Методическая статья

Локализованные RNAi и эктопической экспрессии гена в медицинской пиявки

DOI:

10.3791/697

⸱

17 апреля 2008 г.

 ,  ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of California San Diego - UCSD, 2Department of Physics, University of California San Diego - UCSD

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом видео мы покажем процедуру точной biolistic доставки реагентов в живые ткани романа миниатюрный пистолет гена. Мы сбить выражение молекулы Netrin руководством аксонов в пиявка эмбрионов путем предоставления молекулы дсРНК в вентральной стенкой тела и ганглиях одного сегмента.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом видео мы покажем, использование пневматических капиллярных пистолет для точного biolistic доставки реагентов в живые ткани. Мы используем процедуру возмущают шаблоны экспрессии генов в отдельных сегментах пиявки эмбрионов, оставив необработанными сегментов внутреннего контроля.

Пневматический пистолет капиллярной могут быть использованы для достижения внутренних слоев клеток на ранних стадиях развития, не открывая образца. В качестве метода локализованных введения веществ в живых тканях, biolistic поставки с пушкой имеет ряд преимуществ: он быстрый, бесконтактный и неразрушающий. Кроме того, одной капиллярной оружие может быть использовано для самостоятельной доставки различных веществ. Доставка регионе может иметь поперечные размеры ~ 50-150 мкм и распространяется на ~ 15 мкм вокруг средняя глубина проникновения, которая регулируется в пределах от 0 до 50 мкм. Эта поставка имеет преимущество в том, способна привлечь внимание ограниченное количество ячеек в выбранном месте промежуточное между одной клетки сбить путем микроинъекции и системных нокдаун через внеклеточную инъекции или с помощью генетических методов.

Для сбивания или стучать в экспрессии молекулы аксон руководством Netrin, которая, естественно, выраженные некоторыми центральными нейронами и в брюшной стенке тела, но не спинной области, мы поставляем молекулы дсРНК или плазмид-ДНК в стенке тела и центральных ганглиев. Эта процедура включает в себя следующие этапы: (я) подготовки экспериментальной установки для конкретного анализа (регулировка ускорения давления), (II) покрытия частиц с молекулами дсРНК или ДНК, (III) погрузка покрытых частиц в пушку, до двух реагентов в одном анализе, (IV) подготовке животных для доставки частиц, (V) доставка покрытых частиц в ткани-мишени (стенки тела или ганглии) и (VI) обработки эмбрионов (иммунной, иммуногистохимии и нейронных маркировки) для визуализации результатов, как правило, от 2 до 3 дней после поставки.

Когда частицы были покрыты netrin дсРНК, они вызвали отчетливо видны нокдауна от netrin выражение, которое произошло только в клетках, содержащих частицы (как правило, 1-2 частиц на клетку). Частицы покрытые плазмиды, кодирующей EGFP индуцированной флуоресценции в нервных клетках, когда они остановились в их ядер.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Частицы могут быть покрыты различными реагентами, например, молекулы дсРНК, ДНК плазмиды или красители. Тип и диаметр частиц выбираются в зависимости от реагентов и глубину клетки-мишени в ткани: крупные частицы проникают дальше, но может вызвать некоторые повреждения тканей.

1. Подготовка дсРНК частицы, покрытые

  1. Разместить 100% изопропанола на льду.
  2. Ресуспендируют 5 мг частицы золота (S1600ri, Seashell технологии, ООО; средним диаметром 1,6 мкм) в 100 мл буфера для связывания. Когда раствор будет готов, переходите к следующему шагу.
  3. Развести частиц решение путем добавления 100 мкл буфера для связывания, вихревые кратко и разрушать ультразвуком в течение 1-2 минут, чтобы избежать слипания.
  4. Добавить 5-10 мкг дсРНК / миРНК (dsRNAs / миРНК следует растворить в воде до концентрации ~ 1μg/μl).
  5. Вихревой и оставить при комнатной температуре в течение 2 мин. Эти результате концентрации и временной интервал в миРНК насыщенный частицами золота.
  6. Гранул миРНК / золото частиц комплексов путем центрифугирования при 2500 оборотов в минуту ~ в настольной центрифуге в течение ~ 15 сек.
  7. Удалить супернатант и осторожно добавить 750 мл холодного изопропанола с минимальными помехами для гранул. Спиновые кратко и удалите супернатант.
  8. Ресуспендируют частицы золота в 100 мкл холодного 100% изопропанола, а затем разрушать ультразвуком кратко в ванной sonicator (2-3 импульсов) для разгона частиц агломератов. Последнее, залить взвешенных частиц на предметное стекло и дать высохнуть при комнатной температуре.

2. Подготовка экспериментальной установки для конкретного анализа

  1. Каждое оружие имеет разный диаметр диафрагмы сопла, в пределах от минимума ~ 50 мкм до ~ 3 мм. Конкретные, которые будут использоваться для оружия, следовательно, выбирается в зависимости от участка ткани должны быть целенаправленными.
  2. Он давление с поправкой на глубину в ткани клеток-мишеней, как правило, до ~ 100 мкм (более высокое давление может доставить частиц глубже). Расстояние между эмбрионом и кончик сопла также влияет на глубину проникновения, так как свободные частицы золота импульса в воздухе.

3. Загрузка пистолет с предварительно покрытых частиц

Частицы должны быть загружены в виде сухого порошка в Tygon трубки инжекции частиц линий, подключенных к многообразию. Это трубы, которые должны храниться в сухом помещении при температуре 4 ° С, когда они не используются, могут быть повторно использованы в дополнительных экспериментов с теми же реагентами. Наша экспериментальная установка может обеспечить до двух различных реагентов в анализе через отдельные порты в многообразии.

  1. Очистите сушеные покрытием частиц из стекол, используя лезвие скольжения стеклянной крышкой или лезвием перед загрузкой их в линии трубы Tygon. Это Tygon трубы будут, характерные только для этого реагента, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
  2. Как вы нагрузки частиц, согнуть трубку в форме U близко к разъему, чтобы удержать частицы от распространения по всей трубы и сосредоточены рядом с разъемом. Возьмите частиц с небольшой шпатель или кусок сложенной весят бумаги, и загрузить около половины из них в трубки для каждой серии эмбрионов. Нажмите трубы при загрузке шаг к распространению частиц равномерно.

4. Подготовка животных

До и после поставку золота частицы, эмбрионы хранятся в стерильных искусственный водоем при комнатной температуре.

  1. Место эмбрионов, вентральной стороной вверх, в паз высеченных в квартире, 5 мм толщиной кусок из силиконовой резины (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) и анестезировать их в раствор 8% этанола в стерильной воде искусственного пруда ( младший эмбрионов на стадиях Е6-Е8 может оставаться в воде искусственного пруда, не этанола в течение всего эксперимента).
  2. Непосредственно перед съемкой частиц, снижение уровня ванной, чтобы раскрыть брюшной поверхности эмбрионы, удалив часть решения. Поместите лист папиросной бумаги с небольшой отверстие в середине на вершине ее стабилизировать его и хранить его поверхность от высыхания.

5. Доставка покрытых частиц в ткани-мишени

Один нагрузки частиц как правило, могут быть использованы на срок до десяти выстрелов, с одного выстрела обычно доставку порядка нескольких сотен частиц.

  1. Создание выстрела, открыв один из клапанов для 0,3 сек, при введении болюса частиц из соответствующей строки трубку в пушку.
  2. Нажмите трубы аккуратно между выстрелами выбить частицы из трубки стены и тем самым облегчить их введения в его потоке пушки.
  3. Для покрытия участка ткани интересов, несколько кадров могут потребоваться.
  4. После доставки частиц, место эмбрионов обратно в искусственный водоем, желательно одного эмбриона на лунку в мульти-луночного планшета.

6. Иммуноокраски и маркировки нейронов

Держите эмбрионы при комнатной температуре и в темноте в течение от 1 до 3 дней после доставки частиц, пока RNAi (или эктопической экспрессии) достигается. Затем выполнить одну из следующих процедур на опытных образцов и органы управления:

  1. В гибридизация для анализа на наличие или отсутствие мРНК Netrin. Дигоксигенин меченных пиявки netrin riboprobes гибридизуются целые эмбрионы пиявка.
  2. Иммуноцитохимическая на тест для Netrin белка и других белков, которые являются уникальными для нейронной ткани (таких как анти ацетилированного тубулина). Процедура проводится также и на весь монтажа эмбрионов.
  3. Микроинъекции липофильных красителей (DII и Дио) в отдельных нейронов, для красителя заполняет для обозначения полного беседки нейронов интерес (mechanosensory нейронов давление в нашем случае) в обработанных и сегментов контроля. Этот анализ проводится на живых эмбрионов (нетронутыми или расчлененный).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой демонстрации мы использовали пневматический пистолет капиллярные для доставки золота частиц по ячейкам в небольших локализованных объема живых эмбрионов пиявки стучать в и нокдауна генов. Целевом регионе как правило, имеют диаметр ~ 150 мкм и частицы были обнаружены ~ 15 мкм примерно средняя глубина проникновения, которая регулируется в пределах от 0 до 50 мкм. Когда частицы были покрыты молекулами дсРНК фактора netrin руководством аксона, они вызвали отчетливо видны нокдауна от netrin выражение, которое произошло только в клетках, с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить д-р Майкл Бейкер за помощь в создании конструкций для генной нокаут в себе и для обеспечения покадровой фильмы растущей сенсорных проекций. Мы также хотели бы поблагодарить Вирджиния Vandelinder для оказания технической помощи с экспериментами пневматического пистолета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
золотые частицыПрочееSeashell Technology, LLCS1600ri
связывающий буферРеагентSeashell Technology, LLC
силиконовая резинаРеагентDow CorningSylgard 184

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
  2. Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
  3. Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
  4. Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
  5. Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Applied Physics Letters. 87, 014103(2005).
  6. Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи