Методическая статья

Методы количественной оценки морфологии митохондрий in situ в мышечных и терминальных клетках Шванна мышей

DOI:

10.3791/69732

⸱

10 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Kinesiology and Sport Management, College of Education and Human Development, Texas A&M University, College Station, 2National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Локальные инъекции митохондрий с меткой митохондриальной метки митохондриальной клетки Шванна in vivo для конфокальной микроскопии. Этот метод использует доказательство концепции, продемонстрированное в скелетной мышечной ткани мышей с здоровыми или больными мышцами, для обеспечения визуализации митохондрий высокого разрешения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Морфология митохондриальной сети широко используется как индикатор здоровья клеток; Однако количественное определение архитектуры митохондрий внутри целостных тканей остаётся технически сложным. Терминальные клетки Шванна (tSC), необходимые для поддержания и регенерации нервно-мышечных соединений, особенно трудно анализировать на месте из-за их анатомического расположения и чувствительности к разрушению тканей. Этот протокол описывает воспроизводимый подход для маркировки и количественной оценки морфологии трёхмерных митохондриальных сетей в целостных скелетных мышцах и в tSC у мышей с использованием стандартной конфокальной микроскопии. Метод использует in vivo доставку митохондриального красителя, чувствительного к мембранному потенциалу, за которым следует быстрая обработка тканей и высокоразрешающая конфокальная визуализация. Стеки изображений анализируются для количественной оценки связности, площади и фрагментации митохондриальных сетей. Протокол сначала валидируется на дистрофических и здоровых скелетных мышцах для подтверждения ожидаемых различий в морфологии митохондрий, а затем адаптирован для визуализации и количественной оценки митохондриальных сетей в tSC, выявленных с помощью репортерских мышей S100β. Этот подход позволяет анализировать морфологию митохондрий внутри целостных нервно-мышечных тканей без необходимости использования трансгенных митохондриальных репортеров или специализированных платформ визуализации. Протокол требует только оборудования, обычно доступного в основных учреждениях университета, и может быть адаптировано к другим тонким или поверхностно доступным тканям.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии — это удивительно пластичные органеллы, которые выступают в роли лёгких клетки, потребляя кислород во время клеточного дыхания для поддержки выработки аденозинтрифосфата (АТФ) в ответ на метаболическиепотребности 1. Ранее считалось отдельными органеллами, но теперь известно, что митохондрии сильно интегрированы 2,3,4, разделяя энергетическую подложку по всей сети в соответствии с местными требованиями. Интеграция даёт явное преимущество по сравнению с изоляцией: связанные митохондрии поддерживают дефицит энергии, поддерживая электрохимические градиенты для окисляющего фосфорилирования при повышенном метаболическом спросе. Действительно, распределение, объём и морфология митохондрий соответствуют энергетическим потребностям в ихокрестностях 5. В здравоохранении регулярный оборот митохондриальных сетей поддерживается за счет митохондриального биогенеза, событий слияния и деления, а также митофагии 2,3. Митохондриальный биогенез необходим для поддержания и расширения здоровых митохондрий. Метаболические потребности, такие как физические упражнения, увеличивают экспрессию рецептора, активируемого пролифератором пероксисомы, γ коактиватора 1α (PGC-1α)5. Этот процесс происходит через первичные сигналы выносливости, а именно повышение уровня протеинкиназы, активируемой АМФ, кальция и реактивных видовкислорода 6,7. Слияние расширяет сети, способствуя выживаемости и дополняя дефициты, в то время как деление смягчает дальнейшее повреждение митохондрий за счёт предпочтительного исключения дисфункциональныхобластей 2,3,8. После удаления исключённые области должны пройти митофагию, предотвращая накопление дисфункциональных органелли белков 6,9.

Скелетная мышца составляет около 40% массы тела и зависит от митохондрий для аэробного обмена и клеточной сигнализации для поддержаниягомеостаза 10. В совокупности при нарушениях функции скелетных мышц нарушены механизмы контроля качествамитохондрий 10. Исследования мышечной дисфункции обычно измеряют дыхание митохондрий, объём, морфологию и выработку реактивных видов кислорода (ROS) для оценки качества митохондрий 3,10. В этом отношении при длительной мышечной дисфункции митохондриальное дыхание снижается, при этом ROS увеличивается, а сетифрагментированы на 3,10. Нарушения морфологии митохондрий в основном возникают из-за активации белков митохондриального деления, белка, связанного с динамином, белка 1 (DRP1) и митохондриального деления 1 (FIS1)2,8,11. В ответ на атрофию мышц FIS1, находящийся на поверхности внешней митохондриальной мембраны, привлекает DRP1 для олигомеризации с несколькими димерами DRP1, создавая нить, окружающую митохондрии, уменьшаясь в размере, пока определённая часть митохондрий не будет «защемлена», способствуяфрагментации 3,11. В совокупности чрезмерная активность деления митохондрий, снижение слияния новообразованных митохондрий и дисфункциональная митофагия отвечают за фрагментированное появление дисфункциональных митохондриальных сетей, подобных тем, что описаны у неактивных или больныхмышц 2,12.

Нейромышечное соединение (NMJ) является местом мышечного возбуждения. Потенциалы действия, инициированные в соме, распространяются вдоль аксонов, покрытых миелинизирующими клетками Шванна (SC), и заканчиваются в NMJ, которые инкапсулируются терминальными клетками Шванна (tSC). NMJ могут регенерировать после травмы. Однако вероятность и скорость регенерации уменьшаются по мере увеличения расстояния между местом травмы и NMJна 13,14. После повреждения нерва вследствие пересечения, раздавливания или растяжения СК дедифференцируются в демиелинизированное состояние, подобноепрогенитору 15,16. Демиелинистые СК размножаются и работают в сотрудничестве с макрофагами, чтобы перестроить местную среду для регенерации, очищая обломки между местом повреждения и проксимальным аксонным пеньком через валлеровскуюдегенерацию 17,18. Мигрирующие СК сигнализируют о воспалительной реакции, которая перестраивает среду для успешной регенерациинервов 18. Регенерация нервов происходит внутри нейронной оболочки, образованной предоподобными SC, которые образуют полосы Бунгера, через которые аксонывосстанавливают 19. Затем аксонный пеньок вытягивает филоподии для запускареиннервации 14. После реиннервации пресинапс может полностью регенерироваться, при условии, что tSC реинвестируются на уровнеNMJ 20.

Морфология митохондрий значительно варьируется между типами клеток, соответствуя функцииткани 21. Данные из тканей печени показывают, что митохондрии более компактные и сферические, тогда как митохондрии в белом веществе мозга более удлинённые итрубчатые 22. При вызове, например, в условиях старения и окислительного стресса, митохондрии в этих тканях проявляют фенотип, напоминающий пончик. Однако в остеобластах образование и фрагментация митохондриальных пончиков были связаны с увеличением секреции митохондрий и митохондриальных пузырьков, а также с созреваниемостеобластов 23. Хотя митохондриальные сети скелетных мышц были подробно изучены у нескольких видов, ограничения в визуализации митохондриальных сетей из tSC периферической нервной системы сохраняются. Их трудно захватить в родных условиях, так как ультраструктура клетки значительно изменяется после изоляции, и эти ткани трудно воздействовать красителем in vivo без дополнительной нагрузки на сопутствующие скелетные мышцы.

Методы визуализации, используемые для зафиксирования морфологии митохондрий в живых системах, можно классифицировать как световую или электроннуюмикроскопию 5. При традиционной микроскопии с захватом света красители могут маркировать живые клетки, фиксированные клетки — иммунометировать, а митохондрии — генетически маркировать 5,24. Визуализация живых клеток обычно требует инкубации клеток в течение 20–60 минут перед флуоресцентным анализом. Красители направляются в митохондрии через мембранный потенциал и, следовательно, могут изменяться при условиях изменённого потенциаламембраны 5. Теоретически возможно захватить морфологию митохондриальных ТСК внутри скелетных мышц с помощью окрасителя; однако для этого потребуется визуализация целых тканей и детальные методы маркировки. В частности, он захватывает митохондрии внутри целостных структур без вмешательства мечения скелетных мышц. Для преодоления этих ограничений митохондриальное флуоресцентное окрашивание использовалось для маркировки живых скелетных мышц у здоровых и дистрофических мышей, после чего для in vivo и in situ митохондрий маркировки tSC. Передняя большеберцовая мышца (ТА) была выбрана для оптимизации визуализации скелетных мышц благодаря её поверхностному анатомическому положению, хорошо охарактеризованному объёму инъекции и миофасциальнойдисперсии 25,26,27, а также пригодности для одновременных функциональных измерений. Мышца большого ягодичного мышца (ГМ) была выбрана для визуализации тСК на основе установленной процедурыинъекции 28,29, её тонкой структуры, минимизирующей фоновую флуоресценцию, и поверхностного вентрального положения нервно-мышечных соединений между ГМ и средним ягодичным мышцами, что позволяет предпочтительно маркировать ТСК перед волокнами скелетных мышц.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Шестимесячный (n=3) взрослый самец DBA/2J [Дикий тип (WT)] (RRID: IMSR_JAX:000671) и D2.B10-DMDD2.mdx/J [D2.mdx (mdx)] (RRID: IMSR_JAX:013141), а от трёх до пяти месяцев (n=8) взрослый мальчик и самка B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J (S100B) (RRID: IMSR_JAX:005621) [также объединён с WT, так как не отличается от DBA] использовались из продолжающейся колонии мышей, содержавшихся исследователями. Общий экспериментальный рабочий процесс для инъекций ТА и ГМ, обработки тканей и визуализации изложен на рисунке 1. Дополнительный D2. Мышь MDX была пожертвована исследователем для TSC-визуализации в MDX (n=1). Все процедуры на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных при Техасском университете A&M (AUP 2022-0215) и проводились в соответствии с Руководством Национального исследовательского совета по уходу и использованию лабораторных животных (8-е издание)30. Эвтаназия проводилась путем вывиха шейки матки под анестетикой передозировки изофлурана.

1. Приготовление флуоресцентного митохондриального окрашивающего рабочего раствора 2 мкм

  1. Подвесить митохондриальную окрашивку (50 мкг) в 322 мкл диметилсульфоксида (DMSO) согласно инструкции производителя, чтобы получить наложный раствор с объёмом 200 мкм.
  2. Для подготовки 30 мл рабочего раствора объемом 2 мкм переливайте 300 мкл 200 мкм в стерильный физиологический раствор объемом 29,7 мл. Тщательно перемешайте.
  3. Аликвот 250 мкл рабочего раствора 2 мкм в микроцентрифугные трубки и хранить при -80 °C до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После 3 лет хранения при -80 °C не наблюдалось обнаруживаемого ухудшения сигнала.

2. Краситель и приготовление животных

  1. Один замороженный аликвот разморозить за 15 минут до начала экспериментов. Набрать раствор в инсулиновый шприц на 30 G, 1 куб. мл.
  2. Анестезируйте животное изофлураном. Нанесите офтальмологическую мазь, сбрийте место инъекции и поддерживайте температуру тела с помощью согревающей лампы с температурным датчиком, расположенным между животным и источником тепла.
  3. Очистите место инъекции 70% изопропиловым спиртом.

3. Введение и функция митохондриального красителя мышц большеберцовой передней (ТА)

  1. Введение TA красителя
    1. Ввести 50 мкл 2 мкМ митохондриального окрашивателя в правую мышцу ТА у анестезированных мышей WT и D2.mdx.
    2. Введите иглу в дистальное сухожилие ближе к колену и нажимайте на поршень, одновременно выводя иглу по пути инъекции.
    3. Инкубировать краситель in vivo в течение 1 часа перед вскрытием.
  2. Измерения функции мышц ТА
    1. После 45 минут инкубации красителя анестезируют мышь с помощью изофлурана (индукция 2%–3%, поддержание кислорода 1,5%–2%).
    2. Хирургически обнажите левую мышцу ТА, сохраняя окружающие ткани. Привяжите дистальное сухожилие к балке нагрузки системы мышечного тестирования.
    3. Обмотайте открытую мышцу лабораторной салфеткой и промите при 3 мл мин⁻1 стерильным физиологическим раствором 0,9%, подогретым до 40 °C. Поддерживайте температуру мышц на уровне 32 °C с помощью термолампы.
    4. Разместите электроды из платиновой и иридовой проволоки через мышечный живот для прямой стимуляции.
    5. Подключите нагрузочный пучок к микрометру и отрегулируйте оптимальную длину (L 0) с помощью сжатий (Tw) при 1 Гц. Запишите L0 с помощью цифрового суппорта.
    6. Вызвать максимальные столбнические сокращения (P 0) три раза при 140 Гц с 60 секундами перерыва между схватками. Запишите наибольшее значение силы (g). Собирайте данные с помощью мышечной системы с помощью программного обеспечения для анализа.
  3. Обработка тканей ТА
    1. После инкубации изолируйте и рассеките ТА перед эвтаназией.
    2. Поместите изолированные пучки мышечных волокон в 4% параформальдегид при комнатной температуре на 15 минут, аккуратно дразня волокна под стереомикроскопом.
      ВНИМАНИЕ: Параформальдегид токсичен и должен использоваться в капюшоне с химическим дымом при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и защитные средства).
    3. Добавьте клеточно-пермерационную окрашивающую нуклеиновую кислоту до конечной концентрации 5–10 мкг/мл для маркировки ядер.
    4. Промите образцы три раза в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) по 5 минут каждый, чтобы удалить лишний краситель.
    5. Дегидрат последовательно снимает образцы 50%, 75% и 100% этанола по 5 минут каждая.
    6. Инкубировать образцы последовательно в растворах для очищения тканей I и II по 30 минут при комнатной температуре, используя достаточный объём для полного погружения ткани.
    7. Положите очищенные пучки ТА на накладку и аккуратно выравнивайте стеклянным блоком (2,5 см × 2 см × 1 см; масса 7,8 г)26.

4. Визуализация образцов мышц ТА

  1. Снимите образцы мышц с помощью конфокального микроскопа для получения высокоразрешающих трёхмерных (3D) оптических срезов.
  2. Получите изображения Z-стека на глубине примерно 100 мкм для мышцы с помощью объектива с увеличением 63-кратного увеличения (N.A. 1.40).
  3. Используйте конфокальное программное обеспечение системы визуализации с длиной волны возбуждения 646 нм, чтобы обеспечить максимальную чёткость при минимальном фоне.
  4. Получение изображений в режиме деконволюции с использованием параметров «Системно оптимизированные» с шагом 1 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы бороться с обезвоживанием и фотоотбеливанием, перенесите ткани в раствор для очистки тканей II и разместите их на накладке. Перед визуализацией нанесите две капли очищающего раствора 2 непосредственно на ткань.

5. Загрузка и визуализация ГМ мышц tSC

  1. Используйте мыши S100β для специфической флуоресцентной идентификации tSC.
  2. Сделайте небольшой разрез кожи над мышцой ГМ. Введите 75 мкл 2 мкм далеко-красной флуоресцентной митохондриальной окраски под ГМ перед закрытиемраны 25.
  3. Закройте рану и дайте красителю инкубировать 45 минут, чтобы селективно маркировать tSC без значительной маркировки подлежащих мышечных волокон.
  4. Вскрытие мышц ГМ и немедленно поместите их в охлаждённый физиологический раствор с 0,9% стерильным раствором. Быстро убирайте лишний жир и соединительные ткани.
  5. Перенесите вскрытых ГМ на укрытие для визуализации.
  6. Только если использовать мышей D2.mdx, добавляйте краситель флуоресцентного ацетилхолинового рецептора (AChR) с разбавлением 1:500 в микродиссекционную ванну. Инкубировать ткань в течение 30 минут, чтобы визуализировать постсинаптические компоненты нервно-мышечного соединения (NMJ).
  7. Используйте этот метод двойного маркировки для различия постсинаптических митохондрий от специфических для tSC митохондрий.
    ВНИМАНИЕ: Ограничите вскрытие и очистку ГМ не более чем за 10 минут до размещения на накладке для визуализации, чтобы минимизировать морфологические изменения после вскрытия. Этот временной лимит критически важен для минимизации морфологических изменений после рассечения и деградации митохондрий.
  8. Проведите конфокальную микроскопию для получения высококачественных трёхмерных (3D) оптических срезов.
  9. Получение Z-стековых изображений на глубине примерно 16 мкм для tSC с использованием объектива с увеличением 20x (N.A. 0,75). Получите репрезентативные изображения отдельных tSC высокого разрешения с помощью объектива с увеличением 63 раза.
  10. Внедряйте монтажные процедуры для минимизации обезвоживания тканей и фотоотбеливания во время сеанса визуализации.
    ВНИМАНИЕ: Перенесите ткани в физиологическом растворе на покрытие, убедитесь, что вентральная сторона обращена вниз для инвертированной микроскопии.
  11. Нанесите 2 мкл общего монтажного материала на дорсальную поверхность GM.
  12. Аккуратно расплющайте ткань с помощью откалиброванного стеклянного блока (2,5 см × 2 см × 1 см; масса 7,8 г), чтобы обеспечить равномерную плоскость изображения.

6. Микроскопия фокусированных ионных лучей

  1. Проведите сфокусированную ионно-лучевую сканирующую электронную микроскопию (FIB-SEM) согласно ранее установленнымпротоколам 26.
    1. Применяйте FIB-SEM специально для подтверждения и визуализации новых морфологических признаков, выявленных при конфокальной визуализации.

7. Анализ изображений

  1. Образцы мышц ТА
    1. Проведите количественный анализ конфокальных оптических срезов (1 мкм) ТА-сканов (примерно 75–112 мкм толщиной) с использованием программного обеспечения для анализа изображений на базе ИИ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите несколько контролируемых обучающих сессий перед автоматизированной сегментацией для улучшения адаптации алгоритмов.
    2. Импортируйте отдельные оптические срезы (Z-срезы), чтобы научить программное обеспечение сохранять пиксельную информацию, представляющую белый митохондриальный краситель, исключая чёрный фон.
    3. Разработайте маски для анализа исследователями, чтобы обеспечить высокое качество анализа и точность.
    4. Разделяйте стеки 3D-изображений на отдельные оптические секции после оптимизации алгоритма.
    5. Выберите каждый пятый Z-срез с каждого 3D-изображения для анализа, при этом каждая точка данных представляет среднее значение этих отдельных срезов на выборку.
    6. Количественно определить морфологию митохондрий для получения метрик пространственного распределения и сетевой связности.
    7. Стандартизировать пороги интенсивности, настройки обнаружения краёв и калибровку размера вокселей для всех образцов для минимизации экспериментальной вариабельности.
  2. tSC на ГМ-образцах
    1. Собрать оптические секции диаметром 1 мкм в Z-стеки (толщиной примерно 6–25 мкм) и разделить изображения на отдельные цветовые каналы с помощью программного обеспечения для 2D-анализа изображений.
    2. Калибруйте программное обеспечение с помощью масштабных полос и применяйте пороговые значения для оптимизации визуализации митохондрий tSC с минимальными фоновым помехами.
    3. Проведите бинаризацию и удалите фоновый шум для выделения митохондрий tSC или tSC для измерения количества площадей и частиц.
    4. Сохраняйте двоичные изображения для обеспечения единообразной обработки и проводите все эксперименты с изображениями в одинаковых условиях для обеспечения воспроизводимости между биологическими репликатами.

8. Иммуногистохимия

  1. Внедрить образцы левой мышцы ТА в состав оптимальной температуры резки (OCT) для оценки площади поперечного сечения (CSA).
    1. Срезать образцы толщиной 10 мкм с помощью криостата, установленного при -17°C, и собирать на микроскопические стекла.
    2. Окрашивание поперечных срезов мышц для ламинина для выявления границ миофибра с использованием первичного антитела к ламинину (1:400) и вторичного антитела к родамину (1:400).
    3. Монтировать слайды с использованием подходящего монтажного материала перед началом съёмки.
  2. Изображение слайдирует с помощью конфокального микроскопа случайным образом выбирая 2–3 интересующих области (580 x 580 мкм) на образец с объективом 20x (N.A. 0,75).
  3. Средние значения по регионам на мышцу и анализ примерно 400 миоволокон на секцию ТА.
  4. Используйте программное обеспечение для полуавтоматической сегментации мышц для определения CSA (μm2), маскируя миоволокна.

9. Статистический анализ

  1. Отчёт сводные данные как среднее ± стандартную ошибку среднего значения (S.E.M.).
  2. Проводите статистический анализ с помощью специализированного статистического программного обеспечения, используя параметрические, неспаренные t-тесты Student для определения значимости между разницами средних групп.
  3. Проведите простые линейные регрессии по CSA и мышечной силе с мышц ТА, используя их как маркеры патологии ДМД для сравнения морфологии митохондрий из мышц ТА и ГМ тСК.
  4. Оценить коэффициенты корреляции Пирсона r , чтобы определить корреляцию между патологией ДМД и патологией митохондрий. Определим статистическую значимость как P ≤ 0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондриальные сети показали ожидаемое снижение связности
Представлены репрезентативные 3D-флуоресцентные изображения конфокальных сканирований мышц ТА в двух группах — WT и mdx (рисунок 2). В сравнении с группой WT митохондриальная связность у mdx-мышей кажется сниженной по сравнению с WT (рисунок 2A–D). Большее количество мелких митохондриальных фрагментов наблюдалось у mdx мышей [<100 мк...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Расположение митохондрий внутри клеточных структур, а также их морфология коррелируют с состоянием митохондрий и метаболическимипотребностями 21. Учитывая клиническую значимость здоровья митохондрий, в сочетании с разными кинетиками дыхания и морфологией различных типов клеток, был разработан простой и конфокальный микроскопический метод оценки морфологий митохондрий в тСК после первой оценки метода в скелетных мышцах, предоставляющий информацию о состоянии митохо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят докторов Мариаппан Мутучами, Менделла Римера и Питера Нгхима за щедрое предоставление мышей D2.mdx, используемых для оценки митохондрий tSC. Эта работа была поддержана грантом студентов по исследованию Института спортивной медицины и человеческой эффективности имени Сиднея и Дж. Л. Хаффинса, а также средствами Колледжа образования и развития человека Техасского университета A&M. A.B.M. также поддерживался NIH LRP (NIAMS, 2L40AR077899-02A3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-in-1 Whole Animal SystemAurora Scientific, Ontario, Canada1300AСистема функционирования мышц с программным обеспечением для анализа
AIVIA Leica Microsystems, Bellevue, WA, USA15Программное обеспечение для анализа изображений на основе ИИ
anti-laminin MilliporeSigmaL9393-.2mLМетка границы миофибры
B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J Mouse StrainJackson Labs, Bar Harbor, MEJAX:005621S100β
Cryostar NX50 CryostatEpredia, Kalamazoo, MI, USAhttps://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50Криостат
D2.B10-DMDD2.mdx/J Mouse StrainJackson Labs, Bar Harbor, MEJAX:13141D2.mdx
DBA/2J Mouse StrainJackson Labs, Bar Harbor, MEJAX:00671WT
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher Scientific; Hampton, NJ, USABP231-100Реагент для восстановления митохондриальной окраски
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Клеточный проницаемый краситель нуклеиновых кислот
ImageJ/Fiji National Institutes of Health, Bethesda, MD, USASCR_002285Программное обеспечение для 2D-анализа
Invitrogen ProLong Gold antifade reagent with DAPI Fisher Scientific, Hampton, NJ, USAP36941Монтажное средство
KimWipeKimberly-Clark, Irving, TX, USA06-666AЛабораторные салфетки
Leica LAS_X software Leica Biosystems, Wetzlar, GermanySCR_013673Конфокальный софт
MitoView Fix 640Biotium70075-50ugМитохондриальный флуоресцентный краситель дальнего красного цвета
NIS-Elements Advanced Research software Nikon, Melville, NY, USASCR_014329Программное обеспечение для анализа площади поперечного сечения
Permount Mounting Medium Fisher Scientific, Waltham, MA 02454, USA#SP15-100Общая монтажная среда
Prism 9 software GraphPad Software, La Jolla, CA, USARRID: SCR_002798Программное обеспечение для статистического анализа
Rhodamine (TRITC)Fisher Scientific; Hampton, NJ, USAAP132RMIВторичное антитело
Stellaris 5 White Light Confocal Microscope and corresponding deconvolution softwareLeica Microsystems, Wetzlar, Germany158301313:158201310:158004752:
158301312:158301314:158401100:
158209011:158301130:158204510:
158301120:158401140:158204511:
15500332:15506428:15506517:155
13859:15521522:15525226:155252
32:15525314:15555009:15555017:
15555046:27100022:155933660:
155933666:155933668:158000640
:158002407:158003150:158004141
:158004201:158004421:158004423
:158200681:158202140:158203114:
158203200:158203220:158204201:
158204510:158204709:158301200:
9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP
_CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_
LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C		Конфокальный микроскоп
SZ61Olympus, Breinigsville, PA, USAsz61Стереомикроскоп
Tissue-Plus O.C.T. Compound Scigen, Fischer Scientific, Hampton, NJ, USA23-730-571Состав для оптимальной температуры резки
Visikol ISigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAH1-30Разжижающий раствор для тканей 1
Visikol IISigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAH2-30Разжижающий раствор для тканей 2
α-bungarotoxin 552Biotrend, Koln, Germany00014Краситель для ацетилхолинового рецептора

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Memme, J. M., Slavin, M., Moradi, N., Hood, D. A. Mitochondrial bioenergetics and turnover during chronic muscle disuse. Int J Mol Sci. 22 (10), 5179(2021).
  2. Iqbal, S., Hood, D. A. The role of mitochondrial fusion and fission in skeletal muscle function and dysfunction. Front Biosci. 20 (1), 157-172 (2015).
  3. Hyatt, H. W., Powers, S. K. Mitochondrial dysfunction is a common denominator linking skeletal muscle wasting due to disease, aging, and prolonged inactivity. Antioxidants. 10 (4), 588(2021).
  4. Katti, P., et al. Mitochondrial network configuration influences sarcomere and myosin filament structure in striated muscles. Nat Commun. 13, 6058(2022).
  5. Glancy, B. Visualizing mitochondrial form and function within the cell. Trends Mol Med. 26 (1), 58-70 (2020).
  6. Yan, Z., Okutsu, M., Akhtar, Y. N., Lira, V. A. Regulation of exercise-induced fiber type transformation, mitochondrial biogenesis, and angiogenesis in skeletal muscle. J Appl Physiol. 110 (1), 264-274 (2011).
  7. Powers, S. K., Nelson, W. B., Hudson, M. B. Exercise-induced oxidative stress in humans: Cause and consequences. Free Radic Biol Med. 51 (5), 942-950 (2011).
  8. Hyatt, H., Deminice, R., Yoshihara, T., Powers, S. K. Mitochondrial dysfunction induces muscle atrophy during prolonged inactivity: A review of the causes and effects. Arch Biochem Biophys. 662, 49-60 (2019).
  9. Drake, J. C., Yan, Z. Mitophagy in maintaining skeletal muscle mitochondrial proteostasis and metabolic health with ageing. J Physiol. 595 (20), 6391-6399 (2017).
  10. Chen, X., et al. Mitochondrial dysfunction: Roles in skeletal muscle atrophy. J Transl Med. 21 (1), 503(2023).
  11. Zhang, Z., Sliter, D. A., Bleck, C. K. E., Ding, S. Fis1 deficiencies differentially affect mitochondrial quality in skeletal muscle. Mitochondrion. 49, 217-226 (2019).
  12. Silva, K. A. S., et al. Angiotensin II suppresses autophagy and disrupts ultrastructural morphology and function of mitochondria in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol. 126 (6), 1550-1562 (2019).
  13. Cattin, A. L., et al. Macrophage-induced blood vessels guide Schwann cell-mediated regeneration of peripheral nerves. Cell. 162 (5), 1127-1139 (2015).
  14. Caillaud, M., Richard, L., Vallat, J. M., Desmoulière, A., Billet, F. Peripheral nerve regeneration and intraneural revascularization. Neural Regen Res. 14 (1), 24-33 (2019).
  15. Girouard, M. P., Bueno, M., Julian, V., Drake, S., Byrne, A. B., Fournier, A. E. The molecular interplay between axon degeneration and regeneration. Dev Neurobiol. 78 (10), 978-990 (2018).
  16. Belanger, K., Dinis, T. M., Taourirt, S., Vidal, G., Kaplan, D. L., Egles, C. Recent strategies in tissue engineering for guided peripheral nerve regeneration. Macromol Biosci. 16 (4), 472-481 (2016).
  17. Waller, A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos Trans R Soc Lond. 140, 423-429 (1850).
  18. Napoli, I., et al. A central role for the ERK-signaling pathway in controlling Schwann cell plasticity and peripheral nerve regeneration in vivo. Neuron. 73 (4), 729-742 (2012).
  19. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. J Physiol. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  20. Hastings, R. L., Mikesh, M., Lee, Y. I., Thompson, W. J. Morphological remodeling during recovery of the neuromuscular junction from terminal Schwann cell ablation in adult mice. Sci Rep. 10 (1), 11132(2020).
  21. Glancy, B., Kim, Y., Katti, P., Willingham, T. B. The functional impact of mitochondrial structure across subcellular scales. Front Physiol. 11, 541040(2020).
  22. Stahon, K. E., Bastian, C., Griffith, S., Kidd, G. J., Brunet, S., Baltan, S. Age-related changes in axonal and mitochondrial ultrastructure and function in white matter. J Neurosci. 36 (39), 9990-10001 (2016).
  23. Suh, J., et al. Mitochondrial fragmentation and donut formation enhance mitochondrial secretion to promote osteogenesis. Cell Metab. 35 (2), 345-360.e7 (2023).
  24. Laker, R. C., et al. A novel MitoTimer reporter gene for mitochondrial content, structure, stress, and damage in vivo. J Biol Chem. 289 (17), 12005-12015 (2014).
  25. Fernando, C. A., Pangan, A. M., Cornelison, D., Segal, S. S. Recovery of blood flow regulation in microvascular resistance networks during regeneration of mouse gluteus maximus muscle. J Physiol. 597 (5), 1401-1417 (2019).
  26. Hammers, D. W., et al. The D2.mdx mouse as a preclinical model of the skeletal muscle pathology associated with Duchenne muscular dystrophy. Sci Rep. 10 (1), 14070(2020).
  27. Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells. Front Cell Dev Biol. 9, 757305(2021).
  28. Ramos, S. V., Hughes, M. C., Delfinis, L. J., Bellissimo, C. A., Perry, C. G. R. Mitochondrial bioenergetic dysfunction in the D2.mdx model of Duchenne muscular dystrophy is associated with microtubule disorganization in skeletal muscle. PLoS One. 15 (10), e0237138(2020).
  29. Rosen, H. G., et al. Inhibition of mitochondrial fission protein Drp1 ameliorates myopathy in the D2-mdx model of Duchenne muscular dystrophy. bioRxiv. , (2024).
  30. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th ed, National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  31. Ino, D., Iino, M. Schwann cell mitochondria as key regulators in the development and maintenance of peripheral nerve axons. Cell Mol Life Sci. 74 (5), 827-835 (2017).
  32. Pareyson, D., Piscosquito, G., Moroni, I., Salsano, E., Zeviani, M. Peripheral neuropathy in mitochondrial disorders. Lancet Neurol. 12 (10), 1011-1024 (2013).
  33. Schröder, J. M., Sommer, C. Mitochondrial abnormalities in human sural nerves: Fine structural evaluation of cases with mitochondrial myopathy, hereditary and non-hereditary neuropathies, and review of the literature. Acta Neuropathol. 82 (6), 471-482 (1991).
  34. Schröder, J. M. Neuropathy associated with mitochondrial disorders. Brain Pathol. 3 (2), 177-190 (1993).
  35. Santosa, K. B., Keane, A. M., Jablonka-Shariff, A., Vannucci, B., Snyder-Warwick, A. K. Clinical relevance of terminal Schwann cells: An overlooked component of the neuromuscular junction. J Neurosci Res. 96 (7), 1125-1135 (2018).
  36. Morton, A. B., et al. Inducible deletion of endothelial cell Efnb2 delays capillary regeneration and attenuates myofibre reinnervation following myotoxin injury in mice. J Physiol. 602 (19), 4907-4927 (2024).
  37. Morton, A. B., Norton, C. E., Jacobsen, N. L., Fernando, C. A., Cornelison, D. D. W., Segal, S. S. Barium chloride injures myofibers through calcium-induced proteolysis with fragmentation of motor nerves and microvessels. Skelet Muscle. 9 (1), 27(2019).
  38. Sukhorukov, V. M., Dikov, D., Reichert, A. S., Meyer-Hermann, M. Emergence of the mitochondrial reticulum from fission and fusion dynamics. PLoS Comput Biol. 8 (10), e1002745(2012).
  39. Ferramosca, A., Zara, V. Mitochondrial carriers and substrate transport network: A lesson from Saccharomyces cerevisiae. Int J Mol Sci. 22 (16), (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Mitochondrial MorphologyIn Situ QuantificationSkeletal MuscleTerminal Schwann CellsConfocal MicroscopyMitochondrial NetworkMembrane Potential DyeMitochondrial FragmentationNeuromuscular JunctionS100 Reporter Mice

Похожие статьи