Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Регуляция пути AKT/Wnt/β-катенина и индукция купроптоза куркумином при глиобластоме

655 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69663

⸱

27 января 2026 г.

 , 
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Yangtze University

В этой статье

Краткое содержание

Куркумин (CUM) подавляет прогрессирование глиобластомы (GBM), вызывая купроптоз через подавление оси AKT/Wnt/β-катенина. Этот протокол исследует молекулярный механизм, с помощью которого CUM препятствует прогрессированию злокачественного развития в GBM, и описывает методы оценки того, как CUM индуцирует купроптоз путём модуляции этого пути.

Аннотация

Куркумин (CUM) может регулировать злокачественное поведение глиобластомы (GBM). В этом исследовании изучается, подавляет ли CUM прогрессирование GBM, вызывая купроптоз через сигнальный путь AKT/Wnt/β-катенина. Оптимальные концентрации куркумина определялись с помощью МТТ-анализа. Клетки A172 и U251 были обработаны CUM, ингибитором AKT MK-2206, ингибитором Wnt LGK974 и Elsm-Cu (Elesclomol +CuCl 2). Пролиферация, миграция, инвазия и апоптоз клеток оценивались с помощью окрашивания карбоксифлуоресцеиновым сукцинимидиламидиламиным эфиром, царапин-анализов, анализов Трансвелла и проточной цитометрии соответственно. Для оценки митохондриального окислительного стресса и купроптоза использовались флуоресценция MitoSOX, метаболический анализ морских коньков, иммунофлуоресценция, обнаружениеCu 2+ и вестерн-блотинг. Ось AKT/Wnt/β-катенин была проанализирована с помощью репортерского комплекта TCF/LEF1 и вестерн-блотинга. Была создана модель ксенотрансплантата GBM, и CUM вводилась по гаважу в течение пяти недель. Были оценены эффекты CUM на рост опухоли, купроптоз и экспрессию белка в путях AKT/Wnt/β-катенина. Клетки обрабатывались 10 мкм и 20 мкм CUM in vitro. Лечение CUM снижало пролиферацию, миграцию и инвазию, одновременно способствуя окислительному стрессу и купроптозу. CUM также подавлял сигнальную активность Wnt/β-катенина. Ингибирование путей увеличивало уровень реактивных видов кислорода (в 3,7 раза) и Cu2+ (3,1 раза), а также снижало экспрессию дигидролипоамид ацетилтрансферазы, тем самым сдерживая злокачественное поведение. У обнажённых мышей CUM значительно замедлял рост опухоли, способствовал купроптозу и ингибировал активацию оси AKT/Wnt/β-катенина. Наши результаты показывают, что CUM подавляет сигналы AKT/Wnt/β-катенина, способствует купроптозу и мешает прогрессированию GBM.

Введение

Глиома — самая распространённая первичная внутричерепная злокачественная опухоль в центральной нервной системе (ЦНС)1. Глиома 4-й степени обычно относится к глиобластому (GBM) с плохимпрогнозом 2. ГБМ — это высокоинвазивная опухоль мозга, составляющая почти 50% злокачественных заболеваний ЦНС, с медианной выживаемости менее 1года 3. Он известен своей высокой злокачественностью и высоким уровнем рецидивов 4,5. В настоящее время стратегии лечения GBM в основном основаны на хирургическом вмешательстве, дополненном лучевой терапией, химиотерапией и другими комплексными методамилечения 6. Хотя новые терапевтические стратегии, такие как иммунотерапия, биотерапия и наномедицина, достигли впечатляющих результатов в доклиническихисследованиях 7,8, общий уровень выживаемости за 5 лет остаётся всего 4,3%9. Наиболее распространённой схемой химиотерапии является известная схема Ступпа; однако для пациентов с ГБМ с неметилированным MGMT общий уровень выживаемости не является значительнопродленным 10. Поэтому изучение новых стратегий лечения имеет ключевое значение для продления периода выживания пациентов. В этом исследовании выдвигается гипотеза, что противораковый механизм куркумина (CUM) на GBM связан с купроптозом.

Аномальный метаболизм меди или повреждение клеток медью могут привести к серии заболеваний11. В традиционных окислительно-восстановительных условиях восстановленный Cu+ можно окислить до Cu2+. Цветков и др. обнаружили ранее не обнаруженный механизм медной гибели клеток, называемый купроптозом. Ионы Cu2+ связываются с ацилированными соединениями, после чего экспрессия белков кластера Fe-S снижается, вызывая гибельклеток 12,13. Обширные исследования подтвердили, что купроптоз тесно связан с патофизиологическим процессомопухолей 14,15. Связанные с купроптозом лнкРНК и гены представляют собой потенциальные биомаркеры прогноза и леченияGBM 16. BCMD может выделять Cu2+, вызывать купроптоз и запускать иммуногенную клеточную гибель для леченияGBM 17. Поэтому мы считаем, что купроптоз может использоваться как новая мишень для терапии GBM. Однако большинство существующих схем опираются на синтетические носители, такие как Elesclomol-Cu, или прямую индукцию ионов меди с высокой концентрацией. Хотя это экзогенное радикальное вмешательство может подтвердить концепцию купроптоза, его перспективы клинической трансформации ограничены из-за отсутствия физиологической корреляции и таргетирования. Поэтому поиск естественных или маломолекулярных соединений, способных эндогенно и точно регулировать купроптоз GBM и прояснить его механизм передачи сигнализации, стал ключевым мостом между этим новым механизмом и клиническим лечением.

Китайская медицина широко считается ценным ресурсом для исследований противоопухолевых препаратов. CUM — это полифенольное вещество, извлекаемое из куркумы традиционной китайской медицины. Современная фармакология подтвердила, что он обладает антиоксидантной, противовоспалительной и противоопухолевой функциями. CUM обладает множеством противоопухолевых эффектов. Он может снижать активность клеток GBM, способствуя апоптозу, нарушению мультимолекулярных путей и другиммеханизмам 18. Эксперименты in vitro показали, что низкие дозы CUM в сочетании с облучением могут синергетически усиливать пролиферациюантиGBM 19. Кроме того, CUM может регулировать основные пути, связанные с GBM, включаяMAPK 20. По сравнению с традиционной химиотерапией темозоломидом (TMZ), CUM обладает уникальными терапевтическими преимуществами. Эффективность темозоломида часто ограничена мощными механизмами восстановления ДНК в GBM, что приводит к лекарственной устойчивости; механизм, с помощью которого CUM индуцирует купроптоз, нацеливаясь на митохондриальныйметаболизм 21,22, не зависит от TMZ. CUM не только регулирует метаболические процессы, связанные с купроптозом, но и одновременно мешает нескольким ключевым сигнальным путям, связанным с прогрессированием GBM, предоставляя потенциальные пути для преодоления ограничений отдельных терапий и разработки комбинированных стратегий лечения. Диапазон концентраций CUM, используемый в этом исследовании (10-20 мкм), соответствует эффективным концентрациям, описанным в доклинических исследованиях23. Хотя врожденная низкая биодоступность CUM и его эффективность доставки через гематоэнцефалический барьер являются ключевыми проблемами в практических приложениях, новые системы нанодоставки и стратегии целенаправленной модификации предоставили перспективные решения для преодоления этого узкогоместа 24.

Хотя проапоптотические, антипролиферативные и ингибирующие миграционные эффекты CUM при GBM были описаны вомногих исследованиях 25,26, большинство существующих исследований сосредоточены на его влиянии на традиционные пути апоптоза или аутофагии. Цель данного исследования — прояснить, подавляет ли CUM злокачественное прогрессирование GBM, регулируя купроптоз. Мы исследовали, может ли CUM частично вызывать купроптоз путём подавления оси AKT/Wnt/β-катенина, тем самым подавляя GBM. Исходя из этого, данное исследование предоставляет экспериментальные основы для улучшения лечения ГБМ и для разработки новых мишеней в терапии ГБМ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных проводились в соответствии с установленными институциональными стандартами гуманного ухода и использования лабораторных животных и были официально одобрены Комитетом по этике в отношении животных учреждения. Принимались меры по снижению дискомфорта и стресса у животных, когда это было возможно.

Работы с химическими соединениями, красителями и биологическими образцами следовали установленным практикам биобезопасности для снижения потенциальных рисков. Потенциально опасные вещества — включая параформальдегид, медные реагенты и DHE — обрабатывались с помощью соответствующих средств индивидуальной защиты, включая перчатки, маски и защитные очки. Все отходы, такие как отработанные реагенты и загрязнённые одноразовые предметы, были выделены в специализированные контейнеры для биологической опасности и впоследствии обработаны авторизованными службами по управлению опасными отходами в соответствии с институциональными и экологическими нормами безопасности. Общий экспериментальный дизайн изложен на рисунке 1.

Рисунок 1
Рисунок 1: Рабочий процесс этого исследования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Культивирование и группировка клеток
Нормальные человеческие астроциты мозга (NHA) и линии клеток глиобластомы A172, U251, LN229 и SHG-44 (см. Таблицу материалов) культивировались в среды DMEM, содержащей 10% сыворотки плода крупного рогатого скота (FBS), и содержались в инкубаторе при 3 °C с 5% CO₂. Среда менялась через день, а клетки проходили, когда они достигали примерно 80% слияния. Подходящая доза и время воздействия CUM были определены с помощью MTT-анализа. Клетки NHA, A172, U251, LN229 и SHG-44 обрабатывались разными концентрациями CUM (0, 2,5, 5, 10, 20 и 4 мкм) в течение 24, 48 и 7 часов соответственно, 23 часа. Затем был добавлен 2 мкл раствора MTT. После часа в каждую скважину добавляли 15 мкл диметилсульфоксида и аккуратно перемешивали. Оптическая плотность (OD) при 45 нм измерялась с помощью считывателя микропластин. Необработанные клетки (контрольная группа) использовались в качестве отрицательных контролей во всех экспериментах.

Клетки A172 и U251 были засеяны и разделены на группы: контрольные, низкодозовые CUM (1 мкм), высокодозированные CUM (2 мкм), ингибитор AKT (MK-2206), ингибитор AKT + ингибитор Wnt (MK-2206 + LGK974) и Elsm-Cu (Elesclomol + CuCl₂), в зависимости от условий лечения. Клетки в группах CUM обрабатывали 10 или 2 мкм CUM в течение 4 часов. Клетки группы MK-2206 получили 1 мкм MK-2206 в течение 2 часа. Клетки группы MK-2206 + LGK974 были обработаны μM LGK974 на час после воздействия MK-2206. Клетки группы Elsm-Cu обрабатывались 100 нМ Элескломолом и μM CuCl₂ в течение 4ч. 14.

Проточная цитометрия
Культивированные клетки A172 и U251 в каждой группе инкубировали с PBS, содержащим раствор окрашивания PI с концентрацией 1 мкг/мл в течение 1 минуты. Клетки затем обработали трипсином 0,25% и собирали методом центрифугирования (20 × г, минимум, комнатной температуры). PI-положительные клетки были обнаружены с помощью потокового цитометра с ПЭ-каналом (возбуждение на 488 нм), а уровень гибели клетокрассчитан 27.

Анализ карбоксифлуоресцеина сукцинимидиламидил аминоэфира (CFSE)
Клетки A172 и U251 инкубировали с красителем CellTrace CFSE при 3 °C в течение 1 минуты в темноте. Затем среда была нейтрализована, а ячейки центрифугированы при 20 × г минимум при комнатной температуре. После сбора клетки культивировались и обработаны в соответствии с их группировками. Интенсивность флуоресценции CFSE была проанализирована с помощью проточной цитометрии (возбуждение на 488 нм)27.

Анализ образования клеточных клонов
Культивированные клетки A172 и U251 были переварены, вновь суспендированы и подсчитаны. Было добавлено два миллилитра подготовленной ячейки. После аккуратного смешивания клетки инкубировали примерно 14 дней. Затем клетки фиксировались 4% параформальдегидом в течение 3 минут, после чего фиксатив отбрасывали. После окрашивания 0,1% кристаллического фиолетового цвета. Были сделаны снимки колонии, и скорость формирования клонов быларассчитана как 14.

Тест на царапину клеток
Клетки A172 и U251 (1 × 106 клеток/скважины) культивировались до достижения 90% слияния. Клеточный монослой был один раз поцарапан стерильным наконечником объёмом 2 мкл для образования раны, а затем обработан разными концентрациями CUM в течение h и 48 час. Изображения были сделаны с помощью микроскопа. Скорость заживления царапины оценивалась с помощью программного обеспечения ImageJ. Изображения конвертировались в 8-битный формат, был установлен единый порог для различия скретч-области от ячейки, а царапинные области на 0 и 48 ч вычислялись с помощью функции Analyze Particles (Анализ частиц ). Скорость заживления от царапины (%) = (дистанция 0 ч − 48 ч) / дистанция 0 ч × 100%23.

Эксперимент Трансвелла
Клетки A172 и U251 подвергались воздействию указанных обработок, затем ферментативно отсоединялись и центрифугировали при 200 × г в течение 5 минут при комнатной температуре. Клетки были вновь суспендированы в безсывороточной среде. Matrigel разбавляли в соотношении 1:8 в безсывороточной среде, тщательно смешивали, и 5 мкл наносили в верхнюю камеру вставки Трансвелла, после чего следовала инкубация через 4 часа. В верхней камере было добавлено всего 5 × 104 элементов на каждую скважину, а 60 мкл среды с добавлением 20% FBS — в нижнюю камеру. После 48 часов инкубации клетки фиксировались с помощью параформальдегида и окрашены кристаллическим фиолетовым цветом. Пять зрительных полей были выбраны из центра и периферии каждой скважины. Клетки наблюдались и снимались под микроскопом. Инвазивные клетки были рассчитаны с помощью ImageJ. Изображения конвертировались в 8-битный формат, устанавливались пороги для различия окрашенных клеток от фона, а функция анализа частиц подсчитывала клетки, мигрировавшиечерез мембрану 23.

Обнаружение митохондриального мембранного потенциала (MMP)
Культивированные клетки A172 и U251 в каждой группе инкубировались с мл рабочего раствора JC-1 в течение 30 минут в темноте. Клетки аккуратно промывались предварительно охлаждённым буфером JC-1, наблюдались и фотографировались с помощью флуоресцентного микроскопа. С помощью возбуждения 488 нм полимерные и мономерные сигналы JC-1 собирались с использованием эмиссионных фильтров 590 нм и 530 нм соответственно. Соотношение красной и зелёной флуоресценции (агрегаты JC-1 к мономерам) было проанализировано с помощью программного обеспечения ImageJ для оценки измененийMMP 28. Изображения красного и зелёного каналов были извлечены отдельно, а средняя интенсивность флуоресценции в том же регионе была количественно оценена.

Обнаружение скорости потребления кислорода (OCR)
Были засеяны культивированные клетки A172 и U251. Пластина помещалась в предварительно нагретый анализатор при 3 °C для адаптации. После адаптации была добавлена среда решимости. После автоматической калибровки пластина уравновешивалась на 15-2 минуты при 3 °C без содержанияCO2. Был измерен исходный OCR, и программа анализа была настроена на фиксацию митохондриального OCR с определёнными интервалами. Данные были экспортированы для последующегоанализа 28.

Флуоресцентное обнаружение реактивных форм кислорода (ROS) с помощью флуоресцентного зонда MitoSOX
Клетки A172 и U251 были скорректированы до плотности 1 × 104 клеток/мл, и 1 мл на каждую скважину был посеян в конфокальной антенне, после чего проводилась лекарственная интервенция. Супернатант клетки был отброшен, и добавлен 1 мл разбавлённого зонда MitoSOX (1:1 000). Клетки инкубировали в темноте при 3 °C в течение 1 минуты. Флуоресцентный сигнал фиксировался с помощью флуоресцентного микроскопа (возбуждение/излучение: 510/580 нм) для оценки уровня митохондриальной ROS29.

Иммунофлуоресценция
Накладки были однажды промыты с помощью DMEM-культурного материала. Затем их помещали в пластины с шестью лунками для клеточного посева и применения лекарств. Через 24 часа клетки фиксировались в 4% параформальдегиде и затем блокировались 5% бычьей сывороткой альбумина (BSA) на 30 минут. Блокирующий раствор был удалён, а также применили разбавленные первичные антитела, направленные на дигидролипоамид ацетилтрансферазу (DLAT) и β-катенин, после чего началась ночная инкубация при°C 30. Затем были введены флуоресцентно маркированные вторичные антитела, которые инкубировали при 3 °C в течение 30 минут. Ядра клеток окрашивались с помощью DAPI, а стекли монтировались с использованием реагента против фейда. Флуоресцентные изображения были получены с помощью флуоресцентного микроскопа, а интенсивность сигнала измерялась с помощью программного обеспечения ImageJ. Изображения преобразовывались в 8-битный формат, и устанавливался постоянный порог для различия целевых сигналов от фоновых шумов. Инструмент «Прямоугольник » использовался для выбора нужных областей клеток, средняя интенсивность флуоресценцииизмерялась на уровне 27. Для визуализации митохондрий клетки обработали 20 нМ MitoTracker Red CMXRos в течение 30 минут, а затем фиксировалипараформальдегидом 30.

Комплект репортера TCF/LEF1 для люциферазы
Активация Wnt/β-катенина в клетках A172 и U251 была оценена с помощью репортерного комплекта люциферазы TCF/LEF1. Репортерный вектор TCF/LEF содержит блок TATA и элементы ответа фактора Т/фактора лимфоидного энхансера (TCF/LEF), что позволяет косвенно обнаруживать транскрипционную активность β-катенина через экспрессию зелёного флуоресцентного белка (GFP). Культивированные клетки A172 и U251 были обратно трансфектированы с помощью 5 нг TCF/LEF репортерного вектора. Через шестнадцать часов после трансфекции интенсивность флуоресценции фиксировалась с помощью считывателя микропластин с настройками возбуждения и излучения 488 и 51 нм соответственно31.

Мыши с опухолями
Десять самцов мышей BALB/c (7 недель, 2 ± 2 г) содержались в специфических условиях без патогенов (2 °C, влажность 65%) с неограниченным доступом к стандартной еде и воде. Все процедуры были утверждены Комитетом по этическому рассмотрению Первой аффилированной больницы Университета Янцзы (No 2023092; дата утверждения: 18.10.2023).

Для создания модели ксенотрансплантата GBM клетки A172 (4 ×10 6 клеток/мл) были взвешены в безсывороточной среде, а 0,1 мл вводилось подкожно в правый бок каждой мыши. Животных случайным образом распределяли либо в контрольную группу, либо в группу лечения CUM (n = 5 на группу). Группа CUM получала 60 мг/кг куркумина ежедневно перорально, а контрольная группа — равный объём физиологического раствора. Диаметры опухоли регистрировались каждые 7 дней с помощью верньерного суппорта, а объём опухоли рассчитывался по формуле 1/2 × длина ×ширина 2 (мм3). Через 5 недель мышей эвтаназии вывихом шейки матки, а опухоли собирались в стерильных условиях для измерениявеса 32.

Анализ TUNEL
Ткани опухоли фиксировались в 4% параформальдегиде в течение 24 часа, обезвоживались этанолом, встраивались в парафин и секцировались толщиной мкм. Срезы были очищены от воска и повторно увлажнены, промыты PBS, обработаны протеиназой K в течение 50 минут для получения антигена и инкубированы с 3% перекисью водорода. В течение 1 часа применялась реактивная смесь TUNEL, после чего применялась реагент против фейда. Флуоресцентные изображения были получены микроскопией, а TUNEL-положительные клетки на поле количественно оценивались с помощью программного обеспечения ImageJ.

Иммуногистохимия
Срезы опухоли с вложением парафина запекались при 6 °C, обезвоскивались в ксилоле и регидратировали с помощью серии градуированного этанола. Забор антигена проводился с использованием нагретого буфера ЭДТА, после чего следовало затухание активности эндогенной пероксидазы. Слайды инкубировали с первичным антителом против Ki-67 в течение ночи при °C. После инкубации вторичным антителом в течение 20 минут срезы окрашивались диаминобензидином (DAB) в течение 5 минут и контрокрашивались гематоксилином. После обезвоживания и установки с нейтральной смолой стекли были снимены под микроскопом. Положительное окрашивание было выявлено по коричневато-жёлтому осадку, а клетки с положительным содержанием Ki-67 количественно измерены с помощью ImageJ27.

Флуоресцентное окрашивание дигидроэтидия (DHE)
Уровни ROS оценивались с помощью окрашивания DHE-флуоресценцией. Замороженные срезы опухолевой ткани были промыты с помощью PBS. Фоновая флуоресценция была затушена, и в каждую секцию добавлялся μM DHE на 3 минуты. После стирки PBS секции запечатывались в темноте. Флуоресценция наблюдалась с помощью микроскопа (возбуждение/излучение: 518/605 нм), и в каждой группе было собрано по пять случайных изображений. ImageJ использовался для количественной оценки уровней ROS.

Обнаружение содержимого Cu2+
Концентрация Cu2+ в клетках GBM и тканях опухолей была измерена с помощью колориметрического набора для обнаружения. Клетки A172 и U251 после обработки были собраны и центрифугированы при 1500 × г в течение 10 минут при °C. Клеточные гранулы были вновь взвешены в 0. мл дистиллированной воды, соникированной на льду и снова центрифугированной. Ткани опухоли были гомогенизированы в дистиллированной воде и аналогично центрифугированы при 4 °C в течение 10 минут. Супернатанты (1 мкл) переносились в пластину с 96 лунками, смешивались с 23 мкл хромогенного реагента, герметизировали и инкубировали в течение 5 минут. Оптическая плотность (OD) измерялась на 58 нм с помощью считывателя микропластин, а уровни Cu2+ —14.

Western Blot (WB)
Белки были выделены из культивированных клеток и тканей опухоли. Супернатанты были получены методом центрифугирования при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C, а концентрации белков измерялись с помощью анализа BCA. После денатурации образцы разделялись с помощью SDS-PAGE, переносились на мембраны PVDF и блокировались 5% обезжиренным молоком в течение 1 часа. Мембраны промывались в TBST и инкубировали ночью при °C с первичными антителами против FDX1, LIAS, DLAT, DLD, AKT, p-AKT, Wnt3a, GSK-3β, p-GSK-3β, β-катенина, p-β-катенина и β-актина (см. таблицу материалов)14,33. После дополнительных промывок TBST мембраны инкубировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с HRP, в течение 1 часа, разработанных с использованием реагента ECL и визуализации с помощью хемилюминесценции. Программное обеспечение ImageJ использовалось для количественной оценки интенсивности сигнала с помощью инструмента выбора прямоугольников и функции анализа Gels. Относительная экспрессия белка рассчитывалась как отношение значения целевой полосы серого к внутреннему контролю (GAPDH). Ядерные экстракты из клеток A172 и U251 были подготовлены с помощью набора для экстракции ядерного белка. Экспрессия β-катенина и ламина B1 была оценена, при этом ламин B1 служил контроллером ядернойнагрузки 34.

Статистический анализ
Количественные результаты отражают среднее значение трёх независимых репликатов. Все данные оценивались с учётом нормального распределения и однородности дисперсии. Для сравнения между несколькими группами использовался односторонний ANOVA, а затем пост-хок тест Тьюки. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). P-значение менее 0,05 считалось статистически значимым. Эти процедуры использовались для обеспечения надёжности данных и поддержки надёжности выводов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ингибирование жизнеспособности клеток GBM и индуцированная гибель клеток
Во-первых, после 2, 48 и 72 часов вмешательства CUM не было заметно значительных изменений в жизнеспособности клеток NHA (рисунок 2A), что указывает на отсутствие токсичного влияния на нормальные клетки. В отличие от этого, жизнеспособность клеточных линий GBM (A172, U251, LN229 и SHG-44) была значительно снижена при концентрациях CUM ≥ 1 мкм (P < 0,05-0,001) (рисунок 2B-E

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Частота рецидивов GBM связана с его злокачественными биологическимихарактеристиками 36. CUM оказывает анти-GBM эффект, регулируя окислительный стресс, апоптоз, аутофагию, метастазы, инвазию и ключевые молекулярныецели 37. В этом исследовании клеточные эксперименты показали, что CUM значительно увеличивает смертность клеток GBM и подавляет пролиферацию, формирование колоний, миграцию и инвазию — результаты, соответствующие предыдущим

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,1% раствор для окрашивания кристаллической фиолетовойServicebioG1014Маркировка ячеек
4% параформальдегидBeyotimeP0099Фиксировать клетки или ткани
Ингибитор AKT (MK-2206)Selleck.cn, Шанхай, КитайS1078Специфический ингибитор AKT
Антитела (первичные и вторичные антитела)ABclonal Technology, Ухань, Китай / abcam, Кембридж, Великобритания / Servicebio, Ухань, Китай / Beyotime, Шанхай, Китай / Cell Signaling, Данверс, Массачусетс, СШАA8814, ab32572, GB25303, ab15580, ab108257, ab246917, A8814, AF6708, AA326, 4060, ab219412, 280376, 9322, ab97051, ab229025Обнаружение уровней экспрессии белков
Набор для обнаружения клеточного апоптозаServicebio, Ухань, КитайG1021Обнаружение апоптоза
Краситель CFSE Cell TraceInvitrogen, Карлсбад, Калифорния, СШАC34570Обнаружение клеточной пролиферации
Система хемилюминесцентной визуализацииBio-Rad, Геркулес, Калифорния, СШАChemi Doc XRS+Обнаружение сверхвысокой чувствительности белка
Колориметрический набор для анализа Cu2+Elabscience, Ухань, КитайE-BC-K300-MОбнаружение содержания Cu2+ в опухолевых тканях и клетках GBM
CuCl2Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия751944Индуктор купроптоза
Куркумин (CUM)Источник Шанхайский лист, Шанхай, КитайS19245Полифенольное соединение
Комплект для обнаружения DHEBeyotime, Шанхай, КитайS0063Обнаружение уровней ROS
Диметилсульфоксид (DMSO)ServicebioG4101-2Растворитель для MTT-анализа
Разработчик ECLServicebioG2161Используется для вестерн-блота
ЭлескломолSelleck.cnS1052Индуктор купроптоза
Проточная цитометрияBD Biosciences, Нью-Джерси, СШАBD FACSAria IIIИспользуется для клеточной гибели и анализов CFSE
Флуоресцентный микроскопOLYMPUS, Токио, ЯпонияIX73Используется для иммунофлуоресцентных анализов, ROS, TUNEL, DHE и MMP
Клеточные линии глиобластомы A172 (RRID: CVCL_0131), U251 (RRID: CVCL_0021), LN229 (RRID: CVCL_0393) и SHG-44 (RRID: CVCL_6902)Punosai Biotechnology Co., Ltd., Ухань, КитайCL-0012, CL-0237, CL-0578, CL-0207Клеточные линии человеческой глиобластомы
Программное обеспечение GraphPad Prism 9.0GraphPad Software, LLCВерсия 9.0Статистический анализ
Программное обеспечение ImageJ 1.53kНациональный институт психического здоровьяВерсия 1.53kСтатистический расчет
Рабочее решение JC-1Соларбио, Пекин, КитайM8650Обнаружение MMP
Самцы обнажённых мышей BALB/cSlack Kingda Laboratory Animal Co., Ltd., Хунань, КитайЭксперимент с мышью
Считыватель микропластинBio-Tek, Вермонт, СШАELX-800Для измерения значения OD450 нм
МикроскопОЛИМПBX53Используется для клеточного царапина, эксперимента Трансвелла и иммуногистохимических анализов
Зонд MitoSOXThermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, СШАM36008Используется для обнаружения ROS
Mitotracker Red CMXRosТермо Фишер СайентификM7512Специфическая маркировка митохондрий в живых клетках
Комплект для обнаружения MTTServicebioG4101-1Обнаружение жизнеспособности клеток
Нормальные человеческие астроцитные клетки мозга (RRID:CVCL_B0DK )Huatuo Biotechnology Co., Ltd., Шэньчжэнь, КитайHTX2408Клеточная линия для контрольных экспериментов
Набор для извлечения ядерного белкаBeyotimeP0027Извлечение ядерного белка
Анализатор энергетического метаболизма клеток морского конькаAgilent,  Пекин, КитайSeahorse XFИспользуется для обнаружения OCR
Комплект репортера TCF/LEF1 для люциферазыBiolab Technology Co., Ltd, Пекин, КитайОбнаружение активности сигнального пути Wnt/β-катенина
Набор для обнаружения TUNELBeyotimeC1088Обнаружение апоптоза в опухолевых тканях
Ингибитор Wnt (LGK974)Selleck.cnS7143Специфический ингибитор Wnt

Ссылки

  1. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  2. Liang, R., Xiang, Y., Hu, C., Tang, X. Expression and clinical significance of RBBP4 gene in lower-grade glioma: an integrative analysis. Biochem Biophys Rep. 35, 101533(2023).
  3. Sahoo, O. S., Mitra, R., Nagaiah, N. K. H. The hidden architects of glioblastoma multiforme: glioma stem cells. 3 (1), 66(2024).
  4. Schaff, L. R., Mellinghoff, I. K. Glioblastoma and other primary brain malignancies in adults: a review. JAMA. 329 (7), 574-587 (2023).
  5. Singh, D. Nanocage-tethered polymeric hybridome for pDNA delivery: a revolutionary approach for treatment of glioblastoma. J Can Biomol Therap. 2 (1), 133-144 (2025).
  6. van den Bent, M. J., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 402 (10412), 1564-1579 (2023).
  7. Zhou, Y., Shi, F., Zhu, J., Yuan, Y. An update on the clinical trial research of immunotherapy for glioblastoma. Front Immunol. 16, 1582296(2025).
  8. Ravuluri, J. A. V., et al. Brain-targeted nano-architectures for efficient drug delivery and sensitization in glioblastoma. Curr Pharm Des. 29 (22), 1775-1790 (2023).
  9. LeBlanc, V. G., et al. Single-cell landscapes of primary glioblastomas and matched explants and cell lines show variable retention of inter- and intratumor heterogeneity. Cancer Cell. 40 (4), 379-392.e9 (2022).
  10. Zhang, Y., et al. Single-cell RNA sequencing identifies critical transcription factors of tumor cell invasion induced by hypoxia microenvironment in glioblastoma. Theranostics. 13 (11), 3744-3760 (2023).
  11. Jiang, Y., Huo, Z., Qi, X., Zuo, T., Wu, Z. Copper-induced tumor cell death mechanisms and antitumor theragnostic applications of copper complexes. Nanomedicine (Lond). 17 (5), 303-324 (2022).
  12. Tsvetkov, P., et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 375 (6586), 1254-1261 (2022).
  13. Meena, R., Sahoo, S. S., Sunil, A., Manna, D. Cuproptosis: a copper-mediated programmed cell death. Chem Asian J. 20 (4), e202400934(2025).
  14. Jin, Y., et al. Baicalein enhances cisplatin sensitivity in cervical cancer cells by promoting cuproptosis through the Akt pathway. Biomed Pharmacother. 179, 117415(2024).
  15. Ning, S., et al. Type-I AIE photosensitizer loaded biomimetic system boosting cuproptosis to inhibit breast cancer metastasis and rechallenge. ACS Nano. 17 (11), 10206-10217 (2023).
  16. Chen, Y., Zhang, J., Zheng, W., Xu, H. Cuproptosis-related lncRNAs and genes: potential markers for glioblastoma prognosis and treatment. PLoS One. 20 (2), e0315927(2025).
  17. Huang, Q. -X., et al. Metal-organic framework nanoagent induces cuproptosis for effective immunotherapy of malignant glioblastoma. Nano Today. 51, 10911(2023).
  18. Mohamadian, M., Ahmadi, S. S., Bahrami, A., Ferns, G. A. Review on the therapeutic potential of curcumin and its derivatives on glioma biology. Neurochem Res. 47 (10), 2936-2953 (2022).
  19. Zoi, V., et al. Curcumin and radiotherapy exert synergistic anti-glioma effect in vitro. Biomedicines. 9 (11), 1562(2021).
  20. Wong, S. C., Kamarudin, M. N. A., Naidu, R. Anticancer mechanism of curcumin on human glioblastoma. Nutrients. 13 (3), 950(2021).
  21. Sun, X., et al. Protective effect of curcumin on hepatolenticular degeneration through copper excretion and inhibition of ferroptosis. Phytomedicine. 113, 154539(2023).
  22. Xiang, B., et al. Curcumin ameliorates copper-induced neurotoxicity through inhibiting oxidative stress and mitochondrial apoptosis in SH-SY5Y cells. Neurochem Res. 46 (2), 367-378 (2021).
  23. Wang, Z., et al. Curcumin suppresses glioblastoma cell proliferation by p-AKT/mTOR pathway and increases the PTEN expression. Arch Biochem Biophys. 689, 108412(2020).
  24. Jia, F., et al. Matrix metallopeptidase 2-responsive curcumin-loaded nanoparticles-induced signal transducer and activator of transcription 3 inhibition suppresses glioblastoma multiforme growth via enhancing nuclear factor erythroid 2-related factor 2 activity. Int J Biol Macromol. 307 (Pt 2), 141998(2025).
  25. Su, X., Chen, S., Lu, H., Li, H., Qin, C. Study on the inhibitory effect of curcumin on GBM and its potential mechanism. Drug Des Devel Ther. 15, 2769-2781 (2021).
  26. Bhagat, N., et al. Self-assembled systems for nose-to-brain delivery of temozolomide in brain tumor therapy. Int J Pharm. 675, 125540(2025).
  27. Mohajerani, F., et al. CLEC19A overexpression inhibits tumor cell proliferation and migration and promotes apoptosis concomitant suppression of PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway in glioblastoma multiforme. BMC Cancer. 24 (1), 19(2024).
  28. Li, Z., et al. MELK promotes HCC carcinogenesis through modulating cuproptosis-related gene DLAT-mediated mitochondrial function. Cell Death Dis. 14 (11), 733(2023).
  29. Lin, S., Wu, B., Hu, X., Lu, H. Sirtuin 4 downregulation contributes to chondrocyte senescence and osteoarthritis via mediating mitochondrial dysfunction. Int J Biol Sci. 20 (4), 1256-1278 (2024).
  30. Wang, W., et al. Ferroptosis inducers enhanced cuproptosis induced by copper ionophores in primary liver cancer. J Exp Clin Cancer Res. 42 (1), 142(2023).
  31. Wagstaff, M., et al. β-Catenin interacts with canonical RBPs including MSI2 to associate with a Wnt signalling mRNA network in myeloid leukaemia cells. Oncogene. 44 (29), 2490-2503 (2025).
  32. Liao, C. L., et al. Tetrandrine suppresses human brain glioblastoma GBM 8401/luc2 cell-xenografted subcutaneous tumors in nude mice in vivo. Molecules. 26 (23), 7105(2021).
  33. Huo, S., et al. ATF3/SPI1/SLC31A1 signaling promotes cuproptosis induced by advanced glycosylation end products in diabetic myocardial injury. Int J Mol Sci. 24 (2), 1667(2023).
  34. Zhang, Z., et al. Maresin1 suppresses high-glucose-induced ferroptosis in osteoblasts via NRF2 activation in type 2 diabetic osteoporosis. Cells. 11 (16), 2560(2022).
  35. Wang, H., et al. Targeting Wnt/β-catenin signaling exacerbates ferroptosis and increases the efficacy of melanoma immunotherapy via the regulation of MITF. Cells. 11 (22), 3580(2022).
  36. Liu, Y., et al. DNA aptamer S11e recognizes fibrosarcoma and acts as a tumor suppressor. Bioact Mater. 12, 278-291 (2022).
  37. Walker, B. C., Mittal, S. Antitumor activity of curcumin in glioblastoma. Int J Mol Sci. 21 (24), 9435(2020).
  38. Zhang, B., Xie, L., Liu, J., Liu, A., He, M. Construction and validation of a cuproptosis-related prognostic model for glioblastoma. Front Immunol. 14, 1082974(2023).
  39. Liu, Z., Ma, H., Lai, Z. The role of ferroptosis and cuproptosis in curcumin against hepatocellular carcinoma. Molecules. 28 (4), 1623(2023).
  40. Tian, Z., Jiang, S., Zhou, J., Zhang, W. Copper homeostasis and cuproptosis in mitochondria. Life Sci. 334, 122223(2023).
  41. Prasad Panda, S., Kesharwani, A. Micronutrients/miRs/ATP networking in mitochondria: clinical intervention with ferroptosis, cuproptosis, and calcium burden. Mitochondrion. 71, 1-16 (2023).
  42. Peng, Y., Wang, Y., Zhou, C., Mei, W., Zeng, C. PI3K/Akt/mTOR pathway and its role in cancer therapeutics: are we making headway. Front Oncol. 12, 819128(2022).
  43. Precilla, D. S., et al. Wnt/β-catenin antagonists: exploring new avenues to trigger old drugs in alleviating glioblastoma multiforme. Curr Mol Pharmacol. 15 (2), 338-360 (2022).
  44. Li, C., Yang, J., Wang, W., Li, R. LHPP exerts a tumor-inhibiting role in glioblastoma via the downregulation of Akt and Wnt/β-catenin signaling. J Bioenerg Biomembr. 53 (1), 61-71 (2021).
  45. Liu, Y. T., et al. Dysregulated Wnt/β-catenin signaling confers resistance to cuproptosis in cancer cells. Cell Death Differ. 31 (11), 1452-1466 (2024).
  46. Yu, W., et al. Investigation of cuproptosis regulator-mediated modification patterns and SLC30A7 function in GBM. Aging (Albany NY). 16 (4), 3554-3582 (2024).
  47. Afshari, A. R., et al. Anti-tumor effects of curcuminoids in glioblastoma multiforme: an updated literature review. Curr Med Chem. 28 (39), 8116-8138 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

AKTWnt

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.