Методическая статья

Автоматизированное разделение HPLC с использованием LC-mate: интегрированный повторяющийся автопромплер и сборщик фракций для микромасштабной очистки

DOI:

10.3791/69685

⸱

27 февраля 2026 г.

 , 
1Natural Product Research Center, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Был разработан интегрированный автопромплер и сборщик фракций (LC-mate) для автоматизации повторяющихся разделений ВЭЖХ. Совместимый с HPLC-детекторами, которые выводят аналоговые сигналы, LC-mate повышает производительность ручных систем и ускоряет исследовательские рабочие процессы, основанные на высокопроизводительной жидкостной хроматографии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) играет ключевую роль в очистке высокоценных соединений, удовлетворяя растущие требования химических и биологических дисциплин как в академической, так и в промышленной среде. Однако повторное ручное введение и сбор фракций во время микромасштабной очистки значительно ограничивают эффективность и воспроизводимость. Чтобы преодолеть это узкое место, мы разработали интегрированную систему автосэмплера и сборщика дробей, временно названную LC-mate, которая автоматизирует повторяющиеся разделения, реагируя напрямую на аналоговые сигналы от детектора ВЭЖХ. Прибор построен вокруг шестипортового переключающего клапана высокого давления для инжекции образцов и селекторного клапана для сбора фракций, при этом рабочие параметры управляются через интуитивно понятный сенсорный интерфейс. LC-mate совместим с коммерческими детекторами HPLC, способными к аналоговому выводу, а также может обеспечивать повторяющееся разделение режима градиентной элюции через синхронное запуск сигнала. Демонстрационные эксперименты подтвердили стабильную работу и воспроизводимое разделение для очистки натуральных продуктов, что показало явное сокращение времени ручной обработки. Система предлагает практичное и доступное решение для улучшения автоматизации в традиционных рабочих процессах ВЭЖХ, преодолевая разрыв между ручными и полностью автоматизированными системами очистки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хроматография, впервые разработанная М.С. Тсветтом в начале XX века, в 1960-х годах превратилась в современную высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с достижениями в приборостроении 1,2,3.

Сегодня HPLC играет ключевую роль в очистке высокоценных соединений, отвечая растущим потребностям биомедицины, химии и биологии как в академической, так и в промышленной сферах. В академических исследованиях микромасштабная очистка натуральных продуктов и разрешение хиральных молекул критически зависят от полупрепаративных методовВЭЖХ 4,5,6,7,8. В большинстве практических случаев исследователи вводят часть раствора образца в столбец ВЭЖХ за раз, а не всю цель, чтобы избежать непредсказуемых потерь образца или из-за ограничений размера столбцов, что делает повторные инъекции образца и сбор фракций неизбежными. Несмотря на исключительную возможность разделения, использование ВЭЖХ для очистки образцов остаётся ограниченным внутренними ограничениями современного оборудования и рабочих процессов. Основным узким местом является сильная зависимость от ручного вмешательства, особенно при инъекции образцов и сборе фракций. Эти процессы не только трудоёмки и трудоёмкие, но и подвержены человеческим ошибкам, что снижает пропускную способность, воспроизводимость и общую операционнуюэффективность 9,10.

Коммерческие автопробосборники и сборщики фракций от крупных производителей ВЭЖХ, таких как Agilent, Shimadzu и Waters, обеспечивают надежную и точную автоматизацию, но обычно ограничены проприетарными аппаратными и программными экосистемами. Например, автосэмплер Agilent 1260 Infinity II и коллектор фракций G1364F бесшовно интегрированы в системы HPLC Agilent, обеспечивая отличную воспроизводимость, но ограниченную кроссплатформенную совместимость. Аналогично, автосэмплеры SIL-20A/40C и коллекторы фракций FRC-40/FRC-10A от Shimadzu обеспечивают высокую пропускную способность и отличную механическую точность, но при этом зависят от архитектур управления LC-20 и Nexera от Shimadzu. Модули Waters Alliance HPLC и модули сборщика фракций III также обеспечивают надёжную производительность и гибкие форматы сбора (до 300 мл/мин), но остаются адаптированными для фирменных сред UHPLC и LC-MS от Waters. Кроме того, традиционные автопромплеры, использующие инъекционные иглы, могут снижать восстановление образцов, а пробирочные сборщики фракций могут быть неудобны для работы с большими объёмами элюента. Для большинства других приборов ВЭЖХ полуподготовительная сепарация всё ещё зависит от утомительной и повторяющейся ручной работы.

Эти проблемы подчёркивают необходимость инновационного подхода к автоматизации очистки образцов в рабочих процессах ВЭЖХ. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы разработали LC-mate — компактный и универсальный прибор, интегрирующий модули автосэмплера и сбора дробей в единую платформу. Жидкий сердечник LC-mate состоит из двух ключевых компонентов: высоконапорного шестипортового коммутационного клапана (SKVA-3130-S), изготовленного из нержавеющей стали SUS 316 с потоком 0,4 мм и поддерживающим рабочим давлением до 45 МПа, с точным управлением инжекцией образцов, и 10-канального многопозиционного селекторного клапана с минимальным мёртвым объёмом (27,5 мкл от порта к порту, 5 мкл канавки ротора) с диаметром потокового канала 1,2 мм для эффективного сбора фракций. Такая конфигурация минимизирует мёртвый объём и снижает риск перекрёстного загрязнения. Для подробной спецификации приборов см. Таблицу 1. LC-мат может получать аналоговый выход от детекторов ВЭЖХ и запускать прибор ВЭЖХ через синхронный сигнал, что позволяет самостоятельно управлять как инъекцией образца, так и сбором фракций.

Таблица 1: Параметры приборов, связанных с LC-mate. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Прибор оснащён удобным программным обеспечением управления и интуитивно понятным сенсорным интерфейсом, позволяющим визуализировать аналоговые хроматографические сигналы в реальном времени. LC-mate поддерживает как изократический, так и градиентный режимы разделения, позволяя пользователям настраивать ключевые параметры — включая объём инъекции, количество времени повторения, интервал каждой инъекции и режим сбора [пороговое, временное или Collect All (собирать дроби как выше, так и ниже порога)], а также запускать полностью автоматизированную работу с помощью одной команды. Это устраняет необходимость повторяющихся ручных вмешательств и значительно повышает эффективность очистки ВЭЖХ.

Рисунок 1 иллюстрирует общий внешний вид, принцип работы и конфигурацию LC-mate, интегрированного с системой ВЭЖХ.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Проектирование и настройка системы LC-mate. (A) Схематическая компоновка. (B) Схема приборов. (C) Практическое фото при установке. (D) Соединение линии передачи сигнала между УФ-детектором и LC-мат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Проверка соединения

  1. Проверьте подключения растворителя между HPLC, LC-mate и хроматографической колонкой, чтобы обеспечить правильные пути потока (рисунок 1A).
  2. Проверьте соединение линии передачи сигнала между УФ-детектором и LC-mate, как показано на рисунке 1D.
    1. Подключите чёрный провод к красному выводу, а белый — к чёрному выводу, чтобы совпасть с полярностью аналогового сигнала.
    2. Посмотрите на дисплей LC-мат. Если появляется аналоговая сигнальная форма сигнала, соединение правильное.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если форма сигнала не видна, измените соединения: подключите чёрный провод к чёрной клемме, а белый — к красному.
  3. Проверьте соединение триггера между УФ-детектором и LC-mate.
    1. Подключите один конец кабеля данных к выходному порту УФ-детектора.
    2. Подключите чёрный и белый провода с другого конца к синим и черным клеммам триггера на LC-mate соответственно.
    3. Затяните клемму и триггер, чтобы обеспечить прочное соединение.

2. Запуск интегрированной системы разделения

  1. Обеспечьте правильный запуск HPLC.
  2. Обеспечьте правильный запуск LC-mate.
    1. При запуске системы LC-mate нажмите на значок LC-mate на интерфейсе, чтобы автоматически запустить программу самотестирования системы и инициализировать ключевые аппаратные модули.
    2. Ждите короткого сигнала Di (примерно 0,5 секунды) и исчезновения запроса «Самотестирование» на экране после завершения самотестирования, так как они означают завершение инициализации.

3. Оптимизация условий

  1. Настройте условие разделения ВЭЖХ и начните элюирование для достижения уравновесления столбцов.
  2. Нажмите на значок Test слева на экране LC-mate, и на экране появится следующий интерфейс (рисунок 2A). Параметры Input Injection Volume, Time Elution и Repetition Time и нажмите значок Start ; будет инициирована работа автосэмплера, сборщика фракций и HPLC. В этом случае элуент выходит только через порт 10 клапана селектора и может быть собран вручную или выброшен.
  3. Определите возможные условия разделения, включая разрешение, время работы, время удержания, объём впрыска и длину волны УФ-излучения и т.д., чтобы облегчить последующее разделение и сбор фракций в подходящих режимах.

4. Автозапуск

ПРИМЕЧАНИЕ: На основе хроматограммы возможных условий разделения можно выбрать подходящий способ сбора фракций из опций Threshold, Timing Collection и Collect All слева на интерфейсе.

  1. Сбор дробей на основе порогового значения
    1. Выберите модуль функции Threshold слева на интерфейсе, и система отобразит интерфейс настройки параметров, как показано на рисунке 2B.
    2. Введите объём инъекции, время повторения, порог и время элюции и нажмите Старт; HPLC и LC-mate будут работать автоматически. Фракции с хроматографическими пиками, превышающими этот порог, будут собраны в различные бутылки для сбора предметов.
    3. Отслеживайте индикаторы состояния, расположенные вертикально на дисплее: Наблюдайте за введением инъекции , чтобы убедиться, что введение образца инициировано. Проверьте процесс разделения , чтобы убедиться, что хроматографическое разделение происходит. Обратите внимание на «Опустошение шприца», чтобы определить, когда шприц выводит остаточную жидкость. Обратите внимание на синее выделение соответствующего текста, чтобы подтвердить, в каком состоянии работы сейчас активно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время процесса разделения при нажатии на значок «Хроматограмма» отобразятся хроматограмма и пороговая линия на новом интерфейсе, и хроматограмма идентична той, что отображается на экране компьютера, управляющего ВЭЖХ.
  2. Сбор фракций по периоду времени
    1. Выберите модуль Timeing Collection слева на интерфейсе, чтобы открыть меню настройки параметров (рисунок 2C).
    2. Введите необходимые параметры: объём инъекции, время повторения, время элюции и ряд необходимых времени сбора.
    3. Нажмите кнопку Старт , чтобы запустить автоматизированную последовательность, после чего система ВЭЖХ и LC-mate будут запускаться многократно согласно установленным параметрам.
  3. Сбор дробей в режиме «Collect All»
    1. Выберите функциональный модуль Collect All слева на интерфейсе, система отобразит интерфейс настройки параметров, как показано на рисунке 2D.
    2. Установите порог сбора, и хроматографические пики, которые выше или ниже порога, будут собраны отдельно, что может гарантировать потерю соединения в смеси.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ацетонитрил — это легковоспламеняющийся и токсичный растворитель. Все процедуры, связанные с ацетонитрилом или другими органическими растворителями, должны проводиться в хорошо проветриваемом лабораторном помещении. Персонал должен всегда носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая химические очки для разбрызгивания и перчатки, устойчивые к растворителям. Отходы ацетонитрила и других органических растворителей должны собираться в специально предназначенных, правильно маркированных контейнерах для опасных химических отходов. Эти потоки отходов обрабатывались в соответствии с протоколом охраны окружающей среды и безопасности нашего учреждения лицензированной службой по утилизации.

5. Очистка трубопровода

ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка конвейера гарантирует, что при следующем использовании автосэмплера в конвейере не останется ни одного образца.

  1. Подготовьте небольшую бутылочку с чистым растворителем и вставьте инжекторный трубопровод автопромплера в растворитель.
  2. Выберите модуль очистки с левого интерфейса, чтобы открыть меню настройки параметров (рисунок 2E).
  3. Очистка инжекторного трубопровода
    1. Установите объём инъекции от 0 до 1000 и установите время повторений (без ограничений).
    2. Нажмите на Cleansing под разделом «Очистка завершена», чтобы начать очистку конвейера инжекторов.
    3. Отслеживайте количество циклов стирки, чтобы отслеживать количество завершённых циклов стирки.
  4. Очистка конвейера сбора
    1. Установите время очищения (без ограничений).
    2. Нажмите на Очистку под разделом «Текущий конвейер», чтобы начать очистку конвейера сбора.
    3. Отслеживайте отображение текущего конвейера , чтобы подтвердить, какой конвейер очищается, поскольку система работает последовательно от конвейера 0 до конвейера 10.

figure-protocol-1
Рисунок 2: Интерфейс сенсорного экрана LC-mate для работы метода. (A) Экран оптимизации. (B) Режим порога. (C) Режим тайминга. (D) Режим «собрать всё». (E) Очистка трубопровода. (F) Настройки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

6. Инструкции по сохранению данных

  1. Включите автоматическое сохранение. Система автоматически сохраняет хроматограмму после каждого цикла элюирования.
  2. Выполните ручное сохранение. Нажмите кнопку «Сохранение » после завершения элюирования. Введите необходимые метаданные в диалоговое окно, чтобы сохранить файл.
  3. Выберите место хранения. Выберите сохранение файлов на локальное хранилище устройства, SD-карту или внешний USB-накопитель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте внешний USB-накопитель для хранения всех данных, чтобы избежать ограничений по ёмкости и обеспечить лёгкий доступ к данным.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Очистка 2"-O-галлойл-гиперозида
2"-O-Galloyl-гиперозид (2-GH) — это основной водорастворимый компонент Euphorbia helioscopia L., традиционного китайского лекарства с долгой историей использования для устранения мокроти ивлажности 11. Его химическая структура показана на рисунке 3. Недавно было обнаружено, что 2-GH обладает антифиброзным действием у животн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эти результаты показывают, что система LC-mate может автономно выполнять непрерывную инъекцию образца и сбор фракций с соблюдением установленных параметров, что значительно минимизирует ручное вмешательство и повышает эффективность разделения. Система оснащена удобным интерфейсом, требующим только начальной аппаратной настройки, а затем интуитивно понятного управления сенсорным экраном.

Для достижения успеха экспериментов требуются три ключевых аспекта. Во-пер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вэймин Чжао предложил проект LC-mate, который был выполнен инженерами компании Shanghai Betterren Medical Technology Co., Ltd. Патент на этот инструмент совместно принадлежит компании Shanghai Betterren Medical Technology Co., Ltd. и Шанхайскому институту материи медицины Китайской академии наук.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы искренне благодарят компанию Shanghai Betterren Medical Technology Co., Ltd. за все их вклады в воплощение идеи освобождения химиков от рутинной ручной работы с ВЭЖХ в реальность, а также господину Сюхун Хэ из Welch Materials Inc. за тестирование повторяемости LC-mate.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Высокопроизводительный жидкостный хроматограф — EasySep-1050Shanghai Tongwei Analysis Technology Co., Ltd. Веб-страница инструмента EasySep®-1050 https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100522/C140238.htm1009992Модульная подготовительная система ВЭЖХ, используемая в протоколе. Включает насос подачи растворителей, детектор УФ/ВИС и ручной клапан впрыска. Эта система образует блок разделения ядра, который автоматизирует LC-mate.
(Жидкая хроматографическая колонка) Sharpsil-U C18 150 мм (L) и часы; 30 мм (удостоверение) S-10 и микро; m, 100AShanghai Xuanmei Industrial Development Co., Ltd.U180110-300150Обратная — хроматографическая колонка фазы C18 с размером частицы 10 и мю; м и пору размером 100 Å. Он предназначен для разделения малых молекул (таких как лекарства, органические соединения) и обладает хорошей воспроизводимостью и стабильностью. Размеры колонны (длина 150 мм, внутренний диаметр 30 мм) делают её подходящей для подготовительной или полуподготовительной хроматографии.
LC-mateShanghai Betterren Medical Technology Co., Ltd. Для любых запросов on  инструмент LC-mate, пожалуйста, свяжитесь с соответствующим автором по электронной почте: wmzhao@simm.ac.cn GD202200337Вспомогательное оборудование для систем жидкостной хроматографии, вероятно, используемое для инъекции образцов, мобильного фазового управления или сбора данных. Он может быть интегрирован с системами HPLC для повышения автоматизации и эффективности экспериментальных процессов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Dolan, J. W. Introduction to modern liquid chromatography. , 3rd ed, John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
  2. Georges, A. Preparative liquid chromatography. J Chromatogr A. 965 (1-2), 129-161 (2002).
  3. Hostettmann, K., Marston, A., Hostettmann, M. Preparative chromatography techniques: applications in natural product isolation. , Springer. Berlin. (1998).
  4. Queiroz, E. F., Guillarme, D., Wolfender, J. L. Advanced high-resolution chromatographic strategies for efficient isolation of natural products from complex biological matrices: From metabolite profiling to pure chemical entities. Phytochem Rev. 23 (5), 1415-1442 (2024).
  5. Glowniak, K., Zgórka, G., Józefczyk, A., Furmanowa, M. Sample preparation for taxol and cephalomannine determination in various organs of Taxus sp. J Pharm Biomed Anal. 14 (8-10), 1215-1220 (1996).
  6. Gumustas, M., Ozkan, S. A., Chankvetadze, B. Analytical and preparative scale separation of enantiomers of chiral drugs by chromatography and related methods. Curr Med Chem. 25 (33), 4152-4188 (2018).
  7. Wu, T., et al. Preparative separation of four isomers of synthetic anisodamine by HPLC and diastereomer crystallization. Chirality. 31 (1), 11-20 (2019).
  8. Aguilar, M. I. HPLC of peptides and protein: Methods and protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2004).
  9. Dong, M. W. Modern HPLC for practicing scientists. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2006).
  10. Meyer, V. R. Practical high-performance liquid chromatography. , 5th ed, John Wiley & Sons. Chichester, UK. (2010).
  11. Ding, J., et al. Research progress on modern pharmacological effects and clinical applications of Euphorbia helioscopia L. World Chin Med. 20 (14), 2588-2594 (2025).
  12. Wang, J. Q., et al. Hypericin ameliorates renal tubulointerstitial fibrosis by inhibiting YAP. Acta Med Univ Sci Technol Huazhong. 54 (2), 190-197 (2025).
  13. Li, W. J., et al. Research progress on the hypoglycemic effects of Litsea coreana leaves. Mod Food Sci Technol. 38 (4), 292-297 (2022).
  14. 1260 Infinity Variable Wavelength Detector User Manual. Document G1314-90013. , Agilent Technologies Inc. https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G1314-90013_VWD-B-C_USR_EN.pdf (2010).
  15. 2487 Dual λ absorbance detector operator's guide. Document WAT048740, Rev. 2. , Waters Corporation. (2004).
  16. UltiMate 3000 series variable wavelength detectors VWD-3100 and VWD-3400RS operating instructions. Document 4820.7451, Rev. 1.7. , Thermo Fisher Scientific. https://conquerscientific.com/wp-content/uploads/2023/01/waters-2487-dual-absorbance-detector_operators-guide.pdf (2013).
  17. UltiMate 3000 VWD-3400RS detector product specifications. , Thermo Fisher Scientific. https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/cn/zh/5074.0010 (2013).
  18. Vargas Medina, D. A., Lozada-Blanco, A., García Rodríguez, J. P., Lanças, F. M., Santos-Neto, ÁJ. An open-source smart fraction collector for isocratic preparative liquid chromatography. HardwareX. 15, e00462(2023).
  19. Caputo, M., Lyles, J. T., Salazar, M. S., Quave, C. L. LEGO MINDSTORMS fraction collector: A low-cost tool for a preparative high-performance liquid chromatography system. Anal Chem. 92 (4), 1687-1690 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи