Методическая статья

Валидация гипербарической системы давления с помощью ксеноновой анестезии для Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/69671

⸱

20 февраля 2026 г.

 , 
1Clore Laboratory, University of Buckingham

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Газы, которые кажутся безвредными при атмосферном давлении, могут вызывать такие явления, как наркоз, в гипербарических условиях. Обычные гипербарические камеры давления дорогостоящие и трудоёмкие. В данном исследовании представлен простой и недорогой метод изучения влияния ксенона на Drosophila melanogaster при умеренных давлениях ниже 4 атм.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При гипербарических условиях повышенная концентрация окружающих газов может вызывать различные поведенческие реакции у различных животных. Значительная часть этих поведений представляет собой изменения в когнитивных состояниях, которые пока плохо изучены. Одним из заметных примеров является общая анестезия. Поведенческий эффект нескольких газов при гипербарических условиях при общей анестезии, или наркозе, остаётся долголетним научным исследованием, несмотря на чрезвычайно частое применение этих препаратов в медицине. Ксенон, классифицируемый как благородный газ и анестетик, считается одним из самых безопасных вариантов общей анестезии у человека. Однако в нормобарических условиях он не анестезирует мух. Здесь мы создали простую экспериментальную установку, которая повышает давление окружающей среды до ~3 атм и позволяет изучать ксеноновую анестезию у одного из самых популярных модельных организмов — Drosophila melanogaster. Эта экспериментальная система дополнительно облегчает изучение других газов и их воздействия в гипербарических условиях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Два крайних аспекта поведенческих эффектов, наблюдаемых у животных при гипербарических условиях, — это судороги от кислорода и наркоз отазота 1,2. Любопытно, что когнитивные нарушения, такие как галлюцинации и нарушения памяти, фиксировались при использовании азота и водорода при давлении до уровнябессознательности 3,4. Анестезия, вызванная ксеноном, криптоном и закисью азота в гипербарических условиях, была зарегистрирована до 5,6.

Общая анестезия является краеугольным камнем медицины и явлением, представляющим значительный научный интерес. Несмотря на длительное и широкое применение, наше понимание того, как именно некоторые химические вещества вызывают временное отсутствие движения, памяти, боли и сознания остаётсяограниченным. Ксенон, будучи благородным газом, можно было бы назвать самым необычным представителем среди анестетиков. Он считается безопасным вариантом анестезии, обеспечивая быструю стимуляцию и восстановление, минимальные физиологические нарушения и лишь лёгкие побочные эффекты, такие как послеоперационнаятошнота 8,9.

Учитывая медицинское значение анестезии и необычные химические свойства ксенона, цель этого исследования — исследовать анестезию, вызванную ксеноном, с использованием простой животной модели Drosophila melanogaster. Проводилось множество исследований с использованием плодовых мушек для изучения общей анестезии, с множеством предложенных установок и применения различных летучиханестетиков 10,11,12,13. Однако сообщений о применении анестезии ксенона при дрозофиле не поступало. В нормобарических условиях ксенон не вызывает анестезию у Drosophila melanogaster, обычно известных как плодовые мушки. Для устранения этого ограничения исследование предлагает гипербарическую систему, позволяющую контролируемое управление окружающим давлением от 1 до примерно 4 атм. Было проведено несколько исследований с использованием гипербарических камер для ответа на похожие вопросы14, 15. Однако большинство коммерческих гипербарических камер оснащены прочными, протечными материалами, но при этом они имеют большой объём (~3 л), систематически сложны в эксплуатации и дорогие. Вместо этого метод, описанный в этой статье, прост и недорогой, позволяющий исследовать влияние различных газов и их комбинаций. Он обеспечивает установку, подходящую для мелких животных, таких как D. melanogaster и C. elegans.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка дрозофилы меланогастра

  1. Собирайте 20 самок и 20 самцов мух возрастом 1-3 дня для каждого эксперимента с использованием CO2.
  2. Отдыхайте выбранных мух в флаконе с едой не менее 24 часов перед экспериментом при температуре ~22 °C.

2. Доставка анестезии

  1. Пересадите газы из их баллонов в газовые контейнеры в герметичные газовые мешки для экспериментального использования. Для прямой передачи газа из контейнера в мешки используйте силиконовые трубки.
  2. Прикрепите силиконовую трубку диаметром 25 мм (3,4 мм диаметра) к полипропиленовой шприце. Затем подключите полипропиленовый шприц к газовым мешкам и к трёхстороннему отводу. Для ясности: полипропиленовый шприц будет называться шприцом #1 в остальной части текста.

3. Сборка гипербарической установки (рисунок 1)

  1. Расположите стол светодиодного света в горизонтальной ориентации на столе (длинный край горизонтально относительно поверхности стола).
  2. Разместите инъекционный насос рядом с одной из коротких сторон светодиодного стола, убедившись, что его ориентация позволяет экспериментальному шприцу выходить над подсветкой.
  3. Разместите камеру над установкой, чтобы покрыть область, где находится экспериментальный шприц.
  4. Вырежьте кремниевую трубку длиной 75 мм (диаметром 3,4 мм). Подключите трёхсторонний отвод к манометру с помощью силиконовой трубки от центрального сопла.
  5. Используйте пружинные хомуты шланга на сопле сбоку от манометра и трёхсторонний отвод, чтобы убедиться, что трубка плотно закрепилась.
  6. Используя кнопку, отмеченную двойной стрелкой в блоке управления насоса впрыски, установили скорость 80 мм/м и длительность 38 с для автоматического сжатия или декомпрессии поршня.

4. Процедура анестезии с помощью ксенона

  1. Ограничьте окружающий свет в экспериментальной комнате, включите светодиодный стол и установите яркость на уровне 3. Это помогает увеличить контраст в видео.
  2. Снимите поршень поликарбонатного шприца. Вставьте небольшое количество хлопка в сосок шприца, чтобы мухи не убегали. Для ясности: поликарбонатный шприц будет называться шприцом #2 в остальной части текста.
  3. Чтобы перенести 40 мух из флакона в шприц #2, сначала достаните крышку флакона и поставьте шприц вертикально сверху флакона. Фланец ствола должен сливаться с верхом флакона, чтобы мухи могли проникнуть в ствол шприца. Поверните конструкцию на 180° и постучите. Это поместит мух на дно ствола от шприца. Вставьте поршень обратно. Поместите шприц с мухами внутрь инъекционного насоса.
  4. Ориентируйте отметки от ствола от шприца сбоку, чтобы лучше видеть мух с точки зрения камеры.
  5. Закрепите шприц от ствола и головку поршня к насосу с помощью регулируемых винтов.
  6. Уберите хлопок с кончика шприца #2 и подключите его трёхсторонним отводом.
  7. Начинайте запись видео. Включи манометр. Поверните стоп-кран, чтобы соединить манометр с шприцом #2 и с помощью манометра подтвердите давление 0 кПа в шприце.
  8. Поверните трёхсторонний отвод в боковое положение, чтобы обеспечить обмен воздухом с шприцом перед экспериментом.
  9. Переместите поршень с отметки 20 на 2 мл с помощью ручного управления насосом, который предназначен для максимально быстрого выбора.
  10. Аспирируйте 18 мл анестетика из газового пакета в шприц #1. Соедините шприц #1 с трёхсторонним отводом от бокового люэрского порта. Для оценки правильного объёма 18 мл анестетика в общей смеси 20 мл даст 90% от доли газа. Это можно изменять в зависимости от желаемого итогового процента газа.
  11. Переместите поршень обратно на линию 20 мл с помощью ручного варианта впрыска насоса.
  12. Поверните стоп-кран, чтобы соединить манометр с шприцом #2. Обычно манометр показывает давление ~-3 кПа после заполнения анестетика.
  13. Двигайте поршень автоматически, с настройками скорости и времени на 80 мм/с и 38 секунд. Ожидается, что насос достигнет 5 мл бара ствола за 38 секунд. Когда поршень останавливается, максимальное давление должно составлять ~200 кПа.
  14. Оставьте поршень в положении 5 мл на 20 секунд. Обратите внимание на пиковое давление.
  15. Постучите шприцем, чтобы отогнать мух, цепляющихся за поршень, и они неподвижно оседают внизу.
  16. Начинайте автоматическую декомпрессию в конце 20-х секунд. Завершите эксперимент, когда поршень вернётся на 20 мл. Обратите внимание на итоговое давление для системы контроля утечки.

5. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте в качестве конечной цели использовалась анестетика. Движения мух количественно оценивались с момента начала декомпрессии поршня. Были разработаны два различных метода анализа: пиксельный анализ и отслеживание мух. Каждый метод анализа имел свои недостатки, которые обсуждаются в обсуждении.

  1. Анализ пикселей
    1. Используйте ScreenFlow для редактирования видео. Обрезайте каждое видео до области интересующего (ROI), то есть первых 5 мл ствола шприца.
    2. Обрежайте видео до первых 20 секунд после декомпрессии шприца. Экспортируйте отредактированные видео в виде GIF. Скопируйте GIF.
    3. Используя Fiji, удалите первый кадр из одного дубликата и последний кадр из другого. Для этого выберите Изображение > Видео редактирование > Удаление кадров.
    4. Сделайте каждый GIF бинарным на Фиджи, чтобы мухи выглядели белыми на чёрном фоне. Для этого выберите Процесс > Бинарный > Создать бинарный.
    5. Откройте оба GIF на Фиджи. Вычислите разницу пикселей между GIF-файлами. Для этого выберите Процесс > калькулятор изображения. Эта операция создаст GIF с разницей пикселей.
    6. Сохраните GIF разницы в пикселях. Проанализируйте частицу в разных GIF-файлах. Для этого выберите Анализировать > Анализировать частицы на Фиджи. Отрегулировать порог размера пикселей для увеличения отношения сигнал/шум.
    7. После анализа частиц Фиджи выводит CSV с разницей пикселей на кадр. Сохраните CSV. Данные CSV могут использоваться для отображения движения за кадр. Используйте кумулятивное движение по кадрам для назначения статистических различий между экспериментами.
  2. Отслеживание мух
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для метода отслеживания мух была использована технология искусственного интеллекта для обнаружения и отслеживания центра массы каждой мухи в экспериментальных видео. Для этого были объединены две модели: YOLO (You Look Only Once) для обнаружения и MASA (Matching Anything by Segmenting Anything) для отслеживания. Модели выполнялись на Google Colab с использованием GPU Tesla T4.
    1. Установите библиотеку Ultralytics YOLO в Colab, затем загрузите модель yolo11n.pt. Используйте CVAT (Computer Vision Annotation Tool) для аннотаций мух в кадрах, извлечённых из видео, затем экспортируйте набор данных в формате YOLO для обучения. Подробные процедуры установки и обучения описаны в онлайн-репозитории.
    2. Установите репозиторий MASA в Google Colab и внедрите фильтр Калмана для отслеживания объектов в последовательных кадрах. Интегрировать обученную модель обнаружения YOLO с фреймворком отслеживания MASA.
    3. Используйте FixTrack для ручного просмотра треклетов, сгенерированных объединённым конвейером MASA+YOLO. Определить и объединить неправильно фрагментированные треклеты или исправить несоответствия идентичности для получения непрерывных траекторий для отдельных мух. Подробные процедуры установки и обучения описаны в репозитории FixTrack.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод, описанный в этой статье, позволяет отслеживать как время, так и степень локомоторной активности у мух в гипербарических условиях. Такая конфигурация позволяет таким газам, как ксенон и закись азота, которые не обладают анестетическими свойствами в нормальных условиях, вызывать анестезию у Drosophila melanogaster. Чтобы продемонстрировать это, мы экспериментировали с разными концентрациями ксенона и воздуха. Мы начали устанавливать процесс с использованием 90% ксенона и 10...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Такая простая и недорогая система делает гипербарические поведенческие анализы у Drosophila широко доступными, позволяя проводить быстрые и воспроизводимые эксперименты без специализированных сосудов давления. Однако у него есть некоторые ограничения. Одним из важных компромиссов является более низкое максимальное давление по сравнению с существующими системами. Максимальное давление, которое мы можем вызвать с помощью такой схемы, составляет ~4 атм, тогда как сосуды под давлени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не сообщают о конфликтах интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было финансово поддержано фондом TBD (Tiny Blue Dot). Мы благодарим Дженнифер Сан и Тинг Лю из Google DeepMind за их помощь и советы по отслеживанию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Герметичные газовые мешки (0,5 л)Techinstro7440440
КамераAppleiPhone 15
Двойные пружинные хомуты для шлангаКарта источниковa24120200ux2109
Смесь пищи для дрозофилыПродвинутое земледелиеDM900
Drosophila melanogasterДарвин БиологLZ-210
Инжекторная трубаAitoserleaB09M8G5BQ8
Светодиодный столЛайриM1-3878368
МанометрДвайеромега477AV-8
Металлический трёхпозиционный запор сжатия гайки Sigma Aldrich Z182184
Поликарбонатный шприц (20 мл)DMC MedicalFD-1031NS
Полипропиленовый шприц (20 мл)BD301031
Силиконовая трубка
Ксеноновый газПромышленные газы Чэнду Тайюй

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bert, P. Barometric Pressure: Researches in Experimental Physiology. , College Book Company. Columbus, Ohio. (1943).
  2. Grover, C. A., Grover, D. H. Albert Behnke: nitrogen narcosis. J Emerg Med. 46, 225-227 (2014).
  3. Rostain, J. C., Lavoute, C., Risso, J. J., Vallée, N., Weiss, M. A review of recent neurochemical data on inert gas narcosis. Undersea Hyperb Med. 38, 49-59 (2011).
  4. Clark, J. E. Moving in extreme environments: inert gas narcosis and underwater activities. Extrem Physiol Med. 4, 1(2015).
  5. Lawrence, J. H., Loomis, W. F., Tobias, C. A., Turpin, F. H. Preliminary observations on the narcotic effect of xenon with a review of values for solubilities of gases in water and oils. J Physiol. 105, 197-204 (1946).
  6. Miller, K. W., Paton, W. D., Smith, E. B., Smith, R. A. Physicochemical approaches to the mode of action of general anesthetics. Anesthesiology. 36, 339-351 (1972).
  7. Mashour, G. A., Forman, S. A., Campagna, J. A. Mechanisms of general anesthesia: from molecules to mind. Best Pract Res Clin Anaesthesiol. 19, 349-364 (2005).
  8. Sanders, R. D., Franks, N. P., Maze, M. Xenon: no stranger to anaesthesia. Br J Anaesth. 91, 709-717 (2003).
  9. Law, L. S. C., Lo, E. A. G., Gan, T. J. Xenon anesthesia: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Anesth Analg. 122, 678-697 (2016).
  10. Krishnan, K. S., Nash, H. A. A genetic study of the anesthetic response: mutants of Drosophila melanogaster altered in sensitivity to halothane. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (21), 8632-8636 (1990).
  11. Zalucki, O., Day, R., Kottler, B., Karunanithi, S., van Swinderen, B. Behavioral and electrophysiological analysis of general anesthesia in 3 background strains of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 9, 7-15 (2015).
  12. Daplan, E., Turin, L., Skoulakis, E. M. C. Measuring the anesthetic response to chloroform and isoflurane in general anesthesia mutants in Drosophila melanogaster. Anesthesia Res. 2, 12(2025).
  13. Rodriguez, E., Peng, B., Lane, N. Anaesthetics disrupt complex I-linked respiration and reverse the ATP synthase. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1866, 149511(2025).
  14. Wlodarczyk, A., McMillan, P. F., Greenfield, S. A. High pressure effects in anaesthesia and narcosis. Chem Soc Rev. 35, 890-898 (2006).
  15. Koblin, D. D., et al. Minimum alveolar concentrations of noble gases, nitrogen, and sulfur hexafluoride in rats: helium and neon as nonimmobilizers (nonanesthetics). Anesth Analg. 87, 419-424 (1998).
  16. Thomas, J. J., Baxter, R. C., Fenn, W. O. Interactions of oxygen at high pressure and radiation in Drosophila. J Gen Physiol. 49, 537-549 (1966).
  17. Kent, D. W., Halsey, M. J., Eger, E. I. 2nd, Kent, B. Isoflurane anesthesia and pressure antagonism in mice. Anesth Analg. 56, 97-101 (1977).
  18. Gunning, C. FixtrackV2 at SingleVid. , Github. (2025).
  19. Allada, R., Nash, H. A. Drosophila melanogaster as a model for study of general anesthesia: the quantitative response to clinical anesthetics and alkanes. Anesth Analg. 77, 19-26 (1993).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Hyperbaric PressureXenon AnesthesiaDrosophila MelanogasterAnesthetic GasesBehavioral ResponsePressure ChamberVideo AnalysisPixel DifferenceFly MovementModel Organisms

Похожие статьи