Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Терапевтические эффекты экстракта Acorus calamus L. на кожные повреждения, вызванные радиацией, в модели крыс

469 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69705

⸱

9 января 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine, General Hospital of Northern Theater Command, 2College of Medicine and Biological Information Engineering, Northeastern University, 3Shenzhen Institute for Advanced Study, University of Electronic Science and Technology of China

В этой статье

Краткое содержание

Травма кожи, вызванная радиацией, является распространённым и тяжёлым осложнением лучевой терапии у онкологических пациентов. Эффективного клинического лечения нет. Этот протокол оценивает терапевтический эффект экстракта Acorus calamus L. на кожные повреждения, вызванные радиацией, с целью создания новых кандидатов в препараты и терапевтических стратегий для его клинической профилактики и лечения.

Аннотация

Кожные повреждения, вызванные лучевой реакцией, являются распространённым и изнуряющим осложнением в терапии рака, часто приводящим к задержке заживления ран и увеличению дискомфорта у пациентов. Существует несколько терапевтических препаратов для профилактики или лечения. Традиционная китайская медицина, в частности Acorus calamus L., показала потенциал в лечении различных кожных заболеваний, но её эффективность при повреждениях, вызванных радиацией, остаётся недостаточно изученной.

В этом исследовании использовалась модель крыс Спрага-Доули, подвергшаяся радиации 45 Gy для индуцирования кожных повреждений. Крыс обрабатывали экстрактом Acorus calamus L. с 10%, 20% и 40% в течение 45 дней. Заживление ран, воспаление, апоптоз и ангиогенез оценивались с помощью скоростей заживления ран, гистопатологического анализа, измерений цитокинов, окрашивания TUNEL и иммуногистохимии. Лечение Acorus calamus L. ускорило заживление раны, при этом средняя дозировка показала наивысшую скорость заживления (88,97% через 45 дней). Гистопатологический анализ выявил снижение воспаления, улучшенную организацию коллагена и формирование новых кровеносных сосудов. Уровень воспалительных цитокинов в сыворотке (IL-1β, IL-6, TNF-α) значительно снизился, а апоптоз — снижен с модуляцией ключевых апоптотических белков (P53, Bax, Bcl-2). Экспрессия VEGF и bFGF была повышена, что способствовало ангиогенезу и восстановлению тканей. Acorus calamus L. усиливает заживление кожных травм, вызванных радиацией, снижая воспаление, подавляя апоптоз и способствуя ангиогенезу. Эти результаты свидетельствуют о его потенциале как терапевтического средства для лечения радиационно индуцированного повреждения кожи, предоставляя перспективную альтернативу для лечения кожных травм, вызванных радиацией, в клинической онкологии. Необходимы дальнейшие исследования для уточнения его молекулярных механизмов.

Введение

Травма кожи, вызванная радиацией, является частым и сложным осложнением как при ядерных авариях, так и при лучевой терапииопухолей 1. При лучевой терапии около 95% пациентов развивают определённую степень повреждения кожи, включая эритему, десквамацию, рецидивирующие некротические язвы, постоянную боль и повышенный риск прогрессированиязлокачественного развития 2. Эти поражения часто оказываются рефрактерными к лечению, значительно снижая качество жизни пациентов и иногда требуя прерывания лучевой терапии, что создаёт серьёзную клиническую проблему в радиационнойонкологии 3. Основные механизмы повреждения кожи, вызванных радиацией, сложны и в основном связаны с образованием свободных радикалов в кожных тканях, что нарушает клеточные процессы и усугубляет процессзаживления 4,5. Это приводит к длительной экспрессии генов, связанных с апоптозом, нарушению воспалительных реакций и изменённым сигнальным путям, что способствует устойчивому характеру ран, вызванныхрадиацией 6.

В настоящее время не существует универсально признанной золотой стандартной терапии для кожных повреждений, вызванных радиацией. Клиническое лечение уделяет внимание противовоспалительным или антиоксидантнымметодам 7, в частности местным кортикостероидам, которые снижают кожные реакции с помощью противовоспалительных и иммуносупрессивных эффектов, но при длительном использовании могут вызывать истончение кожи8. Амифостин, одобренное FDA радиопротекторное средство, ограничено в клиническом применении из-за значительных побочныхэффектов 9. Факторы роста ускоряют заживление ран, способствуя пролиферации клеток, ангиогенезу и формированию грануляционной ткани, однако их действия узконаправленны, они обеспечивают ограниченный контроль над повреждениями и воспалениями глубоких тканей и несут риск чрезмернойгиперплазии 7. В результате традиционная китайская медицина (ТКМ) привлекла внимание своей целостной философией, множеством активных компонентов с разнообразными терапевтическими эффектами и благоприятным профилем безопасности. Предыдущие исследования показали, что натуральные продукты, такие как экстракт лакрицы, полисахариды алоэ и куркумин, облегчают воспаление и повреждение тканей, вызванное радиацией, поглощая свободные радикалы, ингибируя провоспалительные медиаторы (TNF-α, IL-6) и способствуя пролиферациифибробластов 10,11,12. Однако большинство этих исследований изучают отдельные активные соединения или отдельные цели, что не даёт достаточного понимания механизмов многокомпонентного синергетического действия. Acorus calamus L., растение, хорошо известное своими противовоспалительными, антиоксидантными, антибактериальными и заживляющими свойствами ран, проявило потенциал при различных кожных заболеваниях.

Acorus calamus L., многолетнее растение из семейства Araneae, содержит несколько биоактивных соединений, включая терпены, фенилпропаноиды, флавоноиды, стероиды и алкалоиды. Его многокомпонентный состав позволяет одновременно воздействовать на несколько целей, создавая синергетические фармакологическиеэффекты 13. Исследования показывают, что он ингибирует воспалительные сигнальные пути, такие как NF-κB и MAPK, а дозозависимо снижает экспрессию мРНК провоспалительных факторов, таких как TNF-α и IL-6, одновременно увеличивая активность антиоксидантных ферментов, таких как SOD и GSH-Px, тем самым оказывая противовоспалительные и антиоксидантные и антибактериальныеэффекты 14,15. Несмотря на задокументированные преимущества в лечении кожных заболеваний, вызванных инфекциями и аллергиями, роль Acorus calamus L. в кожных травмах, вызванных радиацией, остаётся недостаточно изученной. Недавние исследования показали её защитное действие от повреждений, вызванных радиацией, способствуя заживлению ран и снижаявоспаление 13. Однако специфические терапевтические механизмы Acorus calamus L. при кожных травмах, вызванных радиацией, до конца не прояснены.

Общая цель данного исследования — оценить терапевтические эффекты экстракта Acorus calamus L. на животных моделях кожных повреждений, вызванных радиацией. Мы оцениваем заживление ран, воспалительные реакции и поведение клеток, чтобы прояснить механизмы действия экстракта с разных точек зрения. Результаты направлены на создание теоретической основы использования Acorus calamus L. в клиническом лечении кожных поражений, возникающих в результате радиотерапии рака. Кроме того, в исследовании будут представлены функциональные характеристики экстракта, подходящие сценарии вмешательства и основные данные об эффективности, чтобы помочь читателям оценить, соответствует ли этот подход, основанный на натуральном продукте, их исследовательские или клинические потребности. В конечном итоге эта работа направлена на эффективные терапевтические варианты для улучшения качества жизни пациентов, проходящих лучевую терапию опухоли.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Описанные в этом исследовании эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике медицинских исследований животных Северного театра военных действий (номер одобрения этики: 2018-03). Для исследования использовались самцы SD класса SPF (6-8 недель, вес 190-220 г). Детали используемых реагентов и оборудования приведены в Таблице материалов.

1. Содержание экспериментальных животных

  1. Выберите 108 самцов SD с SPF, возрастом от 6 до 8 недель и весом от 190 до 220 г.
  2. Поддерживайте комнатную температуру животных на уровне 22 ± 2 °C, относительной влажности 50 ± 5% и 12-часового цикла светло-тёмный. Дайте крысам свободный доступ к еде и воде. После недельного периода акклиматизации переходите к последующим экспериментам.

2. Группирование животных

  1. Крыс случайным образом разделяют на пять отдельных групп: нормальная группа (нормальная, n = 18), модельная группа (модель, n = 18), положительные группы (положительные, n = 18, крем с бетаметазоном)16, экспериментальная группа с низкой дозой (экспериментальная L, n = 18), среднедозовая экспериментальная группа (экспериментальная M, n = 18) и группа с высокими дозами (экспериментальная H, n = 18). За исключением нормальной группы, все группы подвергались воздействию радиации.

3. Создать животную модель радиоактивного повреждения кожи

  1. Вводите анестезию с точностью и минимальным дискомфортом с помощью интрабрюшинной (i.p.) инъекции раствора пентобарбитала 1% натрия (40 мг/кг). Подтвердите глубину анестезии, наблюдая отсутствие роговицового рефлекса и отсутствие реакции на защемление пальцев. Нанесите мазь на глаза крыс, чтобы предотвратить сухость.
  2. Удалите волосы на спине с помощью электробритвы. Затем продезинфицируйте спину йодом и 75% спиртом.
  3. Положите каждую крысу в положение лёжа. Закрепите 32P-β излучатель (поверхностная доза: 0,9 Гр/мин) над двусторонней областью позвоночника (2 см × 2 см), центрированной в 1 см латерально от средней линии, обеспечивая, чтобы источник контактировал с эпидермисом без зазора. Закрепите аппликатор стерильной медицинской лентой, чтобы предотвратить смещение во время облучения. Облучите целевую область кожи в течение 50 минут, чтобы получить общую поглощённую дозу 45 Gy17.
  4. Когда крыса приходит в сознание после облучения, её возвращают в индивидуальную клетку, обеспечивая доступ к воде и еде ad libitum, поддерживая температуру 22 ± 2 °C, относительную влажность 50 ± 5% и 12-часовой цикл светло-темноты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальный процесс должен строго соответствовать установленным принципам биологической и радиоактивной профессиональной защиты. Кроме того, все операционные процедуры должны соответствовать правилам правильной и соответствующей утилизации медицинских и радиоактивных отходов, чтобы обеспечить безопасность и здоровье всех вовлечённых сотрудников.

4. Подготовка экстракта Acorus calamus L. и введение лекарств

  1. Взвесьте корневища Acorus calamus L., тщательно очистите, дайте высохнуть на воздухе и измельчите в крупный порошок (40 сетки). Включить 10-20 объёмов 50% этанола и гомогенизировать при комнатной температуре в течение 24 часов
  2. После того как экстракт оседл в течение 30 минут, декантируйте супернатант и проведите предварительное фильтрование через 4-8 слоёв марли для удаления крупных примесей. Затем фильтруйте с помощью фильтрующей бумаги и испарите фильтрат под пониженным давлением в ротационном испарителе при температуре 50-60 °C для восстановления растворителя, в результате чего получается твёрдый остаток без растворителя (AE, влажность < 5%).
  3. Препарат мазиAE 18
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сформулируйте мази с экстрактом Acorus calamus L. 10% (Экспериментальная-L, ч/б), 20% (Экспериментальная-M, ч/б) и 40% (Экспериментальная-H, ч/ж) Acorus calamus L. в соответствии с изданием Китайской фармакопеи 2020 года (Общая глава 0109)19.
    1. Точно взвесьте AE (например, 20 г для мази 20%) и соответствующий фармацевтический вазелин (например, 80 г для мази 20%).
    2. Добавьте 10% всего валеина в AE, интенсивно тритурируйте в течение 5 минут, чтобы получить однородную пасту (геометрический метод разбавления, обеспечивающий равномерное распределение AE в липофильном основании).
    3. Растопите оставшийся вазелин при 60 °C, остудите до 55 °C и медленно добавляйте в пасту AE-вазелка.
    4. Перемешивайте магнитным способом при 250 об/мин в течение 30 минут при 55 °C, затем непрерывно перемешивайте, охлаждая до комнатной температуры, чтобы получить гладкую, безчастицевую мазь.
    5. Подготовка для заготовки контроля: расплавить вазелок при 60 °C, перемешивать при 250 об/мин 30 минут и остыть до комнатной температуры (идентично базе мази AE).
    6. Храните все мази и пустой вазелинок при 4 °C в герметичных стерильных контейнерах.
  4. Все группы вводили местными препаратами дважды в день в 09:00 и 17:00 в течение 45 последовательных дней после облучения (нормальная группа, не облучившаяся, получила одинаковый график введения синхронно). Применяемая доза составляла 0,2 г/см², равномерно распределённая по площади дорсальной кожи размером 2 см × 2 см. Обычная группа получила транспортное средство (петролатум), а модельная группа — транспортное средство (петролатум). Положительная контрольная группа получила крем с бетаметазоном. Экспериментальные группы L, M и H получили кремы, содержащие AE в 10%, 20% и 40% (w/w) соответственно. После каждого нанесения обработанную область аккуратно массировали в течение 10 секунд для улучшения всасывания, а крыс фиксировали на 5 минут, чтобы предотвратить облизывание.

5. Сбор ткани кожи крыс и крови

  1. Анестезиируйте крыс с помощью 1% раствора пентобарбитала натрия (40 мг/кг, ин..). Продезинфицируйте хирургические инструменты и удалите кожу вдоль места раны.
  2. Зафиксировать часть ткани в 4% параформальдегида (10 мл), другую часть — в глутаральдегид/тетроксид осмия (5 мл, 2,5%), а остальное сохранить в жидком азоте для дальнейшего анализа (см. таблицу материалов).
  3. Возьмите образцы крови из брюшной аорты крысы. Центрифуга при 3 000 × г при 4 °C в течение 15 минут; аспирировать супернатант в EP-трубки; аликвот и храните при -80 °C.

6. Оценка исцеления

  1. Наблюдайте за раной на 7-й, 15-й, 30-й и 45-й дни после облучения и снимайте поверхность раны камерой высокого разрешения. Импортируйте изображения в ImageJ и нарисуйте область раны вдоль края раны. Вычислите площадь на изображении. Убедитесь, что каждая операция согласована, чтобы избежать ошибок измерений. Рассчитайте время заживления раны и скорость заживления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость заживления ран (%) = (Начальная облучённая зона - Незажившая область раны) / Начальная облучённая зона. Критерии заживления раны: полное заживление определяется как либо покрытая корка < 5% области раны, либо зажившая область > 95% площади раны. Начальная облучённая область: область раны, измеренная в момент, когда облучённые животные имели стабильную рану (базовый уровень).

7. Исследование электронной микроскопией

  1. Быстрый отбор и фиксация тканей
    1. Используйте острое лезвие для удаления кожного блока размером 1 мм³, охватывающего слой эпидермиса и дермы.
    2. Немедленно погрузите образец в предварительно охлаждённый 2,5% глутаральдегидфосфатный буфер (0,1 м, pH 7,4) при 4 °C в течение 24 часов для фиксации.
  2. Буферная промывка
    1. Проведите три промывки с буфером фосфатов 0,1 М (pH 7,4), выделяя 15 минут на каждую промывку.
  3. Постфиксация
    1. Переведите образец в раствор тетроксида осмия 1% при 4 °C для фиксации длительностью 1,5 часа.
  4. Градиентное обезвоживание
    1. Постепенно выделяйте концентрации ацетона 50%, 70%, 80%, 90% и 100%, выделяя на каждый шаг по 15 минут.
    2. Повторите процедуру с 100% ацетоном три раза, при этом каждое погружение длится 10 минут.
  5. Вложение эпоксидной смолы
    1. Замочите образец в смеси ацетона и эпоксидной смолы 2:1 на 2 часа, затем на ночь погрузитесь в чистую эпоксидную смолу.
    2. Полимеризуйте образец при 60 °C в течение 48 часов, чтобы получить твёрдый блок.
  6. Секционирование и окрашивание
    1. Получите ультратонкие срезы диаметром 70 нм с помощью ультрамикротома.
    2. Окрашивайте ацетатом урана в течение 15 минут, затем свинцовым цитратом в течение 5 минут при 60 °C.

8. Окрашивание гематоксилин-эозином (HE)

  1. Выполните вложение парафина
    1. Эксакцизные образцы кожи обезвоживаются с помощью спиртового градиента (например, 70%, 80% и 95% этанола, каждый в течение 15 минут, затем два изменения 100% этанола, каждый по 15 минут), а затем переносят в ксилол до достижения полупрозрачного состояния ткани.
    2. Погрузите в парафин для обеспечения вложения, затем обеспечьте затвердевание.
  2. Выполните девосковую депиляцию и регидратацию
    1. Погрузите парафиновые секции в ксилол I/II по 10 минут каждая.
    2. Промывайте ксилол 100% этанолом, затем погружайте в 95% этанол на 3 минуты, 80% этанол на 3 минуты, 70% этанол на 3 минуты, и наконец полосните дистиллированной водой.
  3. Провести окрашивание гематоксилиновым ядром
    1. Замочить в растворе гематоксилина Харриса на 7 минут при комнатной температуре.
    2. Промойте под проточной водой 10 минут, пока не появится синий цвет.
  4. Реализовать дифференциацию и контрокрашивание
    1. Дифференцировать с помощью 1% соляной кислоты в этаноле в течение 3 секунд (наблюдать ядерную прозрачность под микроскопом).
    2. Контрморилка раствором аммиака 0,5% на 30 секунд.
  5. Выполните эозиновое контрокрашивание
    1. Окрашивание раствором эозина 0,5% (с 1% ледниковой уксусной кислоты) в течение 90 секунд.
    2. Быстро прополосните дистиллированной водой в течение 5 секунд, чтобы удалить лишнюю пятно.
  6. Проведите обезвоживание и очистку
    1. Последовательно пропускают 70%, 80%, 95%, 100% этанол I/II (по 1 минута каждому).
    2. Прочистите ксилол I/II по 2 минуты каждая.
  7. Применяйте герметизацию и наблюдение
    1. Нанесите нейтральную смолу каплями, затем накройте накрывающим слоем.
    2. Сушить в духовке при температуре 60 °C в течение 30 минут перед микроскопическим осмотром.

9. Трихромная окраска Массона

  1. Проводите регулярное удаление воска, аналогично окрашиванию до HE.
  2. Ядерное окрашивание
    1. Замочите в растворе гематоксилина на 10 минут.
    2. Промывайте под проточной водой в течение 5 минут, пока синий оттенок не восстановится.
  3. Окрашивание коллагеновыми волокнами
    1. Погрузитесь в смесь Alizarin Red и Acid Fuchsin на 5 минут.
  4. Дифференцировка фосфомолибных кислот
    1. Перенесите в водный раствор с 1% фосфомолибовой кислоты на 1 минуту.
  5. Контрокрашивание миофибра
    1. Напрямую переведите в 2,5% анилиновый синий раствор на 5 минут.
    2. Быстро промывайте водным раствором с ледниковой уксусной кислотой с 0,5% в течение 5 секунд.
  6. Обезвоживание и крепление
    1. Проведите градиентное обезвоживание этанола: 95% этанола I, 100% этанола II (по 30 секунд каждый).
    2. Прозрачные с помощью ксилола.
    3. Монтировать с помощью нейтральной смолы, высушить при 60 °C, а затем осмотреть под микроскопом.

10. Обнаружение уровней IL-1β, IL-6 и TNF-α с помощью ИФА

ПРИМЕЧАНИЕ: IL-1β, IL-6 и TNF-α — важные провоспалительные цитокины, обычно используемые для оценки как наличия, так и интенсивности воспаления. Мониторинг их уровней крайне важен для понимания воспалительных процессов и оценки эффективности противовоспалительных средств.

  1. Подготовьте образцы сыворотки
    1. Следуйте протоколу, описанному в шаге 5.3, чтобы собрать образцы сыворотки.
  2. Разбавленные стандарты и образцы
    1. Создать градиентное разбавление стандартов с использованием разбавления образца; разбавлять образцы сыворотки в соотношении 1:4.
  3. Добавьте образцы и инкубируете
    1. Вводите 100 мкл стандарта/образца в каждую скважину; покрывать колодцы мембраной; инкубировать при 37 °C в течение 90 минут; Затем сбросьте жидкость и промокните колодцы до сухого высыхания.
  4. Обнаружить реакцию антитела и фермента
    1. В каждую скважину введите 100 мкл ферментно-маркированного реагента, специфичного для IL-1β, IL-6 и TNF-α; инкубировать при 37 °C в течение 60 минут; удалите жидкость и промокните насухо; Промой пластину четыре раза с помощью 200 мкл буфера для стирки.
    2. Добавьте 100 мкл рабочего раствора стрептавидин-HRP (разбавление 1:100) в каждую скважину; инкубировать при 37 °C в темноте в течение 30 минут; Промой пластину четыре раза с помощью 200 мкл буфера для стирки.
  5. Развивайте цвет и заканчивайте
    1. В каждую скважину вводят 100 мкл раствора субстрата TMB; инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут; затем добавьте 50 мкл стоп-раствора в каждую скважину.
  6. Читать данные
    1. Измерить абсорбцию на 450 нм (с длиной волны калибровки 630 нм) с помощью ферментно-связанного иммуноанализатора в течение 30 минут; Вычислите концентрацию (pg/mL) с использованием стандартной кривой.

11. Анализ TUNEL

  1. Предварительная обработка секций
    1. Девоск и обезвоживание парафиновых секций, пока они не достигнут дистиллированной воды.
    2. Введите рабочий раствор протеиназы K в концентрации 20 мкг/мл и инкубируемые при 37 °C в течение 20 минут.
    3. Постирайте секции три раза с помощью PBS, при каждой стирке по 2 минуты.
  2. Реакция маркировки
    1. Примените реакционную смесь TUNEL, содержащую фермент TdT и флуоресцеин-маркированный dUTP.
    2. Инкубировать в увлажнённой камере при 37 °C в темноте в течение 60 минут.
  3. Преобразование сигнала
    1. Стирайте три раза с PBS, уделяя 5 минут на каждую стирку.
    2. Введите антитело против флуоресцеина с меткой HRP при разбавлении 1:500.
    3. Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут.
  4. Хромогенное развитие DAB
    1. После промывания PBS нанесите хромогенный раствор DAB и контролируйте развитие под микроскопом в течение 1–3 минут.
    2. Остановите реакцию с помощью дистиллированной воды.
  5. Контрокрашивание и монтаж
    1. Контрокрашивание ядра гематоксилином в течение 1 минуты.
    2. Дегидрировать с помощью градированного этанола, прозрачить ксилолом и крепить с нейтральной смолой.
  6. Интерпретация результатов
    1. Идентифицируйте апоптотические ядра как коричневато-жёлтые, тогда как обычные ядра выглядят синими.
    2. Случайным образом выберите пять полей высокой мощности (400×) на слайд для расчёта скорости апоптоза.

12. Иммуногистохимическое окрашивание

  1. Девакация и получение антигена
    1. Замочите парафиновые секции в ксилоле I на 10 минут, затем перенесите в ксилол II ещё на 10 минут. Затем обезвоживайте с помощью градиентной серии этанола, начиная с 5 минут в 100% этаноле I, затем 5 минут с 100% этанолом II, по 3 минуты на 95%, 80% и 70% этанола, а затем промывайте дистиллированной водой в течение 2 минут.
    2. Проведите термовосстановление под высоким давлением с буфером цитрата натрия 0,01 м при pH 6,0, поддерживая температуру 121 °C в течение 3 минут.
  2. Блочная эндогенная интерференция
    1. Введите3% раствор H2O2 при комнатной температуре на 10 минут для инактивации эндогенных ферментов.
    2. Нанести 5% раствор блокирующего BSA на ткань и инкубировать в увлажнённой камере при 37 °C в течение 45 минут; Аспирируйте лишний блокирующий раствор без промывания.
  3. Инкубация антител
    1. Раздайте 5% раствор блокировки BSA и инкубуйте при 37 °C в течение 30 минут.
    2. Добавьте первичный рабочий раствор антитела в оптимальной концентрации (например, P53, Bax, Bcl-2, VEGF и bFGF) и инкубируемые ночью в увлажнённой камере при 4 °C; Промыть три раза буфером PBS-T, содержащим 0,1% Tween-20, по 5 минут каждый.
    3. Введите вторичное антитело с меткой HRP разбавленной 1:200; инкубировать в увлажнённой камере при 37 °C в течение 60 минут; Постирайте три раза буфером PBS-T по 5 минут каждая. Затем добавьте сопряжённый раствор ABC и инкубируете при 37 °C в течение 30 минут, затем три промывания с буфером PBS по 5 минут каждая.
  4. Разработка цвета DAB
    1. Добавьте DAB-проявительный раствор, содержащий 0,02% H₂O₂, и наблюдайте за развитием под микроскопом при комнатной температуре в течение 1-4 минут.
    2. Немедленно прекратите реакцию дистиллированной водой.
  5. Контрокрашивание и монтаж
    1. Погрузите образец в раствор гематоксилина Harris на 1 минуту и прополосните под проточной водой в течение 10 минут, чтобы добиться синего цвета.
    2. Последовательно погружайте в следующие растворы: 70% этанол на 30 с, 80% этанол 30 с, 95% этанол 30 с, 100% этанол I на 1 минуту и 100% этанол II на 1 минуту.
    3. Для полной очистки и фиксации погрузите в ксилол I на 2 минуты, затем переведите в ксилол II на 2 минуты. Добавьте нейтральную смолу с креплением по каплею, накройте с помощью coverslip и сушите в духовке при температуре 60 °C 30 минут.
  6. Количественная оценка результатов
    1. Коричневый цвет указывает на положительную реакцию; Положительные сигналы (коричневато-жёлтые) должны противопоставляться негативному фону.
    2. Используйте программное обеспечение Image-Pro Plus для расчёта процента положительных ячеек как минимум в 5 полях зрения.

13. Обнаружение западного блотинга

  1. Подготовка к лизису тканей
    1. Введите жидкую замороженную ткань кожи в предварительно охлаждённый раствор из нержавеющей стали при -80 °C; Постепенно добавляйте жидкий азот тремя этапами для снижения испарения; измельчивать вертикально, пока все частицы не станут невидимы; переместить полученный порошок в EP-трубку с лизисным буфером.
    2. Включать ингибитор протеазы (1:100) и ингибитор фосфатазы (1:50); вихрь на льду в течение 30 секунд; проводить ультразвуковое разрушение; инкубировать при 4 °C в трясущем инкубаторе в течение 2 часа; центрифуга при 4 °C, 14 000 × г в течение 20 минут; Осторожно вдыхайте супернатант.
  2. Количественная оценка и обработка белков
    1. Раздайте 5 мкл супернатанта в пластину с 96 ямецами; добавить 200 мкл рабочего раствора BCA; инкубировать при 37 °C в темноте в течение 30 минут; измерять поглощение при 562 нм с помощью считывателя микропластин; определить концентрацию по стандартной кривой.
    2. Комбинируйте 5× Редуцированный буфер нагрузки белка с белковым раствором в соотношении 4:1; денатурировать в кипяточной водяной бане на 15 минут; храните при -20 °C для будущего использования.
  3. Электрофорез SDS-PAGE
    1. Приготовьте гель с акриламидом с разрешением 12%; налить гель, пока он не достигнет 1 см ниже зубьев гребня; накрыть изопропанолом, чтобы предотвратить воздействие воздуха; после затвердевания удаляют изопропанол; залить 4% концентрирующий гель; вставить гребень на 15 лунок; дать затвердевать при комнатной температуре в течение 30 минут; добавьте 5 мкл предварительно окрашенного белкового маркера в загрузочную ямку 1; добавьте 20 мкл пустого лизата в колодец 2; Добавьте 10 мкл образца с белком 40 мкг в каждую яму, от 3 до 14.
    2. Инициировать электрофорез при 80 В; переключиться на 120 В, когда бромофенол-синий мигрирует в разделяющий гель; поддерживать температуру 10-15 °C с циркуляцией ледяной воды; Проходите, пока бромофенол синий не достигнет 0,5 см от основания геля.
  4. Процедура влажного промокания
    1. Подготовьте трансферный буфер, содержащий 20% метанола; До охлаждения до 4 °C. Активировать мембрану PVDF, погрузив её в метанол на 1 минуту; уравновесить мембрану NC в буфере. Соберите переносной зажим в следующем порядке: «Катодная пластина - Губчатая прокладка - Фильтрующая бумага - Гель - Мембрана - Фильтрующая бумага - Губчатая подложка - Анодная пластина"; тщательно удалять пузырьки валиком; устанавливать параметры в соответствии с целевым молекулярным весом белка: для белков < 50 кДа использовать постоянную передачу напряжения при 100 В в течение 60 минут; для белков 50-100 кДа применять постоянный ток при 250 мА в течение 90 минут; для белков > 100 кДа реализовать постоянный ток при 300 мА в течение 120 минут; Подключите к циркуляционной водяной бане 4 °C.
  5. Процедура иммунодетекции
    1. После переноса погрузите мембрану PVDF в метанол на 1 минуту; три раза с помощью TBST по 5 минут каждый; покрыть поверхность мембраны 3% H₂O₂/TBST; инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 15 минут; аспирировать жидкость; добавьте 5% раствор для блокировки BSA/TBST; блокировать 1 час в инкубаторе с тресущей температурой 37 °C; Промой мембрану три раза с помощью TBST по 5 минут каждая.
    2. Добавьте первичный рабочий раствор антител (например, P53, Bax, Bcl-2, VEGF и bFGF); инкубировать ночь при 4 °C в трясущем инкубаторе; промыть мембрану четыре раза с помощью TBST по 10 минут каждая; добавить вторичные антитела с меткой HRP; инкубировать в трясущем инкубаторе при комнатной температуре в течение 90 минут; Промой мембрану шесть раз с помощью TBST + 0,5% SDS по 8 минут каждая.
  6. Хемилюминесцентная визуализация
    1. Смешивать равные объёмы растворов ECL A и B; равномерно покрывает поверхность мембраны; позволять реакции происходить в темноте в течение 60 секунд; аспирировать лишнюю жидкость; установите время одного воздействия от 1 до 5 с для сильных сигнальных белков; провести кумулятивное воздействие в пяти сегментах (10/30/60/120/300 с) для слабых сигнальных белков; Захват изображений с помощью хемилюминесцентного имиджера.
  7. Рабочий процесс анализа данных
    1. Количественно определять белки с помощью программного обеспечения ImageJ; установить единый порог фонового вычитания; Вычислить соотношение оттенков серого между целевой белкой и эталонным белком (β-актином или GAPDH)
    2. Импортируйте данные в GraphPad Prism для анализа.

14. Статистический анализ

  1. Приводите данные по среднему ± стандартной ошибке среднего. Использовать независимые t-тесты для сравнения между двумя группами и использовать односторонний ANOVA для сравнений между несколькими группами.
  2. Анализ данных с помощью SPSS 26.0 и GraphPad Prism 8.0.2.
  3. Рассмотрим P < 0,05 как показатель статистически значимых различий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Терапевтическое влияние Acorus calamus L. на кожные повреждения, вызванные радиацией
Через 15 дней после облучения у всех групп крыс наблюдалось сухое шелушение, локализованное покраснение, отёк, язвы и корки. Через 30 дней после облучения модель показала самое тяжёлое повреждение кожи, при этом корка и язвы в облучённом участке достигли пика. На 45-й день у модельной группы было минимальное выпадение корки, а рана проявила некоторое сокращение. В отличие от этого, группы Acorus calamus L. и положител...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Кожные повреждения, вызванные радиацией, остаются одним из самых распространённых и сложных осложнений в клинической радиотерапии рака. Будучи крупнейшим органом и первой целью радиации, кожа подвержена повреждениям от свободных радикалов и реактивных видов кислорода, вырабатываемых излучением, что может нарушать функции клеток, включая деление, миграцию и дифференцировку, что в конечном итоге приводит к задержке заживления ран и повреждениютканей 20,21...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Совместным планом Плана науки и технологий провинции Ляонин (Технический проект борьбы) (2024JH2/102600273) и независимым исследовательским проектом Северной театральной общей больницы (ZZKY2024001, ZZKY2024002, ZZKY2024003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4% решение с параформальдегидным исправлениемBeyotime Biotech Inc (Beyotime), КитайP0099
Экстракт Acorus calamus L.Подготовлено внутри компанииN/A   Подробный протокол подготовки описан в разделе 4 протокола.
Антибакс-антитела   Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Ухань, Хубэй, Китай)GB11690
Анти-Bcl-2 антителаWuhan servicebio technology Co., Ltd. (Ухань, Хубэй, Китай)GB113375
Антитела к bFGFProteintech Group, Inc. (Ухань, Хубэй, Китай)11234-1-AP
Анти-P53 антитела Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Ухань, Хубэй, Китай)GB111740
Антитела к VEGF Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Ухань, Хубэй, Китай)GB111971
Набор для анализа белков BCA;Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Ухань, Хубэй, Китай)G2026-200T
Крем с бетаметазоном  United Pharmaceutical Co., Ltd. (Китай)N/A Концентрация: 0,1% с ч/б<бр/> Национальное одобрение лекарственного препарата No: H19994057
ЭтанолШанхайская биохимическая технологическая компания Аладдин, Ltd.E111991Используется в качестве экстракционного растворителя для экстракта Acorus calamus L.
Система изображений гель и блотBio-Rad Laboratories, Inc. (Геркулес, Калифорния, США)ChemiDoc MP
Набор для окрашивания с гематоксилином и эозиномBeijing Solarbio Science & Science Technology Co., Ltd., (Пекин, Китай)    G1120
HRP-конъюгированный козлый антикроличий IgG (H+L)Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Ухань, Хубэй, Китай)GB23303
Инвертированный флуоресцентный микроскопOlympus Corporation (Токио, Япония)IX83   
Массон s Trichrome Stain KitBeijing Solarbio Science & Science Technology Co., Ltd., (Пекин, Китай)    G1340
Считыватель микропластин (для обнаружения поглощения, флуоресценции и люминесценции)Molecular Devices (Сан-Хосе, Калифорния, США)SpectraMax iD3
ПетролатумSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Шанхай, Китай)N/A   белый вазелок фармацевтического класса; температура плавления: 45-60 и градусы; C;  Национальное одобрение лекарственного средства: H31022350
Rat IL-1β ELISA Kit   Beyotime Biotech Inc (Beyotime), КитайPI303
Rat IL-6 ELISA Kit   Beyotime Biotech Inc (Beyotime), КитайPI328
Крыса TNF и альфа; ELISA Kit   Beyotime Biotech Inc (Beyotime), КитайPT516
Набор для обнаружения апоптоза клеток TUNEL (DAB)Beyotime Biotech Inc (Beyotime), КитайC1091

Ссылки

  1. Piffkó, A., et al. Radiation-induced amphiregulin drives tumour metastasis. Nature. 643 (8072), 810-819 (2025).
  2. Wang, K., Tepper, J. E. Radiation therapy-associated toxicity: Etiology, management, and prevention. CA Cancer J Clin. 71 (5), 437-454 (2021).
  3. Grosu-Bularda, A., et al. Navigating the complexities of radiation injuries: therapeutic principles and reconstructive strategies. J Pers Med. 14 (11), 1100(2024).
  4. Kemin, L., Rutie, Y. A critical review of the progress in prevention and treatment of radiation-induced skin damage. Front Oncol. 14, 1395778(2024).
  5. Borrelli, M. R., et al. Radiation-induced skin fibrosis: Pathogenesis, current treatment options, and emerging therapeutics. Ann Plast Surg. 83 (4S Suppl 1), S59-S64 (2019).
  6. Xu, Y., Liu, Q., Li, W., Hu, Z., Shi, C. Recent advances in the mechanisms, current treatment status, and application of multifunctional biomaterials for radiation-induced skin injury. Theranostics. 15 (7), 2700-2719 (2025).
  7. Deng, G. M., He, W. S., Liu, W. Y., Wu, F. S., Chen, J. B. Evolution of radiation-induced dermatitis treatment. Clin Transl Oncol. 26 (9), 2142-2155 (2024).
  8. Bian, X. W., et al. Epigenetic memory of radiotherapy in dermal fibroblasts impairs wound repair capacity in cancer survivors. Nat Commun. 15 (1), 9286(2024).
  9. Singh, V. K., Seed, T. M. The efficacy and safety of amifostine for the acute radiation syndrome. Expert Opin Drug Saf. 18 (11), 1077-1090 (2019).
  10. Wang, Z., Chen, R., Chen, J., Su, L. 18β-glycyrrhetinic acid alleviates radiation-induced skin injury by activating the Nrf2/HO-1 signaling pathway. Biol Chem. 405 (6), 407-415 (2024).
  11. Wang, Z. W., et al. Aloe polysaccharides mediated radioprotective effect through the inhibition of apoptosis. J Radiat Res. 45 (3), 447-454 (2004).
  12. Kongkham, B., Duraivadivel, P., Hariprasad, P. Acorus calamus L. rhizome extract and its bioactive fraction exhibits antibacterial effect by modulating membrane permeability and fatty acid composition. J Ethnopharmacol. 331, 118323(2024).
  13. Abdeahad, H., et al. Therapeutic potency of curcumin on radiodermatitis: A systematic review. Avicenna J Phytomed. 14 (3), 297-304 (2024).
  14. Kim, H., Han, T. H., Lee, S. G. Anti-inflammatory activity of a water extract of Acorus calamus L. leaves on keratinocyte HaCaT cells. J Ethnopharmacol. 122 (1), 149-156 (2009).
  15. Zhao, Y., et al. botanic, phytochemistry and pharmacology of the Acorus L. genus: A review. Molecules. 28 (20), 7117(2023).
  16. Kuan, C., et al. Rice bran extract alleviates inflammation and promotes wound healing in radiation dermatitis. Exp Dermatol. 34 (9), e70162(2025).
  17. Salgueiro, M. J., et al. Biological effects of brachytherapy using a (32)P-patch on the skin of Sencar mice. Appl Radiat Isot. 67 (32), 1769-1774 (2009).
  18. Jain, N., Jain, R., Jain, A., Jain, D. K., Chandel, H. S. Evaluation of wound-healing activity of Acorus calamus Linn. Nat Prod Res. 24 (6), 534-541 (2010).
  19. Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China, 2020 Edition. , China Medical Science Press. Beijing. (2020).
  20. Chen, Y., et al. Senescent fibroblast facilitates re-epithelization and collagen deposition in radiation-induced skin injury through IL-33-mediated macrophage polarization. J Transl Med. 22 (1), 176(2024).
  21. Milam, E. C., Rangel, L. K., Pomeranz, M. K. Dermatologic sequelae of breast cancer: From disease, surgery, and radiation. Int J Dermatol. 60 (4), 394-406 (2021).
  22. Haran, P., Shanmugam, R., Deenadayalan, P. Free radical scavenging, anti-inflammatory and antibacterial activity of Acorus calamus leaves extract against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Cureus. 16 (3), e55987(2024).
  23. Sytykiewicz, H., Łukasik, I., Goławska, S. Chemical composition, anti-tyrosinase and antioxidant potential of essential oils from Acorus calamus (L.) and Juniperus communis (L.). Molecules. 30 (11), 2417(2025).
  24. Liu, Y., et al. Proteomics and transcriptomics explore the effect of mixture of herbal extract on diabetic wound healing process. Phytomedicine. 116, 154892(2023).
  25. Zhou, L., Zhu, J., Liu, Y., Zhou, P. K., Gu, Y. Mechanisms of radiation-induced tissue damage and response. MedComm. 5 (10), e725(2020).
  26. Elgellaie, A., Thomas, S. J., Kaelle, J., Bartschi, J., Larkin, T. Pro-inflammatory cytokines IL-1α, IL-6 and TNF-α in major depressive disorder: Sex-specific associations with psychological symptoms. Eur J Neurosci. 57 (11), 1913-1928 (2023).
  27. García-García, M. L., et al. Fluoxetine modulates the pro-inflammatory process of IL-6, IL-1β and TNF-α levels in individuals with depression: A systematic review and meta-analysis. Psychiatry Res. 307, 114317(2022).
  28. Yan, T., et al. Single-cell RNA-seq analysis of molecular changes during radiation-induced skin injury: The involvement of Nur77. Theranostics. 14 (15), 5809-5825 (2024).
  29. Tu, W., et al. Integrative multi-omic analysis of radiation-induced skin injury reveals the alteration of fatty acid metabolism in early response of ionizing radiation. J Dermatol Sci. 108 (3), 178-186 (2022).
  30. Mukherjee, S., Dutta, A., Chakraborty, A. The cross-talk between Bax, Bcl2, caspases, and DNA damage in bystander HepG2 cells is regulated by γ-radiation dose and time of conditioned media transfer. Apoptosis. 27 (3-4), 184-205 (2022).
  31. Avadanei-Luca, S., et al. Tissue regeneration of radiation-induced skin damages using protein/polysaccharide-based bioengineered scaffolds and adipose-derived stem cells: A review. Int J Mol Sci. 26 (13), 6469(2025).
  32. Hartono, S. P., et al. Vascular endothelial growth factor as an immediate-early activator of ultraviolet-induced skin injury. Mayo Clin Proc. 97 (1), 154-164 (2022).
  33. Guangmei, D., Weishan, H., Wenya, L., Fasheng, W., Jibing, C. Evolution of radiation-induced dermatitis treatment. Clin Transl Oncol. 26 (9), 2142-2155 (2022).
  34. Gupta, S., et al. Exploring anticancer properties of medicinal plants against breast cancer by downregulating human epidermal growth factor receptor 2. J Agric Food Chem. 72 (17), 9717-9734 (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Экстракт Acorus Calamusзаживление рантрадиционная китайская медицинавоспалительные цитокиныингибирование апоптозастимуляция ангиогенезагистопатологический анализиммуногистохимия
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.