Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и очистка внеклеточных пузырьков растений из листьев арабидопсиса с помощью оптимизированного метода сбора апопластического промыва

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69715

⸱

24 марта 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает оптимизированный метод изоляции внеклеточных везикул (ЭВ) из листьев Arabidopsis thaliana для поддержки молекулярных и функциональных анализов на следующих этапах.

Аннотация

Внеклеточные везикулы (ЭВ) — это мембранно-связанные наночастицы, выделяемые различными организмами и типами клеток, и всё чаще признаются важными посредниками межклеточной и межцарственной коммуникации. Хотя биология электромобилей хорошо устоялась в системах млекопитающих, исследования растительных электромобилей относительно недавние и быстро развиваются, отчасти благодаря доказательствам того, что растения могут доставлять малые РНК, мРНК, белки и другие компоненты, участвующие в иммунитете и взаимодействии между растениями и микробами. Однако изоляция высокочистых электроэлектромобилей растений остаётся технически сложной из-за жёстких клеточных стенок, обильного количества вторичных метаболитов и риска цитозольного загрязнения при сборе апопластической жидкости. Этот протокол описывает упрощённый рабочий процесс по выделению и очистке растительных электромобилей из ткани листьев Arabidopsis thaliana . Для минимизации повреждений клеток и цитозольной протечки используется мягкий шаг инфильтрации на основе шприца, а использование отдельных листьев (без черешков/сосудистой ткани) помогает снизить загрязнение сосудистым и внутриклеточным содержимым. EV изначально обогащаются дифференциальной центрифугой и могут быть дополнительно очищены с помощью фракционирования градиента плотности сахарозы или хроматографии с исключением размера (SEC). Этот протокол позволяет получить электромобили с сохраненной структурной целостностью и снижением клеточного загрязнения, минимизируя повреждение клеток и утечку цитоплазмы во время сбора апопластической жидкости, что оценивается с помощью анализа отслеживания наночастиц и пропускной электронной микроскопии. Эти образцы электромобилей подходят для последующих применений, включая профилирование РНК, протеомику и функциональные анализы для исследований взаимодействия растений и микробов. В целом этот метод обеспечивает воспроизводимый и адаптивный подход к получению высококачественных электромобилей для растений.

Введение

Внеклеточные везикулы (ЭВ) — это липидные двуслойные мембранные частицы, которые выделяются широким спектром организмов — от бактерий до человека 1,2. В животных системах EV обычно классифицируются на экзосомы, микровезикулы и апоптотические тела на основе их путей биогенеза иразмера 3. Экзосомы (диаметром ~30–150 нм) образуются в результате слияния мультивезикулярных тел (MVB) с плазматической мембраной, что приводит к освобождению внутрилуминальныхпузырьков 4, тогда как микровезикулы (~100–1000 нм в диаметре) выделяются непосредственно из плазматическоймембраны 5. Помимо экзосом и микровезикул, клетки млекопитающих также производят апоптотические тела, которые высвобождаются во время запрограммированной клеточнойсмерти 6. Эти везикулы участвуют в иммуномодуляции, прогрессировании опухолей и терапевтической обработке, что делает их объектом интенсивных биомедицинскихисследований 7,8. У растений классификация EV менее чётко определена, чем у животных. Исследования на Arabidopsis thaliana выявили несколько подтипов EV растений на основе различий в белковых маркерах, размере и предполагаемых путях биогенеза. К ним относятся тетраспанин-положительные (TET)-положительные EV, которые считаются экзосомоподобными везикулами, полученными из мультивезикулярныхтел 9,10, синтаксиновые белки Penetration 1(PEN1)-положительные EV11, экзоцисто-положительные органеллы (EXPO)EV 12,13, а также другие популяции EV, связанные с аутофагиейEV 14 ипыльцы 15.

Всё больше данных свидетельствует о том, что растения выделяют электромобили как часть своей стратегии защиты от патогенов. Растительные EV доставляют разнообразные молекулярные грузы, включая малые РНК, мРНК и другие регуляторные молекулы, которые подавляют вирулентность грибковых и оомицетныхпатогенов 10,16,17,18,19. Эти результаты выделяют электромобили как средства «РНК-войны», позволяющие растениям напрямую подавлять экспрессию генов патогенов — механизм, имеющий глубокие последствия для защитырастений 20. Помимо иммунитета, растительные EV могут также способствовать ремоделированию клеточных стенок, стрессовым реакциям и развитию сигналов21. В отличие от исследований электромобилей на животных, где стандартизированные протоколы изоляции и характеристики широкораспространены 22, область электромобилей растений всё ещё находится на стадии формирования. Это ограничивает воспроизводимость и сопоставимость между исследованиями, создавая острую необходимость в надёжных, стандартизированных методологиях для выделения и изучения этих пузырьков.

Изоляция электромобилей растений представляет собой уникальные технические задачи, с которыми не сталкиваются животные системы. Повреждённые растительные ткани содержат обильное количество вторичных метаболитов, обломков клеточных стенок и органеллярные фрагменты, которые могут совместно очищаться с EV, что усложняет дальнейшуюхарактеристику 23. Кроме того, апопластическая промывальная жидкость (AWF), которая обычно используется в качестве исходного материала для выделения и очистки электромобилей завода, часто образует гетерогенную смесь везикул изагрязнителей 24. Хотя дифференциальное центрифугирование остаётся широко используемым базовым подходом, она не может полностью разрешить отдельные субпопуляции EV или отделить EV от ко-изолированных макромолекулярныхкомплексов 25,26. Недавние обзоры и методологические исследования предоставили важные рекомендации и лучшие практики для изоляции и характеристики электромобилейрастений 27,28,29,30,31. Тем не менее, практическая реализация и интеграция этих подходов остаются сложными, и дополнительные этапы очистки, такие как центрифугирование градиента плотности и хроматография с исключением размера, часто требуются для повышения чистоты и воспроизводимости электромобилей во всех исследованиях.

Здесь мы представляем упрощённый протокол изоляции электромобилей из апопластической промывальной жидкости Arabidopsis с использованием многоступенчатой стратегии очистки. В отличие от широко используемых методов изоляции электромобилей растений, основанных на инфильтрации всего растения с помощью вакуумныхнасосов 11, этот протокол избегает включения черешков и сосудистых тканей, что может увеличить загрязнение сосудистых структур. Вместо этого используются изолированные пластинки листьев и мягкий метод инфильтрации на основе шприца для улучшения сбора апопластов и минимизации повреждения тканей. Аккуратное обращение с листьями, условия ориентации и центрифугирования дополнительно снижают загрязнение внутриклеточными компонентами, обеспечивая более чистый исходный материал для изоляции электромобилей. После дифференциальной центрифугирования EV можно дополнительно очищать с помощью фракционирования плотности сахарозы или хроматографии с исключением размера для достижения более высокой чистоты и разрешения везикул. Полученные препараты EV хорошо подходят для последующих приложений, включая секвенирование РНК, протеомное профилирование и функциональные анализы, такие как взаимодействие патогенов и исследования поглощения электромобильных электромобилей, что повышает воспроизводимость и интерпретируемость в исследованиях EV растений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите этапы центрифугации в охлаждённой центрифуге при 4 °C для сохранения целостности электромобиля. Следует использовать стерильные трубки. Все этапы обработки образцов должны выполняться быстро и эффективно, желательно несколькими сотрудниками, работающими параллельно, чтобы минимизировать повреждение тканей и предотвратить загрязнение, которое может навредить качеству электромобилей.

1. Подготовка и инфильтрация листьев

  1. Подготовьте 1-литровый буфер изоляции везикул (VIB), состоящий из 20 мМ МЭС гидрата, 2 мМ CaCl2, 0,1 М NaCl, pH 6.
  2. Уберите дистальные зоны листьев, вырезав у основания лезвия, чтобы удалить черешки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется не менее 100 растений возрастом четырёх недель на одну обработку или генотип, чтобы обеспечить достаточный урожай электромобиля. Растения Arabidopsis выращивались в циклах 8 часов света и 16 часов темноты. Не используйте листья с видимыми признаками стресса, такими как обесцвечивание и сморщивание листьев.
  3. Промывайте листья водой с обратным осмосом (RO) три раза. Положите их на бумажные полотенца и аккуратно высушите.
  4. Загрузите примерно 50 мл листьев в шприц на 120 мл. Легко постучите шприцом, чтобы уложить листья.
  5. Добавьте примерно 60 мл VIB в шприц, пока листья полностью не погружаются. Выпустите захваченный воздух, аккуратно нажимая на поршень. Нажмите на кончик шприца кусок парапленки, сложенный четыре раза, чтобы предотвратить утечку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При вакуумной инфильтрации на основе шприца убедитесь, что шприц и поршень надёжно собраны перед применением вакуума. Постепенно прикладывайте силу и крепко держите шприц, чтобы предотвратить резкое движение поршня или потерю контроля.
  6. Проникайте в листья, медленно вытягивая поршень наружу, чтобы создать вакуум. Держите поршень в вытянутом положении 5 секунд, затем медленно отпускайте его. Повторяйте этот цикл проникновения 2-3 раза, пока листья не станут темнее и прозрачнее, что указывает на успешное проникновение.
  7. ПРИМЕЧАНИЕ: Для вытягивания поршня требуется умеренное усилие из-за сопротивления вакууму. Шприц следует крепко удерживать при медленном вытягивании поршена для поддержания контролируемой инфильтрации.
  8. Когда листья проникли, вытащите вантуз. Вылейте лишний буфер в раковину.
  9. Повторяйте шаги 1.4–1.7, пока все собранные листья не будут проникты (рисунок 1A).

2. Сбор апопластической промывальной жидкости (AWF)

  1. Отрежьте полоску скотча шириной ~12 дюймов и положите её липкой стороной вверх. Закрепите один конец ленты, обмотав им пустой, ненужный шприц на 1 мл прямо под широким концем. Аккуратно разместите примерно 50-70 инфильтрированных листьев в перекрывающиеся слои вдоль липкой поверхности, расположив их так, чтобы основание каждого лезвия было обращено к нижнему шприцу, а кончики — вверх для сбора (рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наклеивание нескольких листьев на одну полоску ленты помогает предотвратить повреждения. Выровняйте все листья так, чтобы лопатка была обращена в один конец и ориентирована к нижней части трубки для эффективного восстановления апопластической жидкости во время центрифугирования.
  2. Плотно обмотайте листья вокруг шприца, затем закрепите верхнюю часть свёртка двумя полосками скотча. Введите обёрнутый шприц в трубку объёмом 50 мл, при этом отрезанный конец листьев и основание шприца ориентированы к дну трубки. Убедитесь, что листья плотно заклеены, так как рыхлая обмотка может повредить листья и выпустить поврежденные клетки, загрязняющие апопластную жидкость (рисунок 1B).
  3. Центрифугуйте завернутый шприц с инфильтрированными листьями при 900 × г в течение 10 минут при 4 °C с использованием охлаждённой центрифуги с ротором с фиксированным углом. Соберите апопластическую промывательную жидкость в новую коническую трубку объёмом 15 мл и храните образец во льду. Повторяйте шаги 2.1-2.3, пока все листья не будут использованы для сбора AWF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: AWF должен быть прозрачным, а не зелёным или даже светло-зелёным. Зелёный AWF указывает на наличие хлоропластов/хлорофилла, а также может указывать на загрязнение клеток. Чтобы минимизировать повреждение листьев, используйте ротор с фиксированным углом.

3. Изоляция EV Arabidopsis от AWF посредством дифференциальной центрифугирования

  1. Центрифугуйте собранную апопластическую промывальную жидкость при 2000 г в течение 20 минут при 4 °C с помощью холодильной центрифуги с вращающимся ротором с стандартным ускорением и замедлением. После центрифугирования используйте фильтр из нейлоновых клеток 0,45 мкм для удаления крупных клеточных отходов из супернатанта. Выбросьте шарики. Перенесите фильтрованный супернатант в новые центрифугные трубки (рисунок 2).
  2. Центрифугуйте фильтрованный супернатант при 10 000 × г в течение 30 минут при 4 °C с использованием охлаждённой центрифуги с ротором с фиксированным углом, со стандартными настройками ускорения и замедления. Отбросьте гранулу и оставьте супернатант для ультрацентрифугирования. Этот этап дополнительно удаляет крупные клеточные мусоры и большие пузырьки (рисунок 2).
  3. Переместить супернатант в ультрацентрифугные трубки объёмом 17 мл и ультрацентрифугу при 100 000 × г в течение 1 часа при 4 °C с помощью ультрацентрифуги с ротором с качающим ротором и стандартными настройками ускорения и торможения. После центрифугирования сбросьте супернатант и снова суспензируйте гранулу примерно в 16 мл буфера VIB для промывки. Повторите ультрацентрифугирование для сбора электромобилей (рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование при 100 000 x g проводится для седиментации мелких везикул, таких как экзосомы. Последующие этапы промывания помогают устранить белки, не связанные с EV, за счёт повторного суспензирования гранулы в буфере. Ультрацентрифугные трубки должны тщательно сбалансироваться по массе в соответствии с спецификациями производителя перед центрифугированием. Перед началом работы проверьте трубы и диски на наличие дефектов и убедитесь, что ротор правильно закреплён.
  4. Сбросьте супернатант и снова подвесите гранулу в VIB. Используйте кончик пипетки, чтобы аккуратно соскребать дно трубки, чтобы обеспечить полное восстановление электромагнитной гранулы (рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Электромагнитная гранула часто полупрозрачная и может быть незаметной визуально после повторного взвешивания. Аккуратное соскребание дна трубки облегчает процесс повторной подвески электромобиля. Отрегулируйте объём подвески для достижения желаемой концентрации электромобиля, так как меньшие объёмы подвески обычно приводят к более концентрированной подготовке электромобилей. Обычно при ресуспензии EV в 50 мкл концентрация белков составляет примерно 1-1,5 мкг/мл, а концентрации частиц — около10 9-10 10 частиц/мл.
  5. Храните подвешенные электромобили при 4 °C для немедленного использования или при -80 °C для длительного хранения без мгновенного замораживания в жидком азоте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное хранение может снижать целостность электромобиля. Используйте свежеприготовленные электромобили, когда это возможно.

4. Использование фракционирования плотности сахарозы для очистки электромобилей

ПРИМЕЧАНИЕ: Только ультрацентрифугирование совместно осаждает несколько типов пузырьков. Для достижения более тонкого разрешения можно использовать фракционирование градиента плотности, разделяющее везикулы по их плавучести и плавающим свойствам. В этом подходе градиенты сахарозы используются для обогащения очерченных субпопуляций EV. В качестве альтернативы можно использовать градиенты йодиксанола.

  1. Верхнее нагрузочное отделение сахарозных градиентов электромобилей
    1. Подготовьте запасы с градиентом сахарозы 10-90%, состоящие из следующих концентраций: 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%. 52%, 58%, 64%, 70% и 90% используют VIB. Используйте водяную баню при температуре 60 °C, чтобы помочь растворить 70% и 90% бульонов.
    2. Подготовьте дискретный градиент, нанеся слои по 1 мл каждого сахарозного раствора в ультрацентрифугной трубке объемом 17 мл, начиная с самого концентрированного раствора внизу и последовательно переходя к наименее концентрированному. При сборке градиента исключите слой сахарозы 10%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно размещайте каждый плотный слой вдоль внутренней стенки трубки, чтобы минимизировать смешивание между соседними слоями. Рекомендуется использовать автоматическую пипетку с низкой скоростью дозирования для обеспечения непрерывного, контролируемого потока и повышения устойчивости градиента. Если используется обычная ручная пипетка, дозирование следует выполнять медленно и равномерно, при этом кончик пипетки расположен чуть выше границы предыдущего слоя, при этом следует избегать образования пузырьков воздуха.
    3. Смешайте повторно взвешенную гранулу EV (~100 мкг белка EV) с 1 мл раствора сахарозы 10%. Затем слойте эту смесь как последний слой разрывного слоя. Общий объём составит ~12,1 мл.
    4. Центрифуга при 100 000 г в течение 16 часов при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительных ультрацентрифугных пробегов убедитесь, что трубки, крышки и диски рассчитаны на длительную работу на высокой скорости и соблюдены рекомендованными производителем процедуры балансировки.
    5. Собрать шесть фракций по 2 мл на образец с помощью пипетирования сверху. Каждую фракцию перенесите в новую ультрацентрифугную трубку объёмом 17 мл.
    6. Суспензировать собранные фракции в буфере VIB объемом ~16 мл и центрифугировать при 100 000 г в течение 1 часа при 4 °C.
    7. Сбросьте супернатант, затем снова суспензируйте каждую гранулу в 50 мкл VIB.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Электромобильная пеллета не видна. Аккуратно соскребите днище трубки кончиком пипетки, чтобы подвесить её. Регулируйте объём буфера по мере необходимости (например, 10 мкл для повышения концентрации).
  2. Отделение электромобилей с градиентом сахарозы при нижней нагрузке
    1. Подготовьте запасы с градиентом сахарозы 10-90%, состоящие из следующих концентраций: 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%, 52%, 58%, 64%, 70% и 90% с использованием буфера VIB. Используйте водяную баню при температуре 60 °C, чтобы помочь растворить 70% и 90% бульонов.
    2. Смешайте повторно взвешенную пеллету EV (~100 мкг белка EV) с 1 мл раствора сахарозы 90%. Затем слойте эту смесь как первый слой разрывного слоя.
    3. Подготовьте оставшийся прерывистый градиент сахарозы, последовательно нанося по 1 мл каждого раствора сахарозы поверх смеси EV-90% сахарозы, начиная с 70% сахарозы и постепенно переходя к более низким концентрациям (64%, 58%, 52%, 46%, 40%, 34%, 28%, 22%, 16% и 10%). Аккуратно наносите каждый слой вдоль стенки трубки с помощью пипетки, чтобы минимизировать смешивание между соседними слоями. Общий объём составит ~12,1 мл.
    4. Центрифуга при 100 000 г в течение 72 часов при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительных ультрацентрифугных пробегов убедитесь, что трубки, крышки и диски рассчитаны на длительную работу на высокой скорости и соблюдены рекомендованными производителем процедуры балансировки.
    5. Собрать шесть фракций по 2 мл на образец с помощью пипетирования сверху. Каждую фракцию перенесите в новую ультрацентрифугную трубку объёмом 17 мл.
    6. Суспензировать собранные фракции в ~16 мл буфера VIB и центрифугировать при 100 000 г в течение 1 часа при 4 °C.
    7. Сбросьте супернатант, затем подвесьте каждую гранулу в 50 мкл буфера VIB.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Электромобильная пеллета не видна. Аккуратно соскребите днище трубки кончиком пипетки, чтобы подвесить её. Регулируйте объём буфера по мере необходимости (например, 10 мкл для повышения концентрации).

5. Использование хроматографии с исключением размеров (колонка 35 нм) для очистки электромобилей

  1. Подготовка буфера и уравновесение столбцов
    1. Подготовьте VIB и все дополнительные буферы заново. Фильтруйте все буферы через мембрану 0,22 мкм и дегазируйте под вакуумом перед использованием, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха и закупорку пор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неполное дегазирование или использование нефильтрованных буферов может привести к попаданию в слой смолы пузырьков или частиц, что приводит к нарушению потока и снижению эффективности разделения электромобилей. Если в столбце наблюдаются пузырьки, забег следует остановить, а столбец вновь уравновесить.
    2. Позвольте колонке и буферам уравновеситься до комнатной температуры (18-24 °C) перед снятием колпачков колонок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонна и буферы должны быть полностью уравновешены до комнатной температуры до снятия крышки. Применение буфера комнатной температуры к холодной колонне может вызвать образование пузырьков внутри смолы, что приводит к искажению профилей элюции и снижению воспроизводимости.
    3. Поставьте колонку в вертикальное положение и аккуратно снимите верхнюю крышку колонны.
    4. Снимите нижнюю крышку и дайте буферу полностью слиться из колонны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что буфер хранения полностью опустошён из колонки до уравновешения.
    5. Уравновесить колонку путём промывки с тремя столбцами (25,5 мл) дегазированного VIB-буфера размером 0,22 мкм.
  2. Загрузка электромобилей и сбор образцов
    1. Используйте 100 мкг общего белка EV для каждой очистки SEC. Перед загрузкой в колонку SEC отрегулируйте образцы электромобилей до конечного объёма 500 мкл с помощью VIB.
    2. Подвеску EV на 500 мкл напрямую подведите на нагрузочный фрит в верхней части колонки.
    3. Дайте сэмплу полностью войти в слой смолы перед добавлением буфера VIB. Поддерживайте непрерывный поток колонн на протяжении всего разделения для обеспечения точной элюции, основанной на размере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поток в колонках должен оставаться непрерывным на протяжении всего разделения. Если колонна иссохнет или длительное время приостановка потока, это нарушает разделение по размеру и может привести к перекрытию фракций и снижению обогащения электромобилей.
    4. После того как образец электромобиля (500 мкл) полностью войдёт в слой смолы, добавьте 2 мл VIB и дайте ему полностью элюироваться. Этот элуат соответствует мёртвому объёму столбца и должен быть отброшен. Затем фракция EV собиралась путём последовательного добавления 400 мкл VIB и сбора элюата, повторяя этот процесс для получения фракций 1-6 в микроцентрифугных трубках объёмом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мёртвый объём не должен содержать электромобили. На основе валидации с использованием колонки 35 нм электромобили обычно извлекаются дробями 1-3. При необходимости мертвый объём можно оценить с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA) или иммуноблотирования для маркеров EV для подтверждения их отсутствия.
  3. Очистка и хранение колонн
    1. Сразу после сбора фракции промите колонку объёмом одного столба (8,5 мл) с уровнем 0,5 M NaOH для дезинфекции смолы. Затем промите колонку 17 мл VIB для восстановления нейтрального pH. Затем столбец готов к загрузке следующего образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка колонки только буфером недостаточно для удаления остаточных белков или везикул. Этап очистки NaOH необходим для предотвращения переноса между образцами, особенно для анализов нуклеиновых кислот или РНК.
    2. Для длительного хранения промывайте колонну двумя колонными объёмами деионизированной воды после очистки, затем двумя столбцами с 20% этанолом для хранения. Перескажите колонку и храните её вертикально.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывание колонны деионизированной водой перед хранением этанола предотвращает кристаллизацию соли в слое смолы, что сохраняет работу колонки.

6. Валидация, количественная оценка и оценка размера/морфологии электромобилей

  1. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
    1. Измерьте распределение размера EV и концентрацию частиц по NTA.
    2. Разбавлять образцы EV при 1:100 в стерильном VIB с фильтром 0,2 мкм для достижения концентрации частиц в оптимальном диапазоне обнаружения (примерно 10⁷-10⁹ частиц/мл).
    3. Аккуратно смешайте разбавленные образцы, чтобы избежать образования пузырей, и загрузите их в прибор, оснащённый лазером 532 нм и высокочувствительной sCMOS-камерой.
    4. Выполнять сбор и анализ данных с помощью программного обеспечения NS Xplorer с порогом обнаружения 10 нм (до 1000 нм), применяя динамический алгоритм концентрации на основе объема наблюдения.
  2. Вестерн-блот для маркеров электромобилей
    1. Для анализа вестерн-блот промывайте и ресуспензируйте EV-фракции, полученные после разделения сахарозного градиента в 50 мкл VIB. Смешайте аликвот по 10 мкл из каждой фракции с буфером для нагрузки SDS, денатурируемые и растворяемые на 12% геле трис-глицина перед иммуноблотированием антителами к маркеру EV TET8.
    2. Для EV фракций, полученных из SEC, сначала концентрируйте от 400 мкл каждой фракции до 50 мкл с использованием центробежного фильтра с отсечением молекулярной массы 100 кДа. Затем используйте 10 мкл концентрированного образца для анализа западного блота, как описано выше.
  3. Трансмиссионная электронная микроскопия (TEM)
    1. Отложено 5 мкл электромобилей, подвешенных в VIB, на сетки с светящимися разрядами углеродообразных формваров с 300-сеткой. Затем отведите лишний образец фильтрующей бумагой.
    2. Затем негативно окрашивайте сетку 3 мкл морилки для электронной микроскопии, стирайте фильтрующей бумагой и дайте ей высохнуть на воздухе перед использованием 300 кВ TEM.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы оценить, снижает ли оптимизированный протокол сбора AWF повреждение тканей и цитоплазматическое загрязнение, полученный AWF с использованием нашего метода (Метод 1) был напрямую сравнен с альтернативным методом (Метод 2), основанным на инфильтрации вакуумного насоса всегозавода 11. Повреждение клеток после инфильтрации оценивалось с помощью окрашивания Trypan Blue, которое выявило заметное уменьшение окрашивания на листьях, обработанных методом 1, что указыв...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Растительные EV стали ключевыми игроками иммунитета растений, особенно в урегулировании межцарственной коммуникации с грибковымипатогенами 32. Всё больше доказательств показывают, что растения выделяют EV в апопласт, где они выполняют функции доставки малых РНК (sRNA), мРНК и белков, способных подавлять вирулентность у инвазивных патогенов, таких как Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani и оомицетный патоген Phytophthora capsici

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не раскрывают конфликта интересов.

Благодарности

B.D. поддерживается стипендией Pathways to the Doctorate от Техасского университета A&M. B.H. поддерживается стартовыми средствами от Техасского университета A&M и Министерства сельского хозяйства США HATCH 7009138 номер проекта: TEX08074.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,45 и микро; M-нейлоновые фильтрыVWR76479-032
1 мл ненужный шприцBD Biosciences309659
Ультрацентробежный фильтр мощностью 100 кДаАмиконUFC 910008
100 мл ненужный шприцBD Biosciences551721050
Конические трубки объемом 15 млVWR89039-664
Конические трубки объемом 50 млVWR89039-656
Arabidopsis thaliana (Col-0)Линии, обслуживаемые лабораторнымиНе применимо
Углеродно-формварные сетки с 300 сеткамиТЕД ПЕЛЛА01753-F
Прозрачная лентаСкотч Волшебная ЛентаS-9783
ПарафильмFisher Scientific13-374-12
Буфер PBSСделано внутри компанииНе применимо
qEV оригинальный столбец Gen2 35 нмIZON ScienceICO-35
Рефрижераторная центрифугаЭппендорф5810R
Рефрижераторный центрифуга с фиксированным углом ротораЭппендорфF-34-6-38
Рефрижераторный центрифужный ротор с поворотным ведромЭппендорфA-4-62
СахарозаVWR470302-810
УльтрацентрифугаБекман КоултерXPN-100
Ультрацентрифугные трубкиБекман Коултер337986
Пятна UranyLessНауки об электронной микроскопии250218-01

Ссылки

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Zhou, X., et al. Small extracellular vesicles: The origins, current status, future prospects, and applications. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 184(2025).
  3. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  4. Akers, J. C., Gonda, D., Kim, R., Carter, B. S., Chen, C. C. Biogenesis of extracellular vesicles (EV): Exosomes, microvesicles, retrovirus-like vesicles, and apoptotic bodies. J Neurooncol. 113 (1), 1-11 (2013).
  5. Ratajczak, M. Z., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: Discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
  6. Hristov, M., Erl, W., Linder, S., Weber, P. C. Apoptotic bodies from endothelial cells enhance the number and initiate the differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro. Blood. 104 (9), 2761-2766 (2004).
  7. Marar, C., Starich, B., Wirtz, D. Extracellular vesicles in immunomodulation and tumor progression. Nat Immunol. 22 (5), 560-570 (2021).
  8. Ruan, S., et al. Extracellular vesicles as an advanced delivery biomaterial for precision cancer immunotherapy. Adv Healthc Mater. 11 (5), e2100650(2022).
  9. Cai, Q., et al. Message in a bubble: Shuttling small RNAs and proteins between cells and interacting organisms using extracellular vesicles. Annu Rev Plant Biol. 72, 497-524 (2021).
  10. Cai, Q., et al. Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogen to silence virulence genes. Science. 360 (6393), 1126-1129 (2018).
  11. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles isolated from the leaf apoplast carry stress-response proteins. Plant Physiol. 173 (1), 728-741 (2017).
  12. Ding, Y., et al. Exo70e2 is essential for exocyst subunit recruitment and expo formation in both plants and animals. Mol Biol Cell. 25 (3), 412-426 (2014).
  13. Wang, J., et al. Expo, an exocyst-positive organelle distinct from multivesicular endosomes and autophagosomes, mediates cytosol to cell wall exocytosis in Arabidopsis and tobacco cells. Plant Cell. 22 (12), 4009-4030 (2010).
  14. Jeon, H. S., et al. Pathogen-induced autophagy regulates monolignol transport and lignin formation in plant immunity. Autophagy. 19 (2), 597-615 (2023).
  15. Prado, N., et al. Nanovesicles are secreted during pollen germination and pollen tube growth: A possible role in fertilization. Mol Plant. 7 (3), 573-577 (2014).
  16. Samuel, M., Bleackley, M., Anderson, M., Mathivanan, S. Extracellular vesicles including exosomes in cross kingdom regulation: A viewpoint from plant-fungal interactions. Front Plant Sci. 6, 766(2015).
  17. Pinedo, M., De La Canal, L., De Marcos Lousa, C. A call for rigor and standardization in plant extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 10 (6), e12048(2021).
  18. Huang, Y., et al. Rice extracellular vesicles send defense proteins into fungus rhizoctonia solani to reduce disease. Dev Cell. 60 (8), 1168-1181.e6 (2025).
  19. Wang, S., et al. Plant mrnas move into a fungal pathogen via extracellular vesicles to reduce infection. Cell Host Microbe. 32 (1), 93-105.e6 (2024).
  20. He, B., et al. Publisher correction: Rna-binding proteins contribute to small rna loading in plant extracellular vesicles. Nat Plants. 7 (4), 539(2021).
  21. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles as key mediators of plant-microbe interactions. Curr Opin Plant Biol. 44, 16-22 (2018).
  22. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  23. Regente, M., et al. Plant extracellular vesicles are incorporated by a fungal pathogen and inhibit its growth. J Exp Bot. 68 (20), 5485-5495 (2017).
  24. Mu, J., et al. Interspecies communication between plant and mouse gut host cells through edible plant derived exosome-like nanoparticles. Mol Nutr Food Res. 58 (7), 1561-1573 (2014).
  25. Baldrich, P., et al. Plant extracellular vesicles contain diverse small RNA species and are enriched in 10- to 17-nucleotide "tiny" RNAs. Plant Cell. 31 (2), 315-324 (2019).
  26. Regente, M., et al. Vesicular fractions of sunflower apoplastic fluids are associated with potential exosome marker proteins. FEBS Lett. 583 (20), 3363-3366 (2009).
  27. Rutter, B. D., Innes, R. W. Growing pains: Addressing the pitfalls of plant extracellular vesicle research. New Phytol. 228 (5), 1505-1510 (2020).
  28. Thieron, H., et al. Practical advice for extracellular vesicle isolation in plant-microbe interactions: Concerns, considerations, and conclusions. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70022(2024).
  29. Borniego, M. L., et al. Diverse plant Rnas coat Arabidopsis leaves and are distinct from apoplastic RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2409090121(2025).
  30. Chen, A., He, B., Jin, H. Isolation of extracellular vesicles from Arabidopsis. Curr Protoc. 2 (1), e352(2022).
  31. Koch, B. L., Rutter, B. D., Innes, R. W. Arabidopsis produces distinct subpopulations of extracellular vesicles that respond differentially to biotic stress. bioRxiv. , (2024).
  32. Hamby, R., Cai, Q., Jin, H. RNA communication between organisms inspires innovative eco-friendly strategies for disease control. Nat Rev Mol Cell Biol. 26 (2), 81-82 (2025).
  33. Hou, Y., et al. A phytophthora effector suppresses trans-kingdom RNAi to promote disease susceptibility. Cell Host Microbe. 25 (1), 153-165.e5 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение везикулдифференциальное центрифугированиесахарозный градиентэксклюзионная хроматографиянаночастичный трекингтрансмиссионная электронная микроскопиявзаимодействие растений и микробов
Выделение и очистка внеклеточных пузырьков растений из листьев арабидопсиса с помощью оптимизированного метода сбора апопластического промыва
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.