Микробный анализ ДНК в полевых условиях с использованием биологического набора для экстракции и полевой qPCR установки

Summary

Надёжные и точные формы анализа ДНК, применяемых в полевых условиях, имеют решающее значение для многих отраслей. В этой статье предлагаются два метода экологического микробного анализа в полевых условиях: 1) выделение микробной ДНК из образцов окружающей среды с помощью набора для биологической экстракции, и 2) анализ ДНК с помощью полевой блока qPCR.

Abstract

По мере того как количественная ПЦР (qPCR) становится более широкой в различных отраслях, возможность извлекать и анализировать ДНК в удалённых условиях без логистических препятствий становится крайне важной. Ярким примером является необходимость простых инструментов для количественной оценки бактерий, разрушающих загрязнители, на удалённых участках, пострадавших от сходов с рельсов поездов или выбросов нефти, что позволяет своевременно оценивать риски и воздействие на окружающую среду. Для надёжного достижения этого процессы должны быть портативными и лёгкими, удобными для неспециалистов, устойчивыми к загрязнению и способными давать быстрые результаты, сохраняя при этом строгий контроль качества. Хотя возможности как для экстракции нуклеиновых кислот, так и для qPCR-анализа вне лаборатории существуют уже много лет, только недавно технологические достижения позволили разработать системы для развертывания в полевых условиях, способные обеспечивать надёжную и точную работу. В этом исследовании мы демонстрируем использование набора для экстракции ДНК в сочетании с портативными qPCR-инструментами в реалистичных условиях окружающей среды. Полевые испытания, проведённые при окружающей среде при температуре примерно 30 °C, продемонстрировали выходы ДНК и эффективность амплификации, сопоставимые с теми, что достигнутые в контролируемых лабораторных условиях. Важно, что полученные результаты в полевых условиях продемонстрировали эквивалентную чувствительность и воспроизводимость, подтверждая, что портативные рабочие процессы могут предоставлять высококачественные данные без необходимости традиционной лабораторной инфраструктуры. Эти результаты подчёркивают потенциал децентрализованного молекулярного анализа, который расширяет охват qPCR в удалённых и ограниченных ресурсами условиях, сохраняя при этом точность и надёжность, необходимые для принятия решений.

Introduction

При рассмотрении молекулярно-биологических анализов, таких как qPCR, существует несколько ограничений в управлении образцами. Ярким примером является спрос на простые и надёжные инструменты для количественной оценки бактерий, разрушающих загрязнители, на отдалённых участках, пострадавших от сходов с рельсов поездов или выбросов нефти, что позволяет своевременно оценить экологические риски и воздействия 1,2,3,4,5. Основное ограничение заключается в том, что независимо от того, насколько холодным вы храните образец, микробные сообщества могут (и будут) смещаться со^{временем 6,7}. Чтобы данные точно отражали исходную среду, из которой были собраны образцы, рекомендуется извлечь ДНК из этих образцов в течение 24 часов⁸ часов. Для инженера, собирающего микробные образцы на морской нефтяной платформе, или учёного, находящегося глубоко в глубине тропического леса, этот срок невозможен. Доставить образец воды или почвы из одного из таких удалённых пунктов в судоходную компанию в тот же день, а затем доставить в лабораторию (при этом сохраняя холодильник), где ДНК можно извлечь перед анализом, просто невозможно.

После извлечения ДНК часы останавливаются, и вся генетическая информация образца сохраняется бессрочно с правильными методами^{хранения 9}. Это делает экстракционную ДНК невероятно уникальной по сравнению с подавляющим большинством химических, металлургических и биологических образцов — большинство из которых имеют ограниченный срок годности. Архивированную ДНК можно извлечь спустя годы или десятилетия и проанализировать на новые цели на новых платформах. По этой причине крайне важно, чтобы извлеченная ДНК действительно представляла исходное микробное сообщество, а не изменённое от задержки транспорта.

Кроме того, требование лаборатории по извлечению и анализу образцов значительно ограничивает как гибкость, так и согласованность программ отбора проб. Одна только стоимость логистики может быть слишком высокой для некоторых^{проектов 10}. Возможность анализировать образцы, точно количественно оценивая интересующие генетические цели в течение нескольких часов или даже минут после отбора, открывает множество дверей для экологических проектов по всему миру.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол был выполнен с использованием Bio-Extract Kit (набор для биологического экстракционного поля) и FieldQuant qPCR (полевой qPCR).

1. Взятие проб биомассы из грунтовых вод и протокол изоляции ДНК с использованием инкапсулированного фильтра и биологического полевого набора для экстракции

1. На всех этапах первого шага надевайте перчатки и защитные очки.
2. Подготовьте перистальтический насос и трубку, а также прочистите скважину с помощью стандартного объёмного очищения, следуя рекомендациям Агентства по охране окружающей среды (EPA) по отбору проб подземных вод¹¹.
3. Снимите капсулированный фильтр, адаптер, зажим и крышки из предоставленной трубки центрифугы (рисунок 1).
4. Пропустите трубку (внутренний диаметр 1/4-5/16 дюйма [I.D.]) через предоставленный хомут и затяните его, чтобы закрепить шланг на фиксирующем адаптере (рисунок 2).
5. Подключите вход фильтра к адаптеру Luer-Lock, установленному на предыдущем этапе.
6. Поместите фильтр в приёмную ёмкость, чтобы точно измерить количество фильтрованной воды.
7. Фильтруйте до 1 л воды с низкой скоростью расхода (<0,5 л/мин). Количество фильтруемой воды будет зависеть от мутности воды.
   1. Если фильтр забивается до 1 литра, остановитесь и переходите к следующему этапу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК-анализ чувствителен и может быть проведен с объёмом всего 10 мл, в зависимости от биомассы системы.
8. Вручную записывайте объём, прошедший через фильтр, в миллилитрах (мл). Сбросьте фильтрованную воду.
9. Закройте фильтр с обоих концов. Убедитесь, что тонкий конец закрыт красным колпачком, а толстый — белым зажимом Luer-Lock.
10. Поставьте фильтр обратно в пластиковую трубку, которую он прилагает.
11. Прикрепите этикетку к трубке центрифуги и укажите количество воды, прошедшую через фильтр, местоположение, дату отбора проб и запрошенные анализы. Храните при 1-4 °C до извлечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: фильтры должны быть извлечены в течение 24 часов после отбора проб.
12. Используя включённые спиртовые салфетки для подготовки, очистите ровную поверхность, с помощью которой можно организовать экстракцию (например, деревянную доску, дверь багажника грузовика и т.д.)
13. Для извлечения ДНК разместите все компоненты биологического набора поля экстракции на плоской, чистой поверхности (рисунок 3).
    1. Отснимите колпачки с обоих концов фильтра и отложите колпачки для последующего использования. Найдите и откройте один из 3 мл шприцев, входящих в комплект. Втяните воздух в 3-мл шприц и подключите его к фильтру через фиксирующее соединение.
    2. Вытолкните воздух из шприца, чтобы вытолкнуть оставшуюся воду из фильтра. Отсоедините шприц и втяните больше воздуха, прежде чем повторить процесс.
    3. Повторяйте это несколько раз, чтобы из фильтра вытеснилось как можно больше воды. Вспомните красную крышку розетки.
14. Переверните закрытый шприц раствора A несколько раз, чтобы убедиться, что он хорошо смешан. Снимите крышку шприца с фиксирующим люэром.
15. Подключите шприц Solution A к инкапсулированному входу фильтра диаметром 0,2 мкм через наконечник Люэра и медленно добавляйте весь раствор A, нажимая на поршень. Слишком быстрое давление может привести к образованию обратного давления, поэтому обязательно опускайте поршень медленно. Если засор фильтра мешает добавлению раствора A, снимите красную крышку выхода фильтра и попробуйте снова. Повторите фильтр.
16. Энергично пожимайте закрытый фильтр рукой в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить усталость, можно подготовить несколько образцов до этого этапа, и все они можно пожать рукой одновременно. Если это возможно, для выполнения этого этапа можно использовать перезаряжаемый вихревой миксер вместо рукопожатия.
17. Переверните закрытый шприц раствора B несколько раз, чтобы убедиться, что он хорошо смешан. Снимите замыкающую крышку с шприца.
18. Снимите капсулированную крышку фильтра. Подключите шприц Solution B к входу с капсулированным фильтром через наконечник Luer-Lock и медленно добавляйте весь раствор B, нажимая на поршень. Слишком быстрое давление может привести к образованию обратного давления, поэтому обязательно опускайте поршень медленно. Повторите крышку входа фильтра.
19. Энергично пожимайте закрытый фильтр рукой в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить усталость, можно подготовить несколько образцов до этого этапа и одновременно пожать руки. Если это возможно, для выполнения этого этапа можно использовать перезаряжаемый вихревой миксер вместо рукопожатия.
20. Снимите крышку впуска.
21. С перевернутым фильтром введите 1 мл воздуха в фильтр с помощью шприца объемом 3 мл, прикреплённого к капсулированному фильтру, а затем потянете поршень, чтобы удалить как можно больше лизата (жидкости).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если лизат особенно вязкий, может понадобиться несколько раз нажимать и дергать поршень для удаления раствора из фильтра.
22. Добавьте лизат в трубку с шариками объёмом 5 мл. Закройте трубку и запечатайте сверху парапленкой.
23. Энергично пожимайте трубку рукой в течение 5 минут. Поставьте трубку вертикально, продолжая выполнять шаги.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить усталость, можно подготовить несколько образцов до этого этапа, и все они можно пожать рукой одновременно. Если это возможно, для выполнения этого этапа можно использовать перезаряжаемый вихревой миксер вместо рукопожатия.
24. Чтобы избежать загрязнения верхней части фольги, разместите картридж для подготовки образца на ровную поверхность.
25. Вынимите шприц объемом 1 мл из упаковки и прикрутите колонку с люэр-блокировкой на конец шприца. Используйте заострённый кончик колонки, чтобы проколоть два отверстия в первой части картриджа для подготовки образцов.
    ВНИМАНИЕ: Некоторые участки картриджа содержат хаотропные соли и/или этанол. Надевайте перчатки и защитные очки.
26. Используя пластиковую объёмную пипетку, перенесите 1 мл лизата (только жидкого, избегайте перемещения шариков) из трубки в недавно пробитое отверстие первого отсека картриджа для подготовки образца. Для наилучшего результата медленно добавляйте лизат под небольшим углом при пипетировании в отверстие фольги.
27. Вставьте колонку шприца обратно в красную часть картриджа. Полностью втяните жидкость в шприц, а затем вытолкните её. Выполните это действие насоса 10 раз.
28. Выведите всю жидкость из шприца обратно в красную часть картриджа, прежде чем перейти к следующему этапу. Жидкость не должна передаваться из одного участка в другой — это касается каждого оставшегося этапа протокола выделения образца ДНК.
29. Разместите остроконечный кончик колонки шприца над красно-оранжевым участком и проколите два отверстия через фольгированный барьер. Используйте вантуз, чтобы вытянуть весь объём шприца — жидкость вверх по шприцу, и выкачать обратно. Повторите этот шаг один раз — всего 2 насоса, выталкивая всю жидкость. Не переливайте жидкость на следующий этап.
30. Разместите заострённый кончик колонки шприца над оранжевым срезом и проколите два отверстия через фольгированный барьер. Используйте вантуз, чтобы втянуть весь объём жидкости в шприц и откачать обратно до конца. Не переливайте жидкость на следующий этап.
31. Разместите заострённый кончик колонки шприца над жёлтым участком и дважды проколите барьер из фольги. Используйте вантуз, чтобы втянуть весь объём жидкости в шприц и откачать обратно до конца. Не переливайте жидкость на следующий этап.
32. Разместите остроконечный кончик колонки шприца над синей сухой секцией и проколите фольгированный барьер только один раз. Используйте поршень, чтобы втянуть весь объём воздуха в шприц и быстро выкачать его обратно. Быстро повторяйте этот процесс откачки минимум 20 раз, пока колонка не станет сухой.
33. Разместите заострённый кончик колонки шприца над последним зелёным участком и дважды проколите фольгированный барьер. Используйте вантуз, чтобы втянуть весь объём жидкости в шприц и откачать обратно до конца. Повторяйте этот шаг, всего 5 насосов.
34. Используя шприц объёмом 1 мл и столбец для подготовки образцов, переместите весь раствор из зелёного участка в хорошо маркированную микропробирку объемом 1 мл — это образец ДНК, извлеченный в поле. Храните при 1-10 °C (например, в холодильнике с использованием пакетов со льдом/льдом, или в холодильнике и т.д.) до недели или до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения образцы ДНК могут храниться при -20 °C бесконечно.

2. Протокол анализа qPCR на поле с использованием полевой блока qPCR

ПРИМЕЧАНИЕ: Полевой прибор qPCR и телефон, управляющий инструментом, используют перезаряжаемые батареи. Убедитесь, что оба полностью заряжены перед поездкой на поле.

1. Поместите до трёх образцов ДНК, извлеченных с поля, в чистые прорези лотка. Убедитесь, что в каждом разделе есть один образец: один в слотах 1, 2 или 3, один в слотах 4, 5 или 6 и один образец в слотах 7, 8 или 9.
2. Поместите пробирочные полоски для каждого образца в соответствующие слоты для полос A, B или C на лотке. Выровняйте первую скважину на полосе с первым слоем на лотке.
3. Разблокируйте телефон и откройте приложение, названное в честь товарного знака инструмента qPCR. Телефон и полевая qPCR-единица соединяются через интегрированную короткую беспроводную связь. Когда приложение откроется, нажмите кнопку Start Run .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приложение предварительно загружено на включённом телефоне и нельзя скачать в других местах.
4. На следующем экране нажмите кнопку Generate IDs .
5. На следующем экране вводится информация о выборках для каждого образца; нажмите в раздел Sample ID и введите название образца.
   1. Откройте образцы и выберите соответствующую единицу объёма для типа образца, использованного при извлечении (граммы [g], миллилитры [мл] или мазок).
   2. Затем введите под количество образца и введите объём образца, использованного при экстракции в полевых условиях выше (например, миллилитры фильтрованной воды). Повторите этот процесс для оставшихся двух образцов.
   3. Когда информация для всех образцов завершена, нажмите кнопку продолжить .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется менее 3 образцов, оставьте ID образца по умолчанию, выберите любую единицу и введите 1 в строку количества выборки, чтобы продолжить неиспользованные образцы.
6. На следующем экране нажмите на папку. Перейдите на следующий экран и нажмите «Сохранить в текущую папку».
7. На следующем экране введите название забега и нажмите «подтвердить».
8. Включите инструмент, нажав и удерживая кнопку питания , расположенную в левом верхнем углу инструмента, пока все огни на передней части не загораются (~5 с). Затем нажмите « Подтверждение » в приложении, чтобы продолжить.
9. На следующем экране нажмите Connect через интегрированную короткую беспроводную связь. Нажмите интегрированную кнопку короткого беспроводного сигнала (знакомый торговый знак) сверху прибора, пока не начнёт мигать синий свет. Нажмите подтвердить и дождитесь, пока приложение и инструмент синхронизируются вместе. После синхронизации нажмите на имя инструмента в приложении, чтобы выбрать его, а затем нажмите кнопку подключения , чтобы перейти к загрузке пробирочных полосок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если прибор и приложение не синхронизируются с первого раза, убедитесь, что встроенный короткодействующий беспроводной индикатор на приборе всё ещё мигает, и снова сканируйте тап.
10. Перед тем как снимать колпачки пробиральных полосок, проверьте, не находятся ли лиофилизированные гранулы в верхней части ни одной из пробирочных полосок. Если это так, аккуратно подведите дно колодца, чтобы гранулы опустились ниже в колодец.
11. Снимите крышки из пробирок для первого образца. Добавьте 18 мкл стерильной воды в первую скважину пробиральной полоски и аккуратно протяните пипеткой вверх и вниз, чтобы растворить гранулу. Повторяйте это для оставшихся двух скважин.
12. Добавьте 2 мкл образца в каждую яме и запечатайте пробирки, вставив в пробирки резиновые колпачки с выемками между крышками, обращёнными к задней части лотка. При необходимости повторите шаги 2.10-2.12 для оставшихся образцов. После того как все пробирные полоски заполнены и запечатаны крышками, нажмите кнопку подтверждения в приложении.
13. Удаляйте каждую пробирную полоску по одному и проверяйте наличие пузырьков на дне скважин. Если на дне любой из скважин есть пузырьки, аккуратно раскачивайте полосу взад-вперёд, пока пузырьки не поднимутся к верхней части скважины. Когда все колодцы проверены, нажмите « Подтверждение » в приложении и переходите к загрузке полос в прибор.
14. Откройте крышку прибора и поместите пробиральные полоски в поле qPCR в том же порядке и ориентации, что и на лотке, чтобы петли и выемки между крышками были обращены к задней части прибора. После того как все полоски добавлены, аккуратно нажмите крышку, пока она не зафиксируется, и нажмите на подтверждение.
15. Нажмите кнопку Start Run в приложении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запуск начнётся и займёт ~45 минут при выполнении заранее установленных условий. Эти условия не подлежат редактированию.
16. Когда забег закончится, нажмите на результаты по электронной почте. После подключения телефона к Wi-Fi результаты будут отправлены для анализа и отчета; До тех пор результаты хранятся на инструменте.
    1. После подключения к Wi-Fi пользователю нужно снова нажать кнопку отправки , чтобы отправить результаты.
17. Очищайте лоток между пробоями, чтобы избежать загрязнения между образцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вывод — это файл Excel, содержащий значения порога цикла (Ct) для каждой ямы. Эти результаты отправляются в лабораторию, которая проверяет качество амплификации и преобразует значения Ct в количества с использованием проверенных стандартных кривых, специфичных для каждой цели qPCR, а также на основе объёма и матрицы исходного образца. Эти результаты отправляются пользователю в виде электронного материала, а также в формате PDF.

Results

Экстракция ДНК из представительных образцов окружающей среды проводилась с использованием как биологического набора для экстракции, так и высоко проверенного лабораторного метода, описанного^{ранее 4}. Как показано на рисунке 4, успешное завершение изоляции ДНК с использованием полевой комплекта было подтверждено при сравнении результатов qPCR с высоковалидированным лабораторным методом экстракции. Эта согласованность подтверждает, что метод сохранял целостность ДНК образцов окружающей среды в полевых условиях.

Компоненты полевой комплекта qPCR показаны на рисунке 5. Анализ стандартного разбавления в культуре Dehalococcoides (DHC) с использованием полевого блока qPCR был проведён при температурах как в помещении (21 °C), так и на улице (30 °C), чтобы продемонстрировать надёжность прибора в условиях реальных полевых условий. Результаты, показанные на рисунке 6, показывают низкое отклонение при 10 различных повторениях каждого. Для полного контекста: DHC — это организм, способный разлагать хлорированные растворители, который обычно количественно измеряется с помощью qPCR в индустрии экологической^{реабилитации 4}.

Для проверки точности приборов DHC был проанализирован в трёх различных концентрациях с использованием десяти полевых qPCR-приборов, выполненных в дублировании (см. рисунок 7). Даже при низком количестве относительное стандартное отклонение оставалось низким (ниже 5%) во всех сериях. Обратите внимание, что по сравнению со стандартным отклонением относительное стандартное отклонение важно для логарифмических данных, поскольку оно нормализует результаты с помощью следующего уравнения:

Где RSD — относительное стандартное отклонение, σ — стандартное отклонение набора данных, а μ — среднее значение набора данных.

Вместе оба метода, изложенные в этой статье, дают воспроизводимые результаты на основе реплицированных полевых экстракций и qPCR-анализов. Согласование между экстракцией в полевых и лабораторных исследованиях и qPCR-анализом демонстрирует, что надёжные и высококачественные данные можно получить без зависимости от лабораторной инфраструктуры, что позволяет проводить микробный анализ в удалённых или ограниченных ресурсах условиях.

Рисунок 1: Компоненты инкапсулированного фильтра .Инкапсулированный фильтр используется для фильтрации биомассы из образца воды. Подключившись к перистальтическому насосу через трубку, вода проталкивается через фильтр. После записки общего объёма воды вода сбрасывается, и биомасса, собранная на фильтре, готова к извлечению ДНК. Компоненты: а. стерильная трубка, удерживающая фильтр и компоненты до и после использования, б. впускная крышка, в. хомут для шланга, г. адаптер соединения люэр-фиксирующей трубки, д. инкапсулированный фильтр, е. резиновая выходная крышка. Изображение использовано с разрешения Microbial Insights, ^Inc.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Соединение фильтра и трубок. Трубка надвигается поверх адаптера соединения люэр-фиксирующей трубы и фиксируется с помощью хомута шланга. Другой конец трубки подключён к перистальтическому насосу (это соединение и работа насоса выходят за рамки данного протокола). Изображение использовано с разрешения Microbial Insights, ^Inc.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Компоненты полевых комплектов для изоляции ДНК. Все компоненты стерильны перед использованием. Компоненты включают: (1) инкапсулированный фильтрующий комплект (см. рисунок 1 для подробностей), (2) шприц объемом 3 мл, (3) шприц объёмом 1 мл с предварительной загрузкой раствора A с крышкой, (4) шприц объёмом 1 мл с предварительной загрузкой раствора B, (5) шприц на 3 мл, (6) силиконовая трубка с шариками, (7) 1 мл шприц с изоляционной колонкой, (8) одноразовая трансферная пипетка на 1 мл, (9) Картридж для подготовки образцов для ДНК-изоляции, (10) микроцентрифугная пробирка объёмом 1,5 мл. На фото отсутствуют: парапленочные квадраты для герметизации при встряхивании и спиртовые салфетки для очистки поверхности для экстракции. Изображение использовано с разрешения Microbial Insights, ^Inc.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Сравнение полевой экстракции с использованием реальных образцов . Сравнительные результаты qPCR ДНК, выделенной из двух репрезентативных образцов с помощью лабораторного метода (красные полоски) по сравнению с биологическим набором для экстракции (синие полосы). Эти анализы не были проанализированы в репликации, как ожидалось в стандартном qPCR-анализе. Генные мишени (ось x) показывают изобилие (ось y) в пределах порядка величины для обоих методов. Информация о каждом конкретном гене не включена, так как она выходит за рамки данной статьи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Полевые qPCR-приборы и компоненты. Компоненты включают: A. Полевой инструмент qPCR, B. лоток для подготовки образцов, C — пробирная полоска с лиофилизированными реагентами, D. телефон с предварительной загрузкой с приложением, используемым для работы прибора. Изображение использовано с разрешения Microbial Insights, ^Inc.12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Демонстрация устойчивости полевых qPCR. Стандарт Dehalococcoides (DHC) был проанализирован в десяти повторениях при наружных (30 °C, красные полосы) и в помещении (21 °C, синие полосы) температуры, что подчёркивает надёжность прибора для полевых условий. Номер повторяющего прохода указывается вдоль оси x, а рассчитанное количество DHC — по оси y. Среднее значение внутри (20 °C) было рассчитано как 4,92 × 10² ячейки/мл, SD = 1,14 × 10² ячеек/мл (n = 10), а внешнее (30 °C) — 5,89 × 10² ячеек/мл, SD = 1,80 × 10² ячейки/мл (n = 10). Измерения, полученные при 20 °C и 30 °C, существенно не различались (t-тест Уэлча, p = 0,17). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Демонстрация точности полевых qPCR. Точная производительность между 10 различными приборами, выполняемые в дублировании при трёх различных стандартных концентрациях. Истинное значение и число реплицирования (n = 2 для 10 приборов при каждой стандартной концентрации) указаны вдоль оси x, с цветными полосами, специфичными для полевой единицы. Ось y показывает рассчитанное количество для каждого забега. Процентное относительное стандартное отклонение для каждой стандартной концентрации показано пунктирными линиями над полосой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Ключевой особенностью этого протокола является возможность экстракции микробной ДНК и qPCR-анализа в полевых условиях без необходимости лабораторной инфраструктуры или^{электричества 12}. Метод был оптимизирован для баланса между портативностью и надёжностью, обеспечивая воспроизводимые результаты, соответствующие лабораторным рабочим процессам даже при выполнении на открытом воздухе в диапазоне температур^{окружающей среды 12}. Рекомендуемый диапазон использования — от 4 °C до 95 °C (39 °F до 104 °F), и сравнение бок о бок при стандартных наружных температурах (30 °C, 86 °F) для полевой бригады показывает надёжную стабильность (рисунок 6). Эта согласованность необходима для того, чтобы полевые результаты были интерпретируемы вместе с лабораторными наборами данных.

Для успеха протокола ключевым является несколько шагов. Во время процесса экстракции важно полное удаление жидкости из фильтров и тщательное смешивание реагентов для эффективного лизисирования и извлечения ДНК. Точно так же аккуратный перенос лизата в картридж для подготовки образца с минимальным переносом шариков — ключ к предотвращению засоров или разрушения колонны. Стратегии устранения неполадок включают замедление вжатия поршня для снижения обратного давления и повторное закачивание шприцами, если вязкие лизаты мешают движению жидкости. Для qPCR критически важно избегать пузырьков в анализных скважинах и обеспечивать полную респирацию гранул.

Несмотря на свои преимущества, у этого метода есть свои ограничения. Выходы ДНК могут быть ниже, чем у наборов с настольной центрифугой, а сильно мутные или органически богатые образцы могут затруднять работу колонки. Хотя изолационные наборы просты и просты в использовании для любого — включая пользователей без опыта работы в лаборатории — существует дополнительный риск ошибки при сравнении неопытных специалистов в полевых условиях. Кроме того, хотя полевая единица qPCR даёт быстрые результаты, она ограничена ограниченным количеством одновременных реакций (в настоящее время ограничено 9 генными мишенями за запуск) по сравнению со стандартными термоциклерами. Однако эти ограничения компенсируются скоростью анализа и возможностью фиксировать профили микробных сообществ в полевых условиях. Нет врожденных ограничений на то, какие цели qPCR можно анализировать, кроме каталога лаборатории, предлагающей это оборудование.

Значимость этого метода заключается в его способности мобилизовать молекулярные анализы, обеспечивающие мониторинг микробных популяций в реальном времени в таких средах, как нефтяные месторождения, сельскохозяйственные участки или удалённые экосистемы. Сохраняя целостность ДНК в момент отбора проб и получая результаты на месте, этот подход снижает логистические барьеры, повышает качество данных и позволяет быстро принимать решения. Будущие применения могут включать мониторинг патогенов в области общественного здравоохранения, мониторинг хода биоремедиации или оценку микробных рисков в водных системах. С небольшими модификациями платформа может постоянно адаптироваться для дополнительных молекулярных мишень и новых qPCR-тестов.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Силиконовая трубка 5/16"	Amazon (www.amazon.com)	796753613221	Альтернативные модели могут быть приемлемыми
Кулеры	Staples (www.staples.com)	24299978	Альтернативные модели могут быть приемлемыми
Набор для полевых изолаций ДНК	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/bio-extract/	Проприетарный
Полевой блок qPCR с аксессуарами	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/fieldquant/	Проприетарный
Перчатки	Amazon (www.amazon.com)	Зависит от размера	Альтернативные модели могут быть приемлемыми
Фильтры для грунтовых вод	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/wp-content/uploads/2025/08/MI-Sampling-US-01.02-bio-flo_dna_mi.pdf
Лёд	Местный магазин у дома	NA
Kamoer DIP1500 перистальтический насос 24 В 1500 мл/мин высоты	Amazon (www.amazon.com)	701705886813	Альтернативные модели могут быть приемлемыми
Плоскогубцы с иглоносом	Amazon (www.amazon.com)	762983170575	Альтернативные модели могут быть приемлемыми
Бумажные полотенца	Staples (www.staples.com)	2126874	Альтернативные модели могут быть приемлемыми
Защитные очки	Amazon (www.amazon.com)	B0BNHKWR6W	Альтернативные модели могут быть приемлемыми
Маркер Sharpie Fine Tip	Amazon (www.amazon.com)	71641300033	Альтернативные модели могут быть приемлемыми