Эффективная регенерационная трансформация бесполого амфибийного вида Brassicaceae, Rorippa aquatica

Краткое содержание

Мы представляем эффективный, оптимизированный протокол для трансформации бесполого амфибийного вида рода Brassicaceae, Rorippa aquatica, опосредованной агробактериями, без ресурсоёмких процедур стерильной культуры тканей. Использование маркера визуальной трансформации и трубопровода регенерации побегов успешно создало близкие клональные трансформаторы, что способствовало будущим исследованиям адаптации растений к подводной среде.

Аннотация

Стабильная генетическая трансформация растений, опосредованная Agrobacterium tumefaciens, стала мощным инструментом для фундаментальных исследований в области биологии растений, а также для биотехнологий растений, которые напрямую влияют на улучшение культуры. Простые и эффективные конвейеры трансформации, такие как метод погружения в цветы для Arabidopsis, значительно продвинули масштабный анализ функции генов. Однако такой конвейер нельзя применять к видам растений, не проходящих полового размножения. Rorippa aquatica — это зарождающийся вид амфибийных рода Brassicaceae, демонстрирующий гетерофиллические резкие изменения формы листьев и растений в наземной или подводной среде. R. aquatica размножается исключительно вегетативно. Оптимизированный конвейер, представленный здесь, обеспечивает эффективную и надёжную трансформацию R. aquatica, опосредованную агробактериями, которая не требует стерильной культуры тканей. Листовые черенки кратковременно погружаются в Agrobacterium, подвешенный в буфере трансформации, содержащем двойной вектор, экспрессирующий визуальный маркер RUBY под конститутивным промотором. Затем инокулянты выращивают на фильтрующей бумаге, пропитанной водой, в камере роста. Затем регенерирующие растения с RUBY красной пигментацией отделяют и сажают в почву. Эти начальные регенеранты T1 (R1-T1) экспрессируют красные сектора. Путём вырезания красного сектора и повторения этапов регенерации в следующем поколении R2-T1 образуется большое количество трансгенных родственников, некоторые из которых почти равномерно красные; что свидетельствует о выражении RUBY. Этот простой процесс трансформации может быть принят для R. aquatica и, возможно, других растительных видов, размножающихся вегетативно, чтобы ввести интересующие гены и исследовать их функции в адаптации к наземным и к Водные среды.

Введение

Стабильная генетическая трансформация, то есть введение и экспрессия генов, представляющих интерес для конкретного вида растений, является ключевым элементом фундаментальной науки о растениях и биотехнологии растений. Преобразование, опосредованное Agrobacterium tumefaciens, является самым широко используемым способом генной инженерии растений благодаря надёжному созданию стабильных^{трансформаторов 1}. Разработка бинарной векторной системы, в которой клонирующий вектор T-ДНК и обезвооружённая плазмида vir helper разделены на две части, произвело революцию в трансформации, опосредованной агробактериями ^1,2. Для модельного растения Arabidopsis thaliana простая и экономичная процедура трансформации цветочного погружения позволила получить высокопроизводительную генерацию клональных (гемизиготных) трансформантов для функциональной генетики и^{геномики 3,4}. Однако такой подход невозможен для растений, которые преимущественно или исключительно размножаются вегетативно.

Амфибийные растения обладают уникальной способностью процветать как в наземных, так и в водных (подводных)^{условиях 5}. Rorippa aquatica — это амфибийный вид рода Brassicaceae, проявляющий гетерофиллию. В наземной среде у R. aquatica формируются круглые листья с эпидермисом, состоящим из клеток покрытия и устьица. В отличие от эпи, их водные листья обладают морфологией, хорошо адаптированной к подводной среде: сильно разрезанные игольчатые листья с эпидермисом без кукулированных клеток покрытия или^{устьица 6,7}. Филогенетически R. aquatica тесно связана с Arabidopsis thaliana; оба относятся к одному семейству — Brassicaceae⁶. Вместе с доступностью данных о последовательности целого генома и высокой степенью сохранения кодирующих генов между R. aquatica и A. thaliana, R. aquatica служит зарождающимся амфибийным модельным растением для изучения молекулярной основы адаптации к суше и^{воде 8}. Действительно, недавние физиологические и экспрессионные исследования генов показывают, что перенастройка световых и гормональных сигнальных путей критически важна для гетерофиллии R. aquatica ^7,8.

Для проверки молекулярных функций кандидатных генов и путей генетическая трансформация абсолютно необходима. R. aquatica размножается вегетативно в природе ^8,9. Поэтому, в отличие от A. thaliana, преобразование цветочного погружения Agrobacterium нельзя применять к R. aquatica. Удивительно, но R. aquatica легко восстанавливает целые растения из отложенных листьев без экзогенного добавления фитогормонов¹⁰. Кратко, в течение нескольких дней после отрыва сегмента листа пролиферация клеток становится активной в сосудистой ткани на проксимальном конце разрезанной поверхности. В течение недели и корни, и побеги восстанавливаются, в итоге образуя молодые растения (розетки). Отдельные растения можно разделить и вырастить до^{зрелости 10}. Этот спонтанный процесс регенерации целых растений легко используется для генетической трансформации R. aquatica.

Оптимизированный конвейер, описанный здесь, обеспечивает эффективную и надёжную трансформацию R. aquatica, опосредованную агробактериями, используя её способность к спонтанной регенерации после отрыва листьев. Для простого отбора трансформаторов без дорогостоящих стерильных культурных процессов был принят неинвазивный маркер визуального отбора RUBY — синтетический вектор с тремя генами, приводящим к биосинтезу ^{беталаина 11}. Оптимизируя условия бактериальной культуры, этапы инокуляции и инкубационные процессы черенков листьев для регенерации, были получены надёжно трансгенные растения R. aquatica до зрелости. Почти все начальные трансформанты поколения R1-T1 имеют красные сектора, что указывает на их гетерогенные генетические мозаики. Вырезая секторы красных листьев RUBY+ и повторяя процессы регенерации, становится возможным появление полностью красных розеток, то есть почти клональных трансформаторов R. aquatica при последующем генерировании R2-T1. Этот процесс трансформации легко применяется для введения и экспрессии интересных чужеродных генов в R. aquatica, тем самым ускоряя молекулярно-генетические исследования гетерофиллии и адаптации растений к экстремальным условиям.

Протокол

Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка растительных материалов

1. Вырезать и вырезать, полностью лопасть, зрелые здоровые листья на кусочки длиной 1-2 см из двухмесячных, зрелых материнских растений (рисунок 1A).
2. Выложите лоток для размножения растений (20 x 30 см Perma Nest Trays) двумя слоями сложенных бумажных полотенец автоклавом. Намочите бумажные полотенца стерильной водой, чтобы сверху оставался тонкий слой воды.
3. Размещайте черенки адаксиальной стороной вверх, с пространством вокруг каждого экспланта, чтобы избежать перекрытия (рисунок 1A).
4. Слегка опрыскивайте черенки и плотно накройте лоток пищевой пленкой.
5. Поместите лотки в камеру роста при температуре 25 °C–28 °C с 16 чами света и 8 ч. тёмного периода во влажных условиях и при интенсивности освещения 50 мкмоль/^{м, 2}/с.
6. Проверяйте и поддерживайте чистые, влажные лотки для размножения 2-3 раза в неделю.
   1. Добавьте стерильную воду, чтобы сохранить тонкий слой воды поверх насыщенных бумажных полотенец.
   2. Замените пластиковую плёнку, которая потеряла адгезию и/или имеет признаки загрязнения (например, видимая мутность воды).
7. Используя микроножницы или скальпель, аккуратно вырезайте восстановленные, здоровые отдельные розетки, которые дают и побег, и корень в период от 14 до 21 дня после установления (рисунок 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения одного цвета розетки с целыми побегом и корнем требуется аккуратное удаление. Розетки Rorippa густо размножаются вдоль пересечения экспланта листа и средней жилки, что усложняет идентификацию отдельных розеток. Побег розетки растет адаксиально, а корни растут под поверхностью листьев, что усложняет видимость всего цвета розетки (рисунок 1B).
8. Пересаживайте отдельные розетки в горшки с влажной почвенной средой (соотношение 2:1:1 почвенной смеси: вермилькулит: перлит), дополненной медленно высвобождающим удобрением (рисунок 1B).
9. Полийте водопроводной водой, добавленной 0,25 г/л гранулированного удобрения NPK и накройте куполом для влажности или пластиковой пленкой для поддержания влажности.
10. Поставьте лотки в камеру роста при предварительных условиях (25 °C–28 °C при 16 чах света и 8 ч. тёмном периоде при влажных условиях и интенсивности света 50 мкмоль/^{м² 2}/с)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно сохранять влажные условия почвы. Держите тонкий слой воды под пересадками в горшечках.

2. Культуры агробактерий для трансформации

1. Streak A. tumefaciens — штамм GV3101, содержащий Ti-плазмиду pMP90 (pTiC58DT-ДНК), содержащую вектор RUBY на пластине LB объемом 30 мл, содержащую рифампицин (0,03 мг/мл), гентамицин (0,025 мг/мл) и спектиномицин (0,05 мг/мл), и растёт при 28°C в течение 48-72 часа, пока не появятся отдельные колонии.
2. Выберите одну колонию и инокулятируйте 5 мл бульона МГ/л с добавлением биотина и предшествующих селективных антибиотиков (Таблица 1), инкубировать в вращающемся шейкере при температуре 28 °C при 200 об/мин в течение 16 часов.
3. Перенесите инокулюм в коническую колбу с бульоном 250 мг/л и инкубировать в вращающемся шейкере при 28 °C при 200 об/мин в течение 16 часов.
4. С помощью спектрофотометра убедитесь, что жидкая культура имеет минимальный коэффициент_{OD 600} 1,2. Гранулируйте бактерии с центрифугированием при 3396 x g в течение 10 минут при комнатной температуре (примерно 22 °C). Добавьте бульон из инокулума 200 мкм ацетосирингона (AS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аликвоты фильтр-стерильных AS готовятся в DMSO при рабочей концентрации 100 мМ и хранятся при -20 °C. Бульон из инокулюма нужно готовить свежим. AS добавляется непосредственно перед этапом центрифугации для минимизации деградации. Описания и компоненты медиа приведены в Таблице 1.
5. Чтобы избежать прямого нарушения бактериальной гранулы, выбросьте супернатант и снова подвесьте гранулу в бульоне инокуля.
6. Ручно покрутите колбу так, чтобы раствор имел_{OD 600} примерно 0,8.
7. Инкубировать инокулум на шейкере при 90 об/мин в течение 2,5 часов при температуре окружающей среды (примерно 22 °C).
8. Зафиксировать соответствующие условия (Культура и Инокулюм_{OD 600}, концентрацию AS и количество поверхностно-активного вещества, период инокуляции и количество экспериментальных единиц, необходимых для эффективности трансформации).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация бактерий и ресуспензионных культур необходима для максимизации эффективности трансформации при минимизации чрезмерного роста бактерий. Перед центрифугированием убедитесь, что бактериальная культура имеет минимум OD600 1,2; ресуспензировать до OD600 при уровне 0,8. Изменения в индукционном бульоне оптимизированы для улучшения трансформации без ущерба жизнеспособности регенератора. Рекомендуемые концентрации — 150-225 мкм для AS и 0,005% для поверхностно-активного вещества.
   ВНИМАНИЕ: Утилизируйте все трансгенные бактерии и растения в специализированные контейнеры для биологических отходов.

3. Преобразование черенков листьев R. aquatica

1. Пока культура ресуспензии инокулума проходит инкубацию, выберите несколько двухмесячных растительных растений, которые демонстрируют здоровые листья с целыми краями.
2. Подготовьте лоток для размножения растений (20 x 30 см Perma Nest Trays) с двумя слоями автоклавных бумажных полотенец. Складывайте бумажные полотенца. Намочите бумажные полотенца стерильной водой, чтобы сверху оставался тонкий слой воды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Создайте отрицательный контрольный лоток, в котором невакцинированные экспланты подвергаются идентичным условиям окружающей среды.
3. Убедитесь, что лабораторный стол оснащён 100-500 мл_{ddH 2}O, стерильными контейнерами, соответствующими ожидаемому объёму повторно суспензированного инокуля, микропипеткой и наконечниками.
4. Перед окончанием инкубационной фазы быстро вырежьте десять листьев у основания черешка из выбранных плодовых растений. Поместите эксплантаты в чашку Петри с стерильной водой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для инокуляции листьев крайне важно использовать свежеудаленную ткань, чтобы избежать их высыхания.
5. Через 2,5 часа пипетка 50 мкл поверхностно-активного вещества в раствор восстановленной суспензии объёмом 1 л (концентрация поверхностно-активного вещества 0,005%) и аккуратно прокрутите колбу для смешивания (рисунок 2A). Обеспечьте доступность лотка для размножения для размещения эксплантов после прививки (рисунок 2B).
6. Разместите абаксиальную сторону листа вверх и разрежьте перпендикулярно вдоль средней жилки на части длиной 1 см с помощью скальпеля (рисунок 2C).
7. Немедленно поместите свежесрезанные листья в трубку объёмом 50 мл, подходящую для вращающегося миксера, чтобы использовать их в качестве эксплантов для инокуляции.
8. Залить инокулюм в эксплантную трубку в определённом объёме, чтобы насыщить весь материал, а затем перемешивать в ротационном миксере 10 минут при комнатной температуре для инокуляции (рисунок 2D, E).
9. Удалите все инокуляционные листья из раствора щипцом и напрямую положите их в подготовленный лоток для размножения.
10. Отдельте и разложите промокшие экспланты так, чтобы они частично, но не полностью погружены в тонкий слой воды поверх пропитанных бумажных полотенец (рисунок 2F).
    ВНИМАНИЕ: Поддерживайте асептические условия и избегайте контакта с поверхностями или инструментами, используемыми во время процедур Agrobacterium до их дезинфекции.
11. Запечатайте каждый лоток пластиковой пленкой и инкубуйте в темноте при температуре окружающей среды (22°C) в течение трёх дней.
12. После завершения периода тёмного запечатайте лотки прозрачной пластиковой пленкой и дополните их_{ddH 2}O для поддержания уровня влажности.
13. Переместите лотки для инокуляции в камеру роста при условиях вегетативного размножения.
    ВНИМАНИЕ: Консолидирайте отходы инокулума в контейнере для отходов, обработайте их раствором 10% отбеливателя и утилизируйте согласно рекомендациям по биобезопасности.

4. Регенерация розеток и создание поколения R1-T1

1. Проверяйте лотки для инокуляции 2-3 раза в неделю, чтобы убедиться в чистых и влажных условиях.
   1. Добавьте_{ddH 20}с помощью бутылочки для сжимания. Если есть возможность, перед повторным запечатыванием лотков нанесите туманом с помощью пульверизатора.
   2. Поддерживайте высокую влажность, заменяя пластиковую плёнку, которая потеряла адгезию или имеет признаки загрязнения (например, видимую мутность воды).
2. Визуально осмотрите регенерированные розетки на предмет пригодности для пересадки. Идеальные регенеранты демонстрируют целый побег с множеством листьев и корней длиной не менее 2–3 мм (рисунок 2G).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трансгенные розетки обычно восстанавливаются медленнее, обычно достигая пригодности для пересадки через 21-28 дней после размещения в камере роста.
3. Исключить и пересадить целые трансгенные розеточные растения при тех же условиях, что и клональные регенеранты WT.
4. (По желанию) Записывайте количество регенерированных трансформаторов и коррелируйте с их условиями трансформации для оценки эффективности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте особенно осторожны при отборе. Трансгенные регенеранты часто малы и легко упускаются из виду. Тщательно осматривайте как адаксиальные, так и абаксиальные поверхности листьев с помощью щипцов, чтобы максимизировать выход и минимизировать повреждения.
5. Используйте акцизную розетку, избегая прикосновения к трансгенным листьям. Обрезайте лишнюю листву непосредственно вокруг трансгенного листа. Пересаживайте по одному растения в горшок.
6. Быстро удобряйте, полите и опрыскайте каждое растение, а затем поместите под пластиковый купол для сохранения влажности (рисунок 2G,H).
7. Маркируйте и записывайте каждую трансгенную сеянку.
8. Возвращайте экспланты, содержащие трансформаторы, у которых нет побегов, корней или они кажутся слишком маленькими для пересадки в лоток для дальнейшего отсечка. Пересадите дополнительные трансформаторы, когда рост достателен.
9. Пересадка тумана и воды ежедневно в течение первой недели. Убедитесь, что в лотке всегда есть вода.
10. Удалять и утилизировать любые трансплантаты, которые уже устарели или больше не проявили экспрессию пигмента RUBY.
    ВНИМАНИЕ: Утилизировать все трансгенные материалы в соответствии с институциональными нормами биобезопасности.

5. Последующая регенерация и создание почти клонального поколения R2-T1

1. После того как розеточные растения развиваются в крупные, здоровые растения (2 месяца), с одного саженца выделяют расширенные листья, экспрессирующие RUBY, (рисунок 2H).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя листья, экспрессирующие RUBY, могут выглядеть равномерно красными, чаще всего они химерные. Оба фенотипа подходят для распространения. На следующих этапах применяйте стандартные методы вегетативного размножения.
2. Разделите преобразованные листья и положите их в лоток для размножения. Чётко маркируйте каждый лоток для размножения соответствующим идентификатором донора саженца.
   ВНИМАНИЕ: Не смешивайте листья нескольких рассадов в одном лотоке. Каждое сеянце представляет собой уникальное трансгенное событие и должно отслеживаться как отдельное поколение.
3. Пересадка регенерировала растения R2-T1 (через 14-28 дней после размножения). Присваивать каждому растению новый идентификатор, отражающий его второй статус. Продолжайте стандартный уход после трансплантации, как описано ранее (рисунок 2I, J).

Результаты

Параметры трансформации A. tumefaciens были оптимизированы для успешного получения трансгенных растений R. aquatica, экспрессирующих RUBY, обходя ограничения, основанные на стерильности, при этом используя их быструю скорость бесполой регенерации (см. рисунок 1 и рисунок 2). После того как листовые экспланты были инокулированы и подвергнуты последующему 72-часовому темному обработке, регенерированные растения начали расти в течение 2 недель при описанных условиях. Регенерированные растения с химерными RUBY секторами, достаточно крупными для пересадки, были обнаружены через 3–5 недель после инокуляции (рисунок 3) и были несколько меньше, чем неэкспрессирующие розетки. На контрольных, диких лотках, регенерированных RUBY, не было обнаружено, что подтверждает, что это явление отличается от физиологии R. aquatica. Тип бульона бактериальной культуры, тип бульона с ресуспензией, способ инфильтрации и период инокуляции существенно не различались по способности или скорости генерации трансформаторов (Таблица 2 и Таблица 3). Факторы лечения, положительно влияющие на эффективность трансформации, включали повышение концентрации АС и обработку воздействием ауксина перед инокуляцией эксплантаций листьев. Повышенная концентрация поверхностно-активного вещества негативно повлияла на выход и была признана неподходящей.

Версия R 4.4.2 12,13,14,15 использовалась для анализа данных по количеству растений розеток по Пуассонской общей линейной смешанной модели (Poisson GLMM). Однако в эксперименте D (Таблица 2D), где регенеранты, экспрессированные в RUBY, изучались для 15-минутной инокуляции с дополнением 150 мкм AS или 225 мкм AS, модель нарушила предположения, вызванные недостаточной дисперсией, и вместо этого был применён отрицательный биномиальный GLMM.

Тщательно изучалось влияние различных условий бактериального бульона и культуры на эффективность трансформации. Среди пяти экспериментальных репликатов использование бульона LB Миллера или специфичного для трансформации бульона MG/L приводило к тому, что трансформаторы экспрессировали RUBY при почти идентичных параметрах и не отличались существенно по эффектам (Таблица 2A). Способы экспрессирования регенерированных розеток RUBY из отдельных листьев, состоящих из 15-60 эксплантов на обработку, варьировались от 1,61 ± 0,71 регенерантов, полученных в экспериментах с использованием бульона с ресуспензией LB и не на основе MS (контрольный индукционный бульон, таблица 1), и 3,23 ± 1,13 регенерантов из этих экспериментов с использованием MG/L и оптимизированного индукционного бульона. Несмотря на отсутствие значительной разницы, благодаря субъективным наблюдениям, для будущих экспериментов по оптимизации были выбраны культура MG/L и Оптимизированный индукционный бульон (Таблица 1).

Далее мы протестировали факторы, влияющие на бактериальную нагрузку и возможность доступа к меристематическим тканям растений. Среди восьми репликий (Таблица 2B) инокуляционные экспланты с повышенной концентрацией поверхностно-активного вещества на 0,01% через месяц проявили сильный стресс, что привело к появлению малых, в основном нежизнеспособных регенерантов. Среди этих репликантов, по-видимому, не было регенерированных трансформантов, хотя фенотип эксплантов был бордовым, коричневым и жёлтым пигментацией, поэтому могли быть потенциальные трансформанты. В любом случае, нежизнеспособность регенерантов подтверждала поддержание концентрации поверхностно-активного вещества 0,005%.

Сравнивались два механистических метода — перемешивание или вакуумная инфильтрация — по их эффективности для введения нужной ДНК в растение-хозяин. Метод контрольной инфильтрации, при котором экспланты погружались в 50 мл ресуспензированного инокулюма и вращались в трубчатом миксере, оказался успешным в получении регенерантов, экспрессированных на RUBY, во всех перечисленных видах обработки. Применённая вакуумная инфильтрация также давала регенеранты, экспрессированные на RUBY, но не отличалась по эффективности преобразования по сравнению с методом контроля (p = 0,478, Таблица 2D). Было обнаружено примерно 2-5 регенерантов, экспрессированных в RUBY, в каждом лотоке для распространения, независимо от того, инокуляцировались ли они через вакуумную инфильтрацию или физическое перемешивание.

Изменённая концентрация бактериального инокулума в ацетосирингоне (AS) явно отличалась по влиянию на эффективность трансформации. Повышение концентрации AS с 150 мкм до 225 мкм значительно улучшило производство экспрессирующих трансгенных эксплантов RUBY (p = 0,000309, 0,000458; Таблица 3C,D). Среди четырёх экспериментов каждое лечение состояло из лотка с 40 идентично обработанными инокуляционными эксплантами. Вакцинированные в более высокой концентрации содержали в среднем почти 5 регенерантов с экспрессией RUBY вместо 1 трансформатора на контрольный лоток AS (Таблица 3C). Кроме того, эффект АС, по-видимому, был отделен от периодов длительности прививки.

Среди трёх экспериментов с длительностью инокуляции по 15 минут, с эксплантами, дополненными 225 мкм AS, было обнаружено среднее значение 7,28 ± 4,13 регенерантов, экспрессированных в RUBY, что явно выше, чем при обработке 150 мкм, где скорость регенерации 2,03 ± 1,32 (Таблица 3D). Не наблюдалось явного влияния на временной интервал между контрольными процедурами AS с 150 мкм (p = 0,676), при которых средняя скорость инокуляции за 10 минут составляла 1,48 ± 0,954 по сравнению с 1,84 ± 1,230 регенерантов при 15-минутных инокуляциях (Таблица 3B). Аналогично, инокулянты, обработанные с 10 минут, 225 мкм, регенерировали примерно 5 растенцов RUBY экспрессированных розеток за одну обработку, что явно не отличалось от 15-минутных обработок инокулянтами, где для лечебного лотка было указано 6-7 регенерантов (Таблица 3A).

Кроме того, был протестирован растенный гормон ауксин, который способствует регенерации растений в целом. Подвержение обработке с помощью импульсного ауксина на свежевырезанные части листьев перед прививкой явно положительно повлияло на повышение регенерации RUBY по сравнению с теми, что были в_{ddH 2}O (p = 0,00969, Таблица 2C). При помещении в_{ddH 2}0 с добавлением 285 мкм индол-3-уксусной кислоты (IAA) экспланты демонстрировали среднюю скорость преобразования 6,67 ± 1,490 за обработку по сравнению с безауксиновой обработкой, которая составляла среднюю скорость регенерации 2,00 ± 0,816.

Немедленно регенерированная трансгенная линия получила обозначение как поколение R1-T1 (рисунок 2), с отдельными регенерантами в качестве линий. Все начальные розетки R1-T1 проявили экспрессию RUBY в виде химерных листьев с разнообразными химерными узорами. Чаще всего 1-3 листья растениц экспрессировали отдельные химеры, где RUBY-экспрессированная и неэкспрессированная ткань расходились в средней жилке. Большинство месячных саженцев R1-T1 сохраняли химерную экспрессию (рисунок 3A), но было обнаружено небольшое количество полностью экспрессирующих RUBY.

Бесполые химерные секторы с RUBY-пигментом из листьев рассадников R1-T1 (рисунок 3B) восстанавливались либо полностью RUBY, либо химерные расцветки розеток R1-T1 в течение 2-4 недель после удаления (рисунок 3C). Через месяц у большинства саженцев R2-T1 преимущественно были листья RUBY, а некоторые — невыраженные химерные участки (рисунок 3D, E).

Рисунок 1: Протокол вегетативного распространения и хронология . Репрезентативные изображения иллюстрируют производственный процесс, используемый для регенерации бесполых розеток. (A) Удаление зрелых, здоровых, целых лопастных листьев из устоявшихся материнских растений и разрезание их на 2-3 части. (B) Размещение эксплантов в лоток для размножения и содержание их в определённых условиях. Через 3 недели розеточные плантки были вырезаны из эксплантов и пересажены в почвенную почву. Ниже приведена настоящая фотография регенерированных розеток, всё ещё прикреплённых (розовые стрелки) к материнскому черенке листа. Эти растения находятся на оптимальной стадии для пересадки. Масштабная планка: 10 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Преобразование черенков листьев R. aquatica и регенерация трансформаторов, экспрессирующих транскрипты RUBY . Графический обзор процедуры трансформации и производства преобразованных регенерантов. (A) Получение бактериального инокулума. (B) Подготовка лотка для размножения с стерильной фильтрующей бумагой и водой. (C) Вырезание листьев на эксплантные детали. (D) Погружение эксплантов в инокулум. (E) Перемешивание в ротационном миксере 20r/1 min в течение 10 минут. (F) Размазывание насыщенных эксплантов в лотоке, покрытие пластиковым куполом и инкубация в тёмных условиях 72 часа. (G,H) Через месяц удаление целостных трансформированных регенерантов из эксплантов, воздействовавших агробактериями, и пересаждение для установления зрелых растений. (I,J) Повторяя этап распространения (G,H), чтобы получить почти клональное образование R2-T1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Бесполые поколения трансгенной линии RUBY.(A) Зрелый саженец R1-T1 с химерными листьями с экспрессией RUBY. Чешуйка: 1 см. (B) Два из двадцати эксплантов, только что помещённых в лоток для размножения из трёхмесячного саженца, показанного в (A). Экспланты демонстрируют химерный рисунок RUBY, разделённый в средней жилке. Чешуйка: 1 см. (C) Регенерированные розетки R2-T1 с разной степенью экспрессии химерного RUBY через месяц после удаления, перед пересадкой. Восстановленные RUBY положительные корни (стрелка маррона). Полоса чешуи: 2 см (D) Саженец R2-T1 показан через 1 месяц после пересадки, демонстрирует экспрессию RUBY. Полоса чешуи: 2 см (E) Зрелый саженец R2-T1 через 3 месяца после пересадки, с небольшими секторами (зелёные стрелки). Масштабная полоса: 2 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Блок-схема оптимизированного конвейера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Медиа-формулы Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Влияние четырёх параметров оптимизации на эффективность преобразования R. aquatica. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Влияние концентрации ацетосирингона в инокуляре на эффективностьтрансформации R. aquatica. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

В этом исследовании мы установили простое, прямое регенерационное стабильное преобразование R. aquatica — амфибийного растения рода Brassicaceae, которое размножается исключительно^{бесполым путём 10,16}. Тщательная система трансформации вегетативно размножаемых амфибийных растений не была создана, и практическая трансформируемость R. aquatica не использовалась с помощью визуального маркера. В частности, этот конвейер не требует трудоёмкого стерильного процесса культуры растений или специализированных инкубаторов для роста растений. Таким образом, этот протокол может широко применяться в различных экспериментальных условиях — от научных лабораторий до учебных классов.

Среди различных испытанных условий инокуляции и инкубации несколько факторов значительно повысили эффективность трансформации. Примечательно, что немного более высокая концентрация ацетосирингона (AS), а также концентрация индол-3-уксусной кислоты (IAA) положительно повлияли на эффективность трансформации (Таблица 1 и Таблица 2). AS — это фенольное соединение, привлекающее агробактерии, и доказано, что оно повышает эффективность трансформации растений у Arabidopsis¹⁷. Фитогормон ауксин является центральным элементом перепрограммирования клеток растений. Во время регенерации, вызванной раной, наблюдалось быстрое увеличение экспрессии генов, связанных^{с ауксином 10}. По этой причине можно предположить, что экзогенно нанесённый ауксин (IAA) во время инокуляции экспланта повышает эффективность регенерации. Однако различия в наблюдаемом числе восстановленных растений в трёх исследованиях не наблюдались (57 7,55 против 59,67, 5,51 в контроле против лечения). Поэтому обработка ауксинами, скорее всего, способствует процессу трансформации, а не самой регенерации.

Неионный поверхностно-активный вещество, алкоксилированный трисилан (известный как Silwet L-77), значительно повышает эффективность трансформации Arabidopsis с помощью метода цветочного^{погружения 3}, и поэтому широко используется в сообществе биологии растений. Минимально наблюдался стресс растений среди эксплантов, скорректированных с Silwet L-77 на уровне 0,005% (рекомендуемая концентрация для цветочного опускания). При удвоении этой дозы (0,01%) черенки листьев R. aquatica были сильно повреждены, что привело к практически отсутствию трансформаторов (Таблица 2B). Во время погружения в цветы Arabidopsis использование поверхностно-активных веществ снижает поверхностное натяжение инокулянтов и улучшает доступ к цветочным бутонам. В отличие от этого, как амфибийный вид растений, R. aquatica развивает гладкие листья без трихом и толстых^{кутикул 5}. Увеличение количества поверхностно-активного вещества вызвало повреждение тканей листьев, что указывает на то, что для эффективности трансформации в непубертатных тканях листьев следует уделять приоритетное значение, кроме поверхностно-активного вещества. Поверхностно-активное вещество более актуально для пубертатного фенотипа, где оно способствует проникновению тканей. После интеграции всех протестированных параметров предоставляется конвейер с наиболее оптимальными условиями в виде блок-схемы (рисунок 4).

Использование визуального маркера RUBY играет ключевую роль в этом процессе трансформации. RUBY — это синтетический репортер, кодирующий три кодирующих гена (CYP76AD1, DODA и глюкозилтрансфераза), которые синтезируют ярко-красный пигмент — беталайн¹¹. Когда экспрессия RUBY наблюдалась у регенерантов R1-T1, она проявилась в виде красных секторов, что указывает на то, что они, скорее всего, являются химерными (см. рисунок 2 и рисунок 3). Предыдущее исследование показало, что регенерация R. aquatica происходит от сосудистого камбия срезанного^{листа 10}. Примечательно, что регенеранты R1-T1 иногда имеют химерную границу вдоль средней жилы, при этом половина листки красная, другая половина зелёная (рисунок 3A,B). Регенерация из секторов RUBY иногда давала полностью красные растения с красными корнями (рисунок 3C, бордовая стрелка), которые затем выращивались в равномерно красные растения R2-T1 (рисунок 3D). Побочных эффектов избыточной экспрессии RUBY на рост и развитие R. aquatica не наблюдалось (рисунок 3). В подтверждение отсутствия заметных различий в размере и форме листьев розеток R1-T1 с RUBY секторами (например, рисунок 3B) не наблюдалось. Возможно, что любой сильный, конститутивный трансген, управляемый промотором, может мешать нормальному росту растений и физиологической реакции.

В некоторых случаях эти «близкие клональные» растения RUBY развивали зелёные сектора (рисунок 3E, зелёные стрелки), что указывает на реверсию или заглушание трансгенов. Это указывает на то, что наличие видимого маркера, такого как RUBY , необходимо для экспрессии эктопической экспрессии или подавления (например, РНКи) интересующего гена для будущих молекулярных, механистических исследований. Можно ввести интересный трансген в кассету RUBY и наблюдать фенотипы в красных секторах RUBY . В заключение, используя прямое перепрограммирование, вызванное обрезкой листьев, и неинвазивный видимый маркер, оптимизируется простой и эффективный конвейер преобразования для R. aquatica — растительно размножающегося рода Brassicaceae. Хотя это выходит за рамки данного протокола, будущее понимание точного происхождения регенерации трансформированной R. aquatica может дать представление о клеточном перепрограммировании у растений.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1000 и микро; Наконечники LTS с фильтром LTS с низким удержанием	Рейнин	30389213
Ацетосирингон	Сигма-Олдрич	D134406-1G
Экстракт дрожжей Bacto, технический	Fisher Scientific	DF0886-17-0
BD Бакто Агар	Fisher Scientific	214030
BD Difco LB Broth, Миллер	Midland Scientific	DIFCO 244610
Дегидратированный триптон BD Bacto	Fisher Scientific	DF0123-17-3
Биотин-лиофилизированный порошок	Сигма-Олдрич	B4501-100MG
Прозрачные купола для лотков PermaNest	Решение производителя	GD221
Прозрачная пластиковая плёнка	Томас Сайентифик	22-305654
Грубый вермикулит	Бектин
ди-Калий-гидрофосфат бесводный	Сигма-Олдрич	105109
Одноразовые чашки Петри размером 100 x 15 мм	VWR International	25384-342
D-Mannitol	Сигма-Олдрич	M9546-250G
Этанол, 200 доказательств	Fisher Scientific	04-355-720
Конические центрифугные трубки Falcon объёмом 50 мл	Fisher Scientific	14-432-22
Сложенные бумажные полотенца 9.3" x 10,5"	Кимберли-Кларк	2920
Видимый спектрофотометр GENESYS 30	Thermo Scientific	840-277000
Раствор гентамицина	Сигма-Олдрич	G1272-100ML
Гидрат мононатриевой соли L-глутаминовой кислоты	Сигма-Олдрич	G1626-100G
Хлорид магния	Сигма-Олдрич	M8266-100G
Сульфат магния, гептагидрат	Сигма-Олдрич	M9546-250G
MaxQ 6000 Incubator Shaker	Thermo Scientific	SHKE6000
MES hydrate	Сигма-Олдрич	M8250-100G
Смесь базальной соли Murashige и Skoog (MS), порошок	Сигма-Олдрич	M5524-50L
MX-RL-pro: ротиссерийный ротатор с трубкой	Scilogex	824222019999
мио-Инозитол	Сигма-Олдрич	I7508-100G
Камера роста Персиваля	Персиваль	AR36L3
Перлитовая добавка для почвы для посадки	PVP Industries	PVP105408
Лотки для растений для постоянного гнезда размером 8''x12''	VWR International	470150-476
pH-метр Seven Compact 5220	Меттлер Толедо	30019028
Защищённый скальпель	Fisher Scientific	02-688-79
Рифампицин	Сигма-Олдрич	R3501-5G
Питание для растений с умным высвобождением удобрений	Осмокот	B0071CZTBA
Хлорид натрия	Fisher Scientific	S271-3
Спектиномицин дигидрохлорид пентагидрат	Сигма-Олдрич	S4014-5G
Распылители с насосным испарителем	Томас Сайентифик	1141V43
Квадратные 3,5-дюймовые горшки	Growers Nursery Supply Inc.	03GA-0350S
Сахароза	Сигма-Олдрич	S0389-5KG
Sunshine #4 Профессиональная почва для выращивания	Садоводство Sun GRO	1341CFL0028P S
ПАВ — Silwet L-77	Fisher Scientific	NC1791615
Вакуумный осушитель	Лабораторный депо	55207
Водорастворимый универсальный корм для растений	Чудо-Гро	160101