Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оральная гаважа у новорождённых мышиных щенков и функциональная оценка целостности барьера кишечника с помощью камер Уссинга

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69751

⸱

9 января 2026 г.

 ,  ,  , 
1INSERM U1149, Center of Research on Inflammation, Université Paris Cité, 2CHRU Nancy, IHU Infiny

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье описывается: (1) пероральная доставка тестовых молекул неонатальным мышам уже с DOL 6; и (2) экс-виво оценку функции эпителиального барьера толстой кишки в биопсиях от DOL 10 до отлучения (DOL 20) детёнышей путём оценки парацеллюлярной и трансклеточной проницаемости с использованием камер Уссинга.

Аннотация

Растущие данные подчёркивают важность первых 1000 дней жизни для формирования оси микробиома кишечника. Это раннее окно жизненно важно для установления долгосрочных физиологических траекторий и иммунологических адаптаций, что потенциально влияет на восприимчивость к заболеваниям, связанным с дисбиозом и дисфункцией барьеров. Более глубокое понимание лежащих механизмов требует всесторонней оценки ключевых физиологических параметров, включая парацеллюлярную и трансклетточную проницаемость неонатального кишечника. Оценка этих параметров крайне важна для выяснения, как раннее воздействие экзогенных молекул может влиять на целостность кишечника и долгосрочные результаты для здоровья. Поэтому первая часть этой статьи описывает пероральное введение интересующих молекул у мышиных щенков с самого дня жизни 6, при этом минимизируя стресс, риск травм и каннибализм. Смазанные иголки с округлым наконечником 24G используются для выглаждения щенков мышей весом не менее 2,5 г. Вторая часть описывает ex vivo оценку парацеллюлярной и трансклетварной проницаемости с помощью анализов камеры Уссинга на образцах толстой кишки у щенков между DOL-10 и отлучением от груди. Безконтактные ползунки, адаптированные для небольших биопсий, используются в сочетании с камерами Уссинга для монтажа образцов новорождённой толстой кишки. Парацеллюльный зонд FITC-Dextran 4 кДа и трансклеточный маркер хрен пероксидаза 44 кДа типа VI добавляются в апикальный компартмент системы в начале анализа. Образцы собираются в базолатеральном компартменте через 0, 30, 60, 90 и 120 минут для количественной оценки прохода зонда. Прохождение обоих маркеров количественно измеряется напрямую (FITC) и косвенно (HRP) с помощью считывателя пластин, рассчитывается с использованием стандартных кривых и выражается в виде потока.

Введение

Целостность барьера кишечника играет фундаментальную роль в поддержании общего здоровья, координируя слизистый иммунный ответ и регулируя селективную проницаемость кишечного эпителия. Эта барьерная система контролирует прохождение питательных веществ, предотвращая передачу патогенов, антигенов и токсинов в системнуюциркуляцию 1. Хроническое нарушение этого интерфейса, связанное с повышенной проницаемостью кишечника, обычно называемое «дырявым кишечником», теперь идентифицируется не только как следствие, но и как фактор хронических воспалительных состояний и ряда патологийвнекишечника.

Например, было показано, что нарушение функции барьера кишечника является ключевым компонентом аутоиммунных и метаболических заболеваний, таких как воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), ювенильный идиопатический артрит (JIA) и диабет 1 типа (T1D). Это подчёркивает состояние кишечного барьера как ключевой биомаркер, а также как терапевтическую цель для предотвращения как ранней инициации патофизиологических процессов и предотвращения прогрессирования острого воспаления вхроническое состояние 3,4,5,6.

В этом контексте неонатальный период представляет собой уникальное и высокочувствительное окно развития, в течение которого формирование и созревание интерфейса кишечника и микробиоты глубоко влияют на здоровье кишечника и системы на протяжении всейжизни 7. На этой ранней стадии кишечный эпителий и иммунная система проявляют повышенную чувствительность как к эндогенным, так и к экзогенным факторам, быстро растут и дифференцируются, одновременно адаптируясь к микробной колонизации и изменениям в питании. Нарушения, нарушающие целостность барьера кишечника в этот критический период развития, могут сыграть ключевую роль в появлении широкого спектра острых и хронических заболеваний в дальнейшем возрасте. К таким состояниям относятся иммунно-опосредованные заболевания, такие как пищевая аллергия, а также более тяжёлые хронические заболевания, такие как ВЗК, ИА и Типы 1D 7,8,9. Эти заболевания подчёркивают, что патофизиологические процессы часто начинаются рано, поскольку основное начало обычно происходит между детством и ранней взрослойжизнью 10,11. Поэтому понимание механизмов, регулирующих функцию барьера кишечника у новорождённых, крайне важно для разработки профилактических и терапевтических стратегий, направленных на снижение бремени многих хронических заболеваний.

В этом контексте существует острая потребность в надёжных, физиологически значимых инструментах для изучения целостности барьера кишечника, механизмов хронических заболеваний и воспаления, особенно в неонатальной среде. Такие инструменты должны позволять воспроизводить экспериментальные анализы, уже доказанные во взрослом контексте, не жертвуя точностью и эффективностью. Кроме того, становится всё более актуальным исследовать как краткосрочные, так и долгосрочные эффекты многих молекулярных кандидатов, представляющих интерес, которые, как ожидается, оказывают положительное или вредное влияние на гомеостаз кишечника в неонатальном контексте. Среди доступных инструментов пероральное введение гаваджа у новорожденных мышей представляет собой более чем надёжный способ доставки интересующих молекул на определённой стадии развития. Он позволяет проводить контролируемые исследования влияния различных биоактивных соединений, лекарств или микробных метаболитов на созревание кишечника и функцию барьера.

В первой части этой статьи описывается метод выделки мышиных детёнышей уже в День жизни (DOL) 6, позволяющий изучать вмешательства до, во время и после массового расширения численности видов кишечной микробиоты, вызванного диверсификацией пищи. Таким образом, этот метод позволяет проводить лонгитюдный анализ эффекта лечения на здоровье кишечника по мере роста и развития щенков.

Во второй части этой статьи, дополняя этот подход, экс-виво оценка функции эпителиального барьера толстой кишки с использованием камер Уссинга предоставляет чувствительную и количественную меру характеристик проницаемости. Оценка как парацеллюлярной, так и трансклеточной проницаемости в биопсии толстой кишки у неонатальных мышей (например, щенков DOL 10) позволяет точно определить влияние нескольких ключевых кандидатов на целостность и функцию эпителиального барьера. Парацеллюлярный транспорт — это по сути пассивный механизм, происходящий через межклеточное пространство эпителиального слоя. Он позволяет пропускать мелкие растворённые вещества, движимые электрохимическими и осмотическими градиентами, от просвета к базолатеральной стороне. Этот механизм в основном регулируется белками семейства узких соединений, такими как клаудины и окклюдин. Трансклеточный транспорт, напротив, является активным механизмом, позволяющим поглощать более крупные растворённые вещества и осуществляться через эпителиальные клетки через определённые каналы, носители и насосы.

Флуоресцеин изотиоцианат (FITC)-декстран (4 кДа) преимущественно подвергается парацеллюлярному транспорту из-за своего размера, тогда как пероксидаза хрена (HRP; 44 кДа) селективно передаётся на базолатеральную сторону по трансклюлюлярным путям. Количественная оценка этих неэндогенных маркеров позволяет четко оценить парацеллюлярную и трансклетварную проницаемость соответственно. Анализ камеры Уссинга с FITC и HRP сохраняет архитектуру тканей и позволяет в реальном времени измерять соответственно парацеллюлярную и трансклетточную проницаемость любого сегмента кишечника. Это сочетание неонатального гаважа и анализа камеры Уссинга предлагает мощную стратегию для изучения того, как определённые молекулы влияют на функцию кишечного барьера как немедленно, так и в течение длительного времени, предоставляя стратегии по снижению воспаления и профилактике хронических заболеваний с самых ранних стадий жизни.

В итоге этот протокол описывает две взаимодополняющие экспериментальные процедуры, позволяющие: (1) вводить интересующие молекулы в ранний неонатальный период детёнышкам мышей (шаг 1); (2) оценка как пара- так и трансклеточной проницаемости в сегментах кишечника от неонатальных до отлучающихся щенков с использованием камер Уссинга (шаги 2-6).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных проводились в соответствии с действующими национальными правилами и утверждён Министерством высшего образования, исследований и инноваций Франции через платформу APAFIS (номер авторизации: APAFIS#23855) и гранты от Агентства национальных исследований (ANR): 11-IDEX-0005-02, ANR-24-CE15-7152 и 18-IDEX-0001. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Гаваж новорождённых мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий метод адаптирован из Фрэнсиса и др. 12. Хотя изначальный протокол разрешал давать щенков мышей уже с DOL 2, гаваж здесь не проводился до DOL 6, так как технические требования в более раннем возрасте значительно усложняют процесс. Кроме того, использование молодых щенков усложняет исследования, так как увеличивает риск потери животных в первые дни лечения, что требует увеличения количества когорт.

  1. Подготовка и установка решений для гаваджа
    1. Взвесьте каждого щенка по отдельности.
    2. Отрегулировать концентрацию и объём раствора так, чтобы общий объём не превышал 20 мкл на грамм массы тела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В стандартных условиях щенки мышей редко весят меньше 2,5 г при DOL 6.
    3. Промыйте иглу с круглым наконечником объемом 24 г, тщательно промывая её деионизированной водой, затем 70% этанола с помощью шприца, а затем автоклавируете.
      ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется использовать отдельную иглу для кормления для каждой группы обработки, чтобы предотвратить перекрёстное загрязнение.
    4. Положите чистые бумажные полотенца на дезинфицированную грелку, установленную на ~38 °C.
    5. Перед открытием клеток стирайте перчатки с 70% этанолом, чтобы ограничить передачу запаха щенкам и снизить риск каннибализации.
    6. Перенесите плотину в отдельную клетку в другой комнате, чтобы снизить стресс, вызванный возможными вокализациями щенков.
    7. Натирайте очищенные перчатки материалами для гнезда, чтобы минимизировать риск передачи внешних запахов щенкам во время гавери.
    8. Измерьте длину между ксифовидным отростком (нижний конец грудины) и мордой щенка, чтобы отметить максимальную длину введения на иглу для кормления (рисунок 1A,B).
  2. Внутрипищеводная всадка у мышиных детёнышей
    1. Прикрепите головку иглы к шприцу стерильным образом и заберите больше нужного объёма раствора, чтобы ввести весь необходимый объём без риска введения пузырьков воздуха, так как они значительно увеличивают риск аспирации.
    2. Используя большой и указательный палец недоминантной руки, аккуратно зажмите кожу между лопатками, чтобы поднять щенка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не снимайте слишком много кожи со спины щенка, так как это может вызвать удушье.
    3. Держите щенка почти в горизонтальном положении и аккуратно вводите иглу для кормления в ротовую полость, продвигая её перпендикулярно глотке, пока она не достигнет задней части горла (рисунок 1C).
    4. Сохраняя тот же угол и глубину, сдвините иглу вправо или влево, чтобы избежать языка.
    5. Медленно регулируйте угол иглы, аккуратно наклоняя голову щенка назад, пока шприц, голова и спина не будут выровнены, при этом голова будет слегка наклонена назад (рисунок 1D).
    6. Не прикладывая давления, позволяйте шприцу медленно опускаться под собственным весом, пока максимальная метка введения не окажется близко к уровню морды или не достигнет его уровня (рисунок 1E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если возникает сопротивление, аккуратно поверните шприц, перекатывая его между пальцами, чтобы облегчить спуск. Если шприц всё ещё не продвигается, попробуйте отрегулировать угол введения или возобновить процедуру с помощью игли, смазанной раствором для подачи. Игла не должна оставаться вставленной дольше 20 секунд, чтобы избежать удушья.
    7. Когда максимальная отметка вставки достигнута или близкаясь, быстро раздайте желаемый объём. Если при подаче объёма сопротивление встречается, проверьте выравнивание шприца-головки и назад и немного отрегулируйте глубину вставки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется быстрое выдаление объёма, так как длительное введение иглы значительно увеличивает риск удушья, борьбы и возможных травм животного.
    8. После правильного объёма аккуратно отведите иглу под тем же углом, что и для введения.
    9. Положите щенка на бумажное полотенце, которое ранее положили на грелку, и следите за восстановлением. Нормальный ритм дыхания должен вернуться менее чем через 20 секунд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Появление пузырьков из сноута или рта животного указывает на аспирацию и требует немедленной эвтаназии у щенков младше DOL 14. Наличие очень малого количества крови во рту животного, вызванного поражением между рохоткой и пищеводом, требует мониторинга животного, но не систематической эвтаназии. Если выздоровление щенка неизвестно, положите его на бок. Если он не попытается исправиться, немедленно усыпить.
    10. Когда животное будет подтверждено, поместите щенка обратно в гнездо и объедините его с матерью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: До DOL 10 щенки имеют низкую подвижность и могут оставаться на грелке, пока не завершится обработка всех щенков в клетке. Старших щенков нельзя оставлять без присмотра на площадке, так как они могут попытаться сбежать.

Рисунок 1
Рисунок 1: Гаваж новорождённого мышиного щенка на DOL 10. Расстояние между мордой и ксифовидным отростком измеряется (A), что позволяет отметить максимальную длину ввода на игле для кормления (B). Игла для кормления вводится в левую или правую часть полости рта (C). Достигнув задней части горла, угол иглы регулируется до того момента, когда шприц, голова и спина животного выровняются (D). Игле оставляют плавно скользить вниз без сопротивления, пока максимальная метка для ввода не будет почти достигнута или достигнута (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

2. Эвтаназия и извлечение кишечника у новорождённых мышей

  1. Проведите эвтаназию соответствующим методом, установленным национальным законодательством.
    ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется обезглавливание щенков до DOL 10 и вывих шейки матки детёнышей возраста выше DOL 10. Эвтаназия с помощьюCO2 или анестетиков не рекомендуется, так как щенки демонстрируют высокую толерантность к этим методам.
  2. Поместите усыпленное животное под бинокулярный микроскоп.
  3. Нанесите 70% этанола на брюшной полосы животного.
  4. С помощью щипцов зажмите кожу брюшной полости и подлежащую брюшину, а также сделайте большой поперечный разрез брюшной полости с помощью тонких ножниц (перпендикулярно рострально-хвостовой оси) без разрезания кишечника.
  5. Аккуратно вставьте тонкие ножницы в разрез и удлините разрез вбок через брюшину с обеих сторон.
  6. С помощью щипцов и тонких ножниц разрезают как верхнюю, так и нижню части брюшины — от грудной до нижней части таза (рисунок 2A).
  7. Определите дистальную часть толстой кишки и сделайте разрез параллельно её оси, ближе к прямой кишке.
  8. Сделайте разрез в конечной/ректальной части толстой кишки, чтобы её мобилизовать.
  9. Аккуратно потяните кишку и двигайтесь к слепой груди, удаляя возможные кусочки соединительной или жировой ткани.
  10. Освободите кишку от брюшка, разрезав в месте илеоцекального соединения, выше слепой груди (рисунок 2B).
  11. Отбросьте кекумы и первые несколько миллиметров проксимальной толстой кишки, затем возьмите один-два образца из проксимальной толстой кишки, которые больше размера апертуры ползунка Уссинга (рисунок 2C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется сделать два больших биопсии, так как неонатальная кишечница крайне хрупкая и может легко быть порвана, разрвана или проколота во время очистки и установки.
  12. С закрытыми ножницами аккуратно удалите кал из расплющённой биопсии, приложив лёгкое давление и скользя от проксимальной части к дистальной стороне.
  13. Поместите опустошённую часть толстой кишки в ледяной буфер KRB.

Рисунок 2
Рисунок 2: Вскрытие толстой кишки щенка DOL 10. Эпидермис и брюшин детёныша разрезаются и раскрываются в два этапа, чтобы избежать непроизвольного разреза толстой кишки, пока вся брюшная полость не будет обнажена (A). Кишечник освобождается от брюшной полости через первый разрез дистальной/прямой кишки, затем второй разрез над слепотой (B). Начальные миллиметры проксимальной толстой кишки отбрасываются, и берутся один-два образца толстой кишки, превышающих размер апертуры ползунков Уссинга (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Анализ проницаемости толстой кишки с использованием биопсии мышей в камерах Уссинга

  1. Подготовка анализа
    1. За день до дня эксперимента Уссинга. Для обеспечения оптимальных условий для анализа рекомендуется подготовить несколько растворов за день до эксперимента. Эти решения подготовлены в соответствии с инструкциями в таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: в следующих таблицах указаны необходимые суммы для 12 камер Уссинга, при этом KRB в 10 раз превышает для возможности аквоцитирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: раствор KRB 10x можно хранить при 4 °C до 6-12 месяцев.
    2. В день эксперимента, за 30 минут до эвтаназии животных:
      1. Подготовьте 400 мл буфера KRB, как указано в таблице 2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: KRB 10x, деионизированная вода и бикарбонат должны быть предварительно смешаны и пузырьки с использованием углеводного газа (95%O2; 5%CO2) в течение 15 минут перед добавлением CaCl2, чтобы избежать осадков.
      2. Используя карбогенную систему (95%O2; 5%CO2), пузырьте свежий буфер KRB на 15 минут.
      3. Разделите 400 мл буфера KRB на две части и подготовьте 200 мл Кребс-глюкозы, 200 мл Кребс-Маннитола и раствор HRP, как описано в таблице 3.
    3. Настройка системы Уссинг
      1. Предварительно нагрейте систему Уссинг до 37 °C.
      2. Предварительно собирайте камеры следующим образом:
        1. Поднимите защёлки каждого отверстия.
        2. Разместите камеры в их слотах, не затягивая систему.
        3. Вставьте две газоподающие трубки в каждую часть камер.
        4. Введите четыре электрода в передние отверстия (если есть — здесь не описано) или запечатайте четыре отверстия конусами по 200 мкл, заполненными клеем, перед экспериментом.
        5. Поставьте лотки под камеры в ожидании возможных протечек.
      3. Крепление тканей
        1. Слегка высушите ранее очищенный образец кишки бумажным полотенцем, чтобы удалить лишнюю влагу.
        2. Поместите кусочек толстой кишки под увеличительное стекло и очень аккуратно вставьте одно из лезвий тонких ножниц в световую часть, чтобы разрезать её (рисунок 3A).
          ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез можно сделать одним движением, когда ножницы полностью вставлены. Используемая секция двоечка должна быть максимально прямой, избегая кручива.
        3. Используя тонкие щипцы, закрепите ткань на белой части слайдера, при этом световая часть поднята вверх, к оператору. Ткань должна быть лишена следов жира, фекалий, морщин, перфораций и порезов и широко покрывать отверстие (рисунок 3B).
        4. Закройте слайдер под бинокулярным микроскопом и проверьте возможное смещение ткани. Небольшая деформация ткани должна быть заметна при приложении давления на слайдер, что указывает на плотную закрытость ползунка.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Установите ползунки в камеру Уссинга (рисунок 4) и начните этап уравновешения по отдельности, как только он будет готов, чтобы предотвратить обезвоживание образца.
        5. Сохраняя лёгкое давление на слайдер, чтобы он оставался закрытым, вставьте его в камеру Уссинга, убедившись, что прозрачная часть ползунка направлена влево.
        6. Закройте обе защёлки и затяните винт, расположенный справа, пока патронник не станет герметичным и ползунок не сможет двигаться.
      4. Финальная настройка и балансировка
        1. Добавьте 4 мл Кребс-Маннитола в левый (апикальный) отсек камеры.
        2. Добавьте 4 мл Кребса-глюкозы в правый (базолатеральный) отсек камеры.
        3. Положите небольшой кусочек парапленки между обоими отделениями, чтобы избежать перекрёстного загрязнения.
        4. Откройте впуск газа (95%O2 / 5%CO2) и установите выход в диапазоне 1-2 пузырьков/с.
        5. Удалите крупные пузырьки, расположенные на ткани или в системе, с помощью пипетки Пастера.
        6. Дайте системе балансировать до 20-30 минут.
        7. Приготовьте раствор FITC 4kDa + HRP + Mannitol, как описано в таблице 4.
  2. Начало анализа проницаемости толстой кишки
    1. После достижения равновесия системы замените 200 мкл Кребса-Маннитола из апикального компартмента (слева) на 200 мкл раствора FITC 4Kd + HRP + Маннитола и немедленно запускайте таймер. Промывайте кончик, плавно двигаясь вверх и вниз в отсеке, и выбрасывайте наконечник между камерами.
    2. Для каждой камеры соберите 2 x 100 мкл (дубликатов) из базального (правого) отсека и поместите объёмы в чёрную пластину с 96 лунками. Накройте пластину алюминиевой фольгой, чтобы избежать фотодеградации FITC, присутствующего в пластине.
    3. Немедленно замените ранее собранные 200 мкл на 200 мкл свежего Кребс-Глюкозы.
    4. Повторяйте шаги (2) и (3) каждые 30 минут до достижения 2-часовой временной точки, чтобы получить временные точки: T0, T30, T60, T90 и T120.
    5. Запечатайте пластину алюминиевой фольгой, чтобы избежать фотодеградации FITC, и переходите к количественной оценке FITC.
MgCl2 1M
МВ (г/моль)Итоговый объём = 20 млИтоговая концентрация
milli-Q H2OДовести к финальному тому
MgCl2, 6H2O203.34,066 г1 М
KRB 10X
МВ (г/моль)Финальный том = 1LИтоговая концентрация
milli-Q H20Довести к финальному тому
NaCl58.4470 г1,198 м
KCl74.553,4 г45,6 мМ
Na2HPO 4, 2H2O177.991 г5,62 мМ
2PO4 , 2H2O156.012,3 г14,7 мМ
MgCl2 1M5 мл5 мМ
Бикарбонат 750 мМ
МВ (г/моль)Итоговый объём = 250 млИтоговая концентрация
milli-Q H2OДовести к финальному тому
NaHCO38415,75 г750 мМ
CaCl2 2M
МВ (г/моль)Итоговый объём = 50 млИтоговая концентрация
milli-Q H2OДовести к финальному тому
CaCl211111,098 г2 М

Таблица 1: Подготовка раствора за день до эксперимента Уссинга.

Буфер KRB (400 мл)
ОбъёмИтоговая концентрация
KRB 10X40 мл1X
H2O (милли-Q)352 мл
Бикарбонат 750 мМ8 мл15 мМ
CaCl2 2M240 мкл1,2 мМ

Таблица 2: Подготовка буфера KRB в день эксперимента Уссинга.

Кребс-Глюкоза/Маннитол (по 200 мл каждого)
Итоговый объём = 200 млИтоговая концентрация
Буфер KRBДовести к финальному тому
Глюкоза360 мг10 мМ
или
Маннитол364 мг10 мМ
Решение для HRP
Конечный объём = 1480 мклИтоговая концентрация
Кребс-МаннитолДовести к финальному тому
HRP13 мг8,8 мг/мл

Таблица 3: Подготовка растворов Кребса-глюкозы/маннитола и HRP в день эксперимента Уссинга.

FITC 4kDa + HRP + Маннитол раствор
Для 12 камерОбъёмИтоговая концентрация
СРП (8,8 мг/мл)1345 мкл
Кребс-Маннитол1155 мкл
FITC 4Kd166,6 мг16,66 мМ

Таблица 4: Подготовка раствора FITC 4 кДа + HRP + маннитола в день эксперимента Уссинга.

Рисунок 3
Рисунок 3: Монтаж образца из толстой кишки у щенка DOL 9. Одно лезвие тонких ножниц вставляется в люминальный сегмент образца, чтобы разрезать его одним движением (A). Открытый сэмпл установлен на апертуре ползунка Уссинга с световой стороной, направленной к оператору (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Изображение полностью подготовленных камер Уссинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Оценка параклеточной проницаемости толстой кишки с помощью количественной оценки FITC

  1. Подготовка стандартов FITC
    1. Разведите раствор FITC 4Kd + HRP + Mannitol в Krebs-Glucose для получения стандартных разбавлений, как описано в таблице 5 и рисунке 5.
    2. Отложите 2 x 100 мкл (дубликат) каждого стандартного разбавления от n°1 до n°7 в пластину. Запечатайте пластину алюминиевой фольгой, чтобы защитить от света до начала показания пластины.
  2. Сбор данных: с помощью считывателя пластин установите длину волны возбуждения на 485 нм и излучение на 535 нм и как можно скорее прочитайте пластину.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется считывать пластину как с оптимальным коэффициентом усиления, так и с ручной установкой усиления, чтобы облегчить сравнение межпластинных значений и позволить интерполяцию данных, если при разбавлении стандартов была допущена ошибка.
  3. Хранение пластин: После хранения данных FITC храните пластины запечатанными алюминиевой фольгой при температуре 4 °C на ночь, если планируется измерять HRP в ближайшие дни, или заморозить при -80 °C для длительного хранения.

Рисунок 5
Рисунок 5: Визуальное представление стандартной подготовки разбавлений FITC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой рисунка.

Стандартные разбавления FTIC
N°1234567
Разбавление1:10000 стандартного раствора FITC1:2 разбавления No11:2 разбавления No°21:10 разбавления No11:2 разбавления No41:2 разбавления No5
Кребс-Глюкоза
FITC (μM)1.660.830.4150.1660.0830.04150

Таблица 5: Подготовка стандартных разбавлений FITC в день эксперимента Уссинга.

5. Оценка трансклеточной проницаемости колонки с помощью количественной оценки HRP

  1. За день до дня количественного анализа HRP:
    1. Обеспечьте оптимальные условия в день анализа; За день до эксперимента требуется подготовка нескольких растворов. Эти решения подготовлены как описано в таблице 6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих таблицах указаны необходимые количества для одной пластины с 96 скважинами. Стандарты HRP можно использовать и хранить при -20 °C или -80 °C в течение нескольких месяцев. Из-за нестабильности используйте только свежие буферы из карбоната/бикарбоната.
    2. После подготовки раствора антитела против HRP немедленно покрыть микропластину Clear Flat Bottom High Binding с 96 лунками с 100 мкл на каждую яму. Завернуть её в алюминиевую фольгу и инкубировать ночью при 4 °C.
  2. В день количественного анализа HRP:
    1. Подготовьте 5% блокирующий буфер BSA, как описано в таблице 7.
    2. Выбросьте содержимое тарелки и помойте 280 мкл PBS Tween 4 раза, встряхивая 1 минуту при 350 об/мин между промывками.
    3. Добавьте 200 мкл блокирующего буфера BSA в каждую скважину.
    4. Запечатайте пластину алюминиевой фольгой и инкубуйте на шейкере при 500 об/мин минимум 1 час. Тем временем разморозьте и разведите образцы (1:10 или 1:50) и подготовьте стандартные разбавления, как описано в таблице 8.
    5. Выбросьте содержимое тарелки и помойте 280 мкл PBS Tween 4 раза, встряхивая 1 минуту при 350 об/мин между промывками.
    6. Добавьте 50 мкл стандартных или разбавленных образцов, запечатайте пластину и инкубирайте при 300 об/мин в течение 1 часа при RT.
    7. Во время инкубации принесите реагенты QuantaBlu в RT и подготовьте рабочее решение, как описано в таблице 9.
    8. Выбросьте содержимое тарелки и помойте 280 мкл PBS Tween 4 раза, встряхивая 1 минуту при 350 об/мин между промывками.
    9. Добавьте 100 мкл рабочего раствора QuantaBlu в каждую скважину при RT или 37 °C (в среднем 1,5–90 минут, 30 минут).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прогресс анализа может сопровождаться появлением сильной синей флуоресценции под источником ультрафиолетового света.
    10. Добавьте 100 мкл раствора QuantaBlu Stop Solution в каждую скважину, чтобы остановить активность пероксидазы. Запечатайте пластину и инкубуйте 10 минут при RT при перемешивании при 350 об/мин.
    11. С помощью считывателя пластин установите длину волны возбуждения на 315 нм, а излучение — на 470 нм. Прочитайте табличку как можно скорее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется считывать пластину как с оптимальным коэффициентом усиления, так и с ручной установкой усиления, чтобы облегчить сравнение межпластинных значений и позволить интерполяцию данных, если при разбавлении стандартов была допущена ошибка. В качестве альтернативы набору QuantaBlu Ftorogenic Peroxidase Substrate можно использовать и другие субстраты пероксидазы, такие как тетраметилбензидин (измеряемые при 450 или 650 нм с использованием стоп-раствора или без), но использование этой альтернативы происходит за счёт снижения чувствительности.
Решение BSA
МВ (г/моль)Итоговый объём = 12,7 млИтоговая концентрация
Milli-Q H2OДовести к финальному тому
BSA664301,27 г100 мг/мл
Кребс-Глюкоза + BSA
МВ (г/моль)Итоговый объём = 30 млИтоговая концентрация
Кребс-ГлюкозаДовести к финальному тому
Решение BSA60 мкл0,2 мг/мл
PBS Teen
МВ (г/моль)Итоговый объём = 500 млИтоговая концентрация
PBS 1XДовести к финальному тому
Tween-20500 мкл0.1%
Sol карбоната натрия.
МВ (г/моль)Итоговый объём = 3,22 млИтоговая концентрация
Milli-Q H2OДовести к финальному тому
Na2CO3105.9934,13 мг0,1 м
Сол-бикарбонат натрия.
МВ (г/моль)Итоговый объём = 12,7 млИтоговая концентрация
Milli-Q H2OДовести к финальному тому
NaHCO384106,68 мг0,1 м
pH буфера покрытия 9,6
Финальный том ≈ 11 мл
Sol карбоната натрия.2,58 мл
Сол-бикарбонат натрия.Добавьте до pH = 9,6 (~8,4 мл)
Стандарт HRP 10 мкм
Начальная концентрацияИтоговый объём = 5 млИтоговая концентрация
Кребс-ГлюкозаДовести к финальному тому
Решение для HRP8,8 мг/мл50 мкл0,088 мг/мл
Решение BSA100 мг/мл10 мкл0,2 мг/мл
1,5 нм Стандарт HRP
Начальная концентрацияИтоговый объём = 15 млИтоговая концентрация
Кребс-ГлюкозаДовести к финальному тому
Стандарт HRP 2,0 мкм0,088 мг/мл2,25 мкл13,2 нг/мл
Решение BSA0,2 мг/мл3 мкл40 нг/мл
Анти-HRP-раствор
Начальная концентрацияКонечный объём = 10 млИтоговая концентрация
Буфер покрытияДовести к финальному тому
Анти-HRP антитела5,6 мг/мл8,93 мкл5 мкг/мл

Таблица 6: Подготовка раствора за день до эксперимента HRP.

Блокирующий буфер BSA
Начальная концентрацияИтоговый объём = 25 млИтоговая концентрация
PBS 1X12,5 мл
Решение BSA100 мг/мл12,5 мл50 мг/мл

Таблица 7: Подготовка буфера с блокировкой BSA в день эксперимента HRP.

СтандартКребс-Глюкоза + BSA1,5 нм Стандарт HRPFmol HRP/50 мкл
Blank1000 мкл0 мкл0
1993,75 мкл6,25 мкл0.09375
2987,5 мкл12,5 мкл0.1875
3975 мкл25 мкл0.375
4950 мкл50 мкл0.75
5900 мкл100 мкл1.5
6850 мкл150 мкл2.25
7800 мкл200 мкл3
8700 мкл300 мкл4.5
9600 мкл400 мкл6
10400 мкл600 мкл9
11200 мкл800 мкл12

Таблица 8: Подготовка стандарта HRP в день проведения эксперимента HRP.

Рабочее решение QuantaBlu
Итоговый объём = 12 мл
Раствор субстрата QuantaBlu10,8 мл
Стабильный раствор пероксида QuantaBlu1,2 мл

Таблица 9: QuantaBlu рабочая подготовка раствора в день проведения эксперимента HRP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Стандартная кривая и количественная оценка концентрации скважины
Среднее значение заготовок вычиталось из каждой ямы пластины. С значениями поглощения по оси Y и концентрациями по оси X была создана стандартная кривая с использованием функции «Interpolate a standard curve» из GraphPad Prism. Если все стандартные точки выровнены, модель «Line» даёт наилучшие результаты. Альтернативно, модель «Сигмоидальная, 4 PL, X — это концентрация» предлагает большую гибкость и точность при нелинейной интерполяции с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Оральный гаваж позволяет многократно вводить точную, определённую дозу люминальной дозы отдельным неонатальным мышам. В отличие от этого, добровольное кормление, хотя и является жизнеспособной альтернативой, требует увеличенного времени введения на животное для получения меньшего количества соединения с пониженной точностьюдозирования 12. Кроме того, пероральная гаваж вмещает большие объёмы, чем возможны инъекционными путями, что способствует увеличению ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была выполнена при финансовой поддержке ANR-11-IDEX-0005-02 Laboratoire d'excellence INFLAMEX, премии от Fondation de l'avenir (2025, AP-RM-24-012) и грантов ANR Diab1GUT (ANR-24-CE15-7152). Исследование проводилось в рамках консорциума INFIBREX и получило поддержку инвестиционного плана «France 2030», запущенного французским правительством и реализованного Университетом Парижского Cité в рамках программы IdEx «Инициатива превосходства» (ANR-18-IDEX-0001). Мы с благодарностью выражаем признательность Технической платформе Ussing Chamber в Центре исследований воспаления за их неоценимую поддержку и выражаем особую благодарность Александре Виллемц и Мод Ле Галл за их экспертную помощь. Мы также хотим выразить искреннюю благодарность платформе Animal Facility при Центре исследований воспаления за их важную поддержку, особую благодарность Изабель Рено и Гийому Ансельме.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10 раз DPBS БЕЗ CA & CA MgДульбеккос14200091
Анти-HRP антителаСеверный биосайтGTX10183Моноклональная мышиная хрен пероксидаза IgG [2H11]
Бинокулярная лупаOlympus SZ61Спецификации не требуются.
Чёрная пластина с плоским дном с 96 колодцямиThermoFisher Scientific137101Пластины должны быть чёрными и адаптированы к флуоресцентным показаниям. Крышку нужно снимать во время чтения.
BSAMerckA4503
Мыши C57BL/6JРека Чарльз632C57BL/6J 
CaCl2Merck2382
Прозрачный 96-колодец с прозрачным плоским дном с высоким переплётомКорнинг9018
D-(+)-глюкозаMerckG8270 
Дистиллированный H2O
D-MannitolMerckM4125
Тонкие щипцыFST11445-12
Тонкие ножницыFST14058-09
FITC-Dextran 4KdFD4Лаборатории TdBЧувствительны к фотодеградации.
ГрелкаМинерв20 031 01
HRPMerckP8375
MgCl2, 6H2OMerckM2670 
Milli-Q H2O
P2300 EasyMount Ussing System и ПалатыФизиологические инструментыEM6-C-CEСистемы, камеры и слайдеры должны быть совместимы.
P2306 Уссинг-камерный слайдерФизиологические инструментыPI-P2306Доступны различные модели слайдеров для разных размеров и форм тканей.
Комплект субстрата для фторогенной пероксидазы QuantaBluThermoFisher Scientific15169
Многоразовые кормящие иглы с круглым кончикомFST18061-24Калибр 24, диаметр наконечника 1,25 мм, круглый наконечник. Необходимо промывать стерильной водой, этанол 70% и автоклавировать перед использованием.
Бикарбонат натрияMerckS6297
Карбонат натрияMerckS7795
СпектрофотометрTECAN Spark 10MДля использования 137101 чёрных пластин требуется считыватель пластин с верхней кнопкой.
Tween-20MerckP7949

Ссылки

  1. Di Vincenzo, F., Del Gaudio, A., Petito, V., Lopetuso, L. R., Scaldaferri, F. Gut microbiota, intestinal permeability, and systemic inflammation: A narrative review. Intern Emerg Med. 19 (2), 275-293 (2024).
  2. Mu, Q., Kirby, J., Reilly, C. M., Luo, X. M. Leaky gut as a danger signal for autoimmune diseases. Front Immunol. 8, 598(2017).
  3. Sorini, C., et al. Loss of gut barrier integrity triggers activation of islet-reactive T cells and autoimmune diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (30), 15140-15149 (2019).
  4. An, J., et al. The role of intestinal mucosal barrier in autoimmune disease: a potential target. Front Immunol. 13, 871713(2022).
  5. Picco, P., et al. Increased gut permeability in juvenile chronic arthritides: a multivariate analysis of the diagnostic parameters. Clin Exp Rheumatol. 18 (6), 773-778 (2000).
  6. Dunleavy, K. A., Raffals, L. E., Camilleri, M. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel disease: underpinning pathogenesis and therapeutics. Dig Dis Sci. 68 (12), 4306-4320 (2023).
  7. Borrego-Ruiz, A., Borrego, J. J. Early-life gut microbiome development and its potential long-term impact on health outcomes. Microbiome Res Rep. 4 (2), 20(2025).
  8. Di Costanzo, M., De Paulis, N., Biasucci, G. Butyrate: A link between early life nutrition and gut microbiome in the development of food allergy. Life (Basel). 11 (5), 384(2021).
  9. Kindgren, E., Ahrens, A. P., Triplett, E. W., Ludvigsson, J. Infant gut microbiota and environment associate with juvenile idiopathic arthritis many years prior to disease onset, especially in genetically vulnerable children. eBioMedicine. 93, 104654(2023).
  10. Borowitz, S. M. The epidemiology of inflammatory bowel disease: clues to pathogenesis. Front Pediatr. 10, 1103713(2023).
  11. Leete, P., et al. The effect of age on the progression and severity of type 1 diabetes: potential effects on disease mechanisms. Curr Diab Rep. 18 (11), 115(2018).
  12. Francis, F., et al. Probiotic studies in neonatal mice using gavage. J Vis Exp. (143), e59074(2019).
  13. McClain, R. M., et al. Neonatal mouse model: review of methods and results. Toxicol Pathol. 29 (Suppl), 128-137 (2001).
  14. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19, 98(2019).
  15. Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
  16. Westerhout, J., Wortelboer, H., Verhoeckx, K. Ussing chamber. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , (2015).
  17. Hempstock, W., Ishizuka, N., Hayashi, H. Functional assessment of intestinal tight junction barrier and ion permeability in native tissue by Ussing chamber technique. J Vis Exp. (171), e62468(2021).
  18. Sjögren, E., Eriksson, J., Vedin, C., Breitholtz, K., Hilgendorf, C. Excised segments of rat small intestine in Ussing chamber studies: A comparison of native and stripped tissue viability and permeability to drugs. Int J Pharm. 505 (1), 361-368 (2016).
  19. Moussaoui, N., et al. Changes in intestinal glucocorticoid sensitivity in early life shape the risk of epithelial barrier defect in maternal-deprived rats. PLoS One. 9 (2), e88382(2014).
  20. Gleeson, J. P., et al. The enhanced intestinal permeability of infant mice enables oral protein and macromolecular absorption without delivery technology. Int J Pharm. 593, 120120(2021).
  21. Birchenough, G. M. H., et al. Postnatal development of the small intestinal mucosa drives age-dependent, regio-selective susceptibility to Escherichia coli K1 infection. Sci Rep. 7 (1), 83(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Проницаемость кишечникаанализ с FITC-декстраномпероксидаза хренапарацеллюлярная проницаемостьтрансцеллюлярная проницаемостьтерапия на основе микроРНК
Оральная гаважа у новорождённых мышиных щенков и функциональная оценка целостности барьера кишечника с помощью камер Уссинга
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.