Методическая статья

Упрощённый метод трансформации Phytophthora palmivora с помощью агробактерий

DOI:

10.3791/69753

⸱

20 марта 2026 г.

 ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of Georgia

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем простой, эффективный и воспроизводимый протокол для трансформации Phytophthora palmivora, опосредованной агробактериями, который также применим к P. capsici.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Phytophthora — это род оомицетов, содержащий множество разрушительных растительных патогенов, среди которых широко распространённый вид P. palmivora. Функциональная геномика Phytophthora была ограничена ограниченным доступом надёжных, простых в реализации методов трансформации. Среди доступных подходов особенно привлекательна трансформация, опосредованная агробактериями (AMT), поскольку требует минимального специализированного оборудования и часто производит стабильные трансформанты с помощью вставки генов в одну копию. Большинство протоколов АМТ для трансформации грибков и оомицетов используют минимально содержащие среди (MM) соли в индукционной и совместной культивации Agrobacterium . Подготовка таких сред обычно включает приготовление и смешивание нескольких бульонных растворов, некоторые из которых содержат множество компонентов в разных концентрациях. Этот процесс занимает много времени и подвержен ошибкам, что приводит к непоследовательному успеху трансформации. Здесь мы представляем упрощённый, простой и воспроизводимый протокол AMT для P. palmivora , который использует коммерчески доступную базальную среду Murashige и Skoog (MS) для подготовки среды для индукции и совместного культивирования Agrobacterium . Этот протокол также успешно применялся для трансформации P. capsici и может применяться к другим видам Phytophthora .

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фитофтора, род оомицетов, включает многие из самых разрушительных растительных патогенов мира, ответственных за серьёзные экономическиепотери 1,2. Среди них Phytophthora palmivora — патоген широкого распространения, заражающий многие экономически значимые культуры, включая какао ипапайю. Это самый распространённый причинитель гнили чёрных стручков в какао — тропическом многолетнем дереве, которое является основным компонентом многомиллиардной шоколадной индустрии 4,5,6. Понимание механизмов молекулярной патогенности этого разрушительного патогена крайне важно для разработки новых эффективных стратегий контроля заболеваний, а генетическая трансформация является важным инструментом для проведения таких исследований.

Разработано несколько методов преобразования Phytophthora spp., включая микроснаряднуюбомбардировку 7, полиэтиленгликоль и кальциевдихлорид (PEG/CaCl 2)-опосредованную протопластнуютрансформацию 8,9,10,11, зооспорную электропорацию 12,13,14 и агробактериально-опосредованную трансформацию (AMT)15.16. Среди этих подходов AMT обладает ключевыми преимуществами, поскольку обычно генерирует интеграцию генов с одной копией 15,16 и относительно просто выполнять без необходимости специализированного оборудования.

Ранее был разработан протокол эффективной трансформации P. palmivora с использованиемAMT 16. С помощью этого метода мы успешно трансформировали P. palmivora с множествомконструкций 17,18. Этот метод использует индукцию и совместное культивирование Agrobacterium на основе минимальной среды (MM), которые обычно применяются для трансформации грибков и оомицетов 15,16,19. Хотя протокол трансформации на основе MM показал свою эффективность в генерации трансформаторов, подготовка нескольких стандартных решений и их объединение для создания носителей может быть задачей, которая требует много времени и подвержена ошибкам.

Здесь мы представляем значительно упрощённый метод AMT P. palmivora с использованием коммерческой базальной среды Murashige и Skoog (MS) для замены компонентов соляной среды MM в индукционной и совместной средеAgrobacterium 16. Этот метод устраняет необходимость в приготовлении множества химических растворов, делая процесс менее трудоёмким и высоковоспроизводимым. Более того, этот подход, по-видимому, даёт более высокую эффективность преобразования по сравнению с ранее описаннымметодом 16 и применим к P. capsici.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка запасных растворов, сред и других материалов, необходимых для преобразования

  1. Стандартные растворы для антибиотиков
    1. Приготовьте стандартные растворы канамицина (50 мг/мл), G418 (15 мг/мл) и цефотаксима (100 мг/мл): растворите соответствующие количества антибиотиков в воде, отфильтруйте и стерилизуйте растворы, приготовьте аликвоты по 1 мл и храните их при -20 °C.
    2. Приготовьте настоящий раствор рифампицина (15 мг/мл): растворите соответствующее количество рифампицина в DMSO, приготовьте аликвоты объёмом 1 мл, завернуть их в фольгу и хранить при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно фильтруйте и стерилизуйте химические растворы, приготовленные в DMSO, с помощью шприцев из материалов, совместимых с DMSO, таких как нейлон или PTFE (тефлон).
  2. Среда для роста агробактерий
    1. Жидкая среда Luria-Bertani (LB): Чтобы подготовить 250 мл среды, добавьте 6,25 г LB порошка к 250 мл воды, обработайте раствор автоклавом и храните при комнатной температуре (RT).
    2. Среду агара LB: Чтобы подготовить 250 мл среды, добавьте 6,25 г порошок LB и 3,75 г агар на 250 мл воды, затем автоклавировать раствор и хранить в RT. Добавьте соответствующие антибиотики в растопленный LB агар перед изготовлением пластин. Храните тарелки с добавлением антибиотиков при 4 °C.
  3. Медиа для роста и трансформации P. palmivora
    1. 10% V8 агар: Для приготовления 500 мл добавьте 50 мл оригинального 100% овощного сока V8 в 450 мл воды. Затем добавьте 0,5 гCaCO 3 в подвеску и перемешайте, чтобы хорошо перемешать. Сделайте раствор автоклавом и вылейте его по пластинам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости добавляйте соответствующие антибиотики. Храните тарелки с добавлением антибиотиков при 4 °C.
    2. Жидкая среда Murashige и Skoog (1/2 MS): добавьте 2,15 г Murashige и базальной среды Skoog (MS) на 950 мл воды, отрегулируйте pH до 5,6 при 1 N KOH и добавьте воду до 1 L. Используйте напрямую для получения 1/2 MS агар (шаг 1.3.3), автоклавировать оставшуюся 1/2 MS жидкость и хранить в RT.
    3. 1/2 млн агара для совместного культивирования агробактерий и зооспоры (AZCA): Для приготовления 600 мл AZCA смешайте 567 мл жидкой 1/2 MS с шага 1.3.2 с 9 г агаром. Автоклавуйте решение и храните его в RT.
    4. 50% глицерин: смешайте 50 мл глицерина с 50 мл воды, сделайте автоклавом раствора и храните в RT.
    5. 1M MES (pH 5,6): Чтобы подготовить 200 мл, добавьте 39,048 г MES гидрата в 160 мл воды, затем отрегулируйте pH до 5,6 раствором NaOH. Далее добавьте воду до 200 мл, фильтруйте-стерилизуйте раствор и храните в режиме RT в тёмных условиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MES будет растворяться постепенно по мере повышения pH. Изначально используйте 10 N NaOH, чтобы приблизить pH к 5,6, что почти растворит порошок. Затем добавьте 1 N NaOH, чтобы pH достигнуть ровно 5,6.
    6. 20% глюкозы: растворите 10 г глюкозы в 40 мл воды, затем добавьте воду до 50 мл, фильтруйте-стерилизуйте раствор и храните в RT.
    7. 200 мМ ацетосирингона (AS): растворить 40 мг 4'-гидрокси-3',5'-диметоксиацетофенона в 1 мл DMSO (см. ПРИМЕЧАНИЕ под 1.1.2) и покрыть раствор фольгой. Сделайте это свежим в день превращения.
    8. Индукционная среда агробактерий (AIM): Для подготовки 40 мл среды добавьте 400 мкл 50% глицерина, 400 мкл 20% глюкозы, 1,6 мл 1 мл МЭС (pH 5,6), 40 мкл 200 мМ АС и 37,6 мл раствора 1/2 МС жидкого раствора (pH 5,6) (приготовленного на этапе 1,3,2) в стерильной трубке объёмом 50 мл. Хорошо перемешайте раствор, накройте тюбик фольгой и используйте свежим в течение нескольких часов.
    9. Агробактерий и зооспорный агар (AZCA): Для приготовления 600 мл агара добавьте 6 мл 50% глицерина, 3 мл 20% глюкозы, 24 мл 1 м МЭС (pH 5,6), 600 мл 200 мМ АС к автоклавированному и расплавленному агару 567 мл 1/2 МС (pH 5,6) (готовится на этапе 1.3.3). Налейте раствор в тарелки и накройте их чёрной тканью для защиты от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте химические растворы в расплавленный агар 1/2 MS (шаг 1.3.9) при температуре 55-60 °C. Выключайте свет в капоте на этапах 1.3.7-1.3.9, так как AS чувствительный к свету. Выполните эти три шага в день трансформации.
    10. Plich agar: Для приготовления 1 л агара в 950 мл воды добавьте 0,5 г KH2PO4, 0,25 г MgSO4·7H2O, 1 г L-аспарагин, 5 г глюкозы, 0,5 г экстракта дрожжей, 10 мкл тиамина (100 мг/мл в воде, хранится при 4 °C), 10 мг β-ситостерола (растворить в 3 мл этаноле перед добавлением). Перемешайте раствор, чтобы растворить все ингредиенты, затем добавьте воду, чтобы увеличить объём до 1 л. Разделите раствор на порции по 500 мл и добавьте 7,5 г агар на каждые 500 мл. Сделайте раствор автоклавом и добавьте соответствующие антибиотики, когда температура опустится до 55 °C, затем налейте его по тарелкам.
    11. Мембрана Hybond N+: Разрежьте мембрану с защитными листами на куски размером 5 см x 6 см, оберните их алюминиевой фольгой и автоклавом. При размещении автоклавной мембраны на среде AZCA обращайтесь с ней стерильными щипцами и сбросьте защитные листы.

2. Культивирование P. palmivora

  1. За семь–восемь дней до трансформации выращивайте P. palmivora papaya isolate P116 на свежеприготовленных 10% агарных пластинах V8, разместив одну агарную пробку ранее выращенной культуры Phytophthora (или из бульона) в центр чашки Петри.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить более высокую концентрацию зооспор, важно использовать свежеприготовленный непрочистенный 10% V8 агар.
  2. Инкубировать пластины при 25 °C в цикле 12 часов светлого и 12 часов тёмного цикла в течение 7-8 дней до трансформации.

3. Подготовка Agrobacterium tumefaciens

  1. За три дня до трансформации полоса A. tumefaciens сортирует EHA105, несущий pCB301TOR-GFP16 на агарной пластине LB, дополненной рифампицином (15 мкг/мл) и канамицином (50 мкг/мл). Инкубировать тарелку при 28 °C в течение 2 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начальную подготовку Agrobacterium (шаг 3.1) можно провести за неделю до превращения, а пластины можно хранить при 4 °C после двухдневного инкубационного периода.
  2. За день до трансформации возьмите небольшое количество клеток Agrobacterium и распределите их на новую пластину ЛБ агара, дополненную антибиотиками (как описано в шаге 3.1), используя дно и плоское основание стерильной микроцентрифугной трубки объемом 1,5 мл. Для облегчения распределения добавьте 20 мкл жидкой среды в центр пластины ЛБ, смешайте бактериальные клетки с ЛБ-средой и равномерно распределите их по пластине. Инкубировать тарелку при 28 °C на ночь примерно 16-18 часов.
  3. Зачерпите клетки, выращенные за ночь, наконечником пипетки объёмом 1 мл и подвесьте их в индукционной среде Agrobacterium (AIM) объёмом 1 мл, прокручивая вверх и вниз. Разведите клетки доOD 600 = 0,4 с помощью AIM в стерильной трубке объемом 50 мл, покрытой фольгой. Сделайте минимум 5 мл для совместной инкубации с зооспорами P. palmivora (шаг 5.1).
    ПРИМЕЧАНИЕ:OD 600 в диапазоне от 0,1 до 0,8 позволит успешно провести трансформацию. OD 600 = 0,4 регулярно используется, поскольку эта концентрация обеспечивает наивысшую эффективность трансформации при использовании минимальной среды (MM) для индукции и совместного культивирования Agrobacterium наоснове солей 16.
  4. Инкубировать бактерии в RT в тёмных условиях в течение 1,5–2 часа на платформенном шейкере с мягким перемешиванием (примерно 70 об/мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется держать фары выпока выключенными на этапе 3.3 и ослаблять крышку трубки на 50 мл во время инкубации (шаг 3.4).

4. Выпуск зооспор

  1. После 1 часа инкубации Agrobacterium tumefaciens (шаг 3.4) затопите 7-8-дневную пластину P. palmivora водой 10 мл, предварительно охлаждённой при 4°C, удалите воздушные пузырьки на поверхности среды, мягко постукивая кончиком пипетки, и инкубируют пластину при 4 °C в течение 15 минут, затем 15 минут на RT при свете.
  2. Аккуратно переместите выпущенные зооспоры (примерно 7-8 мл) в стерильную центрифугную трубку на 15 мл с помощью пипетки, не нарушая мицелии и спорангии.
  3. Для измерения концентрации зооспоры перенесите часть суспензии зооспоры (например, 20 мкл) в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл и разведите её 10 раз водой (180 мкл H2O для 20 мкл зооспор). Проведите вихрь в трубке на 1 минуту, чтобы получить инкист в зооспорах для удобства подсчёта, а затем подсчитайте количество зооспор под микроскопом с помощью гемаситометра. Умножьте подсчитанное число на 10 раз, чтобы определить концентрацию зооспорной суспензии, подготовленной на шаге 4.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация зооспоры измеряется для вычисления эффективности преобразования. Обычно мы используем концентрации от 1,5 × 10,6 до 5 × 106 зооспор на мл, с успехом трансформации.

5. Совместная инкубация агробактерий и зооспор

  1. Добавьте 5 мл агробактерии (подготовленного на этапе 3,4) к 5 мл зооспорной суспензии (подготовленной на этапе 4,2) в стерильную трубку объёмом 50 мл, покрытую фольгой. Аккуратно перемешайте и инкубуйте трубку на RT в течение 2 часов в темноте. Держите крышку свободной и не трясите тюбиком во время совместной инкубации.
  2. В период совместной инкубации (шаг 5.1) подготовьте пластины AZCA (шаг 1.3.9). Когда среда затвердеет, положите по одному кусочку стерилизированной мембраны Hybond N+ (подготовленной на этапе 1.3.11) на каждую пластину AZCA и держите пластины в темноте.
  3. После 2 часов совместной инкубации Agrobacterium и зооспоры (шаг 5.1) нанесите 300 мкл смеси на каждую мембрану Hybond N+, размещённую поверх пластин AZCA (шаг 5.2) с наконечником пипетки, оставляя края свободными от жидкости.
  4. Дайте смеси высохнуть на воздухе около 10 минут в капоте, оставив чашки Петри открытыми. Накройте пластины, как только раствор на мембране перестанет циркулировать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время шагов 5.1-5.4 выключайте свет капота. При необходимости используйте свет при добавлении и распределении смеси по мембранам (шаг 5.3).
  5. После сушки на воздухе инкубировать тарелки при 25 °C в темноте в течение 2 дней.

6. Отбор трансформаторов, устойчивых к G418

  1. После 48 часов совместной инкубации (шаг 5,5) переместите мембраны Hybond N+ вверх ногами с помощью стерилизованных щипцов на пластины Plich agar с дополнением G418 (30 мкг/мл) и цефотаксимом (100 мкг/мл). При размещении мембран на пластинах не перетаскивайте их по поверхности среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация G418 для выбора трансформаторов для каждого изолята P. palmivora должна быть определена, так как для разных изолятов наблюдаются разные уровни чувствительности. Для этого разместите мицелиевую пробку диаметром 0,5 см в центре пластин Плиха, дополненную серией концентраций G418 с шагом 5 мкг/мл, начиная с нуля. Подготовьте три пластины для каждой концентрации. Инкубировать тарелки при 25 °C в течение 7 дней. Определите самую низкую концентрацию G418, которая полностью подавляет рост изолята Phytophthora , и используйте её для выбора трансформаторов.
  2. Используйте плоское основание микроцентрифугной трубки объёмом 1,5 мл, чтобы аккуратно нажать и скользить по поверхности мембраны, чтобы убедиться, что она находится в тесном контакте с средой. Осмотрите нижнюю сторону пластин, чтобы проверить наличие пузырьков воздуха между мембраной и средой. Аккуратно выдавите воздушный пузырь, если он есть, используя плоское основание той же микроцентрифугной трубки.
  3. Инкубировать пластины в 12-часовом светлом и 12-часовом тёмном цикле при 25 °C в течение 2-3 дней.
  4. После 3 дней инкубации удалите мембраны стерильными щипцами и продолжите инкубацию пластин при тех же условиях. Мембраны можно удалить через 2 дня, если на пластинах появляются видимые колонии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трансформанты обычно появляются в течение 1-3 дней после удаления мембраны, но некоторые колонии могут появиться позже. Чтобы получить больше трансформаторов, следите за пластинами около недели после удаления мембран.
  5. Перенесите трансформаторы на 10% агарные пластины V8 с той же концентрацией G418 или уменьшенной на 30%.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следуя этому протоколу, мы провели два независимых эксперимента по трансформации P. palmivora с использованием A. tumefaciens EHA105 с pCB301TOR-GFP16. Как и ожидалось, совместная инкубация зооспор с Agrobacterium дала колонии, устойчивые к G418, на агарных пластинах Плих, дополнённых 30 мкг/мл G418, тогда как колонии на контрольных пластинах без заражения Agrobacterium не наблюдались (рисунок 1A). Количество трансформаторов, устойчивых к G418, на 107 зооспор, полученных в этих двух экспериментах, составляло 55 и 50 соответственно (Таблица 1), что почти вдвое превышает самое высокое число (27 ± 5), ранее полученное с использованием более раннегопротокола 16.

Истинные трансформаторы проверялись двумя методами: первый — наблюдение флуоресценции GFP с помощью флуоресцентного микроскопа, а во-вторых, ПЦР-амплификация фрагмента гена EGFP с частотой 550 bp с использованием Taq 2X Master Mix (NEB) с парой праймеров EGFP-F2 (5'-GACTAAACGGCCACAAGTTC-3') и EGFP-R2 (5'-GGGTGCTCAGGTAGTGGTTG-3'). В эксперименте (Exp) 1 15 из 18 трансформаторов, устойчивых к G418, а в Exp 2 — 17 из 21 трансформатора демонстрировали флуоресценцию GFP (Таблица 1, Рисунок 1B). Из семи устойчивых к G418 трансформаторов, которые не показали флуоресценцию в обоих экспериментах, три были подтверждены как настоящие трансформаторы с помощью ПЦР (см. рисунок 1C). В целом уровень истинных трансформантов оценивался в 90%.

Кроме того, нам удалось успешно трансформировать изолят тыквы P. capsici , PC2024-14sz, используя A. tumefaciens EHA105 с pCB301TOR-GFP, следуя протоколу с незначительными изменениями в подготовке зооспорных суспензий (инкубационный период при 4 °C после заполнения 7-дневной пластины P. capsici предварительно охлаждённой водой был продлён до 30 минут). Количество трансформаторов, устойчивых к G418 (30 мкг/мл), на 107 в одном эксперименте составило 13. Девять трансформаторов наблюдались под флуоресцентным микроскопом, и все они производили флуоресценцию (Дополнительный файл 1), что говорит о том, что они настоящие трансформаторы.

figure-results-1
Рисунок 1: Преобразование P. palmivora с использованием A. tumefaciens EHA105 с pCB301TOR-GFP. (A) Появление G418-устойчивых трансформантов P. palmivora на агаре Плиха с добавлением 30 мкг/мл G418. (B) Обнаружение экспрессии GFP под флуоресцентным микроскопом у репрезентативного трансформатора и дикого штамма P. palmivora (WT). Изображения были сделаны как на яркополевых (BF), так и на GFP-флуоресцентных каналах. (C) ПЦР-амплификация EGFP из четырёх трансформаторов с обнаруживаемой флуоресценцией GFP и семи без GFP флуоресценции. Универсальная пара праймеров ITS4/ITS5 20 использовалась для усиления внутреннего транскрипционированного спейсера (ITS) с целью проверки целостности ДНК. Трансформаторы без флуоресценции GFP выделены жирным, подчеркнутым. Сокращения: M = ДНК-лестница NEB 100 bp; WT = изолят дикого типа P. palmivora P1; N = отрицательная контрольная ПЦР с использованием H2O в качестве шаблона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

ЭкспериментOD 600 AgrobacteriumКонцентрация зооспоры (/mL)Объем зооспоры (мл)Количество трансформаторов, устойчивых к G418Количество трансформаторов с обнаруживаемым сигналом GFP (обнаружено / наблюдалось)Количество трансформаторов, устойчивых к G418 / 107 зооспор
10.41.8 x 1064.34315/1855
20.42.9 x 1064.66717/2150

Таблица 1: Эффективность трансформации P. palmivora, опосредованной агробактериями, с использованием A. tumefaciens EHA105 с pCB301TOR-GFP.

Дополнительный файл 1: Экспрессия GFP под флуоресцентным микроскопом у дикого типа (WT) P. capsici и репрезентативного трансформатора, полученного с использованием A. tumefaciens EHA105 с pCB301TOR-GFP. Изображения были сделаны как на яркополевых (BF), так и на GFP-флуоресцентных каналах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол использует базальную среду Murashige и Skoog с половинной прочностью (1/2 MS) для замены компонентов солей минимальной среды (MM), которые обычно применяются в индукционных и совместных средах Agrobacterium для трансформации оомицетов и грибов. Подготовка среды на основе солей MM требует создания нескольких стандартных растворов из множества отдельных химикатов и ихкомбинирования 19. 1/2 MS также содержит множество химических компонентов; однако, поскольку MS широко доступен в коммерческих продажах в виде предварительно смешанного порошка, приготовление срединки упрощается растворением порошка в воде. Эта модификация значительно сокращает время подготовки среды и минимизирует риск человеческих ошибок. Кроме того, протокол повышает эффективность преобразования, обеспечивая большее количество трансформаторов по сравнению с ранее описанным методомAMT 16. Он также эффективен для трансформации P. capsici и, вероятно, применим к другим видам Phytophthora . В дополнительную поддержку его потенциальной широкой применимости, среда на основе MS ранее использовалась для совместной культивации штаммов Agrobacterium tumefaciens , экспрессирующих AtVIP1 (Arabidopsis thaliana VirE2-взаимодействующий белок 1) и зооспор P. infestans , что позволило успешно трансформировать P. infestans21.

Важно отметить, что этот протокол может генерировать низкий процент ложноположительных результатов. Из 39 устойчивых к G418 трансформаторов, протестированных с помощью GFP-флуоресцентного наблюдения или ПЦР, четыре не показали ни флуоресценции, ни амплификации EGFP (Таблица 1, Рисунок 1C). Поскольку частичная интеграция T-ДНК во время трансформации, опосредованной агробактериями, нередкость 22,23, возможно, что в геном P. palmivora была интегрирована только часть T-ДНК, содержащая ген NPTII из плазмиды pCB301TOR-GFP16. Альтернативно, ложноположительные результаты могут возникать из-за недостаточного контакта между мембраной и селективной средой, что позволяет избежать отбора G418. Поэтому крайне важно обеспечить полный контакт мембраны с средой (шаг 6.2).

Этот протокол может быть ещё более упрощён. Например, МЭС в индукционных средах Agrobacterium (AIM ) и агробактерии-зооспорный агар (AZCA) могут быть опущены. MES обычно используется как буферный агент в биохимических и молекулярно-биологических экспериментах для поддержания стабильного pH; однако подготовка 1 M MES стандартного раствора при pH 5,6 занимает достаточное время и увеличивает стоимость. В AMT растений, таких как сладкийбазилик 24 ипапайя-25, использовались аналогичные среды для индукции и совместного культивирования Agobacterium на основе MS без MES, что указывает на то, что MES может быть несущественным для трансформации P. palmivora . Необходимы дополнительные эксперименты, чтобы подтвердить, что пропуск MES не снижает эффективность трансформации.

В целом, этот упрощённый протокол предоставляет практичную и доступную платформу для рутинной генетической манипуляции P. palmivora, P. capsici и, возможно, других оомицетов. Он поддерживает широкий спектр фундаментальных исследований, некоторые из которых обладают трансляционными потенциалами, включая флуоресцентную маркировку патогенов для отслеживания динамики инфекции, маркировку белков для изучения субклеточной локализации и функциональный анализ с помощью целенаправленных изменений экспрессии генов или последовательностей, кодирующих белки. В сочетании с редактированием генома на основе CRISPR протокол, как ожидается, ускорит анализ механизмов патогенности и выявление ключевых факторов вирулентности у этих разрушительных патогенов. Полученные инсайты, в свою очередь, позволят разрабатывать новые, основанные на механизмах стратегии контроля заболеваний.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование поддерживается Национальным научным фондом (премия NSF No 2418799) и Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства (премия NIFA No 2023-67013-42262).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 млVWR525-1126
4'-гидрокси-3',5' диметоксиацетофенонаTCID2666Ацетосирингон (AS)
Трубка объёмом 50 млBio-one Грейнера227261
Абсолютный этанолБиореагенты FisherBP28184
АгарБиореагенты FisherBP1423-500
Алюминиевая фольга
Мембрана Hybond-N+ (30 см и 3 м)ЦитиваRPN303B
Карбонат кальцияСигма-Олдрич239216-500GCaCO3
Цефотаксимная соль натрияThermo Scientific ChemicalsAAJ6269006
D-(+)-глюкозаСигма-ОлдричG8270-1KG
Микробный набор DNeasy PowerLyzerЦягэн12255-50
Щипцы
Флуоресцентный микроскопZeissФлуоресцентный микроскоп ZEISS Axioscope 5 с набором фильтров 38 HE
Сульфат G418Thermo Scientific ChemicalsAC329400010
ГлицеринСигма-Олдрич911046-1L
Гемацитометр (Яркая линия)Hausser Scientific
КанамицинсульфатСанта-Крус БиотехнологияSC-257635
L-Аспарагин безводныйMP BiomedicalsICN10079425
ЛБ Броут, МиллерБиореагенты FisherBP1426-2
Гептагидрат сульфата магнияСигма-Олдрич63138-250GMgSO4· 7H2O
MES HydrateСигма-ОлдричM2933-100G
Базальная среда Мурасигэ и СкугСигма-ОлдричM5519-50L
Чашка Петри (100 мм x 15 мм)VWR25384-342
Дигидрофосфат калияСигма-Олдрич1370391000KH2PO4
РифампицинСанта-Крус БиотехнологияSC-200910
Taq 2X мастер-миксNEBM0270L
Тиамин гидрохлоридСигма-ОлдричT4625-5G
УФ-видимый спектрофотометрFisher Scientific14-385-355
V8 Оригинальный 100% овощной сокКомпания Campbell Soup
VortexerFisher Scientific14-955-163
ВодаКласс молекулярной биологии, очищенный с использованием системы очистки воды Mill-Q
Дрожжевый экстрактACROS611805000В настоящее время доступно через Thermo Scientific Chemicals
&бета;-СитостеролСигма-Олдрич85451-100G

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kamoun, S., et al. The top 10 oomycete pathogens in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 16 (4), 413-434 (2015).
  2. Jones, J. D., Staskawicz, B. J., Dangl, J. L. The plant immune system: From discovery to deployment. Cell. 187 (9), 2095-2116 (2024).
  3. Tocafundo, F., et al. Direct and cross-pathogenicity of Phytophthora palmivora against cacao, papaya, and peach palm. Trop Plant Pathol. 46 (6), 664-673 (2021).
  4. Morales-Cruz, A., et al. Independent whole-genome duplications define the architecture of the genomes of the devastating West African cacao black pod pathogen Phytophthora megakarya and its close relative Phytophthora palmivora. G3 (Bethesda). 10 (7), 2241-2255 (2020).
  5. Ali, S., et al. PCR-based identification of cacao black pod causal agents and identification of biological factors possibly contributing to Phytophthora megakarya's field dominance in West Africa. Plant Pathol. 65 (7), 1095-1108 (2016).
  6. Marelli, J. -P., et al. Chocolate under threat from old and new cacao diseases. Phytopathology. 109 (8), 1331-1343 (2019).
  7. Cvitanich, C., Judelson, H. S. Stable transformation of the oomycete, Phytophthora infestans, using microprojectile bombardment. Curr Genet. 42 (4), 228-235 (2003).
  8. Judelson, H. S., Tyler, B. M., Michelmore, R. W. Transformation of the oomycete pathogen, Phytophthora infestans. Mol Plant Microbe Interact. 4 (6), 602-607 (1991).
  9. Wang, W., et al. an oxathiapiprolin-resistance gene, functions as a novel selection marker for Phytophthora transformation and CRISPR/Cas9 mediated genome editing. Front Microbiol. 10, 2402(2019).
  10. Dai, T., et al. An improved transformation system for Phytophthora cinnamomi using green fluorescent protein. Front Microbiol. 12, 682754(2021).
  11. Fang, Y., Cui, L., Gu, B., Arredondo, F., Tyler, B. M. Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9. Curr Protoc Microbiol. 44 (1), 21A.1.1-21A.1.26 (2017).
  12. Evangelisti, E., Yunusov, T., Shenhav, L., Schornack, S. N-acetyltransferase AAC (3)-i confers gentamicin resistance to Phytophthora palmivora and Phytophthora infestans. BMC Microbiol. 19 (1), 265(2019).
  13. Dong, L., et al. Establishment of the straightforward electro-transformation system for Phytophthora infestans and its comparison with the improved PEG/CaCl2 transformation. J Microbiol Methods. 112, 83-86 (2015).
  14. Huitema, E., Smoker, M., Kamoun, S. A straightforward protocol for electro-transformation of Phytophthora capsici zoospores. Methods Mol Biol. 712, 129-135 (2011).
  15. Vijn, I., Govers, F. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of the oomycete plant pathogen Phytophthora infestans. Mol Plant Pathol. 4 (6), 459-467 (2003).
  16. Wu, D., Navet, N., Liu, Y., Uchida, J., Tian, M. Establishment of a simple and efficient Agrobacterium-mediated transformation system for Phytophthora palmivora. BMC Microbiol. 16 (1), 204(2016).
  17. Gumtow, R., Wu, D., Uchida, J., Tian, M. A Phytophthora palmivora extracellular cystatin-like protease inhibitor targets papain to contribute to virulence on papaya. Mol Plant Microbe Interact. 31 (3), 363-373 (2018).
  18. Pettongkhao, S., Navet, N., Schornack, S., Tian, M., Churngchow, N. A secreted protein of 15 kDa plays an important role in Phytophthora palmivora development and pathogenicity. Sci Rep. 10 (1), 2319(2020).
  19. Minz, A., Sharon, A. Electroporation and Agrobacterium-mediated spore transformation. Molecular and Cell Biology Methods for Fungi. Sharon, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 21-32 (2010).
  20. Bellemain, E., et al. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: An in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10 (1), 189(2010).
  21. Wang, L., et al. A modified Agrobacterium-mediated transformation for two oomycete pathogens. PLoS Pathog. 19 (4), e1011346(2023).
  22. Wu, E., et al. Optimized Agrobacterium-mediated sorghum transformation protocol and molecular data of transgenic sorghum plants. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 50 (1), 9-18 (2014).
  23. Sun, L., et al. TDNAscan: A software to identify complete and truncated T-DNA insertions. Front Genet. 10, 685(2019).
  24. Navet, N., Tian, M. Agrobacterium-mediated transformation of sweet basil (Ocimum basilicum). Bio Protoc. 10 (22), e3828-e3828 (2020).
  25. Hasley, J., Dinulong, R. -J., Adhikari, A., Christopher, D., Tian, M. Genome editing of papaya using both Cas9 and Cas12a. bioRxiv. , (2025).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Agrobacterium TransformationZoospore Co IncubationGFP ExpressionGene Function AnalysisFluorescence MicroscopyOomycete TransformationMurashige Skoog MediumG418 SelectionProtein Localization

Похожие статьи