Оценка мультимодальной функциональности Т-клеток химерных антигенных рецепторов при одноклеточном разрешении с помощью оптофлюидиного анализа

Summary

Адоптивная терапия Т-клеток с использованием CAR-T-клеток показывает перспективы в лечении рака крови, хотя устойчивые реакции непоследовательны. Полифункциональные Т-клетки коррелируют с устойчивостью к ремиссии, но стандартные анализы скрывают ключевые субпопуляции. Мы представляем рабочий процесс с одной клетками с использованием оптофлюидики для идентификации и выделения высокофункциональных CAR-T-клеток для дальнейших исследований.

Abstract

Адоптивная терапия Т-клеток — это новая парадигма лечения, при которой аутологичные Т-клетки генетически модифицируются для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), направленного на опухоли, перед экс-виво расширением и повторной инфузией пациенту. Несмотря на впечатляющие демонстрации противоопухолевой эффективности у пациентов с запущенными гематологическими злокачественными опухоликами, долгосрочные реакции не проявляются в значительной части случаев. Хотя несколько своеобразных факторов могут способствовать вариативности клинических исходов, появляется всё больше доказательств того, что доля полифункциональных Т-клеток в продукте CAR-T-клеток до инфузии сильно коррелирует с долговечностью ремиссии рака. К сожалению, стандартные оценки продуктов клеток CAR-T в настоящее время опираются на объёмные измерения популяций или терминальные анализы, что ограничивает возможность выделения и изучения субпопуляций с повышенными функциональными свойствами. Здесь мы демонстрируем рабочий процесс, использующий оптофлюидическую платформу для оценки профиля секреции цитокинов и активации через экспрессию CD137 отдельных клеток CAR-T, что может быть дополнительно комбинировано с оценкой цитотоксической активности. Клетки с наибольшей степенью мультимодальной функциональности могут быть выделены для дальнейшего анализа с целью разработки терапии CAR-T-клеток следующего поколения.

Introduction

Т-клетки, экспрессирующие химерными антигенными рецепторами (CAR), продемонстрировали выдающуюся противоопухоловую эффективность у пациентов с запущенными гематологическими злокачественными^{опухолиями 1,2}. Однако значительная часть лечённых пациентов в конечном итоге рецидивирует, что подчёркивает необходимость разработки продуктов CAR-T клеток с большей функциональной^{персистентностью} 3,4,5,6. Хотя множество своеобразных факторов могут способствовать вариабельности клинических исходов, появляется всё больше доказательств того, что процент полифункциональных Т-клеток в продукте CAR-T-клетки до инфузии сильно коррелирует с долговечностью ремиссии рака. Таким образом, стратегии обогащения или инженерии CAR-T-клеток с большей полифункциональностью могут привести к появлению терапевтических продуктов с повышенным потенциалом для опосредования долгосрочных клинических ^{ответов 6,7,8}. К сожалению, современные методы характеристики функций клеток CAR-T в значительной степени основаны на объёмных измерениях популяции или терминальных анализах. Они ограничивают возможность выделить и изучать конкретные субпопуляции с повышенными многофункциональными свойствами. Например, секрецию цитокинов обычно оценивают либо из объёмных супернатантов, либо с помощью внутриклеточного окрашивания. Последняя требует фиксации клетки в обмен на информацию на уровне одиночной^{клетки 9}. Аналогично, цитотоксический потенциал чаще всего оценивается для объёмных популяций CAR-T клеток путем количественной оценки потери жизнеспособности целевой клетки после кокультуры Т-клеток и мишени¹⁰. Возможность оценивать секрецию цитокинов, активацию и цитолитическую активность жизнеспособных CAR-T-клеток с одноклеточным разрешением может стимулировать разработку терапевтических продуктов с более устойчивой противоопухолевой эффективностью.

Здесь мы представляем метод одновременного профилирования отдельных CAR-T клеток для мультимодальной функциональности с помощью одноклеточной оптофлюидической платформы (рисунок 1). Система использует оптоэлектрическое позиционирование (OEP) для перемещения шариков захвата цитокинов и отдельных клеток в пространственно разделённые загоны, что позволяет проводить функциональную оценку отдельных клеток CAR-T (рисунок 2A). В этом протоколе мы демонстрируем рабочий процесс по получению CAR-T-клеток посредством невирусного переноса генов и оцениваем секрецию и активацию цитокинов через CD137 отдельных CAR-T-клеток во время совместной культуры с антиген-экспрессирующими и антигенотрицательными целями (см. рисунок 3 и рисунок 4)¹¹. Потенциал дифференцировки профилей цитокинов и активации между продуктами модифицированных клеток иллюстрируется при сравнении стандартных CAR-T-клеток с c-Jun,^{переэкспрессирующими 6}. Цитотоксическая активность против отдельных целевых клеток также может быть оценена с помощью каспаз- или флуоресцентных показаний на оптофлюидической платформе (рисунок 2B). Однако для определения кинетики взаимодействия требуется таймлапс-анализ, который может значительно различаться для каждой конструкции и эксперимента CAR. Аналогично, повторяющиеся тесты на убийство, имитирующие хроническую стимуляцию, требуют альтернативного рабочего процесса. Поэтому в этой статье мы описываем основную процедуру оценки цитотоксичности, но не обсуждаем её подробные применения.

На основе выбранной оценки и целевых характеристик живые CAR-T-клетки, демонстрирующие наибольшую степень мультимодальной функциональности, могут быть выгружены из прибора и перенесены в отдельные скважины в пластинах с 96 лунками для дальнейшего изучения (рисунок 2C).

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер и подготовка среды приведены в таблице 1.

1. Выделение Т-клеток CD8 из конусов системы восстановления лейкоцитов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы стерильной асептической техникой в шкафе для биобезопасности тканевых культур. Все среды для разбавления, промывки и повторного суспензирования должны поддерживаться при 4 °C на протяжении всей процедуры.

1. Добавьте 15 мл среды разделения клеток (плотность 1,077 г/мл) к каждой из двух конических трубок по 50 мл (разделительной трубки).
2. Держите конус системы восстановления лейкоцитов (LRS) (конической стороной вниз) над незакрытой конической трубкой объёмом 50 мл. Используя стерильные ножницы, перережьте пластиковую трубку, выступающую ниже конуса LRS. Положите конус LRS на открытую коническую трубку объёмом 50 мл и отрежьте пластиковую трубку сверху. Соберите примерно 8-10 мл крови в конической трубке объёмом 50 мл.
3. Заполните коническую трубку объёмом 50 мл до 50 мл PBS + EDTA (подготовленными в списке среды и буферов) и пипеткой для смешивания разбавленной крови. Разделите разбавлённую кровь поровну между двумя разделительными трубками.
4. Центрифугуйте разделительные трубки разбавленной кровью при 750 x g в течение 15 минут при комнатной температуре (RT), при этом 9 минут — для ускорения и 2 — для замедления.
5. Используя серологическую пипетку объёмом 10 мл, аккуратно соберите и перенесите оболочки из каждой отделительной трубки в свежую коническую трубку объёмом 50 мл.
6. Заполните каждую коническую трубку объёмом 50 мл до 40 мл PBS + EDTA и повторно суспензуйте, чтобы получить суспензии с одной ячейкой. Центрифугуйте одноэлементные суспензии при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C. Аспирировать супернатант.
7. Восстановите суспензию и комбинируйте клеточные гранулы в 40 мл PBS + EDTA. Центрифугуйте одноэлементную суспензию при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C. Аспирировать супернатант.
8. Суспензировать клеточную гранулу в PBS + EDTA и определить жизнеспособную плотность клеток суспензии периферической мононуклеарной клетки крови (PBMC) с помощью окрашивания Trypan Blue.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Trypan Blue — это непроницаемый с живыми клетками краситель, который окрашивает ДНК. Таким образом, как живые PBMC, так и ненуклеированные клетки (то есть эритроциты) останутся неокрашенными. При определении жизнеспособной плотности PBMC важно исключать мелкие клетки (например, эритроциты).
9. Перенесите нужное количество PBMC в новую коническую трубку объёмом 50 мл для магнитного обогащения CD8⁺ T-клеток. Оцените в 10 раз больше желаемых CD8⁺ Т-клеток как начальное количество PBMC, необходимых для магнитного обогащения. Держите реагенты холодными во время процедуры.
10. Центрифугуйте суспензию ячейки PBMC при 300 x g в течение 10 минут при 4 °C. Аспирировать супернатант. Суспензировать ячеечную гранулу в 40 мкл буфера MACS (подготовленного в списке носителей и буферов) на 1 x 10⁷ ячеек.
11. Добавьте 10 мкл ^CD8+ Т-клеточного коктейля Биотин-Аб на 1 x^{10 7} клеток. Смешивайте с помощью пипетки и инкубуйте 5 минут при 4 °C.
12. Добавьте 30 мкл буфера MACS на 1 x^{10 7} ячеек. Добавьте 20 мкл ^CD8+ Т-клеток на 1 x^{10 7} клеток. Смешивайте с помощью пипетки и инкубуйте 10 минут при 4 °C.
13. Положите заранее охлаждённые колонки LS на магнит. Подставьте под ним коническую трубку объёмом 15 мл для сбора жидкости. Уравновесьте каждый столбец LS с 3 мл буфера MACS.
14. Используя ту же коническую трубку объёмом 15 мл, что и сборная трубка, примените подвеску к уравновешенной колонке LS. Промыйте колонку 3 раза с помощью 1 мл буфера MACS. Дайте каждой промывке 1 мл полностью пройти через колонку LS перед следующим промывкой.
15. Аккуратно суспензируйте собранные клетки и определите жизнеспособную плотность клеток обогащённой ^CD8+ T-клетки с помощью окрашивания Trypan Blue.

2. Активация ^CD8+ Т-клеток на основе шариков

1. Рассчитайте количество человеческих шариков CD3/CD28 для соотношения 1:1 между Т-клетками и шариками. Активационная бусинка содержит 1 x 10⁶ бусинок на 25 мкл.
2. Аккуратно закрутите активационные шарики не менее 30 секунд, прежде чем перевести рассчитанный объём подвески шарика в коническую трубку объёмом 15 мл. Добавьте равный объём среднего вещества, чтобы промыть бусины и вихрь минимум 5 секунд.
3. Вставьте коническую трубку объёмом 15 мл в соответствующий магнит на 1 минуту, чтобы собрать шарики по бокам трубки. Аспирируйте и отвергайте супернатант.
4. Рассчитайте объём среды, необходимый для конечной концентрации Т-клетки 1 x 10⁶ Т-клеток/мл. Извлеките коническую трубку объемом 15 мл из магнита и снова подвесьте в рассчитанном объёме культурной среды. Добавьте рекомбинантный человеческий IL-2 к конечной концентрации 50 U/mL.
5. Перенесите полностью дополненную среду в трубку с Т-клетками и восстановите суспензия. Засейте суспензию клетки в соответствующий формат клеточной культуры (например, 1 мл в пластинах с 48 лунками, 2 мл в пластинах с 24 лунками) и инкубировать в течение 40 часов.

3. Генерация клеток CAR-T путём переноса невирусных генов через нуклеофекцию

ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное нагревание среды (37 °C), реагентов (RT) и центрифуги (RT) критически важно для обеспечения высокой эффективности переноса генов.

1. Подготовьте и маркируйте пластину на 48 лунок с 1 мл клеточной культурной среды для каждого условия нуклеофекции. Инкубировать тарелку не менее 30 минут, чтобы получить тёплую среду с регулировкой_{CO 2} с физиологическим pH.
2. Включите нуклеофектор и выберите позиции для нуклеофекции внутри 16-луночной полосы. Выберите подходящую программу (например, FI-115 для высокой эффективности или EO-115 для повышения жизнеспособности).
3. Вынимите из инкубатора пластину для культивирования клеток с Т-клетками и используйте микроскоп, чтобы проверить визуальный вид клеток, чтобы получить первое впечатление о успешной ли активации. Успешно активированные Т-клетки должны иметь равномерное кластерирование и увеличенную форму клеток. Средний цвет, отличающийся от свежего до слегка оранжевого оттенка, указывает на то, что активация привела к более активному метаболическому состоянию и считается хорошим признаком. На этом этапе цитометрический анализ ранних маркеров активации CD25 и CD69 может подтвердить активацию.
4. Восстановка, сбор и подсчет активированных Т-клеток. Рассчитайте количество необходимых Т-клеток, рассматривая 1,2–2 x 10⁶ Т-клеток на каждое условие. Перенесите рассчитанный объём в свежую коническую трубку объёмом 15 мл и центрифугу при 200 x g на 10 минут при RT.
5. Аспирируйте и избавляйтесь от супернатантов и промывайте Т-клетки 10 мл тёплого PBS. Центрифуга при 200 x g в течение 10 минут при RT. Используйте время центрифугации для размораивания CAR-кодируемых плазмид, обычно содержащих концентрацию 1 мкг/мкл ДНК. Собрать плазмиду с кодированием транспозазы (SB100x) (1,0 мкг) или миникруг (0,5 мкг) вместе с CAR-кодирующей плазмидой (1,0 мкг) или миникругом (0,6 мкг) в отдельной микроцентрифугационной трубке без ДНК объемом 1,5 мл на нуклеофекцию.
6. Приготовьте достаточное количество раствора нуклеофлектора P3 с добавлением добавки (по условию: 16,4 мкл раствора нуклеофлектора + 3,6 мкл добавки).
7. Вынимите 15-мл коническую трубку с Т-клетками из центрифуги, аспирируйте супернатант и проведите центрифугу на 1 минуту при 200 x g, чтобы собрать остаточную жидкость на дне. Возьмите пипетку объёмом 200 мкл, чтобы аккуратно удалить как можно больше буфера, не касаясь клеточной гранулы.
8. Немедленно продолжайте ресуспензию Т-клеточной гранулы в 20 мкл буфера P3 (как указано в списке материалов) по условиям. Перенесите 20 мкл суспензии клетки в буфере P3 в микроцентрифугационную трубку объемом 1,5 мл, содержащую соответствующие конструкции, аккуратно перемешайте без введения воздуха и перенесите суспензию клетки на 16-ямецовую нуклеофекционную ленту. Аккуратно постукайте, чтобы удалить воздух со дна колодца.
9. Поместите 16-ямочную полосу в 4D-нуклеофекторную систему и начните процедуру нуклеофекции. После успешной нуклеофекции на экране для каждого выбранного колодца должен быть виден зелёный крест.
10. Сразу же добавьте 100 мкл предварительно подогретого материала из подготовленной пластины на 48 лунок перед инкубацией в 16-колодной полосе на 10 минут в инкубаторе.
11. Аккуратно подвесьте 2–3 раза, перенесите ячейку в подготовленную пластину на 48 лунок и поместите обратно в инкубатор.
12. Через 4-5 часов аккуратно удалите 500 мкл из каждой колодцы и аккуратно добавьте 500 мкл свежей и предварительно подогретой культурной среды с добавлением рекомбинантного человеческого IL-2 с концентрацией 50 мкл.
13. Регулярно меняйте среду через день для расширения клеток, поддерживая плотность от 0,5 до 2 x 10⁶ Т-клеток/мл.
14. На 6-й день удалите активационные бусины CD3/CD28. Забирайте Т-клетки, аккуратно суспензировав 10x и переносив суспензию клетки в коническую трубку объёмом 15 мл. Поместите коническую трубку объёмом 15 мл в соответствующий магнит на 1 минуту.
15. Аспирировать суспензию клеток, перенести в свежую культивационную пластину и покормить клетки свежей клеточной культурной средой с добавлением IL-2 до конечной концентрации 50 U/mL. Шарики должны оставаться видимыми в боковых стенках 15-мл-конической трубки, оставшейся в магните.
16. Проанализируйте эффективность переноса генов на 7-й день с помощью потоково-цитометрического анализа соответствующей экспрессии CAR или суррогатных маркеров перед переходом к магнитной сортировке трансгенно-положительных CAR T-клеток на 8-й день (Стратегия гейтинга на дополнительном рисунке 1).

4. Магнитное обогащение трансгенно-положительных Т-клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы стерильной асептической техникой в шкафе для биобезопасности тканевых культур. Все среды для разбавления, промывки и повторного суспензирования должны поддерживаться при 4 °C на протяжении всей процедуры.

1. Собирайте Т-клетки путём аккуратной суспензии и переноса в конические трубки объёмом 15 мл. Посчитайте Т-клетки, измерите количество ячеек для магнитного обогащения и центрифугите в течение 10 минут при 300 x g.
2. Аспирируйте, сбросьте супернатанты и промывайте путём повторного взвешивания в 10 мл буфера MACS. Центрифуга на 10 минут при 300 г. Аспирируйте и избавляйтесь от супернатанта.
3. Рассчитайте необходимое количество биотинилированных антител, направленных против суррогатного маркера (например, tEGFR). Обычно антитела следует титрировать до 1 мкл на 1 x^{10 6} клеток.
4. Ресуспензировать Т-клетки с плотностью 1 x 10⁷ клеток на мл и добавить рассчитанное количество биотинилированных антител. Инкубировать 20 минут при 4 °C.
5. Мойте, добавив 10 мл буфера MACS и центрифугу 10 минут при 300 x g. Аспирируйте и избавляйтесь от супернатанта.
6. Ресуспендировать Т-клетки на 1 x 10⁷ элементов на 80 мкл буфера MACS. Добавьте микрошарики с антибиотиком при объёме 20 мкл на 1 x 10⁷ клеток. Хорошо перемешайте и инкубуйте 15 минут при 4 °C.
7. Мойте, добавив 10 мл буфера MACS и центрифугу 10 минут при 300 x g. Аспирируйте и избавляйтесь от супернатанта. Повторная суспензия ячеек в 500 мкл буфера MACS.
8. Положите заранее охлаждённые колонки LS на магнит. Подставьте под ним коническую трубку объёмом 15 мл для сбора жидкости.
9. Уравновесьте каждый столбец LS с 3 мл буфера MACS. Используя ту же коническую трубку объёмом 15 мл, что и сборная трубка, примените подвеску к уравновешенной колонке LS.
10. Промыйте колонку 3 раза с помощью 1 мл буфера MACS. Дайте каждой промывке 1 мл полностью пройти через колонку LS перед следующим промывкой.
11. Чтобы собрать трансгенно-положительные клетки, возьмите колонку LS из магнита и поместите его в свежую коническую трубку объёмом 15 мл. Добавьте 5 мл буфера MACS и аккуратно вытолкните жидкость из колонки.
12. Посчитайте изолированные клетки и центрифугите 10 минут при 300 x g. Трансгенно-положительные клетки суспендируют в соответствующем объёме среды с дополнением IL-2 и инкубируют до проведения функциональных и/или фенотипических оценок. Перед началом рабочих процессов проведите проверку чистоты, окрашивая маркер CAR или суррогатной трансдукции (дополнительный рисунок 2).

5. Подготовка системы

1. Включите прибор и откройте программное обеспечение Cell Analysis Suite (CAS). Убедитесь, что контейнер для сбора отходов пуст. Проверьте, есть ли вода в колонке увлажнителя.
2. Перейдите в панель рабочих процессов. Откройте рабочий процесс Full Clean (заранее загружен во время установки системы).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется запускать рабочий процесс Full Clean в течение 72 часов после начала эксперимента с прибором.
3. Выполните все проверки и переходите к нажатию «Старт». По запросу заменяйте конические трубки и бутылки с реагентами в каждом отсеке реагентов на свежие контейнеры с чистящим раствором BLI. Нажмите на иконку Run , чтобы продолжить.
4. По запросу заменяйте конические трубки и бутылки с реагентами в каждом отсеке реагентов на свежие контейнеры со стерильной водой. Нажмите на иконку Run , чтобы продолжить.
5. Откройте рабочий процесс Pre-flight Check (предварительно загружен при установке системы). Выполните все проверки и переходите к нажатию «Старт».
6. Подготовьте коническую трубку объёмом 50 мл с 2 мл смачивающего раствора. Подготовьте отдельную коническую трубку объёмом 50 мл с 39,6 мл 1x DPBS и 400 мкл увлажняющей добавки.
7. При запросе замените чип Flush на чип оптофлюидики. Нажмите на иконку Run , чтобы продолжить. Тщательно очистите поверхность оптофлюидного чипа и ферулы гнезда 70% этанола перед закрытием гнёзд.
8. По запросу заменяйте конические трубки и бутылки с реагентами в каждом отсеке реагентов на свежие контейнеры с соответствующими растворами.

6. Создание рабочего процесса анализа

1. Перейдите в панель рабочих процессов. Выберите «Создать новый рабочий процесс» (+), выберите «Профилирование Опто-Т-ячеек», затем выберите MCA и анализ цитотоксичности в выпадающем меню.
2. Дважды кликните по Multiplex Cytokine Bead Load , чтобы расширить список загрузки бусин. Если анализируешь менее 3 цитокиновых мишеней, нажмите на X , чтобы удалить цитокиновые шарики из списка загрузки бусин.
3. Обновите каждое поле соответствующим типом бусин, целевой цитокином и местом импорта.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение CAS автоматически загружает каждую шар для захвата цитокинов в порядке снижения яркости Cy5, независимо от того, как расположены записи загрузки шариков.
4. Дважды кликните по приоритетной загрузке APC с управлением , чтобы расширить список загрузки целевой ячейки. Если анализируется более чем 1 контрольная цель-ячейка и 1 образец целевой линии, добавьте дополнительные шаги загрузки ячейки.
5. Обновите каждое поле с желаемым именем линии целевой ячейки, с желаемым полем обзора (FOV) в перо и с критериями выбора APC (указав шаблон выбранного целевой ручки (TPS).
6. Выберите конфигурацию загрузки T-элементов и выберите несколько ячеек линий. Дважды кликните по приоритетной загрузке T-ячейки, чтобы расширить список загрузки T-ячейки.
7. Обновите каждое поле с нужным именем линии T-ячейки, желательными FOV для переписки и критериями выбора T-ячейки (указав шаблон TPS).
8. Дважды кликните по анализу цитотоксичности , чтобы расширить настройки цитотоксичного теста. Обновите специфические для рабочего процесса поля настроек изображения с желаемой длительностью анализа (h).
9. Двойные клики на фенотип и анализы цитокинов расширяют протокол окрашивания для анализа секреции цитокинов.
10. Обновите поля On Chip Staining, указав соответствующее место импорта для первичных и вторичных окрасок.
11. Дважды кликните по T Cell Unload , чтобы расширить список выгрузки. Обновите поле # Exports per Chip (включая бланки) до желаемого количества экспортов. Сохраните и откройте новый рабочий процесс.

7. Цитокиновая нагрузка с уловлением шариков

1. Соникейт и/или вихрь каждого флакона с бусинами, чтобы полностью подвесить бусины захвата. Определите концентрацию шариков с помощью ячейкового счётчика.
2. Отрегулируйте плотность шариков до 4,5 x 10⁶ шариков/мл (бусины типа A) или 4 x 10⁶ шариков/мл (бусины типа B) в 30 мкл буфера разбавления шариков.
3. Храните подвески с шариками при 4 °C до тех пор, пока не потребуется загрузить в отсек для загрузки образцов. Выполните все проверки и переходите к нажатию «Старт».
4. По запросу смешайте цитокиновую суспензию с пипеткой объемом 20 мкл и загрузите подвеску в соответствующее место импорта. Нажмите на иконку Run , чтобы продолжить.
5. По запросу визуально осмотрите несколько зрителей, чтобы убедиться, что шарики захвата распределены равномерно по жидкостным каналам с нужной плотностью. Если распределение нагрузки и/или плотность были неоптимальными, выберите Flush и Import , чтобы повторно попытаться загрузить бусинки. Если распределение и плотность нагрузки были достаточными, выберите «Продолжить » для начала вырезки бусин.
6. Повторите шаг 7.3 для каждого шарика захвата цитокино.

8. Нагрузка на целевую ячейку

1. Определите плотность живой клетки каждой линии-мишени с помощью окрашивания Trypan Blue.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот рабочий процесс предполагает, что целевые клетки получены из активных культур. Если собираются использовать криоконсервированные клетки, убедитесь, что клетки были культивированы хотя бы в одном проходе после оттаивания и пригодны не менее 90%.
2. Соберите 1 x 10⁶ целевых клеток в микрофужную трубку объёмом 1,7 мл. Центрифугу при 300 г в течение 5 минут на RT. Аспирировать супернатант.
3. Повторно суспензируйте каждую целевой ячейку в 100 мкл раствора для окрашивания Annexin V. Инкубировать 30 минут на RT, защищённый от света.
4. Добавьте 400 мкл 1x Annexin V Binding Buffer и повторно подвесите с помощью пипетирования. Центрифугу при 300 г в течение 5 минут на RT. Аспирировать супернатант.
5. Суспензируйте каждую мишенную ячейку в 250 мкл загрузочной среды +_CaCl2. Храните подвески целевых ячейок при 4 °C до появления запроса загрузить в отсек для загрузки образцов.
6. При запросе подвесьте целевые ячейки пипеткой объемом 200 мкл и загрузите подвеску целевой ячейки в соответствующее место импорта. Нажмите на иконку Run , чтобы продолжить.
7. По запросу визуально осмотрите несколько FOV, чтобы убедиться, что целевые клетки загружены равномерно по жидкостным каналам с нужной плотностью. Если распределение нагрузки и/или плотность были неоптимальными, выберите Flush и Import для повторной попытки загрузки целевой ячейки. Если распределение и плотность нагрузки были достаточными, выберите Продолжить , чтобы начать TPS-гейтинг.
8. При запросе перейдите в раздел «Ручные операции», затем нажмите TPS и загрузите запрошенный шаблон TPS.
9. Укажите оптические фильтры и поле зрения для определения TPS-элементов, затем нажмите «Захват только », чтобы начать получение изображения.
10. Откройте редактор настройки гейтинга, нажмите галочку для Annexin и выберите подходящий канал для окрашивания Annexin V для параметра X. В выпадающем меню выберите Log (Delta Median Brightness). Выберите OEP для параметра Y. В выпадающем меню выберите «Ближайший сосед».
11. Перетащите углы полученного элемента, чтобы исключить^низкие ячейки Annexin V^hi и Nearest Neighbor, затем сохраните шаблон TPS, не меняя имя файла.
12. Перейдите обратно в раздел рабочих процессов и нажмите Продолжить , чтобы продолжить пенирование. Повторяйте шаги 8.7–8.11 для каждой линии целевой клетки.

9. Нагрузка на Т-элементы

1. Определите плотность живых клеток каждой линии Т-клеток с помощью окрашивания Trypan Blue.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот рабочий процесс предполагает, что Т-клетки получаются из активных культур. Если собираются использовать криоконсервированные клетки, убедитесь, что клетки были культивированы за ночь после оттаивания и пригодны не менее 90%.
2. Соберите 1 x 10⁶ Т-клеток в микрофужную трубку объёмом 1,7 мл. Центрифугу при 300 г в течение 5 минут на RT. Аспирировать супернатант.
3. Повторно суспензируйте каждую целевой ячейку в 100 мкл раствора для окрашивания Annexin V. Инкубировать 30 минут на RT, защищённый от света.
4. Добавьте 400 мкл 1x Annexin V Binding Buffer и повторно подвесите с помощью пипетирования. Центрифугу при 300 г в течение 5 минут на RT. Аспирировать супернатант.
5. Повторно суспензируйте каждую Т-ячейку в 250 мкл загрузочной среды +_CaCl2. Храните подвески T-элементов при 4 °C до появления запроса загрузки в отсек для загрузки образцов.
6. По запросу подвесьте целевые ячейки пипеткой объемом 200 мкл и загрузите подвеску T-элементов в соответствующее место импорта. Нажмите на иконку Run , чтобы продолжить.
7. По запросу визуально осмотрите несколько FOV, чтобы убедиться, что Т-клетки распределены равномерно по флюидным каналам с нужной плотностью. Если распределение нагрузки и/или плотность были неоптимальными, выберите Flush и Import для повторной попытки загрузки T-ячейки. Если распределение и плотность нагрузки были достаточными, выберите Продолжить , чтобы начать TPS-гейтинг.
8. При запросе перейдите в раздел «Ручные операции», затем нажмите TPS и загрузите запрошенный шаблон TPS.
9. Укажите оптические фильтры и поле зрения для определения TPS-элементов, затем нажмите «Захват только », чтобы начать получение изображения.
10. Откройте редактор настройки гейтинга, нажмите галочку для Annexin и выберите подходящий канал для окрашивания Annexin V для параметра X. В выпадающем меню выберите Log (Delta Median Brightness). Выберите OEP для параметра Y. В выпадающем меню выберите «Ближайший сосед».
11. Перетащите углы полученного элемента, чтобы исключить^низкие ячейки Annexin V^hi и Nearest Neighbor, затем сохраните шаблон TPS, не меняя имя файла.
12. Перейдите обратно в раздел рабочих процессов и нажмите Продолжить , чтобы продолжить пенирование. Повторяйте шаги 9.7–9.11 для каждой линии Т-ячейки.

10. Анализ на цитотоксичность

1. Подготовьте перфузионную среду в конической трубке объёмом 50 мл, добавив 100 мкл предварительно размораженного реагента NucView 530 Caspase-3 к 20 мл Т-клеточной среды (запасная концентрация 1 мМ, конечная концентрация 5 мкм).
2. По запросу заменяйте соответствующую коническую трубку в отсеке реагента на подготовленную коническую трубку с перфузионной средой. Нажмите на иконку Run , чтобы продолжить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 20 мл перфузионного материала достаточно для перфузии одного оптофлюидного чипа в течение 24 часов. Подготовьте дополнительную перфузионную среду, если анализ цитотоксичности длится более 24 часов.
3. Если хотите, прекратите все оставшиеся этапы анализа цитотоксичности после 14 часов, нажав «Пропустить остаток TPS-изображения» и приступите к работе.

11. Анализ фенотипа и цитокинов

1. Приготовьте первичный раствор для окрашивания в пробирке микрофуги объемом 1,7 мл, смешав 76 мкл мультиплексных антител для обнаружения человеческой CD8/NK панели и 4 мкл анти-CD137_BV421.
2. Смешивайте с помощью пипета и храните при 4 °C до появления сигнала для загрузки. По запросу смешайте первичный раствор для окрашивания с пипеткой объемом 20 мкл и загрузите в соответствующее место для импорта. Нажмите на иконку Run , чтобы продолжить.
3. Подготовьте вторичный раствор для окрашивания в отдельной микрофужной трубке объемом 1,7 мл, смешав 72 мкл 1x DPBS с 8 мкл мультиплексного комплекта SA-PE.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичный раствор для окрашивания следует подготовить заранее, чтобы он был готов к загрузке сразу после завершения первичной окраски.
4. Смешивайте с помощью пипета и храните при 4 °C до появления сигнала для загрузки. По запросу смешайте вторичный раствор для окрашивания с пипеткой объемом 20 мкл и загрузите в соответствующее место для импорта. Нажмите на иконку Run , чтобы продолжить.

12. Анализ анализов

1. Перейдите на рабочий стол и откройте программное обеспечение Assay Analyzer . Выберите Анализатор анализа, затем Рабочие процессы, затем тип рабочего процесса для анализа.
2. Используйте любые желаемые критерии для определения интересующих ручек для разрядки. Сгенерируйте список разгрузки согласно нужным критериям, затем вернитесь в программное обеспечение CAS и выберите «Продолжить выбранный рабочий процесс».
3. Проверьте галочку для списка «Создать экспорт» с помощью анализатора анализатора: [идентификатор чипа оптофлюидиков] отмечена.

13. Разгрузка

1. Подготовьте пластину с круглым дном на 96 лунок и 50 мкл Т-элемента на каждую скважину. Нажмите «Продолжить », чтобы продолжить разгрузку ячеек.
2. При запросе откройте отсек загрузки чипа, откройте крышку гнезда и удалите чип для оптофлюидики. Поместите чип в стерильную чашу Петри, приподняв верхний край оптофлюидического чипа на >1°, чтобы клетки не выкативались из ручок. Храните в стерильном инкубаторе для культуры тканей во время следующего этапа промывки.
3. Положите стерильный чип Flush в пустое гнездо, закройте крышку, затем закройте отсек для чипов. Нажмите «Готово » и продолжите.
4. Когда потребуется запрос, откройте отсек для загрузки чипа, откройте крышку гнезда и удалите чип Flush. Вставьте чип от оптофлюида в пустое гнездо, закройте крышку гнезда, затем закройте отсек для чипов. Нажмите на иконку запуска, чтобы продолжить.
5. При запросе выберите «Открыть », чтобы отобразить меню Load/Unload Well Plate . Нажмите «Выгрузить », чтобы снять предыдущую пластину. Обновите ID пластины скважины и тип пластины, выберите «Загрузить», затем «Готово».
6. Нажмите «Продолжить », чтобы продолжить разгрузку ячеек. После того как все нужные ручки будут разгружены, перейдите в раздел «Ручные операции » и откройте отсек для чипов, чтобы достать пластину с интересующими элементами.

Results

Используя описанный протокол, мы проверили индивидуальные CAR Т-клетки с имитацией нуклеофектированных, CAR и c-Jun с гиперэкспрессией CAR с опухоловыми клетками K562 с антигенотрицательным или положительным по рисунку 3, либо оставили их нестимулированными (только Т-клетки). Целевые клетки оценивались на однородную экспрессию антигена как предпосылку для воспроизводимых результатов (дополнительный рисунок 3). Благодаря их выделению в отдельных нанопенах мы смогли охарактеризовать профили экспрессии цитокинов этих клеток как одно- , двойные или тройные продуценты в зависимости от тестируемого состояния (рисунок 3). Эти результаты были подтверждены с использованием ELISA как проверенного метода обнаружения цитокинов (дополнительный рисунок 4).

Как и ожидалось, большинство Т-клеток с имитацией нуклеофекции остались отрицательными по всем трём измеряемым цитокинам (TNF-α, IFN-γ и IL-2). Среди стандартных CAR Т-клеток были обнаружены двойные, тройные и одноположительные производители цитокинов IFN-γ, а также небольшие фракции клеток, секретирующих TNF-α и IL-2, при этом воздействие на антиген-отрицательные опухолевые клетки не вызывало секрецию многоклеточных цитокинов. Интересно, что чрезмерная экспрессия c-Jun увеличивала долю производителей двойных и тройных цитокинов, а также клеток, выделяющих одноцитокиновые клетки, при встрече с целью, тем самым снижая общую долю цитокин-отрицательных клеток по сравнению со стандартными CAR T-клетками. Эти результаты согласуются с предыдущими отчетами, описывающими фенотипическую модуляцию CAR T-клеток с помощью принудительной экспрессии этого транскрипционного^{фактора 6}. Примечательно, что мы наблюдали большую долю IFN-γ-положительных клеток в группе только Т-клеток, чем в группе опухолей-отрицательных антигенов, что может быть связано с меньшим количеством анализируемых клеток в этом состоянии.

Для дальнейшего изучения активации Т-клеток мы оценили экспрессию CD137 у отдельных мок-нуклеофектированных, CAR и c-Jun-гиперэкспрессирующих CAR T-клетках, рассматриваемых как описано выше (Рисунок 4 и Дополнительная таблица 1). Сложность CAR T-клеток с антиген-экспрессирующими целевые клетки K562 привела к повышению экспрессии CD137 по сравнению с клетками с имитацией нуклеофекции. Кроме того, мы наблюдали тенденцию к немного более высокой доле CD137-положительных клеток среди c-Jun-переэкспрессированных CAR T-клеток по сравнению со стандартным продуктом CAR.

В заключение, описанный протокол позволил оценить секрецию цитокинов и активацию CAR T-клеток на уровне одной клетки, что позволило выявить производителей одно- и многоклеточных цитокинов и повторить фенотипические тенденции, ранее описанные на уровне^{объема 6}.

Рисунок 1: Схематический рабочий процесс для мультимодального профилирования с помощью оптофлюидической платформы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Репрезентативные изображения различных особенностей оптофлюидных платформ. (A) Импортировать последовательность отдельных частиц в отдельные ручки через OEP. Ручки в левой части изображений были загружены в предыдущей последовательности. (B) Убийственные события в трёх отдельных ручках со временем, демонстрируя опухолевые клетки, экспрессирующие антиген, экспрессирующие GFP. (C) Экспорт отдельной ячейки из одной ручки через OEP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Репрезентативный анализ профилей секреции цитокинов на уровне отдельных клеток . Отдельные Т-клетки с имитацией нуклеофекции или CAR-T-клетки культивировались при наличии или отсутствии антиген-отрицательных или антиген-положительных опухолевых клеток K562 внутри нанонона, содержащих шарики захвата цитокинов для TNF-α, IL-2 и IFN-γ. Круговые диаграммы показывают пропорции индивидуально сформированных CAR-T-клеток с указанным профилем секреции цитокинов после 24 часов совместной культуры (анализ конечной точки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Репрезентативный анализ экспрессии CD137 на уровне одной клетки. Отдельные Т-клетки с имитацией нуклеофекции или CAR-T окрашивались на экспрессию поверхности CD137 на оптофлюидическом чипе через 24 часа после культуры при наличии или отсутствии опухольевых клеток K562 с антигенотрицательной или положительной по антигену. Скрипичные графики показывают флуоресцентную интенсивность экспрессии CD137 на макетных нуклеофектированных Т-клетках и CAR-T-клетках после 24 часов культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Компоненты среды Т-элемента (стерильные фильтры с помощью вакуумных фильтров 0,22 мкм)	Объём (конечная концентрация)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 мл
Пенициллин/стрептомицин (10 000 U/mL)	5 мл (90 U/mL)
β-Меркаптоэтанол (50 мм)	0,5 мл (45 мкм)
Человеческая сыворотка (инактивированная теплом)	50 мл (9%)
Добавка GlutaMAX (100 раз)	5 мл (0,9x)
Компоненты среды опухолевых клеток	Объём (конечная концентрация)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 мл
Пенициллин/стрептомицин (10 000 U/mL)	5 мл (90 U/mL)
Сыворотка для плода телята (инактивирована теплом)	50 мл (9%)
Компоненты буфера MACS	Объём (конечная концентрация)
DPBS (Mg2+-free,Ca 2+-free)	500 мл
Сыворотка для плода телята (инактивирована теплом)	2,5 мл (0,5 %)
EDTA (0,5 м)	2 мл (2 мМ)
Компоненты буфера PBS/EDTA	Объём (конечная концентрация)
DPBS	500 мл
EDTA (0,5 м)	2 мл (2 мМ)
Компоненты загрузки носителей	Объём (конечная концентрация)
Среда Т-ячейки	18 мл
Загрузочный реагент	2 мл
Загрузочный носитель + компоненты CaCl2	Объём (конечная концентрация)
Загрузка носителей	499 мкл
CaCl2	1,25 мкл
Перфузионная среда + Каспазный субстрат	Объём (конечная концентрация)
Среда Т-ячейки	20 мл
Субстрат NucView 530 Caspase-3 (1 мМ в DMSO)	100 мкл
Компоненты буфера разбавления шариков	Объём (конечная концентрация)
DPBS	800 мкл
BSA (2% с победой)	100 мкл (0,2% в/в)
Tween-20 (10% с победой)	10 мкл (0,1% в/в)

Таблица 1: Подготовка среды и буфера.

Дополнительный рисунок 1. Образцовая гейтинг-стратегия оценки эффективности переноса генов до магнитного обогащения. Примерные контурные и гистограммные графики показывают стратегию гейтинга для выявления CAR-экспрессирующих (tEGFR-положительных) CAR Т-клеток после проведения переноса генов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2. Контроль чистоты после сортировки .Примерные контурные графики показывают долю CAR-экспрессирующих (tEGFR-положительных) CAR T-клеток после проведения магнитной сортировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3. Экспрессия антигена на целевых опухолевых клетках. Репрезентативные графики гистограммы показывают опухолевые клетки WT K562 или модифицированные для экспрессии ROR1, окрашенных изотипами или антителами, направленными на ROR1, с помощью потоковой цитометрии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 4. Обнаружение цитокинов с использованием стандартного ELISA. Концентрации IL-2 и IFN-γ в супернатанте после 24 часов совместной культуры с опухолями K562^ROR1 при E:T 4:1, измеренными с помощью LISA для CAR и CAR+cJ T-клеток. Статистическая значимость, определяемая непарным t-тестом с *P≤ 0,05, **P≤ 0,01, ***P≤ 0,001, ****P≤ 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 1: Проанализированные клетки. В таблице указано количество отдельных ячеек, проанализированных в каждом состоянии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

Продемонстрированный рабочий процесс позволяет оценивать секрецию цитокинов и профиль активации отдельных CAR-T клеток во время совместной культуры с антиген-положительными и антиген-отрицательными целями, что по желанию может сочетаться с оценкой цитолитической активности. Хотя возможность собирать мультимодальные функциональные данные с разрешением одной ячейки предоставляет возможность анализа производительности CAR T-клетки с беспрецедентной точностью, количественная измеримость измерений сильно зависит от точности технологии OEP при загрузке одинакового количества шариков захвата цитокинов, целевых ячеек и CAR-T ячеек в каждое перо. Поэтому крайне важно оптимизировать плотность нагрузки и критерии TPS каждого реагента или образца клетки для обеспечения загрузки с одной шарикной и/или одной ячейкой в каждом загоне. Хотя адаптация концентрации подвески шарика или ячейки в флюидических каналах позволяет обеспечить адекватную загрузку пера, опции Flush и Import на платформе служат дополнительной стратегией для повторной попытки загрузки.

Одной из преимуществ дизайна оптофлюидического чипа является разделение компоновки пера на 22 отдельных точки зрения. Загрузив Т-клетки, спроектированные с использованием различных CAR-конструкций, в разные FOV внутри оптофлюидического чипа, мы также смогли оценить, может ли альтернативная конструкция, обеспечивающая сверхэкспрессию c-Jun, улучшить генерацию CAR-T клеток с мультимодальной функциональностью по сравнению со стандартной конструкцией CAR (Рисунок 3 и Рисунок 4). Таким образом, оптофлюидическая платформа позволяет быстро выявлять кандидатные конструкции CAR, которые могут повысить долговечность ремиссии рака, вызванной CAR-T-клетками. Стоит отметить, что анализ взаимодействия между мишенными и эффекторными клетками на уровне одной клетки требует решающего контроля ключевых параметров, например, гетерогенности экспрессии мишенных антигенов на опухолевых клетках и чистоты популяции CAR-T-клеток (дополнительный рисунок 2 и дополнительный рисунок 3).

Хотя мы сосредоточились на оценке секреции IL-2, TNF-α и IFN-γ, широкий спектр растворимых аналитов с помощью коммерчески доступных мультиплексных панелей захвата цитокинов позволяет значительно настраивать рабочий процесс. Недавние достижения показывают, что область также развивается в направлении высокомерной проточной цитометрии, открывая новые возможности для синергии с функциональным профилированием различных типов иммунных^{клеток 12,13}. Например, будущие применения могут включать скрининговые кампании для выявления полифункциональных регуляторных Т-клеток (Treg), экспрессирующих CAR. Они выделяют несколько противовоспалительных цитокинов, таких как TGF-β и^IL-1014. Таким образом, адаптивность оптофлюидической системы может проложить путь для критически важных открытий по мере расширения клеточной иммунотерапии на новые рубежи в лечении незлокачественных заболеваний.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4D-нуклеофектор	Лонза
Антибиотиновые микрошарики	Miltenyi Biotec	130-090-485
CD3/CD28 Dynabeads	Термо Фишер	11131D
Комплект для изоляции Т-клеток CD8+	Miltenyi Biotec	130-096-495
Конические трубки CELLSTAR объемом 15 мл (PP)	Greiner Bio-One	188271-N
Конические трубки CELLSTAR объемом 50 мл (PP)	Greiner Bio-One	227261
Корнинг 75 см² U-образная наклонная колба для клеток на шее с крышкой для уплотнения пробок	Корнинг	430720U
Costar с 24 скважиной прозрачной TC-обработанной пластиной с несколькими скважинами, индивидуально упакованные, стерильные	Корнинг	3526
Costar с 48 скважинами прозрачных TC-обработанных пластин с несколькими скважинами, индивидуально упакованные, стерильные	Корнинг	3548
DPBS, без кальция, без магния	Термо Фишер	14190169
Магнит DynaMag-15	Термо Фишер	12301D
EGFR (Эрбитукс, Цетуксимаб)	Эли Лилли	NDC 66733-948-23	Для внутреннего сопряжения (биотин)
Антитела EGFR (C225 (цетуксимаб)) [Alexa Fluor 647]	Novus Biologicals	NBP2-75903AF647
Плодная бычья сыворотка, ценность	Термо Фишер	A5256801
Добавка GlutaMAX (100 раз)	Термо Фишер	35050038
Человеческий ИЛ-2, премиум-класс	Miltenyi Biotec	130-097-748
Человеческая сыворотка	Deutsches Rotes Kreuz (DRK)/ Немецкий Красный Крест (GRC)	Н/Д
Столбец разделения клеток MACS, LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
P3 первичная ячейка 4D-нуклеофектор X-комплект	Лонза	V4XP-3032
Плотность Pancoll человек: 1,077 г/мл	PanBiotech	P04-60500
Набор для обнаружения апоптоза PE Annexin V I	BD Biosciences	559763
Пенициллин-стрептомицин (10 000 U/мл)	Термо Фишер	15140122
Комплект для биотинилирования и изоляции поверхности клеток Пирса	Термо Фишер	A44390
Стартовый набор QuadroMACS (LS)	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI 1640 Medium, Glutamax Supplement, HEPES	Термо Фишер	72400054
Серологические пипетки 2, 5, 10, 25 и 50 мл	Greiner Bio-One	710180, 606180, 607180, 760180, 768180
Трипан-синий морил (0,4%)	Термо Фишер	15250-061
UltraPure 0,5  M EDTA, pH 8,0	Термо Фишер	15575020
β-меркаптоэтанол (50 мМ)	Термо Фишер	31350010
Реагенты маяка
96-колодцевая, круглая пластина	Корнинг	3799
Чип Beacon Plastic Flush		500-00030
Чистящий раствор BLI, натрий гипоклоит, 0,825%	Bruker	520-08000
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Сигма-Олдрич	A4161
Антитело Brilliant Violet 421 против человека CD137 (4-1BB)	Биолегенда	309820
Хлорид кальция (CaCl2)	Сигма-Олдрич	C5670
LEGENDplex Human IFN-и гамма; Захватные бусины B3, 13X	Биолегенда	740545
LEGENDplex Human IL-2 Захват Шарика A5, 13X	Биолегенда	740934
LEGENDplex Человеческие антитела к обнаружению Th Panel V02	Биолегенда	741041
LEGENDplex Человек, TNF-и альфа; Шарик захвата B7, 13X	Биолегенда	740711
LEGENDplex SA-PE	Биолегенда	740452
Субстрат NucView 530 Caspase-3, 1 мМ в DMSO	Hö lzel	B-10406
OptoSelect Chip 3500	Bruker	500-12001
Натрий Азид	Сигма-Олдрич	S2002
TWEEN 20	Сигма-Олдрич	P1379
Буфер экспорта веганов	Bruker	520-00040
Бутылки VWR Media, квадратные, PETG, 125 мл	VWR	216-2265
Бутылки VWR Media, квадратные, PETG, 500 мл	VWR	216-2267
Увлажняющая добавка	Bruker	520-08016
Раствор для увлажнения	Bruker	520-00009