Исследовательская статья
У небольшой группы женщин-доноров старение уменьшило электротактическую миграцию hADSC. DCEF изменял экспрессию генов (747 вверх, 624 вниз), обогащая термины транспорта натрия/канала GO и пути PI3K-Akt KEGG, что указывает на участие в возрастной электротакси, не устанавливая причинно-следственную связь.
Стволовые клетки, полученные из человеческих жиров (hADSCs), играют ключевую роль в регенерации тканей и заживлении ран, а их направленная миграция является необходимым условием для оказания этих терапевтических эффектов. Электрические поля (EF) хорошо известны как ключевые сигналы, направляющие миграцию клеток во время восстановления раны, однако электротактическое поведение hADSC — особенно то, как характеристики доноров (например, возраст) регулируют это поведение и его молекулярные механизмы — остаётся плохо изученным. Этот пробел в знаниях ограничивает оптимальное применение hADSC в регенеративной медицине. В этом исследовании мы впервые подтвердили существование электротаксиса в hADSC и подтвердили его зависимость от напряжения: при постоянных электрических полях (DCEF) от 100 до 200 мВ/мм hADSC мигрировали направленно к аноду, при этом более сильные интенсивности EF повышали как направление миграции, так и скорость миграции (по сравнению с контролем 0 мВ/мм). Затем мы сравнили hADSC у молодых женщин-доноров (27,00 ± 4,58 года) и пожилых женщин-доноров (62,33 ± 4,04 года) с использованием РНК-секвенирования (RNA-seq) после стимуляции DCEF 200 мВ/мм. Транскриптомический анализ выявил 747 повышенных и 624 пониженных гена у пожилых hADSC, при этом дифференцированно экспрессируемые гены (DEG), обогащённые биологическими процессами/путями, критически важными для электротаксиса — включая трансмембранный транспорт ионов натрия, активность натриевого канала с ограничением напряжения (термины GO) и сигнальный путь PI3K-Akt (путь KEGG). Функционально, пожилые hADSC демонстрировали значительно меньшую анодальную миграцию (уменьшение накопленного расстояния, евклидово расстояние и прямолинейность) по сравнению с молодыми hADSC при стимуляции DCEF. Это исследование впервые подтверждает наличие возрастно-зависимого электротаксиса в hADSC, показывая, что возраст донора коррелирует с нарушенной электротаксической способностью. Также показано, что дисрегулированная активность натриевых каналов и сигнализация PI3K-Akt могут лежать в основе этого возрастного снижения. Эти результаты указывают на потенциальные регуляторные механизмы электротаксиса hADSC и дают новые идеи для адаптации терапий на основе hADSC (например, выбор оптимальных доноров или таргетирование путей натрия/PI3K-Act) с целью улучшения регенерации тканей и заживления ран.
Стволовые клетки, полученные из адипозов (ADSC), обладают сильной способностью к самообновлению и значительным регенеративным потенциалом. При соответствующих условиях индукции они могут дифференцироваться на остеобласти, хондроциты и адипоциты, средипрочих: 1. С помощью паракринной сигнализации ADSC также может поддерживать образование кровеносных и лимфатических сосудов 2,3, подавлять образованиерубцов 4 и проявлять иммунорегуляторныеэффекты 5. Поэтому ADSC считается идеальной семенной клеткай для клеточной терапии в регенеративной медицине.
Функция ADSC зависит от различных характеристик донора, которые могут влиять на их потенциальную эффективность в клеточных терапиях, включая возраст донора, индекс массы тела, пол идругие 6. ADSC, полученные от пожилых доноров, демонстрируют более выраженные признаки старения, с пониженным потенциалом дифференцировки адипогенной дифференцировки, потенциалом остеогенной дифференцировки и миграционнойспособностью 7,8,9. Кроме того, способность способствовать пролиферации кератиноцитов и стимулировать механизмы самовосстановления организмауменьшается 10.
Клеточно-направленная миграция является ключевым физиологическим механизмом заживления ран и регенерации тканей, при этом электрические поля (ЭФ) играют важную роль в направлении миграции клеток и стимулировании восстановленияран 11. Например, когда эпителиальный барьер повреждён, эндогенные электрические поля сразу возникают и сохраняются до заживления раны и восстановления функции эпителиальногобарьера 12,13,14. Как один из сигналов, направляющих направленную миграцию клеток, электрические сигналы имеют более высокий приоритет, чем другие сосуществующие сигналы, такие как торможение контакта, механические силы и хемотактическиефакторы 15,16. Разработано несколько методов для стимулирования заживления ран и регенерации тканей, например, с помощью лекарств и внешних электрических стимуляторов, которые усиливают или имитируют эндогенные электрические поля вчеловеческом теле 17,18. Способность клеток мигрировать по градиенту электрического поля называется электротаксисом. Исследования in vitro показали, что многие различные типы клеток способны на направленную миграцию в электрических полях. Некоторые клетки мигрируют к аноду, такие как клетки черепного гребня у млекопитающих, человеческие астроциты и клетки рака молочной железыу человека 19,20,21. Другие клетки мигрируют к катоду, такие как трубчатые эпителиальные клетки человека почек, дермальные фибробласти человека и человеческие нейтрофилы 22,23,24. ADSC можно направлять для миграции к аноду в постоянных электрических полях постоянного тока, и при длительном культурировании экзогенный импульсный электрический ток эффективно способствует направленной миграции ADSC к аноду при сохранении жизнеспособности клетки25. На сегодняшний день исследования электротаксисных характеристик человеческих стволовых клеток, полученных из жира, остаются редкими, а механизмы, регулирующие их электротаксическое поведение, до сих пор не полностью изучены.
Мы первыми систематически исследовали возрастно-зависимые электротаксические различия в hADSC у молодых и пожилых женщин-доноров под градиентными постоянными электрическими полями (DCEF), а также дополнительно раскрыли основные механизмы (связанные с активностью натриевого канала и сигнализация PI3K-Act) с помощью транскриптомического анализа. В этом исследовании мы изучали влияние DCEF на hADSC. Используя секвенирование РНК и дифференциальный анализ обогащения генов, мы сравнили профили экспрессии генов между двумя группами hADSC — полученными от молодых и пожилых женщин-доноров — после стимуляции DCEF, чтобы выявить возрастные транскрипционные различия. Мы выдвинули гипотезу, что старение доноров нарушает электротаксическую реакцию hADSC, и что это возрастное снижение связано с изменением активности натриевого канала и PI3K-Akt сигнализации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
До начала сбора тканей было получено информированное согласие всех участников. Это исследование было одобрено Этическим комитетом Первой аффилированной больницы Китайского медицинского университета (одобрение No [2018]2018-110-2). Письменное информированное согласие было получено от всех участников перед сбором тканей
Изоляция и культура hADSC
Сбор тканей: Образцы жировой ткани человека в области брюшной полости были получены во время рутинных плановых процедур липосакции, проводимых в отделении пластической хирургии Первой аффилированной больницы Китайского медицинского университета. Все доноры были здоровыми женщинами-добровольцами, проходившими косметическую абдоминальную липосакцию, и дополнительных хирургических вмешательств для исследовательских целей не проводилось. Образцы тканей были собраны хирургом в стерильных условиях сразу после аспирации и перенесены в лабораторию в стерильных контейнерах на льду в течение 30 минут.
Размер выборки: В исследование было включено всего 6 доноров, включая 3 молодых донора (возраст: 27,00 ± 4,58 года) и 3 пожилых донора (возраст: 62,33 ± 4,04 года).
Обработка тканей: Переместить фрагменты жировой ткани в коническую трубку объёмом 50 мл, центрифугировать при 1800 x g в течение 3 минут при 4 °C и аккуратно аспирировать верхнюю масляную фазу (чтобы удалить избыточные липиды). Добавьте 0,2% коллагеназы IV типа (конечный объём: 5-10 мл на 1 г жировой ткани) в тканевую гранулу, затем поместите трубку в водяную баню или инкубатор при температуре 37 °C на 45 минут. Аккуратно перемешивайте трубку каждые 10-15 минут во время пищеварения, чтобы обеспечить равномерный контакт между коллагеназой и тканями. После переваривания прекратите реакцию, добавив DMEM с низким содержанием глюкозы, дополненную 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина (соотношение объёма среды нейтрализации к раствору коллагеназы = 1:1).
ВНИМАНИЕ: При обращении с коллагеназой надевайте одноразовые перчатки, лабораторный халат и защитные очки, чтобы избежать контакта кожи и глаз, подготовьте и используйте реагент в биологическом шкафу безопасности (BSC) для предотвращения загрязнения аэрозолями, а в случае разлива немедленно протирайте 75% этанола и утилизируйте загрязнённые материалы как биологические отходы.
Изоляция клеток: Центрифугуйте нейтрализированную пищеварительную смесь при 1200 г в течение 10 минут при 4 °C, чтобы пеллетировать клетки. Сбросьте супернатант, затем снова суспензуйте гранулу в буфере эритроцитного лизиса (155 мМ NH₄Cl, 10 мМ KHCO₃, 0,1 мМ EDTA; pH 7,4; объём: 2-3 мл на гранулу) и инкубировать при комнатной температуре (22-25 °C) в течение 5 минут для лиза остаточных эритроцитов. Фильтруйте суспензию клетки последовательно через сита диаметром 200 мкм, чтобы удалить непереваренные тканевые остатки и получить суспензию с одной клеточкой.
Подсчёт клеток: До посева количество клеток количественно измерялось с помощью гемоцитометра. Кратко, hADSC отделялись с трипсинов-ЭДТА 0,25%, ресуспендовали в почвенной среде и смешивали 1:1 с раствором трипана синего 0,4%. Жизнеспособные клетки (неокрашенные) подсчитывались вручную с помощью гемоцитометра Нойбауэра под световым микроскопом, а общее количество жизнеспособных клеток рассчитывалось как: количество клеток/мл = (средний подсчитанный коэффициент разбавления x 104).
Культура клеток: Засейте фильтрованные клетки при плотности 5 x 103 клетки/см² в среде роста (низкоглюкозный DMEM + 10% FBS + 1% пенициллина/стрептомицина) и инкубировать при 37 °C с 5%CO2. Заменяйте среду каждые 2-3 дня, чтобы удалить неприлипшие клетки и поддерживать оптимальные условия для культуры. Все hADSC, использованные для последующих экспериментов — включая характеристику клеток (обнаружение поверхностных маркеров, анализы на дифференцировку по трилинейе), стимуляцию DCEF, анализ миграции и морфологии, анализы старения/пролиферации и секвенирование РНК — находились в проходах 3 по 5.
Характеристика hADSC
Экспрессия маркеров поверхности клеток: Культивировать клетки до 70% совпадения, затем диссоциировать адгезирующие клетки с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА (инкубировать при 37 °C в течение 3 минут). Центрифугуйте ячейку при суспензии 300 x g в течение 5 минут при 4 °C, сбросьте супернатант и снова суспензируйте гранулу в 1x PBS (объём: 1-2 мл). Аликвотируйте 1 x 105 клеток на образец (ревзвешенное в 100 мкл при 1x PBS) и добавляйте флуоресцентно конъюгированные антитела при указанных разбавлениях: анти-CD44 (1:50), анти-CD90 (1:100), анти-CD29 (1:50), анти-CD73 (1:50) и анти-CD105 (1:20)1,4,7. Инкубировать смесь антитела и клеток при 4 °C в течение 30 минут в темноте, чтобы избежать закаления флуорофора. После инкубации центрифугуйте при 1000 г в течение 5 минут при 4 °C и полностью аспирируйте супернатант. Суспензируйте гранулу в 1-2 мл 1x PBS, снова центрифугуйте при 1 000 x g в течение 3 минут при 4 °C, сбросьте супернатант и повторите этот процесс промывания два раза для удаления несвязанных антител. Наконец, суспензировать клеточную гранулу в 200 мкл свежего 1x PBS, получить флуоресцентные данные с помощью потокового цитометра и провести количественный анализ с помощью программного обеспечения FlowJo (v10). Рабочий процесс гейтинга следовал стандартным процедурам фенотипирования MSC: элемент FSC-SSC для исключения мусора и выбора основной популяции ячеек на основе размера и детализации, затем исключение дублетов с использованием графиков FSC-A против FSC-H и графиков SSC-A против SSC-H для обеспечения событий с одной ячейкой. Затем была проведена гейтинг живых клеток для исключения трипан-синеположительных или PI-положительных мёртвых клеток. Флуоресцентное гейтинг проводилось для однократных контролей, а неокрашенные контроли использовались для установки порогов для CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 (положительные маркеры) и CD34, CD45 (отрицательные маркеры). Были экспортированы и проанализированы представительные участки ограждения для подтверждения идентичности hADSC.
Потенциал дифференцировки
Адипогенная дифференциация: Собирайте HADSC поколения P3 при слиянии 85% с использованием 0,25% трипсина-EDTA, затем посевайте их в пластинах с 24 колодцами при плотности 1 x 10⁵ ячеек на колодец (используя полный DMEM-среду) и инкубируют при 37 °C с 5%CO2 , пока клетки снова не достигнут 85% слияния. Для индукции используйте набор для дифференцировки адипогенеза, составляющий компонент комплекта A (адипогенный индуктор) и компонент B (адипогенный поддерживающий) согласно руководству, а компонент A — первые 3 дня, а затем переходите на компонент B в течение 1 дня. Повторяйте этот цикл в течение 3 недель. Для окрашивания аспирируйте индукционную среду, аккуратно промывайте клетки 3 мл 1x PBS (чтобы не нарушать слои клеток), фиксируйте клетки с 4% параформальдегидом (PFA) при комнатной температуре в течение 20 минут, затем инкубировать раствором 0,3% масло Red O (приготовленным в 60% изопропаноле) при комнатной температуре в течение 15 минут. Промыйте клетки 3 раза с помощью PBS для удаления лишнего окраски, затем сфотографируйте липидные капли с помощью инвертированного светового микроскопа (20 раз).
Остеогенная дифференциация: Семена hADSC в пластинах с 12 лунками при плотности 1 x 10⁵ клеток на колодцу, и когда клетки достигают 85% слияния, используйте набор для дифференцировки остеогенеза для индукции — восстанавливайте компонент A (остеогенный индуктор) и компонент B (остеогенная добавка) в низкоглюкозном DMEM (конечные концентрации: 10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина, 0,1 мкм дексаметазона, 10 мМ β-глицерофосфата, 0,05 мМ аскорбиновой кислоты-2-фосфат) и обновлять среду каждые 3 дня в течение 3 недель. Для окрашивания фиксируйте клетки с 4% PFA при комнатной температуре на 15 минут, промывайте 3 раза с 1x PBS, затем инкубуйте раствором 2% Ализарин Red S (pH 4.2, приготовленные в деионизированной воде) при комнатной температуре в течение 30 минут. Промывайте клетки 3 раза с помощью 1x PBS для удаления несвязанного окрашивания, затем сфотографируйте кальциевые узелки под фазово-контрастным микроскопом (20x) и количественно оцените минерализацию, измеряя площадь узлов с Alizarin Red S-положительными с помощью программного обеспечения ImageJ.
Хондрогенная дифференциация: Центрифугуйте 250 000 hADSC при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C в конической трубке объёмом 15 мл для формирования клеточной гранулы, добавьте 500 мкл полного DMEM-среды в пробирку и инкубируемые на ночь при 37 °C с 5%CO2 для стабилизации гранулы. На следующий день используйте набор для дифференцировки хондрогенеза для индукции — восстановите компонент A (хондрогенный индуктор) в среде, независимой отCO2 (конечные концентрации: 1% пенициллин/стрептомицин, 10 нг/мл TGF-β3, 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты-2-фосфат, 100 мкг/мл пирувата натрия) и аккуратно обновляйте среду каждые 3 дня (избегайте беспокойства гранулы). После 3 недель индукции зафиксировать клеточную гранулу 4% PFA при комнатной температуре на 30 минут, аспирировать фиксатор, инкубировать раствором толуидина Blue O 0,1% (с в/в) (приготовленным в буфере ацетата натрия 0,1 м, pH 4,0) при комнатной температуре в течение 15 минут, аспирировать морилку, промыть гранулу 3 раза деионизированной водой, чтобы удалить избыток красителя, затем снимите под микроскопом с ярким полем (20x) и количественно измерите накопление сульфатированного протеогликана, измеряя среднюю оптическую плотность (OD) окрашивания толуидином Blue O с помощью программного обеспечения ImageJ.
ВНИМАНИЕ: При работе с 4% PFA (токсичным и коррозионным реагентом) работайте исключительно в выхлопной вытяжке, надевая одноразовые перчатки, лабораторный халат и защитные очки, чтобы избежать вдыхания пара или контакта с кожей и глазами — если возникает контакт, немедленно промыйте проточной водой в течение 15 минут и обратитесь за медицинской помощью. Для утилизации опасных отходов собирайте использованные материалы, загрязнённые PFA и PFA (например, наконечники пипеток, пластины) в специализированный контейнер для химических отходов с маркировкой PFA Waste и утилизируйте, используя институциональные протоколы по опасным отходам, чтобы избежать смешивания с биологическими отходами.
Сборка камеры электротаксиса: Просверлите два отверстия (диаметром 0,75 см) на противоположных концах центральной линии на крышке чашки Петри диаметром 10 см, расположенной в 1 см от края чашки (чтобы разместить мосты агар-соль). Нанесите тонкий слой вакуумной смазки (≤ 2 см в длину, ≤ 1 см шириной) на дно чашки Петри вдоль центральной линии, на расстоянии 4 см от каждого края (рисунок 1A). Используя стерильные щипцы с мелким наконечником, положите стерильную стеклянную накладку размером 1 см x 2 см на каждое смазочное пятно и аккуратно прижмите для плотного уплотнения (чтобы избежать повреждения скольжения при покрытии; Рисунок 1B-C). Нанесите ещё один тонкий слой вакуумной смазки поверх каждого прикреплённого покрытия, затем нанесите второй стерильный стеклянный слой размером 1 см x 2 см непосредственно на смазку, чтобы получить двойной стек с накладкой. Аккуратно прижимайте, чтобы обеспечить плотное уплотнение между двумя крышками (предотвратить утечку среде; Рисунок 1D). Вдоль диагональной линии, соединяющей верхний левый угол одной стеки с ближайшим краем тарелки и нижний правый угол противоположной стопки с ближайшим краем, нанесите вакуумную смазку, чтобы создать непрерывную стену барьера. Стена должна плотно прилипать к дну посуды (без щелей) и иметь примерно 2 см в высоту и 0,5 см в ширину (рисунок 1E). Стерилизуйте собранную камеру под ультрафиолетовым светом в течение 20 минут (чтобы избежать микробного загрязнения), затем храните при комнатной температуре в стерильных условиях до использования (рисунок 1F).
Стимуляция DCEF: Поместите стерильные стеклянные стекли (для засева клеток) в чашку Петри диаметром 10 см и инкубируем на ночь при 37 °C с 5%CO2 для предварительной подготовки стеклян (способствуя прилипанию клеток). Приготовить раствор Штейнберга, разбавляя 10 мл 10x стандартного раствора в 90 млddH 2O (стерильные; конечные концентрации: 58 мМ NaCl, 0,67 мМ KCl, 0,44 мМ Ca(NO3)24H2O, 0,83 мМ MgSO47H2O, 10 мМ HEPES; pH 7,4). Добавьте 0,3 г агар к 20 мл подготовленного раствора Штайнберга, разогрейте в микроволновке 20 секунд, пока агар полностью не растворится и не станет прозрачным, затем сразу заполните специальные стеклянные сольные мосты горячей смесью агар-штайнберга и дайте ей затвердеть при комнатной температуре. После затвердевания стерилизуйте соляные мосты под ультрафиолетовым светом в течение 15 минут, затем стерилизуйте две стаканы (каждая с 30 мл раствора Steinberg) под ультрафиолетовым светом в течение 15 минут. Семенные hADSC генерации P3 на предварительно кондиционированных стерильных стеклах с плотностью 2 x 10⁴ клетки/см², инкубируют при 37 °C с 5%CO2 в течение 24 часов, чтобы обеспечить адгезию клеток, затем переместить клеточные стекли на взлётно-посадочную полосу собранной электротаксисной камеры и закрепить их стерильными боковыми затворами (чтобы предотвратить движение). Герметизируя полосу, наместив стеклянную накладку размером 3 см на 2 см поверх вакуумной смазки, аккуратно прижимая для плотного уплотнения и нанося дополнительную вакуумную смазку вдоль краёв верхнего покрытия, чтобы создать барьер (предотвратить испарение среды). Заполните резервуары камеры средой, независимой отCO2 (дополненной 10% FBS и 1% пенициллином/стрептомицином; объём: 5-8 мл на резервуар), вставьте стерилизованные мосты агар-соли через отверстия в крышке чашки Петри (один конец погружен в средний резервуар, другой — в стаканы, заполненные раствором Steinberg), и подключите стаканы к источнику питания через электроды Ag/AgCl (для подачи стабильного постоянного тока). Примените постоянное электрическое поле (DCEF) 2 В/см в течение 4 часа, контролируйте напряжение каждые 15 минут с помощью цифрового мультиметра (при необходимости регулируйте для поддержания постоянной напряжённости поля) и делайте таймлапс-изображения миграции ячеек каждые 5 минут на 4 случайных полях с помощью программного обеспечения (5x объективный, режим яркого поля).
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании электрического оборудования убедитесь, что источник питания и электроды сухие и размещены на непроводящей поверхности, чтобы избежать электрического удара. При подключении или отключении электродов надевайте изолированные перчатки, отключайте питание перед регулировкой, а в случае средней утечки на электрические компоненты немедленно отключите питание и протирайте впитывающей бумагой, пропитанной 75% этанола. В этом исследовании, минимизируя толщину камеры электрофореза и поддерживая её примерно на уровне 1 мм, а также проводя многоточечные измерения напряжения на обоих концах камеры, колебания напряжённости поля контролировались в пределах 10%. В таких условиях считается, что распределение электрического поля в зоне культуры по сутиравномерно 26.
Анализ миграции и морфологии
Живые изображения: Для hADSC при стимуляции DCEF импортируйте последовательности изображений с таймлапсами (интервалы в 5 минут) в программное обеспечение ImageJ, вручную отслеживайте 100 ячеек по 4 независимым полям от начала (t=0) до конца стимуляции (t=4 h) с помощью плагина Manual Tracking, и рассчитывайте среднюю скорость миграции (мкм/мин) и направленность (отношение D/T, где D = расстояние по прямой линии от начала до конца, T = общая длина пути) с помощью плагина Chemotaxis Tool (ImageJ).
Отслеживание: Вычислите следующие параметры миграции для количественной оценки электротаксического поведения: направленность (Σcosθi/n, где θi — угол между вектором смещения ячейки и направлением электрического поля (EF), а n — общее количество отслеживаемых ячеек от -1 до 1, при этом значения ближе к 1 указывают на более сильную анодовую миграцию), накопленное расстояние (общая длина пути, пройденная каждой ячейкой в период стимуляции, в мкм), скорость пути (накопленное расстояние, делённое на время стимуляции в мкм/ч) и евклидово расстояние (прямое смещение каждой ячейки от начала до конца в мкм, отражающее чистую миграцию).
Морфометрия: После стимуляции DCEF фиксируйте клетки с 4% PFA при комнатной температуре на 20 минут, промывайте 3 раза с 1x PBS, окрашивайте цитоскелет фаллоидином-TRITC (разбавление 1:500 в 1x PBS; объём: 200 мкл на скважину для пластин с 24 лунками) при комнатной температуре в течение 30 минут (для маркировки F-актина) и контрокрашивание ядра DAPI (1 мкг/мл в 1x PBS; объём: 100 мкл на одну скважину) в течение 5 минут. Клетки снимались с помощью флуоресцентного микроскопа при увеличении в 20 раз (с репрезентативными изображениями высокого разрешения, полученными в 40 раз). Phalloidin-TRITC визуализировали с использованием длины волны возбуждения 540-555 нм и длины волны излучения 565-580 нм, тогда как DAPI — с использованием длины волны возбуждения 358-405 нм и длины волны излучения 420-480 нм. Затем измеряйте следующие морфологические параметры на ImageJ: Длинная ось (максимальный диаметр Ферета, самое длинное расстояние между любыми двумя точками на периметре ячейки), вертикальная длина (ширина ячейки, перпендикулярная длинной оси) и вертикальность (sinα, где α — угол между длинной осью ячейки и направлением EF, при этом более высокие значения указывают на большее выравнивание с EF).
Анализы старения и пролиферации
Окрашивание SA-β-Gal: Используйте набор для обнаружения стареющих клеток (синих окрашенных клеток) под микроскопом яркого поля (20x объектив). Семена HADSC генерации P3 в пластинах с 6 колодцями при плотности 2 x10-5 клеток на колодцу, культивировать до 80% совпадения, аспирировать среду, аккуратно промыть клетки 3 раза с помощью 1x PBS, добавить 1 мл фиксирующего раствора (в наборе) в каждую скважину и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут, промыть клетки 3 раза с 1x PBS для удаления остаточного фиксативного средства после фиксации, добавляйте 0,5 мл рабочего раствора для окрашивания SA-β-галлон (приготовленного путём смешивания 50 мкл субстрата SA-β-галлон с 450 мкл буфера для окрашивания согласно инструкции к набору), герметизуйте пластину прозрачной пленкой (чтобы предотвратить испарение), инкубируемые ночью (16-18 часов) при 37 °C (избегайте воздействияCO2 , так как он изменяет pH и подавляет активность ферментов), На следующий день зафиксировать яркополевые изображения ≥10 случайных полей на одну скважину (10x объективно), посчитать количество окрашенных синим (SA-β-gal+) ячеек и общее количество ячеек, а также вычислить процент стареющих клеток как (Количество клеток SA-β-gal+ / Общее количество ячеек) x 100.
Иммунокрашивание Ki67
После окрашивания SA-β-gal аспирируют раствор для окрашивания, промывайте клетки 2 раза с 1x PBS, пропустите мембраны клетки с 0,1% Triton X-100 (приготовленным в 1x PBS; 1 мл на колодцу) при комнатной температуре в течение 10 минут и блокируйте связывание неспецифических антител с помощью 5% BSA (в 1x PBS; 1 мл на колодцу) при комнатной температуре в течение 1 часа. Клетки затем инкубировали первичным антителом Анти-Ki67 (разбавление 1:200 в 1% BSA/PBS; 500 мкл на скважину) при 4 °C ночью. На следующий день клетки были промыты трижды с помощью 1x PBS (по 5 минут каждая), удалять несвязанные первичные антитела и инкубировать с Alexa Fluor 488 488-конъюгированным вторичным антителом (разбавление 1:500 в 1% BSA/PBS; 500 мкл на колодцу) при комнатной температуре в течение 1 часа в темноте. Клетки промывались три раза с 1x PBS и окрашивали DAPI (1 мкг/мл в 1x PBS; 200 мкл на яму) в течение 5 минут. Флуоресцентные изображения были получены с помощью флуоресцентного микроскопа при увеличении в 20 раз (при этом репрезентативные изображения высокого разрешения получались при 40-кратном увеличении). Клетки Ki67+ с маркировкой Alexa Fluor 488 визуализировались с использованием длины волны возбуждения 485-495 нм и длины волны излучения 515-545 нм, тогда как ядра с окрашенным DAPI были сфотографированы с использованием длины волны возбуждения 358-405 нм и длины волны излучения 420-480 нм. Процент пролиферативных клеток рассчитывался следующим образом: (Количество клеток Ki67+ / Число ядер DAPI+ ) x 100.
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с первичными и вторичными антителами работайте в BSC для предотвращения загрязнения, акво-антитела в одноразовых объёмах для предотвращения повторных циклов замораживания и оттаивания и собирайте материалы, заражённые антителами (например, наконечники пипеток, пластины) в специальный автоклавируемый пакет биологических отходов для стерилизации путем автоклава перед утилизацией.
Возрастно-зависимый электротаксисный анализ hADSC: Используйте блок питания постоянного тока для генерации DCEF трёх интенсивностей: 0 мВ/мм (контрольный), 100 мВ/мм и 200 мВ/мм, используйте рабочую станцию с живыми ячейками для наблюдения и записи миграции ячеек в реальном времени, а для каждой интенсивности EF количественно сравнивайте анодальную миграционную способность hADSC от молодых и пожилых женщин-доноров, измеряя накопленное расстояние, Евклидово расстояние, скорость следа и направленность, с тремя независимыми биологическими репликами на группу для обеспечения надёжности результата. Параметры электротактической миграции количественно оценивались с помощью плагинов Manual Tracking и Chemotaxis Tool в ImageJ (NIH). Отдельные клетки вручную отслеживались на протяжении всего 4-часового периода стимуляции, и следующие параметры вычислялись по стандартным методам: Накопленное расстояние: общая длина пути, пройденная каждой ячейкой за период записи. Евклидово расстояние: прямолинейное расстояние между начальной и конечной позицией ячейки. Скорость пути: накопленное расстояние, делённое на общее время отслеживания (мкм/ч). Направленность: вычисляется как средний косинус угла (θ) между каждым вектором смещения и вектором электрического поля (значения варьируются от -1 до 1; значения ближе к 1 указывают на сильную анодальную миграцию).
Секвенирование РНК
Экстракция и подготовка РНК: Стерилизуйте контейнер, наполненный льдом, под ультрафиолетовым светом в течение 15 минут (для поддержания стабильности РНК) и выполняйте все последующие этапы на льду. Перенесите стеклянные стекла с hADSC (1 см x 2 см) из камеры электротаксиса в стерильную чашу Петри, промыйте клетки 3 раза 3 мл ледяного 1x PBS (аккуратно добавьте PBS, слегка перемешайте и полностью аспирируйте для удаления остаточной среды), затем добавьте 1 мл реагента TRIzol в каждый затвор и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут до полной лизы клеток (убедитесь, что лизат покрывает весь клеточный слой). Перенесите лизат в центрифужную трубку без РНазы объемом 1,5 мл, добавьте 0,2 мл хлороформа, интенсивно запустите вихрь в течение 15 секунд для индуцирования фазового разделения, инкубируем трубку на льду в течение 15 минут, затем центрифугуйте при 12 000 x g в течение 15 минут при 4 °C. Это делит лизат на три слоя: верхнюю водную фазу, содержащую РНК, средний белковый слой и нижнюю органическую фазу. Аккуратно перенесите верхнюю водную фазу (≈ 0,5 мл) в новую трубку без РНазы (избегайте прикосновения к среднему слою), добавьте 0,5 мл изопропанола, аккуратно вторгайтесь в вихрь для осадки РНК, инкубируете на льду 10 минут, затем центрифугуйте при 12 000 x г в течение 10 минут при 4 °C; РНК образует белую гранулу внизу трубки. Сбросить супернатант, повторить осаждение изопропанола один раз для улучшения чистоты РНК, полностью аспирировать супернатант, высушить РНК на воздухе в BSC при комнатной температуре в течение 5-10 минут (не пересушать, так как это снижает растворимость), ресуспензировать РНК-гранулу в 30 мкл воды, обработанной DEPC, инкубировать при 55 °C в течение 10 минут для облегчения растворения, количественно измерять чистоту РНК с помощью соотношения A260/A280 (целевое: 1,8-2,0) с помощью спектрофотометра, оценить целостность РНК с помощью РНК-наночипа; цель: Целостность РНК [RIN] > 8.0, и хранить квалифицированные образцы РНК при -80 °C до секвенирования.
ВНИМАНИЕ: Тризол и хлороформ токсичны, летучие и канцерогенные, поэтому обращайтесь исключительно с ними в вытяжке с дымом, надевая нитриловые перчатки, лабораторный халат и защитные очки — избегайте вдыхания паров, протирайте бумажным полотенцем и промывайте с мылом и водой в течение 10 минут, если они пролились на кожу, и не смешивайте с отбеливателем или другими окислителями (так как это может образовывать токсичные газы). Для утилизации опасных отходов, связанных с экстракцией РНК, собирайте смеси, изопропаноловые супернатанты и загрязнённые трубки в герметичный, химически устойчивый контейнер с маркировкой РНК (не смешивать с водными или биологическими отходами) и утилизировать по институциональным протоколам по опасным отходам, чтобы не сбросить в канализацию.
Предварительная обработка данных и контроль качества: Подготовьте секвенирующие библиотеки с использованием комплекта подготовки библиотеки mRNA-seq VAHTS по протоколу производителя — обогащать мРНК с помощью магнитных шариков олиго(dT), фрагментировать мРНК в фрагменты по 200-300 бп с помощью двухвалентных катионов, синтезировать кДНК первой цепочки с помощью случайных гексамеров, затем кДНК второй цепоти, выполнять ремонт концов, добавлять A-хвосты, лигировать адаптеры секвенирования, амплифицировать библиотеки с помощью ПЦР и очищать с помощью шариков. Секвенируйте библиотеки на платформе секвенирования (150 парных конечных чтений), генерируя примерно 50 миллионов необработанных чтений на выборку, затем с помощью программного обеспечения обрезать чтения низкого качества (удалять чтения с >50% оснований с рейтингом качества Phred <20) и последовательности адаптеров, сохраняя примерно 48 миллионов чистых считываний на образец (квартал 30 > 90%) для дальнейшего анализа после обрезания.
Анализ биоинформатики: Выровнять чистые считывания с человеческим эталонным геномом (GRCh38/hg38) с помощью программного обеспечения Hisat2 v2.2.1 и сохранять результаты выравнивания в формате BAM-файлов, использовать программное обеспечение htseq-count v0.13.5 для подсчёта количества считываний, отображённых к каждому гену (на основе аннотаций генов Ensembl), нормализовать данные о количестве генов с помощью функции estimateSizeFactors из пакета DESeq (2012) R, чтобы устранить эффекты пакетов и различия в глубине секвенирования, а также проведение дифференциального анализа экспрессии с использованием функции nbinomTest (пакет DESeq), выбирая дифференциально экспрессированные гены (DEG) с использованием порогов изменения свержения (FC) > 2 и скорректированного p-значения (padj) < 0,05. Провести анализ обогащения генной онтологии (GO) (биологический процесс, молекулярная функция, клеточный компонент) и анализ обогащения путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) на ДЭГ-х с использованием пакета clusterProfiler v4.0 R, с акцентом на обогащения, связанные с миграцией клеток (например, адгезия клеток, миграция клеток), транспортом ионов (например, трансмембранный транспорт ионов натрия) и сигнальными путями (например, сигнальный путь PI3K-Act). Выполнять неконтролируемую иерархическую кластеризацию на DEG с помощью пакета pheatmap v1.0.12 R и визуализировать паттерны экспрессии генов по образцам с помощью тепловой карты (z-баллы с масштабированием строк).
Статистический анализ: Все экспериментальные данные представлены как Среднее ± Стандартная ошибка среднего (Mean ± SEM), с как минимум 3 независимыми биологическими репликами на группу (n ≥ 3). Используйте t-тест Студента для сравнения различий между двумя группами (например, молодые и пожилые доноры) и односторонний анализ дисперсии (ANOVA), затем пост-хок тест Тьюки для сравнения различий между тремя и более группами (например, разные интенсивности EF), проведение статистического анализа с помощью программного обеспечения SPSS 23.0 и определение статистической значимости следующим образом: *p < 0.05, **p < 0.01, p < 0,001.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Применение электрических полей направляет направленную миграцию hADSC и увеличивает их миграционную способность
Экстракцированные hADSC демонстрировали типичные маркеры поверхности мезенхимальных стволовых клеток (например, CD29, CD44, CD90, CD73, CD105) и обладали потенциалом трилинейной дифференцировки (адипогенный, остеогенный, хондрогенный; Рисунок 2A), соответствующим стандартным критериям идентификации hADSC. Мы применили электрические поля постоянного тока (DCEF) с...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
На ранних этапах процесса восстановления и регенерации тканевых повреждений электрические поля становятся одними из первых физических сигналов, установленных в микросреде. Их направленные свойства пространственно-временно коррелируют с набором клеток в местоповреждения 27. Эндогенные электрические поля возникают из трансэпителиального потенциала, создаваемого поляризованным транспортом ионов в эпителиальных тканях. Когда эпителиальный барьер нарушается или стареет...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.
Мы искренне благодарим кафедру пластической хирургии Первой аффилированной больницы Китайского медицинского университета (Шэньян, Китай) и Институт регенеративных исцелений Калифорнийского университета в Дэвисе (Калифорния, США) за предоставление критически важной экспериментальной инфраструктуры и совместных исследовательских ресурсов, которые позволили провести это исследование. Мы также выражаем благодарность компании Shanghai OE Biotech Co., Ltd. за техническую поддержку в области секвенирования РНК и биоинформатического анализа.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4 градуса; C/-20°; C/-80&°; Холодильник C | Хайер, Китай | HYC-390/DW-25L262/DW-86L728J | |
| Агар | ХУШИ, Китай | 10000561 | |
| Биоанализатор Agilent 2100 | Agilent Technologies, США | G2939BA | |
| Alizarin Red S | Сигма-Олдрич, США | A5533 | |
| Кабинет биобезопасности | Thermo Fisher Scientific, США | 1300 A2 1,5 м | |
| CaNO3· 4H2O | ХУШИ, Китай | 10013960 | |
| Центрифуга | Thermo Fisher Scientific, США | X4R Pro | |
| CO2 Инкубатор | Thermo Fisher Scientific, США | Forma Steri-Cycle 3307 | |
| Коллагеназный тип IV | Biosharp, Китай | BS076 | |
| Конфокальный микроскоп | ZEISS, Германия | LSM 900 | |
| Импульсное питание постоянного тока | Daedo Powertronics, Корея | DDP-500 | |
| Дексаметазон | Сигма-Олдрич, США | D4902 | |
| Цифровой мультиметр | Флюк, США | FLUKE-175 | |
| DMSO | Сигма-Олдрич, США | D2650 | |
| Электронный баланс | Сарториус, Германия | BSA224S-CW | |
| FBS | Гибко, США | 10270-106 | |
| Потоковый цитометр | Thermo Fisher Scientific, США | A24858 | |
| IBMX (1-метил-3-изобутилксантин) | Сигма-Олдрич, США | I7018 | |
| Индометацин | Сигма-Олдрич, США | I7378 | |
| Инсулин | Сигма-Олдрич, США | I5500 | |
| Инвертированный микроскоп | ZEISS, Германия | Axio Observer 7 / ACR | |
| ITS-G | Сигма-Олдрич, США | I3146 | |
| KCl | ХУШИ, Китай | 10019318 | |
| KH2PO4 | ХУШИ, Китай | 10019320 | |
| Линоловая кислота | Сигма-Олдрич, США | L1376 | |
| Живая сотовая станция | Live Cell Instrument, Корея | Chamlide TC | |
| DMEM с низким уровнем глюкозы | Гибко, США | 11885084 | |
| MgSO4· 7H2O | ХУШИ, Китай | 10019322 | |
| Na2HPO4· 12Ч<суб>2O | ХУШИ, Китай | 10019324 | |
| NaCl | ХУШИ, Китай | 10019318 | |
| Спектрофотометр NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific, США | ND-2000 | |
| Oil Red O | Сигма-Олдрич, США | O0625 | |
| Пенициллин/стрептомицин | Гибко, США | 15140122 | |
| Пипетки | Эппендорф, Германия | 4920000061 | |
| SYBR Premix EX Taq | Такара, Китай | RR420A | |
| Толуидин Блю O | Сигма-Олдрич, США | T3260 | |
| Трис | ХУШИ, Китай | 10019326 | |
| ТРИзол | Бейотим, Китай | R0016 | |
| Trypsin-EDTA | Гибко, США | 25200056 | |
| Вертикальный микроскоп | ZEISS, Германия | 415200-0000-000 | |
| Вакуумная смазка | ДОУ КОРНИНГ, США | 1597418 | |
| Витамин C | Сигма-Олдрич, США | A4544 | |
| Система очистки воды | Thermo Fisher Scientific, США | GenPure xCAD плюс UF-TOC | |
| &бета;-глицерофосфат | Сигма-Олдрич, США | G9422 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение