Методическая статья

Антипролиферативный анализ бляшек для скрининга in vitro биоактивных молекул против Toxoplasma gondii Tachyzoites

DOI:

10.3791/69725

⸱

23 января 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de Quimioterapia de Protozoários Egler Chiari, Departamento de Parasitologia - ICB, Universidade Federal de Minas Gerais

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этой работы — описать простой метод анализа бляшек для помощи в скрининге новых биоактивных молекул против тахизоитой стадии простейшего Toxoplasma gondii.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Токсоплазмоз — это паразитарная инфекция, часто связанная с глазными поражениями и неонатальными мальформациями. С начала 1950-х годов первостепенное лечение этого заболевания основывалось на сочетании сульфадиазина, пириметамина и фолиновой кислоты. За эти годы было введено лишь несколько альтернативных режимов. Это подчёркивает необходимость открытия новых биоактивных молекул против Toxoplasma gondii. Поскольку этот патоген является обязательным внутриклетковым паразитом, традиционный лабораторный скрининг препаратов обычно требует дорогих материалов и оборудования, например, анализов с использованием флуоресцентных белков или паразитов, экспрессирующих β-галактозидазу. Кроме того, такие методы, как количественная оценка оптической микроскопии, могут занимать много времени. Анализ бляшек — это метод, который оценивает интенсивность внутриклеточной пролиферации патогена путём измерения количества областей и площади разрушения в клеточном монослое, повреждённом литическим циклом паразита. В данной работе описывается оптимизированный протокол анализа бляшек, разработанный для скрининга активных молекул внутриклеточных тахизоитов T. gondii in vitro. Этот протокол использует недорогие материалы и простую лабораторную установку, что даёт быстрые и воспроизводимые результаты, облегчающие идентификацию новых активных молекул против этого паразита различными исследовательскими группами.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Токсоплазмоз — это зоонозное заболевание с гетерогенным распространением по всему миру, поражающее примерно треть мировойпопуляции 1,2. Симптомы этого заболевания связаны с уровнем иммунитета хозяина и репликациейпаразита 3,4. Острая фаза заболевания, характеризующаяся репликацией стадии тахизоита, обычно бессимптомна у иммунокомпетентныхлиц 5,6. В отличие от этого, у людей с ослабленным иммунитетом симптомы наблюдаются более часто, включая неспецифические симптомы, такие как общее недомогание, лихорадка, а также энцефалит и ретинохороидит 6,7,8. Несмотря на клиническую значимость, существующее лечение неэффективно против стадии брадизоита Toxoplasma gondii bradyzoite (в хронической фазе) и не приводит к паразитологическому лечению. Побочные эффекты на действующие препараты также снижают соблюдениелечения 9,10,11. Поэтому необходимо найти новые, более безопасные и эффективные методы лечения токсоплазмоза.

Разработка новых лекарств требует длительного времени, миллиардов долларов инвестиций и нескольких этапов исследований. Поскольку стоимость разработки лекарств высока, фармацевтической отрасли необходимо заранее выбрать лучшего кандидата на препарат— 12,13,14,15. Для скрининга на наркотики могут применяться различные подходы, включая in silico методы, использование искусственного интеллекта и наиболее распространённый подход — биологическиеметоды 16,17,18,19. Биологический скрининг in vitro включает использование библиотек молекул (хемобиблиотек) для обеспечения доступности молекул для идентификации биологическойактивности 20,21,22. Поскольку эти хемобиблиотеки содержат разнообразие молекул, необходимо оптимизировать ресурсы и время. Поэтому анализ бляшек может служить методом быстрого скрининга новых биоактивных молекул на различные патогены, такие как T. gondii.

Анализ бляшек — это метод in vitro , который использует литический цикл внутриклеточных патогенов для количественного определения концентрации патогенов в клеточном монослое, что приводит к образованию некротических бляшек современем 23. Первое исследование с использованием метода анализа бляшек датируется началом второй половины XX века, когда команда Ренато Дульбекко использовала монослои куриных фибробластов, инфицированных вирусом западного конского энцефаломиелита, чтобы продемонстрировать пропорциональность между числом образованных некротических бляшек и концентрациейвируса 16. Использование этой техники у T. gondii также хорошо описано, как ранее объяснили Уферман и егосоавторы 23.

Одно из первых исследований, в котором использовался анализ бляшек для наблюдения реакции на ингибирование T. gondii против различных концентраций молекул, было проведено Робертсом и др. в 1976 году,17. Хотя анализ бляшек широко используется для титрированиявирусов 16,24, этот метод применялся лишь некоторыми исследовательскими группами для оценки анти-T. gondii активности молекул 21,22,25,26,27. В поисках теста, который позволил бы тестировать библиотеки соединений с высокой пропускной способностью, с использованием недорогих материалов и простой лабораторной установки, был рассмотрен анализ на бляшки как альтернатива рутинному лабораторному скринингу на наркотики. Это привело к созданию оптимизированного протокола, который позволяет одновременно оценивать активность различных молекул с помощью простых материалов и системы получения изображений, обеспечивая быстрые и воспроизводимые результаты. Поэтому мы описываем здесь подробный протокол, валидированный в нашей лаборатории, чтобы помочь другим группам в скрининге новых биоактивных молекул против тахизоитов T. gondii.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Манипуляция паразитическими и клеточными культурами, а также утилизация и назначение отходов выполнялись в соответствии с бразильским законодательством, как требует Национальное агентство санитарного надзора (ANVISA) RDC No 222/2018. Все процедуры контролировались Внутренним комитетом по биобезопасности (CIBio) из ICB-UFMG. В данном исследовании не используются животные, люди или генетически модифицированные организмы. Гранты от CNPq, CAPES и FAPEMIG поддержали эту работу. ESMD (CNPq 308082/2023-0) и RWAV (CNPq 305574/2021-3) являются стипендиатами по продуктивности CNPq. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка дополненной среды RPMI-1640

ПРИМЕЧАНИЕ: среда RPMI-1640 изначально была разработана для культивирования клеток лейкемии человека как в суспензированном, так и в монослойном виде. Однако последующие исследования показали его пригодность для различных культиваций клеток млекопитающих.

  1. В бутылку с 250 мл RPMI-1640 добавьте 2,5 мл 200 мл L-глутамин (100x).
  2. Добавьте в среду 2,5 мл антибиотика-антимикотика (100 раз).
  3. Далее добавьте в бутылку 5,0 мл или 25 мл сыворотки плода (FBS) с RPMI-1640 (2% или 10% FBS).
  4. Храните в холодильнике (2-8 °C).

2. Подготовка PBS (1 раз)

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подготовить 1 л фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) при pH 7,2 и 25 °C, следуйте следующим шагам.

  1. Отдельно измеряйте следующие количества соли: 1,4 г Na2HPO 4, 0,24 г KH2PO4 и 8,5 г NaCl.
  2. Добавьте взвешенные соли отдельно в стакан на 1 л с 800 мл деионизированной воды. Перемешайте раствор, пока все соли полностью не растворятся.
  3. Измерьте pH раствора с помощью pH-метра. Это должно быть 7.2. При необходимости используйте 6 млн соляной кислоты или 3 млн гидроксида натрия, чтобы снизить pH до 7,2.
  4. С помощью стеклянного стержня количественно перенесите вышеуказанный раствор в объёмную колбу объёмом 1 л.
  5. Добавьте деионизированную воду в объёмную колбу, пока общий объём не достигнет 1 L, убедившись, что мениск находится на правильной метке.
  6. Смешайте раствор в объёмной колбе, аккуратно перевернув его.
  7. Разделите итоговый раствор PBS на меньшие стеклянные бутылки (100-250 мл).
  8. Автоклавировать бутылки при 121 °C, 1,1 кг/см 2 в течение 15 минут.
  9. Храните раствор PBS в холодильнике (2-8 °C).
    ПРИМЕЧАНИЕ 1: Используйте PBS при 37 °C для всех экспериментов.

3. Приготовление раствора формальдегида 4%

  1. Смешайте 35,68 мл 1x PBS и 4,32 мл 37% P.A. формальдегида.
  2. Храните раствор в пластиковой колбе при комнатной температуре (25 °C).

4. Подготовка стандартного раствора активных молекул

ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте растворимость молекул в DMSO, DMF, этаноле или воде и выберите наиболее подходящий растворитель. Чтобы минимизировать потенциальные разбавляющие токсичные эффекты на паразитов, стандартный раствор должен быть как минимум в 1000 раз концентрирован по концентрации самой высокой концентрации тестируемого соединения. Например, если максимальная концентрация для тестирования составляет 1 мкм, то стандартный раствор должен быть не менее 1 мМ. Для подготовки раствора на 10 мМ следуйте следующим шагам:

  1. Взвесьте соединение для тестирования с помощью аналитических весов с точностью 0,0001 г.
  2. Определите объём разбавителя, необходимого для получения раствора 10 мМ, используя следующую формулу:
    V (mL) = (Y MM) x 100
    Где:
    Y: масса соединения в миллиграммах (мг)
    MM: молярная масса соединения
    V (мл): объём растворителя
  3. Добавьте разбавитель к реципиенту, содержащему взвешенное соединение.
  4. Гомогенизуйте с помощью вихревого миксера.
  5. Разделите раствор на небольшие аликвоты и храните их в морозильнике при -20 °C.
  6. Перед использованием дайте раствору аликвота полностью разморозиться и снова гомогенизироваться с помощью вихревого миксера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления субзапасных растворов с другими концентрациями используйте следующую формулу
    V (μL) = x mM × y μL/10 mM
    V (μL) ∶ объём стандартного раствора, необходимого для подготовки нового раствора
    x мМ: желаемая концентрация нового раствора.
    y (μL): желаемый объём нового раствора.

5. Клеточная культура

  1. Используйте ячейки NHDF, аккуратно покрутив флакон в водяной бане при температуре 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки NHDF могут быть заменены фибробластами крайней плоти человека (HFF) или другими клетовыми линиями, образующими стабильный монослой. Анализ бляшек работает только с клеточными линиями, которые образуют стабильный монослой, то есть с клетками, рост которых останавливается при контакте. Клеточные линии, не демонстрирующие ингибирования пролиферации, такие как опухолевые линии, не могут использоваться, поскольку клетки конкурируют с паразитами за питательные вещества в культурной среде и восполняют область бляшек, образованную паразитами.
  2. Немедленно перенесите размораживаемые клетки в коническую трубку объёмом 15 мл с дополненной средой RPMI-1640 с 10 мл (см. шаг 1).
  3. Центрифугуйте ячейки при температуре 200 г в течение 5 минут при комнатной температуре. Когда цикл вращения завершается, на дне трубки должна быть видна клеточная гранула.
  4. Аккуратно сбросьте супернатант, чтобы сохранить клеточную гранулу.
  5. Суспензируйте клеточную гранулу с помощью 12 мл дополнительной среды RPMI-1640, содержащей 10% FBS, и посев три колбы по 25см 2 культуры или одну колбу 75см 2 дюйма. Через 2–3 дня осмотрите колбу с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа, чтобы определить восстановление клеточной пролиферации (клетки должны показать слияние не менее 40%-50%).
  6. Когда клетки достигают полного монослоя (100% слияния), удалите среду из колбы с помощью пипетки Пастера. Отбросьте медиум и пипетку.
  7. Добавьте 1-2 мл PBS 1 раз в колбу, подождите 1 минуту и удалите PBS.
  8. Добавьте в колбу 1 мл раствора трипсина-версена 0,05% и поставьте в инкубатор с 5%CO2, влажностью и температурой 37 °C на 2 минуты.
  9. Через 2 минуты осмотрите клетки с помощью инвертированного микроскопа, чтобы убедиться, что клетки отделились.
  10. Отсоединяемые ячейки повторно суспензируют с помощью 24 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% FBS с помощью серологической пипетки объемом 10 мл и автоматического диспенсера пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая фляга на культуре площадью 25 или 75 см² с конфлюентным монослоем способна размножаться в 5 или 15 других бутылках по 25 см² соответственно.
  11. После добавления необходимого объёма среды (24 мл) гомогенизируйте суспензию клетки серологической пипеткой.
  12. Перенесите 4 мл клеточной суспензии в среднем в каждую колбу размером 25см 2 или 12 мл —75 см 2 колбы. Не забудьте оставить 4 мл суспензии клеток в начальной колбе.
  13. Поместите колбы в инкубатор с 5%CO2, влажностью и температурой 37 °C.
  14. Дождитесь, пока не получится полный монослой клеток (100% от слияния).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идентифицируйте каждую флягу по дате и номеру отрыва.

6. Подготовка посевной тарелки

  1. Проверьте целостность клеточного монослоя (100% слияние) в колбе с помощью инвертированного микроскопа.
  2. Следуйте процедуре трипсинизации, описанной выше (шаги 5.7–5.9).
  3. Используя серологическую пипетку объемом 5 мл, повторно суспензируйте отсоединённые клетки с помощью среды RPMI 4 мл и перенесите их в коническую трубку объёмом 15 мл.
  4. Центрифуга при 200 г в течение 5 минут при комнатной температуре в течение 5 минут.
  5. Аккуратно отбросьте супернатант.
  6. Повторно суспензируйте клеточную гранулу с помощью 1 мл свежей среды RPMI-1640.
  7. Гомогенизуйте с помощью вихревого миксера.
  8. Пересадите 10 мкл в трубку объёмом 1,5 мл с 490 мкл раствора формальдегида 4% (разбавление 1:50) с помощью микропипетки со стерильным наконечником.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент разбавления = (Общий объём (μL)) / (Объём образцы (μL))
  9. Подготовьте камеру Нойбауэра.
  10. Гомогенизуйте фиксационный раствор с паразитами (подготовленным в пункте 6.8) с помощью вихревого миксера.
  11. Добавьте 10 мкл раствора с фиксированными паразитами в камеру Нойбауэра.
  12. Посчитайте четыре квадранта камеры Нойбауэра, каждый из которых состоит из 16 клеток.
  13. Определите количество ячеек на мл:
    Количество ячеек (на мл) = [(n° ячеек на квадрат)/4] x Fd x 104
    Где:
    Fd (коэффициент разбавления) = 50
  14. Засеять каждую колодцу из 12- или 6-колодцевой культивной пластины, с 5 × 104 или 1 x10 5 клеток соответственно, ресуспендированными в 1 или 2 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% FBS.
  15. Поставьте пластины в инкубатор с 5%CO2, влажной атмосферой и температурой 37 °C.
  16. Ждите, пока монослой клетки достигнет 100% слияния.

7. Культивирование тахизоита в экстракорпоральном виде

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа бляшек мы рекомендуем RH-штамм T. gondii.

  1. Сбросьте старую среду из колбы размером 25см 2 , содержащей полный монослой (100% слияние) клеток NHDF, с помощью пипетки Пастера. Далее добавьте 4 мл свежего RPMI-1640 полного медиума в колбу.
  2. Перенесите 5 мкл супернатанта, содержащего свежие отходящие тахизоиты из предыдущей колбы, с лизированной инфицированной культурой. Объём 5 мкл обеспечивает литический цикл в 6–7 дней на колбу площадью 25 см².
  3. Поместите новую заражённую колбу в инкубатор с 5%CO2, влажной атмосферой и температурой 37 °C.

8. Количественная оценка тахизоитов

  1. Удалите субстанцию из колбы с недавно вышедшими паразитами с помощью пипетки Пастера и перемените в коническую трубку объёмом 15 мл.
  2. Центрифугуйте трубку при 760 х г при комнатной температуре на 2 минуты. Когда цикл отжимания заканчивается, на дне трубки видна видимая гранула.
  3. Аккуратно отбросьте супернатант.
  4. Восстановите суспендированную гранулу паразита с помощью 1 мл свежей среды RPMI-1640 с 2% FBS.
  5. Гомогенизуйте паразитную суспензию с помощью вихревой миксер.
  6. Перенесите 10 мкл паразитной суспензии в трубку объемом 1,5 мл с 490 мкл раствора формальдегида 4% (разбавление 1:50) с помощью пипетки со стерильным кончиком.
  7. Следуйте шагам, описанным в 6.10–6.12.
  8. Определите количество тахизоитов на 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество тахизоитов (на мл) = [(n° тахизоитов квадрата)/4] x Fd x 104
    Где:
    Fd (коэффициент разбавления) = 50

9. Подготовка к тесту бляшек для активных молекул S-кренинга из химиобиблиотеки

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный анализ направлен на выявление молекул, снижающих пролиферацию T. gondii более чем на 50% при концентрации 1 мкм. Перед началом этого анализа необходимо провести анализ на цитотоксичность (например, метод MTS или метод MTT), чтобы убедиться, что концентрации соединений, используемые в тесте бляшек, не токсичны для клеток хозяина.

  1. Подтвердите, что клеточные культуры достигли 100% слияния в пластинах с 12 или 6 лунками.
  2. Отбросьте старую среду и добавьте 1 или 2 мл свежего дополнительного RPMI-1640 среднего вещества с 2% FBS в каждую скважину в пластинах с 12 и 6 лунками соответственно.
  3. Добавляйте соединения для тестирования в каждую скважину с нужной концентрацией. Для начального скрининга рекомендуется концентрация 1 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующую формулу для расчёта объёма, который нужно добавить в каждую скважину.
    V (μL) = (Конечная концентрация в скважине (μM) x Объём внутри скважины (μL)/(Стоковый раствор (μM))
  4. Добавьте 600 тахизоитов (для пластины с 12 лунками) или 1000 тахизоитов (для пластины с 6 лунками) деформации RH в каждую пластину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вариации в пролиферации паразитов могут возникать из-за различий между поставщиками культурной среды или FBS, либо из-за используемых клеточных линий. Поэтому рекомендуется провести пилотный эксперимент для определения оптимального количества паразитов для каждого лабораторного состояния. При необходимости скорректируйте количество используемого паразита для эксперимента.
  5. Поставьте пластины в анкубатор при 37 °C с 5%CO2 и влажной атмосферой на 7 дней без каких-либо помех.
    ВНИМАНИЕ: Пластины нельзя перемещать или трогать в течение 7-дневного инкубационного периода. Если это произойдёт, эксперимент будет испорчен.

10. Окрашивание пластин кристаллическим фиолетовым и получение изображений

  1. Через 7 дней удалите среду из каждой колодцы.
  2. Тщательно промой каждую колодцу с помощью 1x PBS при комнатной температуре.
  3. Сбросьте PBS и аккуратно добавьте 1 мл 70% спирта в каждую колодцу. Оставьте при комнатной температуре на 15 минут, затем выбросите.
  4. Добавьте водный раствор 0,5% кристаллической фиолетовой и дайте постоять 30 минут при комнатной температуре.
  5. Удалите раствор кристаллического фиолетового цвета.
  6. Тщательно промыйте каждую колодцу один раз деионизированной водой.
    ВНИМАНИЕ: При снятии среды или PBS во время промывки не касайтесь низа колодца кончиком пипетки, так как это может повредить целостность монослоя. Во время промывки не бросай струю PBS или спирта прямо на клетки. Добавьте их тщательно вдоль границы колодца.
  7. Положите тарелку лицом вниз на впитывающую бумагу, чтобы слить лишнюю воду, и дайте ей высохнуть при комнатной температуре 24 часа.
  8. Фотографируйте пластины с помощью высокочётного плоскогосканера 28,29 или системы документации для изображения, настроенной для вариантов Coomassie bluegel 21,22,30.

11. Анализ обратимости

ПРИМЕЧАНИЕ: Основная цель обратимого теста с T. gondii tachyzoites — определить, полностью ли устраняется или снижается ли способность к пролиферации обработанных паразитов после удаления соединений из культурнойсреды 31.

  1. Засейте пластину с 6 колодцями NHDFcells, как описано на шаге 6. Для каждой скважины добавьте 1 x 105 элементов, ресуспендированных в 2 мл дополнительного RPMI-1640 с 10% FBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда клеточный монослой достигает 100% слияния в каждой яме, пластина готова к анализу бляшек.
  2. Сбросьте среду и добавьте 1 x 104 тахизоита суспензированного в свежем среде 2 мл с 2% FBS в каждую яму.
  3. После того как тахизоиты взаимодействуют с клетками NHDF в течение 1 часа, добавьте выбранные соединения в итоговую концентрацию, близкую к 90% ингибирующей концентрации (IC90). В качестве положительного контроля используется колодец, содержащая только разбавитель препарата.
  4. Обрабатывайте тахизоиты в течение 4 дней в инкубаторе при 37 °C с 5%CO2 и влажной атмосферой.
  5. После четырёхдневного периода обработки промыйте пластину три раза с 1x PBS при 37 °C, чтобы полностью удалять соединения.
  6. Добавьте в каждую колодцу по 2 мл свежей среды без соединений и храните тарелку в инкубаторе ещё 7 дней.
  7. Покрасьте пластину кристаллическим фиолетовым красителем и сфотографируйте её, как описано в шаге 10.

12. Анализ изображений с помощью программного обеспечения ImageJ

  1. Откройте изображения с помощью программного обеспеченияImageJ 32.
  2. Выберите область, соответствующую одной яме, с помощью инструмента овального выбора (рисунок 1A,B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе не обращайте внимания на участки на границе скважин, где есть дефекты. Они обычно присутствуют по краям скважины.
  3. Скопируйте и создайте новое изображение: скопируйте выбранную область, нажав Ctrl + C; создать новый файл изображения, нажав Ctrl + N; вставьте скопированное изображение в новое чёрное окно с помощью Ctrl + V.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При создании нового изображения используйте настройки по умолчанию: 8-битный, заполнение чёрным, 512 x 512 пикселей и один срез (рисунок 1C).
  4. Перейти к: Image > Adjust > Threshold или нажмите Ctrl + Shift + T (рисунок 1D).
  5. В окне Threshold выберите опции Хуан и Красный , затем нажмите Авто (рисунок 1E).
  6. Нажмите «Анализировать», затем выберите «Анализировать частицы » (рисунок 1F). Оставьте настройки по умолчанию в окне, которое появляется, и нажмите OK (рисунок 1G).
  7. Откроется новое окно. Скопируйте значение, отображаемое в %Area (выделенное красным прямоугольником на рисунке 1H), чтобы вычислить процент пролиферации или ингибирования паразитов.
  8. Повторяйте эти шаги для каждой ямы на тарелке.
  9. Для расчёта процента распространения используйте следующую формулу:
    % пролиферации = (% Хорошо обработанная площадь/% Контроль зоны) × 100
  10. Для расчёта процента ингибирования используйте следующую формулу:
    % ингибирования = [1- (%Хорошо обработанная площадь/%Зона контроля)] × 100

Рисунок 1
Рисунок 1: Пошаговый анализ результатов в программном обеспечении ImageJ. (A) Выбор инструмента «Oval». (B) Выбор области интереса на изображении. (C) Новое окно изображения (Ctrl + N) с рекомендуемыми настройками. (D) Шаги для «Анализа порога после вставки интересующей области в новое окно изображения. (E) Выбор вариантов Хуана и красного в окне Threshold, в результате чего все белые области заполняются красным. (F) Последовательность шагов, используемых для «Анализа частиц». (G) Настройка, используемая для анализа частиц. (H) Результат процента от общей уничтоженной площади отображается в окне сводки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

13. Статистический анализ

  1. Организуйте данные в таблице Excel внутри программного обеспечения Office после расчёта процента ингибирования распространения.
  2. Откройте программное обеспечение GraphPad Prism 5.0 и нажмите на XY (Ниже новой таблицы и графика).
  3. В разделе Y (ниже «X:error bar») введите количество повторений данных (обычно три биологических репликатов). Это число может варьироваться в зависимости от количества выполненных повторений.
  4. Выберите Среднее только рядом с графиком и НЕ выбирайте «Ввести и построить значения ошибки, уже рассчитанные в другом месте», затем нажмите Создать.
  5. Разместите данные концентрации по оси X, а данные о проценте ингибирования пролиферации — в столбцах A, A:Y1, A:Y2, A:Y3, A:Y4, A:Y5.
  6. Нажмите на = Анализировать, затем Трансформировать, а затем OK. Откроется новое окно. В этом новом окне нажмите на Transform X Values с помощью X = Log(X), затем выберите Создать новый график результатов и затем OK.
  7. Нажмите = Анализировать , а затем Нормализировать. Откроется новое окно. В разделе «Как определяется 0%?» нажмите и установите Y = 0.0. В разделе «Как определяется 100%?» нажмите и установите Y = 100; выберите «Проценты » и нажмите «Создать новый график результатов».
  8. Нажмите на символ: Подобрать кривую с нелинейной регрессией, расположенной выше = Анализировать. Нажмите на Доза-ответ - Торможение, затем на лог (ингибитор) против нормализованного ответа - Переменный уклон, и затем нажмите OK.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Откроется окно со следующими результатами: IC50 (ингибиторная концентрация 50%), доверительный интервал 95% и значение R2. Эти значения крайне важны и должны быть включены в таблицу результатов внутри статьи.
  9. Для оценки других ингибирующих концентраций, таких как IC25, IC90 или IC95, используйте ссылку (https://www.graphpad.com/quickcalcs/Ecanything1.cfm) Quick Calcs - GraphPad; EC: эффективная концентрация. Сообщите о IC50 и HillSlope, полученных программным обеспечением Prism, для каждого тестируемого препарата.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для оценки анализа бляшек после лечения критически важны как положительные (клетки, инфицированные тахизоитами и не лечившиеся), так и отрицательные (неинфицированные клетки с 0,1% ДМСО). В конце эксперимента положительная контрольная яма должна иметь чётко определённые пустые пространства с остатками приклеенных клеток (рисунок 2). В отличие от этого, отрицательная управляющая яма должна отображать целый монослой без пустых пробелов. Отрицательный контроль критически важен для подтверждения...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стандартизация новых протоколов для антипролиферативных тестов является фундаментальным шагом для продвижения научных исследований по идентификации будущих лекарств. Представленный здесь протокол предлагает альтернативный подход к in vitro оценки активности биоактивных молекул против тахизоитов T. gondii. Поскольку T.gondii — это обязательный внутриклеточный паразит, который локомотирует за скользящей подвижностью, когда паразиты выходят из лизированной клетки,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы также выражают благодарность за финансирование от Национального совета добровольных исследований и пескисы (CNPq), Фонда Ампаро в Пескисе де Минас-Жерайс (FAPEMIG) и CAPES/PROEX. Авторы выражают благодарность Pró-Reitoria de Pesquisa Федерального университета Минас-Жерайс за поддержку этого исследования. ESMD (CNPq 308082/2023-0) и RWAV (CNPq 305574/2021-3) являются стипендиатами по продуктивности CNPq.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05 % трипсин-ЭДТАЖизненные технологии25300-062
Серологическая пипетка объёмом 10 млОленK17-110
Центрифуга с трубкой Falcon объёмом 15 млФанемМодель: 206
Серологическая пипетка объёмом 5 млОленK17-115
6-колодцевая культивационная плитаСарштедт833920
Аналитический балансМеттлер Толедо Модель: AB204 Серийный номер: 1116473813
Антибиотик-антимикотик (100X)Жизненные технологии15240-062
Автоматическая пипеткаКасвиK1-AID
ЦентрифугаЭппендорфМодель 5415 R Серийный номер: 0023591
CO2 ИнкубаторКорпорация PHCНомер модели: MCO-230AICUVL-PA Серийный номер: 210360090
Бутылка для культуры 25 см²Сарштедт833910
Диметилсульфоксид (DMSO) П.А.Merck 1,02,95,21,000
Ethanol P.AMerck1,00,98,31,000
Сыворотка для плода быка (FBS)Жизненные технологии12657-029
Формальдегид 37-38%Panreac131328
GraphPad Prism Программное обеспечение GraphPad-Версия 8.0.1
ImageJ  программное обеспечение  --Версия 1.52e
Системы документации изображенийБио-РадМодель:  Серийный номер системы визуализации ChemiDoc MP: 734BR2249
Ламинарная вытяжкаVeco do BrasilМодель: VLFS-09
L-глутамин 200 мМ (100X)Жизненные технологии25030-081
Микротрубка объёмом 0,5 млСарштедт72,699
Неонатальный нормальный дермальный фибробласт человека (NHDF)ЛонзаCC-3132Щедро предоставлена доктором Шейлой Нарделли из Фиокрус Паран, Бразилия
Камера Нойбауэра 0,100 мм 0,0025 мм²New Optics7301-1
pHmeterMicronalМодель: B374 Серийный номер: 30/37
Pipette 20-200 & micro; LKasvi basic22032893
Пипетта 2-20 и микро; LLabmate Pro656630226
Pipette  0.2-2 и микро; LLabmate Pro556610114
Pipette  1000-5 000 и микро; LUniscienceYM4A021482
Pipette  100-1000 и микро; LEppendorf Research plusQ34354C
Калийфосфат монобазовый  (KH2PO4) P.A Синтезатор01F2002.01.AF
Средний RPMI-1640Sigma-Aldrich R0883
Хлорид натрия (NaCl) P.A. Cromoline Quí слюда Фина  -
Дибазовый натрий фосфат (Na2HPO4) П.А.CRQ Produtos Quimicos EireliR2715920500
Совет 1.000 и микро; LСарштедт7,01,186
Совет 10 и микро: LСарштедт7,03,010
Совет 5.000 и микро; LСарштедт70,11,83,001
Tip  200 и микро; LСарштедт7,03,030
Передающая пипетка  (3,5 мл) Сарштедт86,11,71,001
Трубка объёмом 15 млСарштедт6,25,54,502
Фиолетовый кристаллMerck101408
Вихревой миксерФениксМодель: AP56 Серийный номер: 6633
Водяная баняHemoquimica do BrasilМодель: HM1003 Серийный номер: 700001556

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molan, A., Nosaka, K., Hunter, M., Wang, W. Global status of Toxoplasma gondii infection: systematic review and prevalence snapshots. Trop Biomed. 36 (4), 898-925 (2019).
  2. Bigna, J. J., et al. Global, regional, and country seroprevalence of Toxoplasma gondii in pregnant women: A systematic review, modelling and meta-analysis. Sci Rep. 10 (1), 12102(2020).
  3. Dian, S., Ganiem, A. R., Ekawardhani, S. Cerebral toxoplasmosis in HIV-infected patients: A review. Pathog Glob Health. 117 (1), 14-23 (2023).
  4. Wang, Z. -D., et al. Toxoplasma gondii Infection in Immunocompromised Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. Front Microbiol. 8, 389(2017).
  5. Layton, J., et al. Clinical spectrum, radiological findings, and outcomes of severe toxoplasmosis in immunocompetent hosts: A systematic review. Pathogens. 12 (4), 543(2023).
  6. Weiss, L. M., Dubey,, Jitender, P. Toxoplasmosis: A history of clinical observations. Int J Parasitology. 39 (8), 895-901 (2009).
  7. Fabiani, S., et al. Ocular toxoplasmosis, an overview focusing on clinical aspects. Acta Trop. 225, 106180(2022).
  8. Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: Clinical features, pathology and management. Clin Exp Ophthalmol. 41 (1), 95-108 (2013).
  9. Dunay, I. R., Gajurel, K., Dhakal, R., Liesenfeld, O., Montoya, J. G. Treatment of Toxoplasmosis: Historical perspective, animal models, and current clinical practice. Clin Microbiol Rev. 31 (4), e00057-e00117 (2018).
  10. Wei, H. -X., Wei, S. -S., Lindsay, D. S., Peng, H. -J. A systematic review and meta-analysis of the efficacy of anti-Toxoplasma gondii medicines in humans. PloS One. 10 (9), e0138204(2015).
  11. Shammaa, A. M., Powell, T. G., Benmerzouga, I. Adverse outcomes associated with the treatment of Toxoplasma infections. Sci Rep. 11 (1), 1035(2021).
  12. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nat Biotechnol. 32 (1), 40-51 (2014).
  13. Paul, S. M., et al. How to improve R&D productivity: The pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 9 (3), 203-214 (2010).
  14. Andrade, E. L., et al. Non-clinical studies required for new drug development - Part I: Early in silico and in vitro studies, new target discovery and validation, proof of principles and robustness of animal studies. Braz J Med Biol Res. 49 (11), e5644(2016).
  15. Brodniewicz, T., Grynkiewicz, G. Preclinical drug development. Acta Poloniae Pharmaceutica. 67 (6), 578-585 (2010).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Roberts, C. O., Chaparas, S. D., McLaughlin, D. The use of the plaque assay in chemotherapeutic and dermal hypersensitivity studies on Toxoplasma gondii. Trans Am Microsc Soc. 95 (3), 470(1976).
  18. Mo, J., et al. Effect of the Pseudomonas metabolites HQNO on the Toxoplasma gondii RH strain in vitro and in vivo. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 21, 74-80 (2023).
  19. Barbosa, B. F., et al. Enrofloxacin is able to control Toxoplasma gondii infection in both in vitro and in vivo experimental models. Vet Parasitol. 187 (1-2), 44-52 (2012).
  20. Wall, G., Lopez-Ribot, J. L. Screening repurposing libraries for identification of drugs with novel antifungal activity. Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), e00924-e01020 (2020).
  21. dos Santos, M., et al. Medicines for malaria venture pandemic box in vitro screening identifies compounds highly active against the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Trop Med Infect Dis. 8 (12), (2023).
  22. Costa, A. L. O., et al. Antiproliferative and morphological analysis triggered by drugs contained in the medicines for malaria venture COVID-box against Toxoplasma gondii tachyzoites. Microorganisms. 12 (12), 2602(2024).
  23. Ufermann, C. -M., Müller, F., Frohnecke, N., Laue, M., Seeber, F. Toxoplasma gondii plaque assays revisited: Improvements for ultrastructural and quantitative evaluation of lytic parasite growth. Exp Parasitol. 180, 19-26 (2017).
  24. Condit, R. C. Principles of virology. Fields Virology. I, 25-57 (2007).
  25. Montazeri, M., et al. In vitro and in vivo evaluation of kojic acid against Toxoplasma gondii in experimental models of acute toxoplasmosis. Exp Parasitol. 200, 7-12 (2019).
  26. Ke, O. Y., Krug, E. C., Marr, J. J., Berens, R. L. Inhibition of growth of Toxoplasma gondii by qinghaosu and derivatives. Antimicrob Agents Chemother. 34 (10), 1961-1965 (1990).
  27. Liu, X., et al. Anti-Toxoplasma gondii effects of lipopeptide derivatives of Lycosin-I. Toxins. 15 (8), 477(2023).
  28. Emi, A., et al. Development of an automated plaque-counting program for the quantification of the Chikungunya virus. Sci Rep. 15 (1), 12429(2025).
  29. Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179 (1), 81-89 (2012).
  30. Pereira Filho, A. A., et al. In vitro activity of essential oils from piper species (Piperaceae) against tachyzoites of Toxoplasma gondii. Metabolites. 13 (1), 95(2023).
  31. Martins-Duarte, E. S., et al. In vitro activity of N-phenyl-1,10-phenanthroline-2-amines against tachyzoites and bradyzoites of Toxoplasma gondii. Bioorg Medl Chem. 50, 116467(2021).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Subramanian, G., et al. Targeted phenotypic screening in Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii reveals novel modes of action of medicines for malaria venture malaria box molecules. mSphere. 3 (1), e00534(2018).
  34. Dans, M. G., et al. Screening the medicines for malaria venture pathogen box for invasion and egress inhibitors of the blood stage of Plasmodium falciparum reveals several inhibitory compounds. Int J Parasitol. 50 (3), 235-252 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitro

Похожие статьи