 (1), e0342022(2023).
  21. Liu, K., et al. Trim27 aggravates airway inflammation and oxidative stress in asthmatic mice via potentiating the NLRP3 inflammasome. Int Immunopharmacol. 134 (1), 112199(2024).
  22. Song, L., et al. Legionella pneumophila regulates host cell motility by targeting Phldb2 with a 14-3-3ζ-dependent protease effector. Elife. 11 (1), e73220(2022).
  23. Gao, Z., Jiang, J., Hou, L., Ji, F. Lysionotin induces ferroptosis to suppress development of colorectal cancer via promoting Nrf2 degradation. Oxid Med Cell Longev. 2022 (1), 1366957(2022).
  24. Bai, X., et al. Maackiain protects against sepsis via activating AMPK/Nrf2/HO-1 pathway. Int Immunopharmacol. 108 (1), 108710(2022).
  25. Zhu, Y., et al. The protective role of zingerone in a murine asthma model via activation of the AMPK/Nrf2/HO-1 pathway. Food Funct. 12 (7), 3120-3131 (2021).
  26. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  27. Dodson, M., Castro-Portuguez, R., Zhang, D. D. NRF2 plays a critical role in mitigating lipid peroxidation and ferroptosis. Redox Biol. 23 (1), 101107(2019).
  28. Cahuzac, K. M., et al. AKT activation because of PTEN loss upregulates xCT via GSK3β/NRF2, leading to inhibition of ferroptosis in PTEN-mutant tumor cells. Cell Rep. 42 (5), 112536(2023).
  29. Cai, J., et al. Fatostatin induces ferroptosis through inhibition of the AKT/mTORC1/GPX4 signaling pathway in glioblastoma. Cell Death Dis. 14 (3), 211(2023).
  30. Li, F. J., et al. System X(c)-/GSH/GPX4 axis: an important antioxidant system for the ferroptosis in drug-resistant solid tumor therapy. Front Pharmacol. 13 (1), 910292(2022).
  31. Guo, F., et al. Juglone induces ferroptosis in glioblastoma cells by inhibiting the Nrf2-GPX4 axis through the phosphorylation of p38MAPK. Chin Med. 19 (1), 52(2024).
  32. Tuncer, C., Hacioglu, C. Borax induces ferroptosis of glioblastoma by targeting HSPA5/NRF2/GPx4/GSH pathways. J Cell Mol Med. 28 (7), e18206(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Ferroptosis Induction in Glioma by Calceolarioside A via Modulation of the PI3K/Akt/Nrf2 Pathway
Posted by JoVE Editors on 8/06/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/69643

Теги

PI3K AktNrf24
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.