Этот протокол описывает изготовление растворимых микроигольчатых пластырей, содержащих α-лактальбуминовые наномицеллы, насыщенные капсаицином. Метод предлагает воспроизводимый, минимально инвазивный подход для целенаправленной трансдермальной доставки гидрофобных биоактивных веществ в жировую ткань, способствуя эффективному локальному снижению жира и потенциально расширяя применения в управлении ожирением.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изготовление растворимых микроигольных пластырей с наномицеллами α-лактальбумина для трансдермальной доставки капсаицина и восстановления жировой ткани
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Этот протокол описывает изготовление и применение растворимых микроигличных (MN) пластырей с наномицеллами α-лактальбумина для целенаправленной трансдермальной доставки капсаицина в жировую ткань. Процесс начинается с частичного ферментативного гидролиза α-лактальбумина, в результате чего амфифильные пептиды самособираются в наномицеллы, инкапсулирующие гидрофобное соединение капсаицин. Наномицеллы, насыщенные капсаицином, смешиваются с матрицей гиалуроновой кислоты (HA) и поливинилспирта (PVA), отливаются в формы на основе полидиметилсилоксана (PDMS) и центрифугируют для получения массив объемом 10 × 10 MN. После вакуумной сушки MN демонстрируют достаточную механическую прочность для проникновения кожи и растворяются примерно в течение 30 минут после нанесения. Репрезентативные результаты включают сканирующую электронную микроскопию, подтверждающую равномерную морфологию MN, конфокальную микроскопию, подтверждающую проникновение в кожу и высвобождение лекарств, а также эксперименты in vivo на мышах с высоким содержанием жиров (HFD), показывающие снижение жировой массы, улучшенную метаболическую активность и индуцирование жирового потемнения. Этот протокол обеспечивает воспроизводимый и минимально инвазивный метод трансдермальной доставки гидрофобных биоактивных веществ, предлагая перспективный терапевтический подход к лечению ожирения. Этот протокол оптимизирован для воспроизводимости и подходит для адаптации к другим гидрофобным биоактивным веществам.
Введение
Ожирение стало одной из самых насущных глобальных проблем здравоохранения, при этом его распространённость стабильно растёт как в развитых, так и в развивающихся странах. По данным Всемирной организации здравоохранения, в 2016 году более 650 миллионов взрослых были классифицированы как страдающие ожирением, а в 2022 году примерно 43% взрослых в возрасте ≥18 лет имели избыточный вес, а 16% жили сожирением 1. Ожирение тесно связано с метаболическими синдромами, сердечно-сосудистыми заболеваниями, диабетом 2 типа и несколькими видами рака, что накладывает значительные социально-экономические и медицинскиенагрузки 2,3. Современные терапевтические стратегии, включая ограничение питания, физические упражнения, фармакотерапию и бариатрическую хирургию, дают лишь частичные и часто временные пользы. Эти подходы часто страдают от плохого соблюдения пациентами, ограниченной долгосрочной эффективности, высокой инвазивности и нежелательных побочныхэффектов 4,5. В результате существует острая необходимость в безопасных, эффективных и соответствующих пациенту локальных методах лечения ожирения.
Природные биоактивные соединения привлекают всё больший интерес как средства против ожирения благодаря их многоцелевым действиям и в целом благоприятным профилям безопасности. Например, рутин, флавоноидный гликозид, проявляет антилипогенные и метаболические регуляторные эффекты, подавляя адипогенные транскрипционные факторы и способствуя биогенезумитохондрий 6. Капсаицин, резкий компонент чили-перца, сообщается как способ усиливать энергозатраты, вызывать потемнение белой жировой ткани и подавлять накопление липидов через активацию ваниллоидного потенциала транзиентного рецептора 1 (TRPV1)сигнала 7,8. Однако клиническая трансляция этих соединений затруднена низкой растворимостью в воде, низкой биодоступностью в ротовой полости, быстрым метаболизмом и, в случае капсаицина, раздражением желудочно-кишечного тракта приупотреблении 9.
Системы доставки лекарств на основе нанотехнологий предлагают перспективные решения этих ограничений. Липосомы, полимерные наночастицы и наноносители на основе белков могут значительно улучшить растворимость, стабильность и усвоение клеток10. В частности, α-лактальбумин, молочный белок пищевого происхождения, может частично гидролизироваться в амфифильные пептиды, которые самособираются в наномицеллы, способные инкапсулировать гидрофобные молекулы, такие каккапсаицин-11. Эти α-лактальбуминовые наноструктуры показали повышение растворимости, стабильности и биодоступности различных гидрофобных биоактивных веществ в пищевых и фармацевтическихматрицах 12,13. Тем не менее, системное введение наноносителей всё равно может привести к внецелевому распределению тканей и потенциальной системнойтоксичности 14.
Технология Microneedle (MN) стала малоинвазивной, удобной для пациентов платформой для трансдермальных доставок лекарств. Растворяемые МН, полученные из биосовместимых полимеров, таких как гиалуроновая кислота (HA) и поливиниловый спирт (PVA), могут безболезненно проникать в слой роговицы, растворяться после введения и обеспечивать точное локальное накопление препаратов в целевыеткани 15,16. Сочетание наноносителей с MN дополнительно увеличивает накопление лекарств в подкожной жировой ткани, одновременно снижая системное воздействие и побочныеэффекты 17. Важно отметить, что растворяющиеся пластыри на основе HA- и PVA MN внедряются в клиническую практику для трансдермальной доставки вакцин и биофармацевтических препаратов, демонстрируя благоприятную безопасность, приемлемость пациентов и производственность вмасштабах 18.
Опираясь на эти достижения, настоящее исследование описывает изготовление растворимых пластырей MN, загруженных α-лактальбумиминовыми наномицеллами, инкапсулирующими капсаицин. В этом протоколе α-лактальбумин растворяется при 6 мг/мл и ферментативно гидролизируется для образования амфифильных пептидов, которые самособираются в наномицеллы, нагруженные капсаицином. Наномицеллы интегрируются в матрицу HA/PVA (по 5% w/v каждая) и отливаются в формы полидиметилсилоксана (PDMS) для образования массив объемом 10 × 10 MN с высотой иглы 600 мкм — конфигурация, совместимая со стандартными процессами микроформования и легко масштабируемая для увеличения, человеческих участков. Ожидается, что эта интегрированная конструкция улучшит растворимость и стабильность капсаицина, обеспечит рН-чувствительное высвобождение в жировой ткани и повысит локальную эффективность в организме против ожирения, способствуя потемнению жировой ткани, подавляя липогенез и улучшая системные метаболические параметры. Используя пищевой α-лактальбумин и клинически продвинутые растворяющиеся материалы MN, эта платформа предлагает трансляционно релевантную, минимально инвазивную стратегию, которую можно адаптировать к пластырям человеческого масштаба для самостоятельной локализованной терапии ожирения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Комитетом по этике экспериментальных животных в Пекине. Присвоенный номер одобрения лаборатории/исследователя — AW03019102-3. Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.
1. Подготовка наномицелл α-лактальбумина, инкапсулирующих капсаицин 12
- Растворить α-лактальбумин в деионизированной воде до концентрации 6 мг/мл и отрегулировать pH до 7,4. Размешивайте раствор с помощью магнитной мешалки при температуре 8-28 × г до полного растворения α-лактальбумина (обычно 20-30 минут).
- Добавьте протеазу Bacillus licheniformis (BLP) с соотношением ферментов к субстрату 1:100 (ч/ш).
- Инкубировать смесь при 50 °C в течение 30 минут, чтобы получить амфифильные пептиды.
- Прекратите реакцию, нагрев раствор до 95 °C в течение 5 минут, затем охладите до комнатной температуры и профильтруйте через мембрану диаметром 0,22 мкм.
- Растворить капсаицин в этаноле до концентрации 1 мг/мл. Капсаициновый раствор капсаицина капляйте в пептидный раствор при аккуратном перемешивании.
- Продолжайте перемешивания 2 часа, чтобы наномицеллы самостоятельно собрались.
- Удалите свободный капсаицин, диализируя смесь (MWCO 3,5 кДа) против деионизированной воды в течение 12 часов, заменяя воду каждые 4 часа.
- Лиофилизуйте подготовленные наномицеллы α лактальбумина.
- Охарактеризуйте наномицеллы с помощью анализа TEM, DLS и зета-потенциала.
2. Изготовление растворимых микроигольных пластырей 11
- Приготовьте полимерный раствор, растворив HA (5% w/v) и PVA (5% w/v) в деионизированной воде при 60 °C и перемешивая, пока раствор не станет прозрачным.
- Охладите полимерный раствор до комнатной температуры и смешайте его с наномицеллами с капсаицином (M(Cap)) в соотношении 4:1.
- Дегазируйте смесь в вакууме в осушителе, соединённом с вакуумным насосом (примерно −80 кПа) в течение 10 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха перед литью в формы PDMS.
- Загрузить 200 мкл смеси в формы PDMS (10 × 10 игл, высота 600 мкм).
- Центрифугуйте формы при 1800 × г при RT в течение 10 минут, чтобы полностью заполнить полости микроигл.
- Повторите наполнение один раз, затем второе центрифугирование при тех же условиях, что и на шаге 2.5, а затем высушите формы в вакууме (примерно −80 кПа) при комнатной температуре в течение 12 часов.
- Аккуратно снимите микроигольчатые пластыри с форм.
- Изучите морфологию микроиглы по SEM.
3. Механические испытания микроигл 19
- Разместите микроиголочный пластырь на сцене анализатора текстуры так, чтобы иглы были направлены вверх.
- Сжимайте участок с помощью зонда со скоростью 20 мкм/с до достижения смещения 0,7 мм.
- Запишите силу перелома и убедитесь, что она составляет ≥0,15 N на иглу, чтобы обеспечить проникающую способность кожи.
4. Тест на введение и растворение in vitro 11
- Сбрийте кожу брюшной полости мышей и удалите кожу для экс-виво тестирования.
- Положите вырезанную кожу на агарозный гель.
- Плотно прижимайте микроигольчатый пластырь к коже в течение 30 секунд.
- Поддерживайте контакт между пластырём и кожей в течение 30 минут.
- Наблюдайте растворение иглы.
- Окрашивайте кожу окрашиванием H&E и визуализируйте места введения под CLSM.
5. Исследование выпуска in vitro 11
- Погрузите микроигольные пластыри в буфер PBS (pH 6,5 или 7,4) при 37 °C.
- С определёнными интервалами извлекайте буферные образцы и немедленно пополняйте их равным объёмом свежего буфера.
- Определите концентрацию капсаицина в собранных образцах с помощью ВЭЖХ.
- Сравните профили выпуска при разных условиях pH с помощью ВЭЖХ.
6. Применение in vivo у мышей с ожирением, вызванных HFD, 11
- Вызвать ожирение у мышей C57BL/6N, кормя высокожирной диетой (HFD, 60% ккал жира) в течение 8 недель.
- Случайным образом разделите мышей на пять групп: нормальная контрольная, HFD-контрольная, микроигольный пластырь с пустыми мицеллами (MP-M), инъекция наномицеллы с капсаицином (InJ-M(Cap)) и микроигольная пластырь с наномицеллой с капсаицином (MP-M(Cap)).
- Депилируйте паховую область каждой мыши.
- Накладывайте по одному микроигольному пластырю на депилированную область каждые 2 дня в течение 28 дней и держите пластырь на месте 30 минут.
- Фиксируйте вес тела и потребление пищи каждые 2 дня в течение периода лечения.
- В конце процедуры проанализируйте состав жира и мышных тканей в целом теле, с помощью МРТ.
- Оценивайте физическую активность, потребление кислорода, выработку CO₂ и коэффициент дыхания (RQ) в метаболических клетках согласно инструкциям производителя.
- Собирайте iWAT, sBAT и основные органы, фиксируйте, встраивайте, разрезайте и окрашивайте ткани с помощью H&E, а также оценивайте гистологические изменения с помощью световой микроскопии.
- Выполнить вестерн-блотинг для TRPV1, PPARγ, C/EBPα, UCP1 и Cyt C с использованием стандартных процедур.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Морфология и характеристика наномицелл
Трансмиссионная электронная микроскопия (TEM) показала, что наномицеллы α-лакальбумина имеют равномерно дисперсированные, сферические частицы с узким распределением размеров (рисунок 1). После инкапсуляции капсаицина средний диаметр частицы увеличивался с ~22 нм до ~30 нм, что свидетельствует о успешной загрузке препарата в мицеллярное ядро. Последовательно, потенциал зета немного смещался с −16,8 мВ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Это исследование показывает, что растворимые микроиглы (MN) пластыри с наномицеллами α-лактальбумина, инкапсулирующие капсаицин (M(Cap)), могут добиваться локальных, минимально инвазивных противоожирительных эффектов. α-Лактальбуминовые наномицилы эффективно инкапсулировали гидрофобный капсаицин, улучшили его водную дисперсируемость и улучшили клеточное поглощение, что привело к более сильному ингибированию адипогенеза и более выраженному митохондриальному биогенезу в адипоцитах 3T3-L1, ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Раскрытия информации нет.
Благодарности
Этот проект был поддержан Фондом молодых учёных Национального фонда естественных наук Китая (No 32202024), Фондом молодых учёных провинциального фонда естественных наук провинции Шаньдун (No ZR2024QC103), Ключевой план исследований и разработок провинции Шаньдун (2025CXGC010803, 2022CXPT022), Технологическую систему птицеводческой промышленности провинции Шаньдун (SDAIT-11-10) и Программу сотрудничества между университетами и промышленностью, финансируемую Бюро образования города Яньтай, Китай (разработка платформы вакцин следующего поколения для домашних животных).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Преадипоциты 3T3-L1 | ATCC | CL-173 | Клеточная линия для исследований адипогенеза |
| Bacillus licheniformis протеаза (BLP) | Сигма-Олдрич | P5380 | Ферментативный гидролиз α-лактальбумина |
| Капсаицин (≥ 98%) | Сигма-Олдрич | M2028 | Активное соединение, подлежащее инкапсулированию |
| Центрифуга (≥ 4000 об/мин) | Эппендорф | 5810R | Заполнять формы |
| Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM) | Zeiss | LSM 900 | Визуализировать распределение и проникновение мицелл |
| Флуоресцентный краситель Cy3 | GE Healthcare | PA23001 | Для маркировки наномицелл |
| Флуоресцентные красители Cy5 или Cy7 | Fanbo Biochemical, Пекин, Китай | Н/Д | Для биораспределения визуализации |
| Дульбекко s Модифицированный Орел» s Medium (DMEM) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | Для клеточной культуры |
| Этанол (≥ 99.7%) | Химический реагент Sinopharm | 100092683 | Растворитель для капсаицина |
| Сыворотка плода крупного рогатого скота (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 16000-044 | Для клеточной культуры |
| Диета с высоким содержанием жиров (60% ккал жира, D12492) | Research Diets, США | D12492 | Вызывать ожирение у мышей |
| Гиалуроновая кислота (HA, Mw 100– 300 кДа) | Aladdin Biochemical Technology Co., Китай | H108124 | Полимер для изготовления микроигл |
| Изофлуран | RWD, Китай | R510-22-10 | Анестезия |
| Метаболическая клетка | Панлаб, США | Н/Д | Оценивать активность, потребление кислорода и RQ |
| Деионизированная вода Milli-Q | Миллипор | Н/Д | Растворитель |
| Система МРТ | NiuMag, Китай | MesoQMR23-060H-I | Для измерения жира/сухого состава тела |
| Микроигольчатые формы PDMS (10 и раз; 10, 600 и миль; m ростом) | Blueacre Technology или кастомные | Н/Д | Изготовление микроигл |
| Penicillin– стрептомицин | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | Для клеточной культуры |
| Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS, pH 7.4) | Термо Фишер Сайентифик | 10010023 | Буфер для исследований in vitro и in vivo |
| Поливиниловый спирт (PVA, Mw 30– 70 кДа) | Aladdin Biochemical Technology Co., Китай | P109389 | Полимер для изготовления микроигл |
| Сканирующий электронный микроскоп (SEM) | FEI Tecnai | G2 F30 | Для характеристики морфологии микроиглы |
| Анализатор текстур | BosinTech, Шанхай, Китай | СПАСИБО. XTC-20 | Для проверки прочности микроиглы |
| Раствор Trypan blue (0,4%) | Термо Фишер Сайентифик | 15250061 | Визуализация мест введения микроиглой |
| UV– Vis спектрофотометр | ПеркинЭлмер | Лямбда 35 | Для анализов на высвобождение лекарств |
| Вакуумная печь/осушитель | Термо Фишер Сайентифик | Н/Д | Сушить микроиголки |
| Вестерн-блотинговый аппарат | Био-Рад | Mini-PROTEAN Tetra | Анализ белков |
| &альфа;-Лактальбумин (≥ 95%) | Сигма-Олдрич | L6010 | Источник белка для образования наномицелл |
Ссылки
- Obesity and overweight. WHO Fact Sheets. , World Health Organization. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/obesity-and-overweight (2025).
- Bray, G. A., Kim, K. K., Wilding, J. P. H. Federation, W. O. Obesity: A chronic relapsing progressive disease process. A position statement of the World Obesity Federation. Obes Rev. 18 (7), 715-723 (2017).
- Hruby, A., Hu, F. B. The epidemiology of obesity: A big picture. Pharmacoeconomics. 33 (7), 673-689 (2015).
- Dietrich, M. O., Horvath, T. L. Limitations in anti-obesity drug development: The critical role of hunger-promoting neurons. Nat Rev Drug Discov. 11 (9), 675-691 (2012).
- Garvey, W. T., et al. American Association of Clinical Endocrinologists and American College of Endocrinology comprehensive clinical practice guidelines for medical care of patients with obesity. Endocr Pract. 22, 1-203 (2016).
- Li, Z., Liang, S., Sun, H., Bao, C., Li, Y. Antilipogenesis effect of rutin-loaded liposomes using a microneedle delivery system. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (47), 54294-54303 (2023).
- Hsu, C. L., Yen, G. C. Effects of flavonoids and phenolic acids on the inhibition of adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes. J Agric Food Chem. 55 (21), 8404-8410 (2007).
- Zhang, L. L., et al. Activation of transient receptor potential vanilloid type-1 channel prevents adipogenesis and obesity. Circ Res. 100 (7), 1063-1070 (2007).
- Zheng, J., Zheng, S., Feng, Q., Zhang, Q., Xiao, X. Dietary capsaicin and its anti-obesity potency: from mechanism to clinical implications. Biosci Rep. 37 (3), BSR20170286(2017).
- Negahdari, R., et al. Therapeutic benefits of rutin and its nanoformulations. Phytother Res. 35 (4), 1719-1738 (2021).
- Bao, C., et al. Microneedle patch delivery of capsaicin-containing α-lactalbumin nanomicelles to adipocytes achieves potent anti-obesity effects. Adv Funct Mater. 31 (20), 2011130(2021).
- Hu, Y., et al. The construction of enzymolyzed α-lactalbumin-based micellar nanoassemblies for encapsulating various kinds of hydrophobic bioactive compounds. Food Funct. 10 (12), 8263-8272 (2019).
- Wang, Q., et al. The stability and bioavailability of curcumin-loaded α-lactalbumin nanocarriers formulated in functional dairy drink. Food Hydrocoll. 131, 107807(2022).
- Luo, T., et al. Adipose tissue-targeted drug delivery for treating obesity: Current opportunities and challenges. Drug Deliv. 32 (1), 2547751(2025).
- Patel, D., Patel, N., Parmar, M., Kaur, N. Transdermal drug delivery system: An overview. Int J Toxicol Pharmacol Res. 1, 61-80 (2011).
- Singh, P., et al. Single-administration self-boosting microneedle patch for the treatment of obesity. Adv Ther. 7 (9), 2400028(2024).
- Than, A., et al. Transdermal delivery of anti-obesity compounds to subcutaneous adipose tissue with polymeric microneedle patches. Small Methods. 1 (11), 1700269(2017).
- Nguyen, H. X., Nguyen, C. N. Microneedle-mediated transdermal delivery of biopharmaceuticals. Pharmaceutics. 15 (1), 277(2023).
- Chu, L. Y., Choi, S. O., Prausnitz, M. R. Fabrication of dissolving polymer microneedles for controlled drug encapsulation and delivery: Bubble and pedestal microneedle designs. J Pharm Sci. 99 (10), 4228-4238 (2010).
- Richmond, W., Wogan, M., Isbell, J., Gordon, W. P. Interstrain differences of in vitro metabolic stability and impact on early drug discovery. J Pharm Sci. 99 (11), 4463-4468 (2010).
- Amini-Nik, S., Yousuf, Y., Jeschke, M. G. Scar management in burn injuries using drug delivery and molecular signaling: Current treatments and future directions. Adv Drug Deliv Rev. 123, 135-154 (2018).
- Prausnitz, M. R., Langer, R. Transdermal drug delivery. Nat Biotechnol. 26 (11), 1261-1268 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
