Методическая статья

Доклиническая модель синовита с использованием человеческой синовиальной ткани ex vivo с сохраненной функцией и архитектурой

332 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69734

⸱

20 марта 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency Medicine, University of Iowa Health Care, 2Interdisciplinary Graduate Program in Immunology, University of Iowa, 3Department of Orthopedics and Rehabilitation, University of Iowa Health Care, 4Carver College of Medicine, University of Iowa, 5Office of Research and Development, Iowa City Veterans Affairs Health Care System, 6Department of Internal Medicine, University of Iowa Health Care, 7Iowa State University, 8Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали человеческую систему ex vivo transwell, способную оценивать острые воспалительные изменения, инфекционные и структурные изменения синовиума.

Аннотация

Артрит — это воспалительное состояние в суставах, приводящее к повреждению хряща, боли и потере подвижности. Недавние достижения в исследованиях артрита конкретно показывают, что капсула сустава (например, синовиум) является важным источником воспаления, но нет человеческих моделей, воспроизводящих основную синовиальную архитектуру. Для решения этой проблемы была создана Объединённая система анализа пространства (JSAS). Передняя синова была получена внутриоперационно у пациентов, проходивших тотальную артропластику колена (ТКА). Синовиум был рассечен и разбит на 3-мм биопсийные ядры. Керны помещались в верхнюю яму трансвестной скважины диаметром 5 мкм или 0,4 мкм с 300 мкл ДМЭМ с 10% ФБС. В нижней скважине добавлялось 600 мкл среды, которое обменивалось каждые 2-3 дня. Жизнеспособность оценивалась до 7 дней при гипероксических (50%), атмосферных/стандартных (~21%) и физиологических (5%) инкубационных состояниях. Стимулы в нижней яме включали моноцитный хемоаттрактантный белок 1 (MCP-1/CCL2), липополисахарид (LPS), N-ацетилцистеин, S. aureus и B. burgdorferi. Среда хранилась для ELISA, а ткани — для анализа формалина с фиксированным парафином (FFPE). В стандартных условиях синови оставался полностью жизнеспособным в течение 3 дней. Стимул модифицировал структуру и функцию оболочки интимальной оболочки и сублинируя синовиальные клетки, включая потерю границы резидентного макрофага, расширение сублинирования, апрегуляцию патогенных фибробластов и выработку цитокинов IL-1β и TNFα. Иммунные клетки и фибробласты мигрировали в нижнюю камеру (5 мкм пор) по анализу потоковой цитометрии. Подвижный B. burgdorferi мигрировал в ткань с размером пор 0,4 мкм, тогда как неподвижный S. aureus — нет. Соответствующие цитокины экспрессировались в достаточном количестве для ELISA. JSAS — это модульная система, способная изучать острые изменения человеческой синовии, позволяя учитывать сложность 3D-структур в доклинической модели, сохраняя при этом биологически значимую структуру и функцию.

Введение

Артрит поражает более 20% всех взрослых в США и 50% тех, кто старше 65 лет страдает хроническимизаболеваниями. 1. Она также является одной из ведущих причин инвалидности вовсём мире 2. Артрит включает не только повреждение хряща, но и воспаление суставной капсулы или синовиума (например, синовита). Хронический синовит, вероятно, является одним из основных источников провоспалительных цитокинов, которые усиливают повреждение костей и хрящей при остеоартрите и ревматоидномартрите 3,4. Поэтому понимание иммунно-опосредованных изменений в синовиуме, вероятно, крайне важно для разработки новых терапевтических и, возможно, профилактических методов для пациентов с артритом.

Синовий — это организованная структура, состоящая из двух основных слоёв: клеточной интимальной оболочки (IntL) и сублинирования (SubL). IntL взаимодействует с синовиальной жидкостью (SF), а SubL образует компоненты SF и содержит сосудистыеструктуры 5. Внутри IntL есть как макрофаги, так и фибробластоподобные синовиоциты (FLS). Макрофаги IntL — это резидентные клетки, локально обновляемые интерстициальными макрофагами внутриSubL 6. Эти резидентные синовиальные макрофаги (РСМ) имеют M2-искажение экспрессией CD206 и TREM2, эпителиализируются и экспрессируют узкие маркеры соединения. Эта подструктура IntL может играть ключевую роль в функциональном и физическом поддержании гомеостаза пространства всуставах 5,6. Это наблюдалось при ревматоидном артрите (РА). Например, при разрушении IntL у пациентов с ревматоидным артритом наблюдаются обострения, которые проходят при восстановлениислизистой 6,7. Спонтанная ремиссия РА конкретно связана с MerTK + CD206+ синовиальнымимакрофагами 7. РСМ также были выявлены у СФ пациентов с острой болью в суставах, что показало, что тяжесть инфекционных или воспалительных заболеваний коррелирует с количеством РСМ и воспалительных цитокинов8. К сожалению, связь между структурами IntL и SubL, функциональными изменениями RSM и FLS, а также образованием воспалительных медиаторов, которые могут впоследствии повредить хрящ и/или кости, трудно проверить, особенно у людей.

Для изучения основных механизмов синовита в нескольких клинически значимых условиях была разработана модель человека ex vivo под названием Joint Space Analysis System (JSAS). Эта система даёт воспроизводимые результаты с помощью модульных элементов для широкой оценки воспалительного и инфекционного артрита. В этой статье описываются процессы получения тканей после распространённых операций на открытых суставах, таких как тотальная замена сустава, дизайн JSAS, гистоморфометрия, необходимая для количественной оценки острых структурных изменений в синовиуме, а также функциональные реакции ткани, включая иммунофлуоресценцию (IF), РНКскоп и ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA). JSAS отличается от распространённых моделей in vitro для людей тем, что сохраняет структуры IntL и SubL, позволяя получать близкие in vivo представления о острых или острых при хроническом синовите, приводящем к повреждению хряща. Сохраняя родную структуру синовиума, можно вскрыть внутренние способности RSM и FLS для снижения или поддержания воспаления. Как ex vivo модель, она не требует дифференцировки периферических иммунных клеток в синовиальные макрофаги и не требует чрезмерного упрощения синовиума до 1-2 отдельных типов клеток. Она отличается от животных моделей, таких как артрит, индуцированный коллагеном (CIA), использованием естественно заболевшей человеческой ткани, что позволяет проводить специфическую оценку патогена, релевантную для человека. Наконец, можно смоделировать несколько инфекций, что позволяет выявить модель септического артрита наряду с остеоартритом и воспалительным артритом. Основное ограничение — культура в течение 3 дней в стандартных условиях до начала апоптоза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол согласия пациентов и обработки тканей был утверждён местным Институциональным обзорным советом (IRB). Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Извлечение тканей и биопсия

  1. Определяйте пациентов до операции на основе расписания хирурга. Привлекайте пациентов в возрасте 18-65 лет, проходящих операцию на открытом суставе, такую как тотальная артропластика колена (ТКА) или остеотомия большеберцового бугорка (ТТО, также известная как синдром Фулкерсона), и которые не принимают системные иммуномодуляторы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале исключать пациентов с более одной артроскопией или более одной инъекцией глюкокортикоидов, так как у этих пациентов был более высокий интраоперационный отказ в получении тканей по сравнению с другими популяциями из-за фиброза. Учитывая риск передачи инфекции, отложите набор пациентов с анамнезом гепатита C или вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), если это не имеет значения для исхода. Всегда соблюдайте безопасные практики обращения с свежими человеческими тканями, независимо от инфекционного заболевания.
  2. Ортопеды выполняют артротомию и вскрытие в рамках стандартной процедуры. Определите переднюю синовию непосредственно проксимально от трохлеарной борозды и используйте электрокоагуляторию для удаления синовии en bloc, избегая рассечения мышцы articularis genu или рядом с медиальными и латеральными эпикондилями. Синовэктомия относительно нейтральна для ТКА и при воспалительных состояниях может бытьполезной 9,10. Стерильно передайте синовий члену исследовательской группы и поместите его в стерильный контейнер с холодным фосфатно-буферным физиологическим раствором Dulbecco (DPBS) на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прекратить забор тканей, если хирургическая команда заметила аномалии или если синовэктомия может ухудшить закрытие или исход операции. Последнее особенно редко встречается при ТКА, так как удаление синовиума может использоваться как расширенная процедура для ослабления плотных суставов... Величина удаления зависит от размера эксперимента. Можно получить примерно четыре биопсийных керна диаметром 3 мм на 1см² ткани. Во многих случаях можно получить 24см² и более ткани. Вес ткани сильно зависит от хирургического вскрытия, поэтому он менее надёжен, чем площадь поверхности, для определения адекватности эксперимента. Рисунок 1 иллюстрирует шаги 1.2–1.7.
  3. Верните синовиум в лабораторию и дважды помойте в холодном DPBS в течение 10 минут на пластинном качалке.
  4. Переместите синовиум в стерильную чашу Петри диаметром 10 см и больше в стерильных условиях в шкаф, сертифицированный по биобезопасности уровня 2 (BSL2). Добавьте холодные, стерильные, низкосодержащие глюкозу среду Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), содержащие пируват натрия и L-глутамин, достаточно, чтобы заполнить блюдо наполовину. Определите синовиальную оболочку по перламутровому слою IntL (рисунок 2A), в отличие от прижжённой стороны (рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Международная служба хрупка. Осторожно, чтобы не отслаить его, иначе он может диссоциировать с подлинкой (рисунок 2A, сжатый гемостатом). Перламесосценция может быть изменена предыдущей историей гемартроза (появление жёлто-оранжевого цвета из-за гемосидерин), высокого ИМТ (покрытого жиром) или воспаления (красный, хрупкий и ворсинистый). Крайне важно правильно определить международный рейтинг перед началом действия. Тщательно проверьте признаки хирургического удаления, кауберации, кровотечения и свертывания, чтобы определить, что следующие этапы не выполняются на международном уровне.
  5. Вскрытие посторонних жировых и стромальных тканей на прижжённой стороне для выделения синовиума, сохраняя глубину ткани примерно 4-5 мм во всех областях. Можно использовать ирисовые ножницы или скальпели по личным предпочтениям. Меняйте медиа чашки Петри по мере необходимости, чтобы сохранить поле зрения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Задняя стромальная или жировая ткань легко удаляется. Однако трудности с вскрытием или ощущение сильного сопротивления свидетельствуют о задержанной связке, метаплазии тканей, таких как неправильное отложение хряща, или пересечении IntL.
  6. После вскрытия на соответствующую глубину получите биопсийные ядра диаметром 3 мм при необходимости для минимум 2 технических репликации на каждое испытанное состояние. Выполняйте синовиальную подкладку, обращённую к инструменту для отбора керна, а не поверхности чашки Петри. Качественный биопсийный пунш может быть использован примерно 10–15 раз перед заменой из-за притупления, так как тупой биопсийный пуншон может привести к повреждению структуры интимальной оболочки.
    1. Выполняйте корн с мощной перпендикулярной нагрузкой и мягким поворотом. Если ткань скручивается, то инструмент для биопсии стал тусклым и требует замены. Стабилизируйте недоминантную руку с помощью щипцов или гемостатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для максимизации перфузии тканей, а также для увеличения количества кернов на пациента и обеспечения достаточного количества технических повторений для этих экспериментов, использовались 3 мм. Могут использоваться ядра альтернативного размера, но для этого протокола тестировалось только 3 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избыток удержанного жира из-за недостаточной диссекции может привести к плаванию сердечника в JSAS, что является неоптимальным. Если керны всплыли на поверхность, а не оставались погружёнными, вернуться к вскрытию или выбрать подводное ядро.
  7. Откройте вторую чашку Петри и наполните 5-10 мл подогретой (37 °C) средой с 10% FBS. С помощью плоских или беззубчатых щипцов перенесите сердечники в эту чашу, чтобы смыть мусор с помощью 1-2 секунд мягкого механического перемешивания. Не зажимайте сердечники плотно, иначе это может повредить внутреннюю оболочку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь можно сделать паузу на ≤24 часа, поместив тканевые ядра в инкубатор при стандартной температуре 37 °C и 5%CO2.

2. Создание совместной системы анализа пространства (JSAS)

  1. Подготовьте нижню скважину JSAS с 600 мкл подогретого (37 °C) низкоглюкозного DMEM с 10% FBS. Хотя 1% пенициллин-стрептомицина был протестирован без заметного негативного эффекта в этой системе, антибиотики обычно не добавляют в среду при адекватном поддержании стерильности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если кокультурируется с бактериями или клеточной линией, требующей другой среды, нижняя колодица может быть другой средой. Избегайте антибиотиков при сокультурировании с бактериями.
  2. В нижний колодец добавьте выбранную обработку. Например, липополисахарид (LPS). Чтобы избежать различий в осмолярности, рекомендуется, чтобы объём обработки не превышал 2,5% от общего объёма (например, ≤15 мкл при 600 мкл). Буферируйте любые изменения pH после лечения, чтобы поддерживать pH 7.0-7.4. В противном случае используйте управление транспортным средством.
  3. Выбирайте размер пор по трансвеллу в зависимости от желаемого экспериментального результата (рисунок 3).
  4. Добавьте 300 мкл низкоглюкозного DMEM с 10% FBS в трансвелл.
  5. Аккуратно перенесите отдельные сердечники стерильными щипцами в среду трансвелла. Ориентация ткани нельзя контролировать; Однако жирность и естественная плавучесть стромальной ткани естественным образом приводят к тому, что интимальная оболочка лежит лицом вниз для большинства ядров тканей.
    1. Тщательно визуализируйте сердечники, так как процесс пробывания может нарушить интимную оболочку, и избегайте использования сердечников, которые в начале эксперимента выглядят изношенными. Если ядро плавает, улучшите вскрытие и выберите альтернативное ядро.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим матрицу коллагена, если ориентация ткани важна; однако это повлияет на время формирования химического градиента с нижней скважиной.
  6. Поместить в инкубатор при 37 °C и 5%CO2 на желаемое время.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самое раннее время для биологических изменений — 8 часов. Последний подтверждённый временной момент биологической активности — 3 дня.

3. Экспериментальная демонтаж и анализ

  1. Для гистологии используйте стерильные, незубчатые щипцы для переноса ткани на 3-5 мл 10% нейтрального буферного формалина (NBF) для анализа с фиксированным формалином, парафин-вложённым (FFPE). Храните в NBF 3-7 дней перед встраиванием и секционированием.
    1. Не оставляйте ткани долго надеяться, так как это усугубляет аутофлуоресценцию. Провести гистологический анализ, включая окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)11 для гистоморфометрии, иммунофлуоресценции (IF)12 и/или РНК-скопа сIF 13 согласно стандартным методам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не проколоть трансвелл щипцами при удалении ткани. Будьте очень осторожны при переносе кора, иначе интимальная оболочка может диссоциировать. Аккуратно поместите сердцевину в фиксационное средство и не перемешивайте. NBF следует использовать внутри сертифицированного вытяжки для химических выхлопов, утилизировать в соответствии с местными стандартами по охране окружающей среды и безопасности (EHS) и не может сливаться в раковины. Неиспользованная человеческая ткань из эксперимента помещается в более чем 10% отбеливателя на 30 минут, затем помещается во вторичный контейнер согласно местным требованиям EHS и затем утилизируется в маркированных контейнерах для биологической опасности для сжигания. Раствор отбеливателя можно вылить в раковину, если это одобрено местной EHS. Следуйте местным рекомендациям, которые могут отличаться в зависимости от учебного заведения.
  2. Встраивайте технические реплики в тот же блок FFPE. Используйте экранированные кассеты, чтобы избежать потери образца. Сечение по продольной оси толщиной 5 мкм. Разместите три серийных секции на одном слайде (дополнительный рисунок 1).
  3. Изображение H&E скользит с частотами 10x и 40x с использованием микроскопии яркого поля. Определите IntL как организованный клеточный слой на границе между тканью и пустым пространством.
    1. Приобретите 3 репрезентативных сечения 10x и 10 репрезентативных секций 40x в рамках минимум 2 технических репликов на каждое условие лечения, сохраняя IntL в поле зрения. Снимайте изображения в виде высококачественных TIFF. Проведите анализ гистоморфометрии:
    2. Проведите измерения в ImageJ/FIJI. Сначала задайте масштаб с помощью меню Анализ → Set Scale. Set Scale требует использования калибровочного слайда, который отображается на каждом микроскопе на каждом объекте. Сначала используйте инструмент прямой линии, чтобы создать линию известной длины на основе изображения калибровочного слайда. Назначьте масштаб глобально.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При 10x шкала составляет 3 пиксели/мкм. При 40x масштаб составляет 12 пикселей/мкм.
    3. Измерьте толщину SubL с помощью 10x изображений с помощью инструмента Straight Line. Измерьте толщину как отвесную глубину от поверхности IntL до нижней части SubL (мкм). После нарисования каждой линии используйте клавишный ярлык m , чтобы измерить длину линии.
      1. В среднем минимум 5 измерений для каждого изображения 10x (рисунок 4A,B). Переход между SubL и стромальной тканью определяется переходом к менее организованным, менее клеточным областям, содержащим коллаген и жир (рисунок 4B). Разрежьте точку перехода между тканевыми компартментами.
    4. Для 40-кратных измерений толщины IntL, IntL-клеточности, целостности IntL и SubL клеточности начните с открытия 40-кратного TIFF в Adobe Photoshop (или любом подобном редакторе изображений). IntL определяется как слой толщиной от 1 до 5 клеток, организованный в отдельный клеточный слой на границе между тканью и пустым пространством (например, синовиальная жидкость) (рисунок 4C).
    5. Создайте новый слой. Выберите инструмент Polygonal Lasso . С помощью клика мыши для запуска лассо, а также закрепления инфлекций в строке, разделите переход между IntL и SubL по всему изображению. Затем продолжайте лассо прямо за пределами Международного Защитного пространства в пустом пространстве.
      1. Закройте лассо двойным щелчком. Инвертируйте выбранную область (выберите → обратное), затем заполните пространство чёрным цветом с помощью инструмента «ведро краски ». Это покроет все области, не входящие в IntL. Сохраните это изображение в виде JPG высокого разрешения, представляющего IntL, затем спрячьте слой.
    6. Создайте новый слой. В настройках полигонального лассо выберите функцию пересечения , которая выберет только место пересечения новой и старой областей лассо. Проведите лассо вокруг слоя подлинирования, щёлкая по середине IntL, по левому и правому краям изображения на фоновый холст, а затем разделите переход между SubL и бесцеллюлявой тканью позади него.
      1. Если нижняя часть SubL превышает размеры изображения 40x, просто выберите фоновое холст вокруг оставшегося края. Снова выберите обратную область, как выше, затем используйте инструмент « ведро краски », чтобы заполнить чёрным цветом. Сохраните это изображение в виде высококачественного JPG, представляющего SubL. Сохраните этот слоистый образ как PSD для будущего использования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эритроциты часто встречаются в этих слайдах и могут мешать будущим измерениям количества клеток. Если сосудистые участки большие, используйте инструмент для многоугольного лассо, кисть или другие подходящие инструменты для создания масок на отдельном слое, покрывающем эти области.
    7. В FIJI откройте изображение маски  IntL. Измерьте толщину IntL (мкм) как среднее минимум 5 измерений по 40x изображению с помощью инструмента прямой линии, как на шагах 3.3.2-3.3.3.
    8. Измерьте общую длину (мкм) IntL с помощью инструмента сегментированной линии. Затем измерьте длину только целых участков, также с помощью инструмента сегментированной линии (рисунок 4D,E). Срезы IntL, которые не являются целыми, обозначены промежутками между клетками, видом, поглощённым молью, и отделением или отслаиванием IntL из тканей.
      1. Вычислите % целостной границы IntL в (intall IntL/total IntL)*100. Это нужно сравнивать с регуляторами тех же временных точек, чтобы компенсировать любой артефакт секционирования.
    9. Измерьте клеточность IntL с помощью изображения маски IntL. Сначала преобразовать в 8-битный (тип изображения → → 8-битный). Затем пороговое (изображение → порог), чтобы минимизировать шум и максимально распознать ячейку. В меню порога снимите тёмный фон и используйте нижний переключатель для корректировки.
      1. Ручное определение порога на изображение, чему способствует исчезновение шума (например, фоновый артефакт), сохраняя при этом исходное количество ядерных тел. Сравнивайте оригинальное изображение чаще, чтобы сохранить достоверность. Когда шум минимизирован (ложноположительный), но сигнал гематоксилина максимизирован (истинно ядерный положительный), уместно установить порог (дополнительный рисунок 2).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Порог будет одинаковым для одного сканирования слайда, но будет различаться между слайд-сканерами, а также между отдельными 10- или 40-кратными изображениями. Он также будет отличаться между партиями H&E, так как глубина цвета вряд ли будет одинаковой. Таким образом, простые макросы неуместны, если существуют различия в любой из следующих категорий изображений: пациент, партия H&E, толщина сечения, условия освещения (яркость/цветовая температура комнатного или микроскопа), программное обеспечение для получения изображения, микроскоп для получения изображения и использование алгоритмов баланса белого или цвета. Этот список не является исчерпывающим. Используя микроскоп AmScope T390B-3M с совместимой камерой и программным обеспечением, при максимальном освещении микроскопа в тускло освещённой комнате, с автоматическими настройками баланса белого, 10 случайных 40x изображений, охватывающих 3 пациентов, порог варьировался от 96 до 182, со средним показателем 137. Этот широкий диапазон отражает различия в базовых 8-битных гистограммах, а не несогласованность пользователей. Таким образом, важно обеспечить визуальную точность между исходным изображением и пороговым изображением, а не точное значение порога. Автоматизация этого процесса выходит за рамки типичных лабораторных учёных и требует программирования от специалиста по анализу изображений.
    10. Используйте Analyze Particles (Analyze → Analyze Particles) с размером ячейки 8-150мкм² для идентификации и подсчёта ядер в качестве заместителя номера клеток. Выберите наложенные маски в настройках, чтобы визуализировать идентифицированные ячейки, снова сравнивая с исходным изображением. Поскольку IntL в первую очередь является линейной, а не объёмной структурой, нормализуйте эти 100 мкм длины IntL (например, #cells/100 мкм). В среднем это составляло примерно 13,19 (диапазон 5,4-21,9, SD 3,9) клеток на 100 мкм в свежеизвлеченной синовиальной ткани.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон от 8 до 150мкм 2 был определен на основе Set Scale и итеративного визуального сравнения порогового изображения с исходным. Пределы, определённые эмпирически на основе набора данных, соответствуют предположениям о форме, основанных на макрофагах с диаметром ячейки примерно от 8 до 20 мкм14,15. Крупные размеры исключались, так как это часто представляло собой несколько отдельных ядер, находящихся в непосредственной близости, которые читались как одна клетка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Похожие рабочие процессы могут быть реализованы, например, в QuPath.
    11. Откройте маску SubL с исключением эритроцитов (рисунок 4G). Выполнить 8-битное преобразование, пороговое и анализировать частицы, как указано в шагах 3.3.9-10. Поскольку SubL — это объёмный слой, нормализуйте количество ячейок, подсчитанных до 100 мкм² площади SubL (например, измерение незамаскированных участков) (рисунок 4H).
  4. Для анализа потоковой цитометрии мигрирующих клеток в нижней скважине центрифугуйте при 300 г при 4 °C в течение 10 минут и держите гранулу на льду. Ожидайте ~20 000 живых мигрирующих клеток на 3 мм биопсийное ядро через 24 часа. Ранее были опубликованы методы проточнойцитометрии. 8.
  5. Для ELISA центрифугные среды на максимальной скорости (>5000 x g) в течение 5 минут при 4 °C для гранулирования клеток или остатка. Храните при нужной температуре. Ранее были опубликованыметоды ELISA 8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оптимизация условий культуры кислорода

Физиологическая перфузия тканей составляет примерно 6%–8% кислорода, тогда как стандартные условия инкубации для клеточной культуры находятся на уровне кислорода в атмосфере (~21%)16. Для сравнения, гипероксигенация может повысить жизнеспособность клеточной культуры или бытьтоксичной 17. Достаточное использование JSAS потребовало раннего определения жизнеспособности синовиальной ткани; Поэто...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта работа продемонстрировала возможности JSAS, в частности поддержание живой синовиальной ткани с нетронутой, функционально отзывчивой синовиальной архитектурой. В большинстве инкубационных условий клеточная гибель была минимальной до 72 часов культуры. Для оценки микроскопических изменений синовиальной структуры была описана уникальная гистологическая система измерений, количественно оценивающая структурные изменения IntL и SubL. Такие изменения указывают на острый или острый по хронич...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликтов интересов нет.

Благодарности

Этот протокол был бы невозможен без щедрости пациентов, пожертвовавших свои ткани, и мастерства наших коллег-ортопедических хирургов, которые готовы безопасно приобрести ткани в рамках работы. K.I.C. поддерживается NIAMS K08 AR084605, а C.P.P. — Программой карьерного развития в сфере ветеранов [IK2BX004532]. Эта группа признаёт использование Центрального микроскопического исследовательского центра Университета Айовы, ключевого ресурса, поддерживаемого вице-президентом Университета Айовы по исследованиям, и Медицинским колледжем Карвера. Данные проточной цитометрии были получены в центре Flow Cytometry Facility, который является основным исследовательским центром Carver College of Medicine / Holden Comprehensive Cancer Center при Университете Айовы. Учреждение финансируется за счёт пользовательских взносов и щедрой финансовой поддержки Медицинского колледжа Карвера, Комплексного онкологического центра Холдена и Медицинского центра администрации ветеранов Айова-Сити. Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны: Национальным центром исследовательских ресурсов Национальных институтов здравоохранения по Награде No 1 S10 OD034193-01; и Национальный онкологический институт Национальных институтов здравоохранения под номером P30CA086862.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

```html
Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10 см Petri чашиCorningCLS430167
23srRNA RNAscope зондACD/Biotechne468211
24-луночные пластинкиLife Sciences3524
3 мм биопсийные пунктыIntegra12460406
50 мл конические колбыN/A
70% этанол (для стерилизации)N/A
Borrelia burgdorferiATCC35210 должен использоваться в поздней экспоненциальной фазе для максимальной патогенности
BSK-HSigma-AldrichB8291
CD68 антителоInvitrogen14-0688-821:1000
CO2 баллон (стандартные условия)N/A
Фосфатно-буферный раствор Dulbecco (без кальция и магния)Thermofisher14190144
фетальный бычий сывороточныйBiotechneS11150Теплоинактивированная партия: F22100
пинцет (без зубов)N/A
гемостатN/A
Гумифицированный клеточный инкубатор (стандартные условия)N/A
Инкубатор с гипоксиейN/A
Танк с гипоксией (5% O2, 5% CO2, оставшаяся N2, физиологические условия)N/A
IL-4 антителоThermofisherMA5-424701:100
iNOS антителоThermofisherPA1-0361:100
Ирисовые ножницыN/A
ЛипopolisaccarideSigma-AldrichL2630
DMEM с низким содержанием глюкозы (+натрий пирувата, +L-глютамин)Life Technologies11885084
MMP9 антителоThermofisherMA5-327051:1000
Модульная инкубационная камера (гипероксические условия)Emrbient, IncMIC-101
Моноцитарный хемоаттрактантный белок 1Peptrotech300-04-20UG
N-ацетилцистеинSigma-AldrichA9165Должно готовиться свежо для каждого эксперимента и буферизироваться эквимолярным натрием бикарбоната до pH 7-7.4
OPG ELISAMilliporeRAB04841:1 разбавление
Кислородный баллон с регулятором расхода литров в минутуN/A
PDPN антителоInvitrogen14-9381-821:100
Пропидий иодидаThermofisherJ66764.MC
RNAscope мультиплексный флуоресцентный V2 анализACD/Biotechne323100
sRANKL ELISAMyBioSourceMBS2626241:1 разбавление
Staphylococcus aureus USA 300 MRSAATCCBAA-1717
SYBR GreenThermofisherS756310 000X запас
TNF антителоThermofisherPA5-198101:100
Трансвелл-вставки - размер 0,4 мкмMillicellPICM01250
Трансвелл-вставки - размер 5 мкмCorningCLS3421
```

Ссылки

  1. Fallon, E. A., et al. Prevalence of diagnosed arthritis - United States, 2019-2021. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 72 (41), 1101-1107 (2023).
  2. Allen, K. D., Thoma, L. M., Golightly, Y. M. Epidemiology of osteoarthritis. Osteoarthritis Cart. 30 (2), 184-195 (2022).
  3. Alivernini, S., Firestein, G. S., Mcinnes, I. B. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. Immunity. 55 (12), 2255-2270 (2022).
  4. Mathiessen, A., Conaghan, P. G. Synovitis in osteoarthritis: Current understanding with therapeutic implications. Arthritis Res Ther. 19 (1), 18(2017).
  5. Culemann, S., Grüneboom, A., Krönke, G. Origin and function of synovial macrophage subsets during inflammatory joint disease. Adv Immunol. 143, 75-98 (2019).
  6. Culemann, S., et al. Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint. Nature. 572 (7771), 670-675 (2019).
  7. Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nat Med. 26 (8), 1295-1306 (2020).
  8. Cyndari, K. I., Scorza, B. M., Zacharias, Z. R., Pessôa-Pereira, D., Strand, L. Resident synovial macrophages in synovial fluid: Implications for immunoregulation. Clin Immunol. 271, 110422(2024).
  9. Kooner, S. S., Clark, M. The effect of synovectomy in total knee arthroplasty for primary osteoarthritis: A meta-analysis. J Knee Surg. 30 (4), 289-296 (2017).
  10. Lipina, M., et al. Arthroscopic synovectomy of the knee joint for rheumatoid arthritis. Int Orthop. 43 (8), 1859-1863 (2019).
  11. Rosas, L., Mora, A. L., Rojas, M. Osu tristate sennet H&E staining of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue sections. protocols.io. , (2023).
  12. Biologicals, N. Immunofluorescent IHC staining of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue protocol. , https://www.novusbio.com/support-by-application/Fluorescent-IHC-Staining-of-FFPE-Tissue (2025).
  13. Rnascope multiplex fluorescent reagent kit v2 with sample preparation and pretreatment. , Advanced Cell Diagnostics Inc. https://acdbio.com/rnascope-multiplex-fluorescent-v2-assay (2022).
  14. Fakoya, A. O., Naeem, A., Pierre, L. Statpearls. 20235, Treasure Island (FL). Internet (2024).
  15. Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. Am Rev Respir Dis. 126 (2), 332-337 (1982).
  16. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med. 15 (6), 1239-1253 (2011).
  17. Pilarek, M., Grabowska, I., Ciemerych, M. A., Dąbkowska, K., Szewczyk, K. W. Morphology and growth of mammalian cells in a liquid/liquid culture system supported with oxygenated perfluorodecalin. Biotechnol Lett. 35 (9), 1387-1394 (2013).
  18. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Curr Issues Mol Biol. 42, 473-518 (2021).
  19. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  20. Arvikar, S. L., Steere, A. C. Lyme arthritis. Infect Dis Clin North Am. 36 (3), 563-577 (2022).
  21. RNAscope multiplex fluorescent reagent kit v2 user manual. , Advanced Cell Diagnostics Inc. Newark, CA. (2022).
  22. Feng, J., Wang, T., Zhang, S., Shi, W., Zhang, Y. An optimized SYBR Green i/pi assay for rapid viability assessment and antibiotic susceptibility testing for Borrelia burgdorferi. PLoS One. 9 (11), e111809(2014).
  23. De Buys, M., Moodley, K., Cakic, J. N., Pietrzak, J. R. T. Staphylococcus aureus colonization and periprosthetic joint infection in patients undergoing elective total joint arthroplasty: A narrative review. EFORT Open Rev. 8 (9), 680-689 (2023).
  24. Ross, J. J. Septic arthritis of native joints. Infect Dis Clin North Am. 31 (2), 203-218 (2017).
  25. Kwon, H. -K., Yu, K. E., Lee, F. Y. Construction and evaluation of a clinically relevant model of septic arthritis. Lab animal. 52, 11-26 (2022).
  26. Carrel, M., Perencevich, E. N., David, M. Z. USA300 methicillin-resistant Staphylococcus aureus, United States, 2000-2013. Emerg Infect Dis. 21 (11), 1973-1980 (2015).
  27. Parlet, C. P., Brown, M. M., Horswill, A. R. Commensal staphylococci influence Staphylococcus aureus skin colonization and disease. Trends Microbiol. 27 (6), 497-507 (2019).
  28. Bünter, J. P., et al. Wild-type AGR-negative livestock-associated MRSA exhibits high adhesive capacity to human and porcine cells. Res Microbiol. 168 (2), 130-138 (2017).
  29. Patel, H., Rawat, S. A genetic regulatory see-saw of biofilm and virulence in MRSA pathogenesis. Front Microbiol. 14, 1204428(2023).
  30. Soong, G., et al. Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus adaptation to human keratinocytes. mBio. 6 (2), e00289-e00315 (2015).
  31. Ni, F., Zhang, Y., Peng, X. Correlation between osteoarthritis and monocyte chemotactic protein-1 expression: A meta-analysis. J Orthop Res. 15, 516(2020).
  32. Tsai, P. H., Liou, L. B. Effective assessment of rheumatoid arthritis disease activity and outcomes using monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) and disease activity score. Int J Mol Sci. 25 (21), 11374(2024).
  33. Boyce, B. F., Xing, L. Biology of rank, rankl, and osteoprotegerin. Arthritis Res Ther. 9 (Suppl 1), S1(2007).
  34. Asano, T., et al. Soluble RANKL is physiologically dispensable but accelerates tumour metastasis to bone. Nat Metab. 1 (9), 868-875 (2019).
  35. Kanzaki, H., et al. Soluble RANKL cleaved from activated lymphocytes by tnf-α-converting enzyme contributes to osteoclastogenesis in periodontitis. J Immunol. 197 (10), 3871-3883 (2016).
  36. Zahan, O. M., Serban, O., Gherman, C., Fodor, D. The evaluation of oxidative stress in osteoarthritis. Med Pharm Rep. 93 (1), 12-22 (2020).
  37. Ozcamdalli, M., et al. Comparison of intra-articular injection of hyaluronic acid and N-acetyl cysteine in the treatment of knee osteoarthritis: A pilot study. Cartilage. 8 (4), 384-390 (2017).
  38. Kim, H. R., Kim, K. W., Kim, B. M., Lee, K. A., Lee, S. H. N-acetyl-l-cysteine controls osteoclastogenesis through regulating Th17 differentiation and RANKL production in rheumatoid arthritis. Korean J Intern Med. 34 (1), 210-219 (2019).
  39. He, T., et al. Efficacy of n-acetylcysteine as an adjuvant therapy for rheumatoid arthritis: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Br J Hosp Med (Lond). 85 (11), 1-16 (2024).
  40. Tsikas, D., Mikuteit, M. N-acetyl-l-cysteine in human rheumatoid arthritis and its effects on nitric oxide (NO) and malondialdehyde (mda): Analytical and clinical considerations. Amino Acids. 54 (9), 1251-1260 (2022).
  41. Yeh, Y. T., Liang, C. C., Chang, C. L., Hsu, C. Y., Li, P. C. Increased risk of knee osteoarthritis in patients using oral N-acetylcysteine: A nationwide cohort study. BMC Musculoskelet Disord. 21 (1), 531(2020).
  42. Kaneko, Y., et al. Oral administration of N-acetyl cysteine prevents osteoarthritis development and progression in a rat model. Sci Rep. 9, 18741(2019).
  43. Coleman, M. C., et al. Sci Transl Med. 10 (427), eaan5372(2018).
  44. Drehmer, D., et al. Nitric oxide favours tumour-promoting inflammation through mitochondria-dependent and -independent actions on macrophages. Redox Biol. 54, 102350(2022).
  45. Fang, F. C., Vázquez-Torres, A. Reactive nitrogen species in host-bacterial interactions. Curr Opin Immunol. 60, 96-102 (2019).
  46. Winyard, P. G., et al. Measurement and meaning of markers of reactive species of oxygen, nitrogen and sulfur in healthy human subjects and patients with inflammatory joint disease. Biochem Soc Trans. 39 (5), 1226-1232 (2011).
  47. Xue, M., et al. Endogenous MMP-9 and not MMP-2 promotes rheumatoid synovial fibroblast survival, inflammation and cartilage degradation. Rheumatology (Oxford). 53 (12), 2270-2279 (2014).
  48. Piacenza, L., Zeida, A., Trujillo, M., Radi, R. The superoxide radical switch in the biology of nitric oxide and peroxynitrite. Physiol Rev. 102 (4), 1881-1906 (2022).
  49. Dikalov, S. I., Mayorov, V. I., Panov, A. V. Physiological levels of nitric oxide diminish mitochondrial superoxide. Potential role of mitochondrial dinitrosyl iron complexes and nitrosothiols. Front Physiol. 8, 907(2017).
  50. Krenn, V., et al. Grading of chronic synovitis: A histopathological grading system for molecular and diagnostic pathology. Pathol Res Pract. 198 (5), 317-325 (2002).
  51. Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Vet Pathol. 52 (5), 819-826 (2015).
  52. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: Classification, update, and measurement of outcomes. J Orthop Surg Res. 11, 19(2016).
  53. Felson, D. T., et al. Essential fatty acids and osteoarthritis. Arthritis Care Res (Hoboken). 76 (6), 796-801 (2024).
  54. Jarraya, M., et al. Prevalence of intra-articular mineralization on knee computed tomography: The multicenter osteoarthritis study. Osteoarthritis Cartilage. 31 (8), 1111-1120 (2023).
  55. Rai, M. F., Cai, L., Zhang, Q., Townsend, R. R., Brophy, R. H. Synovial fluid proteomics from serial aspirations of ACL-injured knees identifies candidate biomarkers. Am J Sports Med. 51 (7), 1733-1742 (2023).
  56. Rivellese, F., et al. Rituximab versus tocilizumab in rheumatoid arthritis: Synovial biopsy-based biomarker analysis of the phase 4 R4RA randomized trial. Nat Med. 28 (6), 1256-1268 (2022).
  57. Paggi, C. A., Teixeira, L. M., Le Gac, S., Karperien, M. Joint-on-chip platforms: Entering a new era of in vitro models for arthritis. Nat Rev Rheumatol. 18 (4), 217-231 (2022).
  58. Li, Z. A., et al. Synovial joint-on-a-chip for modeling arthritis: Progress, pitfalls, and potential. Trends Biotechnol. 41 (4), 511-527 (2023).
  59. Thompson, C. L., et al. Human vascularised synovium-on-a-chip: A mechanically stimulated, microfluidic model to investigate synovial inflammation and monocyte recruitment. Biomed Mater. 18 (6), acf976(2023).
  60. Thangadurai, M., Sethuraman, S., Subramanian, A. A 2d inflammatory co-culture model for investigating synovial fibroblast and macrophage interactions in rheumatoid arthritis. Sci Rep. 15 (1), 30105(2025).
  61. Rosso, F., Rossi, R., Cottino, U., Bonasia, D. E. Tibial tubercle osteotomy for patellofemoral malalignment and chondral disease provided good outcomes: A systematic review. J ISAKOS. 7 (2), 78-86 (2022).
  62. Kleuskens, M. W. A., Van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. An ex vivo human osteochondral culture model. J Orthop Res. 39 (4), 871-879 (2021).
  63. Schwab, A., et al. Ex vivo culture platform for assessment of cartilage repair treatment strategies. ALTEX. 34 (2), 267-277 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи