Методическая статья

Геномное картирование модификаций гистонов и сайтов связывания факторов транскрипции в нейроэндокринных мелкоклеточных линиях рака легких с помощью CUT&RUN

DOI:

10.3791/69656

⸱

3 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology and Oncology, Department of Medicine, Cancer Center, Medical College of Wisconsin, 2Linda T. and John A. Mellows Center for Genomic Sciences and Precision Medicine Center Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Data Science Institute, Medical College of Wisconsin

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптимизированный протокол секвенирования следующего поколения (CUT&RUN-seq) описан для нейроэндокринных мелкоклеточных клеточных клеток рака лёгких. Она позволяет картировать по всему геному различные модификации гистонов и сайтов связывания транскрипционных факторов (например, E2F7) для изучения эпигенетической и транскрипционной дерегуляции в патобиологии SCLC.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белоки ремоделирования хроматина и транскрипционные факторы (ТФ) играют ключевую роль в биологии опухолей мелкоклеточного рака лёгких (SCLC). Общегеномная характеристика посттрансляционных модификаций гистонов (PTM) и сайтов связывания TF необходима для выявления регуляторных элементов ДНК и генных путей, которые приведут к более глубокому механистическому пониманию SCLC и номинированию целей для терапевтического вмешательства. Расщепление под мишенями и высвобождение Использование нуклеазы, а затем следующее секвенирование следующего поколения (CUT&RUN-seq) — это мощный метод картирования специфических модификаций гистонов и определения профилей связывания ДНК широкого спектра белков in situ в клеточном геноме. В CUT&RUN микрококковая нуклеаза (MNase), сросшаяся с белком A/G, рекрутируется через антитела к геномным расположениям белков, ассоциированных с хроматином, где фрагменты ДНК высвобождаются из объёмного хроматина при активации и расщеплении MNase. Это локализованное переваривание создаёт небольшие, специфичные для локуса фрагменты ДНК, подходящие для секвенирования.

Здесь мы представляем подробный протокол профилирования модификаций гистонов H3K4me3 (ассоциированных с активными или открытыми промоторами) и H3K4me1 (связанного с активными энхансерами), а также транскрипционного фактора E2F7 в SCLC. Этот протокол был оптимизирован для нейроэндокринных (NE) моделей клеточных линий SCLC, которые обычно характеризуются крупными ядрами, скудной цитоплазмой и ростом в виде неадгезентных агрегатов в суспензии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Посттрансляционные модификации гистонов (ПТМ) и транскрипционные факторы (ТФ) являются центральными регуляторами экспрессии генов. Гистоновые ПТМ, такие как ацетилирование, метилирование, фосфорилирование и убиквитинация, главным образом на своих N-концевых хвостах, влияют на структурухроматина 1,2. При раке гистоновые ПТМ часто нарушаются, что приводит к аномальной активации онкогенов или заглушанию генов-супрессоровопухоли 3. ТФ связывают определённые последовательности ДНК с промоторами или энхансерами для активации или подавления целевых генов, часто привлекая ферменты, модифицирующие гистоны, координирующие ремоделированиехроматина 4. Ферменты, которые записывают, стирают или считывают гистонные метки, такие как гистонацетилтрансферазы (HAT), гистондеацетилазы (HDACs) и метилтрансферазы (HMT), часто мутируют или дисрегулируются при раке, что делает их привлекательными терапевтическимицелями 5.

В SCLC эпигенетические изменения и транскрипционные факторы, определяющие родословную (LDTF), являются ключевыми факторами биологииопухолей 6. В отличие от генетических мутаций, эпигенетические изменения, включая метилирование ДНК и модификации гистонов, регулируют экспрессию генов без изменения базовой последовательности ДНК. Эти модификации могут заглушить гены-супрессоры опухолей или активировать онкогены, подпитывая агрессивное поведение SCLC. Например, гистон-метилтрансфераза KMT2D часто мутирует с частотой изменения 12,9% в большой реальной когортепациентов с SCLC 7 и отвечает за монометилирование гистона H3 лизина 4 (H3K4me1), что связано с активными энхансерными участками генома. SCLC — это молекулярно гетерогенное заболевание. SCLC классифицируются на молекулярные подтипы на основе дифференциальной экспрессии четырёх LDTF: гомолог ахет-щитка 1 (ASCL1), фактор нейрогенной дифференцировки 1 (NEUROD1), белок 1 (YAP1) и POU класс 2 гомеобокс 3 (POU2F3). Нейроэндокринные (NE) подтипы, включая ASCL1 и NEUROD1, составляют примерно 70-80% случаев SCLC8. Поэтому изучение распределения и профилей различных гистонных PTM и сайтов связывания TF в различных подтипах SCLC может прояснить генно-специфические для подтипов программы, уязвимые к терапевтическому вмешательству.

Традиционный метод идентификации гистонных ПТМ и сайтов связывания специфических регуляторных белков на уровне всего генома — это секвенирование иммунопреципитации хроматина (ChIP-seq)9. Однако ChIP-seq требует большого количества входных клеток и часто даёт высокий фон по всему геному. В результате ChIP-seq требует высокого уровня обогащения целевого белка для различения истинного сигнала от шума и глубокого секвенирования для эффективного анализа данных. Кроме того, формальдегидная перекрёстная связь, используемая в ChIP-seq, может маскировать эпитопы и создавать ложноположительные сайтысвязывания 10. Расщепление под мишенями и высвобождение С использованием нуклеазы, а затем следующее секвенирование следующего поколения (CUT&RUN-seq) — это высококачественная альтернатива для картирования гистонных PTM и сайтов связывания TF in situ внутри целостных клеток. В этом методе проницаемые клетки инкубируются антителом, направленным на интересующий хроматино-ассоциированный белок, а затем связываются с белоком слияния белка A(G)-микрококковой нуклеазы (MNase). Целенаправленное переваривание ДНК, окружающее интересующий белок, затем индуцируется в условиях с высоким содержанием кальция и низкой соли, высвобождая определённые фрагменты ДНК для очистки. Очищенные фрагменты ДНК используются для создания библиотек секвенирования штрих-кодов, которые могут объединяться для высокопроизводительного секвенирования 11,12,13,14. По сравнению с ChIP-seq, CUT&RUN требует значительно меньше клеток в качестве входа, создаёт меньше фонового шума, избегает перекрёстных артефактов и требует меньше чтений секвенирования — что особенно подходит для экономичного изучения динамических состояний хроматина при раке.

Разработана технология CUT&RUN для изучения геномных позиций белоков, взаимодействующих с хроматином, включая модификации гистонов, сайты связывания TF и ассоциированные с хроматином комплексы, что позволяет выявить эпигенетические регуляторныеландшафты 11,12. Этот метод позволил провести детальный анализ архитектуры энхансер-промотора, регуляции транскрипционных сетей и динамики состояния хроматина в процессе развития и прогрессирования заболевания15. В исследованиях рака CUT&RUN позволяет точно картировать гистоновыеметки 16,17 и заселяемость онкогенных транскрипционных факторов, помогая выявлять линейно-специфические регуляторные программы и потенциальные терапевтическиецели 15,16. Кроме того, CUT&RUN может проводиться in situ в клетках, включая CD8+T-клетку 17, а также на образцахтканей 18,19.

Для обнаружения геномного расположения PTM и сайтов связывания транскрипционных факторов E2F7 в подтипах SCLC мы применили CUT&RUN-seq к четырём моделям клеточной линии SCLC NE: H146 и DMS79 (подтип ASCL1), а также к H446 и H82 (NEUROD1 подтип), с мутациями KMT2D или без них. Мы профилировали метку гистона H3K4me1 — модификацию, ассоциированную с энхансером, в основном катализируемую KMT2D, и E2F7, которая была показана как кофакторASCL1 20. Гистонная метка H3K4me3, ассоциированная с активными промоторами, служила положительным контролем, а IgG — отрицательным.

Здесь мы представляем подробный протокол CUT&RUN-seq для клеточных линий SCLC NE, основанный на следующем: коммерчески доступном наборе CUT&RUN (см. Таблицу материалов), оригинальной работе Скене иХеникоффа 11, 12, 13 и наших собственных лабораторных оптимизациях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол (рисунок 1) предоставляет пошаговые инструкции для выполнения CUT&RUN-seq в линиях NE SCLC, которые обычно растут как неадгезентные агрегаты или плавающие кластеры.

1. Клеточная культура

  1. Поддерживать клеточные линии DMS79 (подтип ASCL1), H146 (подтип ASCL1), H82 (NEUROD1 подтип) и H446 (NEUROD1 подтип) в 13 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% плодовой бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина (см. Таблицу материалов) в колбах объемом 75 мл. Культивируйте клетки в инкубаторе при 37 °C при 5%CO2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все клетки, использованные в этом исследовании, были приобретены у ATCC и прошли аутентификацию с помощью короткого тандемного повторного профилирования.

2. Проницаемость клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная проницаемость клеток необходима для того, чтобы антитела, pAG-MNase и переваренные фрагменты белка-ДНК могли свободно диффундировать в клетки и наружу. Перед запуском протокола CUT&RUN на новой клеточной линии необходимо провести оптимизации для определения идеальной концентрации дигитонина для эффективной проницаемости. Для протокола CUT&RUN следует использовать минимальную концентрацию для достижения более 95% проницаемости (95% клеток «мертвые»).

  1. Положите 5% запас дигитонина, ингибитор протеазы и спермидин на лёд и дайте им полностью оттаять.
  2. Подготовьте буфер для мойки согласно Таблице 1 и держите его на льду.
  3. Приготовьте рабочий раствор с 0,05% дигитонином, смешав 10 мкл из 5% запаса с 990 мкл буфера для промывания. Тщательно перемешайте с помощью вихря и держите на льду.
  4. Генерируйте серию разбавления дигитонина (0,05%, 0,01%, 0,001% и 0,0001%)" последовательно разбавляя предыдущий раствор до конечного объёма 1 мл каждой трубки. Вихрь каждого разбавления перед переходом к следующему. В то же время подготовьте контрольный тест с содержанием 0,05% диметилсульфоксида (DMSO) в буфере для промывания (всего 100 мкл; см. таблицу 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дигитонин и ДМСО — опасные химикаты. Обращайтесь с осторожностью и выбрасывайте все отходы в правильно маркированный контейнер с надёжными крышками.
  5. Держите все растворы для разведения дигитонина и контроль DMSO на льду до их использования.
  6. Определите количество необходимых клеток, умножив количество условий проницаемости на количество клеток, необходимых для каждого теста. Добавьте дополнительные 20% для компенсации вариаций пипетирования (например, для пяти условий по 5×105 ячеек в каждом, подготовьте примерно 1,2 x 5 x 5 x 105 ячеек).
  7. Соберите необходимое количество культивированных клеток путём центрифугирования при 600 × г в течение 3 минут при комнатной температуре (RT). Суспензировать гранулу в 600 мкл по 1× PBS (100 мкл на каждое условие плюс 20% дополнительно).
  8. Аликвот 100 мкл ресуспензированных клеток PBS в пять микроцентрифугных трубок по 1,5 мл — по одной трубке для каждой концентрации дигитонина и одной для контроля DMSO.
  9. Центрифугуйте трубки при 600 × г на 3 минуты при RT.
  10. Аккуратно удалите супернатант и снова суспензируйте каждую гранулу в 50 мкл соответствующего буфера контроля дигитонина или DMSO.
  11. Инкубировать образцы на RT в течение 10 минут.
  12. Смешайте 10 мкл обработанных клеток с 10 мкл трипан-синего и загрузите 10 мкл смеси на слайд для подсчёта ячеек.
  13. Используйте счётчик клеток для количественной оценки жизнеспособных клеток (неокрашенных) и нежизнеспособных, проницаемых положительных клеток (окрашенных в синий цвет).
  14. Определите самую низкую концентрацию дигитонина, которая производит наибольшую долю трипан-синих положительных клеток. Используйте эту концентрацию для эксперимента CUT&RUN на следующем этапе. Подтвердите, что контроль DMSO сохраняет жизнеспособность, типичную для нормальной здоровой клеточной культуры.

3. Продолжение CUT & RUN

ПРИМЕЧАНИЕ: Реагенты в этом протоколе масштабируются на 5 реакций, с добавлением дополнительных веществ для учёта потерь при пипетировании. Список материалов и оборудования см. Таблицу материалов. Рекомендуется как минимум две независимые биологические реплики для каждого эксперимента CUT&RUN.

  1. День 1
    1. Подготовка буфера CUT&RUN
      1. Подготовьте буфер Wash, смесив буфер Pre-Wash, ингибитор протеазы 25x и 1 M спермидина, как указано в таблице 3.
      2. Подготовьте буфер проникаемости ячейки, добавив 5% дигитонина в буфер промывки согласно таблице 3.
      3. Подготовьте буфер антител, добавив 0,4 мкл ЭДТА к 100 мкл буфера проницаемости клеток с соответствующей концентрацией дигитонина, как описано в таблице 3. Положите подготовленный буфер на лёд.
      4. Оставшийся буфер проницаемости клеток храните при 4 °C для использования во второй день.
    2. Активация шариков Concanavalin A (ConA)
      1. Аккуратно подвесьте подвеску ConA, чтобы обеспечить равномерное распределение.
      2. Перенесите 55 мкл суспензии шариков (11 мкл на образец) в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
      3. Поместите трубку на магнитную стойку объёмом 1,5 мл, пока шарики полностью не отделятся, затем пипетка для удаления супернатанта.
      4. Немедленно промой шарики дважды с помощью 500 мкл ледяного буфера активации шариков (100 мкл на образец). Подвесьте шарики с помощью аккуратной пипетки при каждой стирке и используйте магнитную стойку для удаления супернатанта между стирками.
      5. После окончательной промывки удалите супернатант и аккуратно подвесите активированные шарики в 55 мкл (11 мкл на образец) ледяного буфера активации шариков.
      6. Aliquot 10 мкл шариков подвесят в каждую трубку комплекта из 8 полос и держат трубки на льду.
    3. Собирайте клетки и связывайте их с активированными шариками
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клетки важна для соотношения сигнал/фон. Однако жизнеспособность клеточных линий SCLC NE может варьироваться (70%–90%) из-за высокой скорости обновления клеток и предпочтения выращивания в виде средне-крупных агрегатов в суспензии.
      1. Извлеките клетки из инкубатора при температуре 37 °C и изучите их под микроскопом для подтверждения качества.
      2. Перенесите суспензию ячейки в коническую трубку объёмом 50 мл и центрифугу при 1 000-1 200 × г в течение 5 минут при RT.
      3. Аспирируйте среду из конической трубки и промывайте клеточную гранулу 20 мл 1× PBS.
      4. Снова центрифуга, аспирация PBS и переварить гранулу с помощью аккутазы в течение 3-5 минут при 37°C, в зависимости от размера гранулы.
      5. Прекратите пищеварение, добавив 5 мл PBS + 10% FBS. Получите суспензию с одной ячейкой, аккуратно пипетируя вверх и вниз серологической пипеткой.
      6. Центрифугуйте клетки при 1 000-1 200 × г в течение 5 минут, сбросьте супернатант и снова суспензируйте клеточную гранулу в 5 мл PBS.
      7. Подсчитайте стартовые клетки, подтвердите жизнеспособность и целостность клетки.
      8. Вычислите общее количество необходимых клеток, умножив количество реакций на количество клеток за одну реакцию (5×105). Добавьте 20% избыток для учёта ошибок пипетирования (например, 1,2 × 6 × 5 × 105 на 6 реакций). Перенесите рассчитанные ячейки на трубки объёмом 1,5 мл. Центрифуга при 600 x g, 3 минуты на RT.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте хотя бы одну дополнительную реакцию в качестве запасного варианта.
      9. Повторная суспензия ячеек в RT Wash Buffer с плотностью 5×10 5 ячеек за реакцию (всего шесть реакций), используя 100 мкл на реакцию, аккуратно, но тщательно пипетируйте для обеспечения равномерной суспензии. Центрифугу при 600 г в течение 3 минут на RT. Pipette для удаления супернатанта.
      10. Повторите этап стирки (шаг 9) ещё раз.
      11. Аликвот 100 мкл промытых клеток в каждую трубку из 8 полосок, содержащего 10 мкл активированных шариков CoA. Аккуратно перемешайте пипеткой и быстро закрутите в мини-центрифуге, чтобы собрать суспензию (бусины не должны оседаться).
      12. Инкубировать шлам из бусиночных клеток в течение 10 минут при RT, чтобы клетки могли связаться с шариками.
      13. Поставьте трубки на магнитную стойку для трубок объемом 0,2 мл, дайте суспензии очиститься, а пипетка — для удаления наверха. Сохраните 10 мкл супернатанта, чтобы убедиться, что клетки связаны с шариками. Отбросьте оставшийся супернатант и быстро переходите к следующему этапу.
      14. Снимите трубки с магнита. Немедленно добавьте 50 мкл ледяного буфера антител в каждую реакцию и аккуратно пипеткойте, чтобы снова подвесить шарики.
      15. Смешайте 10 мкл супернатанта и 10 мкл суспензии клетки/шарика (ревзвешенного в буфере антител) с 10 мкл трипан-синего и загрузите смесь на стекло стола клеток.
      16. Анализируйте с помощью счётчика ячеек. Убедитесь, что супернатант почти не содержит бусинок или клеток, а смесь бусин/клеток содержит проницаемые клетки, окружённые бусинами.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Важно проверить совместимость клеток с клеточными шариками с связыванием шариков.
    4. Проницаемость и связывание антител
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успех CUT&RUN критически зависит от аффинности антитела к своей цели и его специфичности в определённых экспериментальных условиях. Мы рекомендуем следующее: 1. Используйте коммерческие антитела, проверенные для CUT&RUN, когда они доступны. 2. Для мишеней без антител, валидированных CUT&RUN, рассмотрим те, что валидированы на иммунофлуоресценцию (IF), поскольку антитела IF распознают эпитопы в их родном клеточном контексте, аналогично in situ связыванию антител с мишенью внутри пермеабилизированных клеток в CUT&RUN. 3. Протестируйте 3-5 антител параллельно, чтобы определить наиболее эффективное для вашего конкретного применения.
      1. Быстро вращайте панель K-MetStat и пипетку для повторного подвески. Добавьте 2 мкл панели K-MetStat к реакциям, предназначенным для положительных и отрицательных контрольных антител H3K4me3. Пипетты для смешивания и лампы быстрого вращения (опционально).
      2. Добавьте по 0,5 мкг антител H3K4me3, H3K4me1 и IgG, а также 0,6 мкг поликлонального антитела E2F7 из разных источников в каждую реакцию (Таблица 4). Маркируйте 8-полосные трубки.
      3. Аккуратно перемешайте каждую реакционную трубку. Инкубировать ночь при 4 °C на нутаторе с приподнятыми крышками трубок. Не вращайте и не переворачивайте трубки.
  2. День 2
    1. Связывание pAG-MNазы с антителами
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оседание бусины за ночь — это нормально и не влияет на результат. Если после ночной инкубации бусины становятся комками или липкими, подвесьте бусины с помощью аккуратного пипетирования. Для повышения согласованности и пропускной способности рекомендуется многоканальное пипетирование. При использовании трубок с 8 полосок снимайте и заменяйте буферы по одной полоске, чтобы предотвратить высыхание шариков ConA.
      1. Поставьте магнитную подставку на лед.
      2. Вынимите 8-полосные трубки из инкубации при температуре 4 °C и быстро откройте жидкость, чтобы собрать жидкость.
      3. Положите трубки на магнитную стойку, пока суспензия не рассеится. Аккуратно закрутите пипетку и удалите супернатант.
      4. Держите трубки на магнитной подставке. Промывайте трубки дважды с 200 мкл буфера проницаемости холодных клеток. Пипетка для удаления супернатаната.
      5. Снимите трубки с магнитной стойки и немедленно добавьте 50 мкл буфера проницаемости холодных клеток в каждую реакцию. Аккуратно пипетирую для повторного суспензия клеток и бусин.
      6. Добавляйте 2,5 мкл pAG-MNазы в каждую реакцию и хорошо перемешивайте, аккуратно пипетируйте.
      7. Инкубировать реакции в течение 10 минут при RT.
      8. Быстро поверните трубки, поставьте их обратно на магнитную подставку, пока суспензия не рассеится. Пипетка для удаления супернатаната.
      9. Держа трубки на магнитной подставке, промывайте трубки дважды с 200 мкл холодного буфера проницаемости клеток. Пипетка для удаления супернатаната.
      10. Вынимите трубки с магнитной стойки, аккуратно подвесьте в 50 мкл холодного буфера проницаемости ячеек. Поставьте трубки на лёд.
    2. Целенаправленное расщепление и высвобождение хроматина
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите переваривание, зависящее от Ca2+, при 0 °C, чтобы минимизировать нежелательное расщепление доступной ДНК12 MNase. Включать ДНК с шипами, такую как Escherichia coli (E. coli), чтобы она составляла примерно 0,5–5% (идеально ~1%) от общего числа секвенирования13. Спайк-вставная ДНК используется для нормализации глубины секвенирования и особенно важна при сравнении образцов в серии, например, при оценке глобальных изменений модификации гистонов после ингибирования или генетического удаления ферментов, модифицирующих гистоны.
      1. Добавляйте 1 мкл хлорида кальция 100 мм в каждую реакцию в 8-трубочной полосе (начиная с шага 3.2.1.10) во время льда. Аккуратно пипеткойте, чтобы полностью суспензировать бусины и обеспечить эффективное пищеварение.
      2. Инкубировать трубки на нутаторе при 4 °C в течение 2 часа, с приподнятыми крышками концов.
      3. В новой трубке объёмом 1,5 мл приготовьте смесь Stop Buffer. Для каждой реакции комбинируют 33 мкл стоп-буфера с 1 мкл ДНК E. coli spike-in (0,5 нг). Аккуратно разведите вихрь для смешивания.
      4. Добавьте 33 мкл стоп-буфера к каждой реакции в конце двухчасовой инкубации. Смешивайте с помощью аккуратной пипетки.
      5. Инкубировать реакции в термоциклере при 37 °C в течение 10 минут.
      6. Быстро вращайте трубки, чтобы собрать содержимое на дне, затем поместить их на магнитную стойку, пока раствор не станет прозрачным.
      7. Аккуратно перенесите примерно 84 мкл супернатанта, содержащего ДНК, выпущенную CUT&RUN, в свежие пробирки объемом 1,5 мл.
    3. Очистка ДНК с помощью набора для очистки ДНК (см. таблицу материалов)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед первым применением добавьте 6,9 мл изопропанола в буфер связывания ДНК и 20 мл ≥ 95% этанола в буфер для промывания ДНК.
      1. Добавьте 420 мкл буфера связывания ДНК к каждому собранному супернатанту. Ненадолго используйте вихрь для тщательного смешивания.
      2. Поместите колонку для очистки ДНК в его пробирки.
      3. Загрузите каждый образец в соответствующий столбец.
      4. Центрифугу при 16 000 × г в течение 30 секунд на RT. Сбросьте проток и верните колонку в сборную трубу.
      5. Добавьте 200 мкл буфера для промывания ДНК в каждую колонку и центрифугу при 16 000 х г в течение 30 секунд при RT. Отбросьте проток и поставьте колонку в сборную трубку.
      6. Повторите этап стирки один раз.
      7. Снова центрифугуйте при 16 000 г в течение 30 секунд на RT, чтобы полностью удалить остатки буфера мойки.
      8. Перенесите колонки на маркированные трубки объёмом 1,5 мл.
      9. Нанесите 12 мкл буфера элюции непосредственно к мембране в центре колонны.
      10. Инкубировать 5 минут на RT, затем центрифугировать при 16 000 × г в течение 1 минуты на RT, чтобы элюировать ДНК.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная точка остановки. Храните элюированную ДНК при -20 °C для дальнейшей обработки.
    4. CUT&RUN ДНК количественная оценка и анализ распределения размеров фрагментов
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте ДНК с помощью флуорометра с набором dsDNA High Sensitive Assay Kit, который обеспечивает более точные измерения двухцепочечной ДНК, чем методы поглощения.
      1. Используйте по 1 мкл каждого образца для определения концентрации CUT&RUN ДНК с помощью набора для высокочувствительного анализа dsDNA (см. таблицу материалов).
      2. Используйте дополнительный 1 мкл ДНК для оценки наличия и распределения размеров фрагментов. Проведите анализ фрагментов с помощью набора высокой чувствительности ДНК (см. таблицу материалов) согласно указаниям производителя (опционально).
        ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно легко обнаружить высокообильные связывающие белки, такие как посттрансляционные модификации гистонов (PTM). Однако факторы низкой концентрации транскрипции могут быть сложнее обнаружить.
    5. Построение библиотек, анализ фрагментов и секвенирование
      ПРИМЕЧАНИЕ: ≤5 ng общей суммы CUT&RUN ДНК, определённая количественной оценкой dsDNA High Sensitive Assay Kit Kit, была использована для построения библиотек секвенирования следующего поколения CUT&RUN (NGS). Чтобы минимизировать количество адаптерных димеров, уменьшите объём адаптера с Illumina до 1 мкл для переходной связки. Количество циклов ПЦР во время строительства библиотеки можно корректировать в зависимости от количества входных данных, выхода библиотеки и уровня дублирования. Могут использоваться различные стратегии выбора размера для очистки ДНК Магнитные шарики (см. таблицу материалов) в зависимости от PTM или факторов транскрипции мишеневых гистонов.
      1. Строительство библиотеки осуществлялось с использованием комплекта для подготовки библиотеки CUT&RUN (см. таблицу материалов) согласно инструкциям производителя комплекта с небольшими изменениями. Вкратце, 5 ng CUT&RUN ДНК использовались в качестве рекомендуемого входа для подготовки библиотеки. Для ДНК менее 5 нг используйте как можно больше для подготовки библиотеки. Для каждого образца использовались двойные праймеры i5 и i7 индекса для успешного мультиплексированного секвенирования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасная точка остановки. ДНК можно хранить при -20°C для дальнейшей обработки.
      2. Измеряйте концентрацию библиотеки CUT&RUN с помощью флюорометра и набора для анализа высокой чувствительности dsDNA. Распределение размеров библиотек CUT&RUN NGS определялось с помощью набора высокой чувствительности ДНК (см. таблицу материалов) на основе руководства по набору высокочувствительной ДНК или аналогичного капиллярного электрофорезного прибора TapeStation (см. таблицу материалов).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Разведите библиотеку CUT&RUN, чтобы приблизить концентрацию в диапазон обнаружения набора dsDNA High Sensitive Assay Kit и High Sensitivity DNA Kit.
      3. Библиотеки пулов (40-46) основаны на равных молекулярных и уникальных индексах. После выбора размера магнитных шариков для очистки ДНК было проведено парное секвенирование (длина чтения 100 б.п.) для объединённых библиотек на системе Illumina NovaSeq 6000 для половины S-Prime (SP) при глубине чтения примерно 10 миллионов чтений на библиотеку.
    6. Анализ данных CUT&RUN
      1. Анализируйте данные CUT&RUN с помощью пользовательского конвейера (рисунок 5A). Оценивайте качество чтения с помощью FastQC. Удалите последовательности адаптеров с начала чтения с помощью Cutadapt. Выравнивание парных концов считывает по человеческому геному (hg38) и референсному геному E. coli с Bowtie2. Используйте Samtools для удаления неотображаемых чтений. Удаляйте дублирующиеся чтения с помощью Picard и генерируйте файлы bedGraph с помощью Bedtools. Создавайте bigWig (чёрно-белые) файлы с помощью DeepTools. Визуализируйте данные с помощью IGV и DeepTools. Нормализуйте общее количество чтений к скачкам E . coli . Выполните пиковый вызов с помощью SEACR (Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN)19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Типичные или «классические» линии клеток SCLC NE характеризуются крупными ядрами, скудной цитоплазмой и ростом в виде неадгерантных агрегатов или компактных сфероидов в суспензии. Клеточные линии с высоким содержанием ASCL1, такие как NCI-H146 и DMS79, а также линии с высоким уровнем NEUROD1, такие как NCI-H82 и H446, демонстрируют классический фенотип SCLC: клетки малого и среднего размера с скудным цитоплазмой, мелкогранулированным хроматином и склонностью к росту преимущественно в вид...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпигенетическая дисрегуляция и LDTF являются ключевыми факторами биологии опухолейSCLC 6. Определение геномного распределения специфических модификаций гистонов и белков, связывающих ДНК в SCLC, может выявить потенциальные механизмы приобретённой терапевтической устойчивости и фенотипической пластичности. CUT&RUN-seq — это мощный метод картирования взаимодействий гистонов и негистонов между белками и ДНК с высокимразрешением 14 из клеток и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано NCI K08CA241309 (PI: Хуэй-Цзы Чен), премией ACS IRG (PI: Хуэй-Цзы Чен) и премией Американской ассоциации лёгких за открытие рака лёгких (PI: Хуэй-Цзы Чен). Секвенирование проводилось в Центре геномных наук и прецизионной медицины имени Линды Т. и Джона А. Меллоуз. Мы также благодарим всех членов лаборатории за их взгляды и поддержку этой работы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильный>реагент
RPMI-1640 media Gibco ThermoFisher Scientific11875093Среда для культивирования клеток
Сыворотка для плода быка (FBS)НейромикаFBS002-HIКомпонент среды клеточного культивирования
1% пенициллин-стрептомицин и nbsp;Gibco ThermoFisher Scientific15140122Антибиотики, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение клеточных культур
Раствор Trypan Blue, 0,4%Gibco ThermoFisher Scientific15250061Для оценки проницаемости с помощью автоматического счётчика клеток использовалось Trypan Blue Staining.
Roche cOmplete, коктейль с ингибиторами Proease без ЭДТАРош11873580001Ингибитор протеазы. Составы буфера промывки
5% Digitonin EpiCypher21-1004Компоненты буфера  а рецепт буфера можно найти в буферном листе
Буфер активации шариковEpiCypher21-1001Компоненты буфера  а рецепт буфера можно найти в буферном листе
Бусины Concanavalin A (ConA)EpiCypher21-1401Парамагнитные микросферы, сопряжённые с ConA, — это магнитные шарики, покрытые лектином, которые позволяют связываться с липидной мембраной
CUT& RUN Kit CUTANA ChIC ЭпиШифр14-1048Реагенты для CUT& RUN генерация ДНК
Набор для очистки ДНКCUTANA  EpiCypher14-0050Извлекать ДНК из высвобождённых целевых фрагментов ДНК в супернанте реактивной реакции
CUT& Комплект подготовки библиотеки RUNCUTANA EpiCypher14-001Сгенерировать CUT& RUN библиотеки секвенирования следующего поколения (NGS)
  Магнитные бусины для очистки ДНКAgencourt AMPure XP Бекман КоултерA63880Очистка и выбор размера ПЦР-продуктов (например, адаптерный димер и удаление праймера)
Спайк-иннинг ДНК E. coliEpiCypher18-1401Используется как экзогенный спайк-ин для калибровки последовательных считываний по серии сэмплов и mdash; например, леченные и нелеченные заболевания
pAG-MNaseEpiCypher  15-1016После связывания с первичным антителом фермент расщепляет целевой фрагмент ДНК с обеих сторон связанного белка при активации кальцием
PBS PH7.4 1xGibco (Thermo Fisher Scientific)10010-049Промывочные ячейки
Буфер до промывкиEpiCypher21-1002Компоненты буфера  а рецепт буфера можно найти в буферном листе
Высокая чувствительность к dsDNA  Набор для анализовQubitTM Thermo Fisher ScientificQ32854CUT& Квантификация ДНК RUN
Стоп-буферEpiCypher21-1003Компоненты буфера  а рецепт буфера можно найти в буферном листе
Набор ДНК с высокой чувствительностью;Agilent Technoligies5067-4626CUT& RUN ДНК и анализ распределения размеров фрагментов и кветификация ДНК и NGS библиотек
<Сильный>Материал
8-полосные ПЦР-трубки объёмом 0,2 млEpiCypher10-0009kТрубки для CUT& RUN-реакции, совместимые с магнитной сепарационной стойкой ламп объёмом 0,2 мл
8-канальные слайды LUNALogos BioSystems INCL72001Слайды для подсчёта клеток и bbsp; Проверка жизнеспособности и целостности ячейки
Многоканальный реагентный резервуарFisher Scientific14-387-072Буферный контейнер для мытья
DynaMagTM-2 (магнитная сепарационная стойка), лампы объёмом 1,5 млТермо Фишер Сайентифик12321DШарики ConA изолировались из буфера хранения магнитной сепарационной стойкой и затем активировались ресуспензией в буфере активации в микроцентрифужной трубке объёмом 1,5 мл.
Магнитная сепаративная стойка, трубки объёмом 0,2 млEpiCypher10-0008Встать для разделения  Клетки, связывающие бусеры, антитела, pAG/MNase от реакции и буферы промывания
Eppendor Research плюс 8-канальная пипета, 0,5-10 uL Эппендорф3125000010Образцы пробирок с 8 полосами аспирации  Для ускорения рабочего процесса, аналогичный многоканальный пипеттор
Eppendorf Refrence 2 8-канальная пипета, 30-300 мклЭппендорф4926000050Этапы аспирации и промывки для ускорения рабочего процесса, сопоставимая многоканальная пипетка
<Сильно>Снаряжение
Миксер Scientific Industries Vortex-Genie 2, переменная скорость, 120 ВFisher Scientific50-728-002Минцентрифуга и спин
LUNA FX7 Автоматический счётчик ячеекLogos BioSystems INCL70001Счётчик ячеек
Нутатинговый миксерVWR82007-202Этапы инкубации шариков (ночная инкубация антител, реакция переваривания pAG-MNase).
Eppendorf 6331 Nexus Gradient MasterCycler Thermal CyclerЭппендорф6331CUT& Построение библиотек следующего поколения RUN
Флуорометр Кубит-4Термо Фишер СайентификQ33226Количественная оценка ДНК.
Биоанализатор Agilent 2100Agilent TechnologiesG2939AРазмер фрагмента, анализ концентрации для CUT& RUN DNA и CUT& RUN библиотеки,  сопоставимый капиллярный электрофорезный прибор (например, Agilent TapeStation)
Agilent TapeStationAgilent TechnologiesG2992AAРазмер фрагмента, анализ концентрации для CUT& RUN DNA и CUT& Библиотеки RUN
Система Illumina NovaSeq 6000  Illumina, Сан-Диего, Калифорния, СШАПоследовательность объединённого CUT& ЗАПУСТИТЬ библиотеки 

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kimura, H. Histone modifications for human epigenome analysis. J Hum Genet. 58 (7), 439-445 (2013).
  2. Millan-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications-cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  3. Seligson, D. B., et al. Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence. Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).
  4. Wang, Y., et al. STAT3 facilitates super enhancer formation to promote fibroblast-to-myofibroblast differentiation by the analysis of ATAC-seq, RNA-seq and ChIP-seq. J Cell Mol Med. 29 (11), e70639(2025).
  5. Zhao, Z., Shilatifard, A. Epigenetic modifications of histones in cancer. Genome Biol. 20 (1), 245(2019).
  6. Takumida, H., et al. Integrative epigenome and transcriptome analyses reveal transcriptional programs differentially regulated by ASCL1 and NEUROD1 in small cell lung cancer. Oncogene. 44 (34), 3113-3125 (2025).
  7. Sivakumar, S., et al. Integrative analysis of a large real-world cohort of small cell lung cancer identifies distinct genetic subtypes and insights into histologic transformation. Cancer Discov. 13 (7), 1572-1591 (2023).
  8. Rudin, C. M., et al. Author correction: Molecular subtypes of small cell lung cancer: A synthesis of human and mouse model data. Nat Rev Cancer. 19 (7), 415(2019).
  9. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  10. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).
  11. Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. Elife. 6, e21856(2017).
  12. Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat Protoc. 13 (5), 1006-1019 (2018).
  13. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. Elife. 8, e46314(2019).
  14. Custers, S., et al. Cleavage under targets & release using nuclease (CUT&RUN) protocols for the study of genetic and epigenetic regulation in cancer. Methods Mol Biol. 2944, 207-225 (2025).
  15. Hainer, S. J., Boskovic, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329.e11 (2019).
  16. Marroquin-Rivera, A., et al. Immune-related transcriptomic and epigenetic reconfiguration in BV2 cells after lipopolysaccharide exposure: An in vitro omics integrative study. Inflamm Res. 73 (2), 211-225 (2024).
  17. Huang, H., et al. Deciphering the role of histone modifications in memory and exhausted CD8 T cells. Sci Rep. 15 (1), 17359(2025).
  18. De Sarkar, N., et al. Nucleosome patterns in circulating tumor DNA reveal transcriptional regulation of advanced prostate cancer phenotypes. Cancer Discov. 13 (3), 632-653 (2023).
  19. Roberti, A., Fraga, M. F. Epigenomic profiling of histone posttranslational modifications in frozen cancer tissue using CUT&RUN. Methods Mol Biol. 2930, 229-243 (2025).
  20. Black, J. B., et al. Master regulators and cofactors of human neuronal cell fate specification identified by CRISPR gene activation screens. Cell Rep. 33 (9), 108460(2020).
  21. Augert, A., et al. Small cell lung cancer exhibits frequent inactivating mutations in the histone methyltransferase KMT2D/MLL2: CALGB 151111 (Alliance). J Thorac Oncol. 12 (4), 704-713 (2017).
  22. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).
  23. Yang, Y., et al. H3K9me3 involved in FOXL2 regulation of SerpinE2 expression to affect steroid hormone synthesis in follicular granulosa cells. FASEB J. 39 (12), e70730(2025).
  24. Panday, A., Elango, R., Willis, N. A., Scully, R. A modified CUT&RUN-seq technique for qPCR analysis of chromatin-protein interactions. STAR Protoc. 3 (3), 101529(2022).
  25. Lardo, S. M., Hainer, S. J. Single-cell factor localization on chromatin using ultra-low input cleavage under targets and release using nuclease. J Vis Exp. (180), e63536(2022).
  26. Hsieh, T. S., et al. Resolving the 3D landscape of transcription-linked mammalian chromatin folding. Mol Cell. 78 (3), 539-553.e8 (2020).
  27. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nat Methods. 13 (11), 919-922 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CUT And RUNH3K4me3H3K4me1E2F7

Похожие статьи