Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Дифференцировка и индукция накопления липидных капель в человеческих адипоцитах как модель для изучения ожирения in vitro

275 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69759

⸱

20 марта 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cell Pathology, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

В этой статье

Краткое содержание

Представленный протокол направлен на разработку клеточной модели, имитирующей человеческое ожирение. Для достижения этого стволовые клетки, полученные из жира, дифференцируются в адипоциты, которые затем откармливаются смесью выбранных жирных кислот.

Аннотация

Изменения жировой ткани, связанные с ожирением, изменяют локальные секреторные профили и влияют на взаимодействие с другими окружающими клетками, включая раковые клетки. Постоянная доставка питательных веществ меняет метаболизм жировых клеток, заставляя их выступать в роли липидного резервуара. Обычно исследования механизмов ожирения опираются на животные модели, которые, однако, не позволяют анализировать метаболические процессы на клеточном уровне. Поэтому необходимо разработать надёжную in vitro модель человеческого ожирения, которая поможет исследовать изменения функций ожиревших адипоцитов по сравнению с их худыми аналогами. В данной работе представлен протокол дифференцировки человеческих адипоцитов от их предшественников (стволовых клеток, полученных из жира) с использованием смеси инсулина, изобутил-1-метилксантина, дексаметазона и индометацина. Впоследствии дифференцированные адипоциты инкубировали набором жирных кислот, включая линолеат, пальмитат и олеат, для стимулирования накопления липид. В результате была создана ценная модель, имитирующая гипертрофические клетки при условиях ожирения, что может быть использовано для дальнейших исследований.

Введение

Считается, что ожирение является одним из основных факторов риска широкого спектра заболеваний, таких как нарушения опорно-двигательного аппарата, сердечно-сосудистые заболевания, инсулинорезистентность, метаболический синдром, диабет и отдельные виды рака1. Ожирение — одна из самых заметных и недооценённых проблем общественного здравоохранения, причины которой несколькообразны. Кратко: ожирение вызывается дисбалансом между потребляемыми и расходуемыми калориями, что приводит к увеличению накопленияжира 2. Избыток калорий приводит к патологическому расширению и дисфункции жировой ткани (АТ), ключевого элемента контроля энергетического гомеостаза организмом.

Адипоциты являются основным клеточным компонентомAT 3. Основным фактором роста АТ при условиях ожирения является гипертрофия клеток, то есть увеличение объёма адипоцитов за счёт увеличения количества жира, накапливаемого в цитоплазме в виде липидных капель (LDs)4. Даже если ожирение является сложным патологическим заболеванием, исследования биологического функционирования адипоцитов могут служить моделью для анализа его причин и изучения новых стратегий лечения. Это подчёркивает необходимость более глубокого понимания молекулярных механизмов, влияющих на изменения функции адипоцитов для разработки новых терапевтических стратегий, направленных на лечение заболеваний, связанных с ожирением.

Животные модели наиболее близко отражают физиологические состояния, что делает их широко используемыми для in vivo исследованийожирения 5. Однако сделать выводы о фундаментальных биологических процессах на клеточном уровне остаётся крайне сложной в такой многослойной системе, которая способствует использованию моделей адипоцитов in vitro . Исследования in vitro чаще всего основаны на модели клеток 3T3-L1 у мыши, которая при соответствующих условиях приобретаетфенотип 6, похожий на адипоциты. Тем не менее, из-за своего происхождения эта модель не может использоваться для более сложных анализов, таких как условия совместного выращивания с человеческими клетками, и результаты не всегда могут быть напрямую переведены в человеческие адипоциты. Исходя из всех этих причин, ведётся поиск модели, имитирующей ожирение у людей, и использование человеческих стволовых клеток, полученных из жировых препаратов (ADSC), с их последующей дифференцировкой, кажется рациональным. Поэтому эта модель наиболее подходит для изучения гипертрофии человеческих адипоцитов in vitro благодаря своей низкой сложности. Он позволяет сравнивать параметры одного типа клеточной культуры при различных условиях, что невозможно in vivo из-за наличия нескольких типов клеток в жировой ткани.

Человеческие преадипоциты и стволовые клетки, выделенные из АТ, являются наиболее распространёнными примерами для изучения дисфункции этойткани 6. Эти клетки после дифференцировки являются привлекательной моделью для модуляции уровней LD в адипоцитах путём дополнительного оттолщивания. Тем не менее, существует относительно мало исследований, изучающих гипертрофию вчеловеческих клетках 7,8,9, и большинство из них используют только один тип жирных кислот (ФА) для индуцирования накопления LD.

Этот протокол предполагает дополнение человеческих адипоцитов смесью ФА (пальмитат, олеат и линолеат) для имитации условий ожирения. Это позволяет создать инструмент, основанный на человеческих адипоцитах, перегруженных липидами, который можно напрямую сравнивать с контрольными (наивными) жировыми клетками. Эту модель впоследствии можно использовать для изучения фенотипических и функциональных изменений среди нормальных и гипертрофных адипоцитов или, при необходимости, для экспериментов с условиями ко-культуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Используйте стерильные методы для выполнения всех этапов протокола в ламинарной клеточной культивной капюшоне. См. таблицу материалов для подробностей обо всех реагентах и оборудовании. Протокол дифференцировки, описанный ниже, подходит для стволовых клеток, полученных из жировых организмов, и может различаться между другими типами клеток и их происхождением. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка ADSC для дифференцировки

  1. Подготовьте среду для роста ADSCs (ADSCs GM): Добавьте модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM), содержащую 1 г/л глюкозы с 10% плодовой бычьей сывороткой (FBS), 2 мМ глутамина и антибиотиками — антимикотический раствор (100 U/mL пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина B).
  2. Разогрейте ADSC GM, фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) и раствор трипсина/EDTA до 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ADSC получаются из коммерческих источников. Используйте клетки на ранних проходах. Несколько пассажей приводят к снижению потенциала дифференцировкиADSC 10.
  3. Асептически удалите GM ADSC из ADSC, растущих в колбане T75, предназначенной для клеточной культуры.
  4. Промывайте остатки ГМ ADSC, промывая чашу с 5 мл PBS.
  5. Удалите весь объём PBS из колбы.
  6. Добавьте 2 мл трипсина/ЭДТА в миску для культуры и инкубуйте при 37 °C, пока клетки не отделятся. Контролируйте этот процесс с помощью инвертированного микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Постукивание по культивной тарелке ускорит отслоение клеток.
  7. Блокируйте активность трипсина, добавив 6 мл свежего ГМ ADSC.
  8. Переместите весь объём суспензии клеток из посевной антенны в трубку, подходящую для центрифугирования.
  9. Центрифугуйте ячейки при 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
  10. Удалите супернатант.
  11. Подвесить клетки в 2 мл недавно добавленных ГМ ADSC.
  12. Рассчитывайте плотность и жизнеспособность клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счётчика клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток можно оценить с помощью окрашивания трипана-синего красителя.
  13. Засеять клетки в нужном числе колодцев — 15 000 клеток на колодец, пластиковую пластину на 96 лунок в 100 мкл среды роста ADSC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Семенные клетки всегда в дублировании для получения адипоцитов, предназначенных для контроля и инкубации при условиях ФА. В зависимости от типа эксперимента ADSC могут быть размещены на разных типах пластиковых тарелок или тарелок. Рекомендуемая плотность посева составляет 30 000–60 000 клеток насм². В зависимости от количества ячеек, необходимых для последующих анализов или последующих экспериментов, можно корректировать формат контейнера для 6- или 12-ямецов.
  14. Культивировать клетки при 37 °C в увлажнённой атмосфере с содержанием 5%CO2.
  15. Когда клетки достигнут 100% слияния (обычно через 24–48 часов после нанесения пластин), индуцируйте их дифференцировку в адипоциты согласно инструкциям ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно достичь высокого уровня слияния клеток перед индукцией дифференцировки. В других случаях это может повлиять на эффективность дифференцировки. Если для пластинчатых клеток достигает высокой слияния более 48 часов, меняйте среду каждые 3-4 дня на свежую среду роста ADSC.

2. Индукция адипогенной дифференцировки

  1. Подготовьте дифференцировальную среду (СД): Добавьте среду DMEM/F12 10% FBS, 2 мМ глутамина, антибиотики — антимикотический раствор (100 Мк/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина B), 5 мкг/мл инсулина, 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX), 5 мкМ дексаметазона и 200 мкм индометацин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте DM только в том объёме, необходимом для прямого использования. Не храните её долго и всегда используйте свежеприготовленный DM. Перед употреблением нагрейте ДМ в водяной бане до 37 °C. IBMX и индометацин могут осадиться, если их добавить в среду при температуре ниже 37 °C. Чтобы растворить её, нагрейте жидкость в водяной бане до 37 °C.
  2. Асептически удалять и отбрасывать весь объём среды из слияющихся ADSC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среда роста ADSC следует полностью удалить до добавления Мастера.
  3. Аккуратно добавьте 100 мкл/скважину ДМ в клетки, растущие в пластине на 96 лунок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не давайте клеткам высохнуть при смене среды.
  4. Инкубировать клетки в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2 в течение 7 дней.
  5. Удалить и убрать весь объём DM из ADSC.
  6. Аккуратно добавьте 100 мкл/скважину свежего ДМ в клетки, растущие в пластине на 96 лунок.
  7. Инкубировать клетки в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%CO2, в течение следующих 7 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прогресс адипогенной дифференцировки можно обнаружить по ярким наблюдениям липидных вакуолей, появляющихся в индуцированных клетках.

3. Ожирение адипоцитов

  1. Приготовьте среду для культуры адипоцитов с добавлением ФА: добавьте в среду DMEM/F12 10% FBS, 2 мМ глутамина, антибиотики — антимикотический раствор (100 Ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина B), 0,33 мМ линолеата, 0,17 мМ пальмитата и 0,17 мМ олеата.
  2. Подготовьте среду для контрольной культуры адипоцитов: Добавьте среду DMEM/F12 10% FBS, 2 мМ глутамина, антибиотики — антимикотический раствор (100 U/mL пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина B), 0,44% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,26% этанола (последние два соединения также использовались в качестве растворителей FA).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте контрольный и дополнительный материал адипоцитными культурами ФА только в необходимом объёме для прямого использования. Не храните его долго и всегда используйте свежеприготовленные материалы. Перед использованием нагрейте среду в водяной бане до 37 °C.
  3. После всего 14 дней дифференцировки аккуратно удаляйте и отбрасываете весь объём среды СД из адипоцитов, дифференцированных на пластине с 96 лунами.
  4. Аккуратно добавьте 100 мкл/скважину среды для культуры адипоцитов с добавлением ФА в половину колодцев с клетками, растущими в пластине из 96 луц.
  5. Аккуратно добавьте 100 мкл/скважину контрольной среды для культуры адипоцитов во вторую половину колодцев с клетками, растущими в пластине на 96 луц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не давайте клеткам высохнуть при смене среды.
  6. Инкубировать клетки при 37 °C в увлажнённой атмосфере с содержанием 5%CO2 в течение следующих 48 часов.
  7. Через 48 часов используйте контрольные клетки и клетки, инкубированные с ФА, для последующих экспериментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе достигнутые оттолщенные адипоциты могут использоваться для различных экспериментальных целей, таких как окрашивание клеток, анализ клеточного метаболизма или совместное выращивание с другими типами клеток.

4. Пятна от липидных капель

  1. Подготовьте среду для культуры адипоцитов: Добавьте среду DMEM/F12 10% FBS, 2 мМ глутамин и антибиотики — антимикотический раствор (100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина B).
  2. Разбавлять флуоресцентный краситель для окрашивания LD в среде адипоцитной культуры с разбавкой 1:1000.
  3. Удалить и выбросить весь объём контрольной среды для культуры адипоцитов и среды адипоцитной культуры, дополненную FAs из клеток, растущих в пластине с 96 лунами.
  4. Аккуратно добавьте 50 мкл/скважину среды для культуры адипоцитов флуоресцентным красителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не давайте клеткам высохнуть при смене среды.
  5. Инкубировать клетки при 37 °C в увлажнённой атмосфере с 5%CO2 в течение 15 минут.
  6. Смывайте флуоресцентный краситель, заменив его на 100 мкл/хорошо адипоцитную культурную среду.
  7. Получение изображений в канале обнаружения зелёной флуоресценции (Ex 427 nm/Em 585 nm) с помощью флуоресцентного микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это протокол окрашивания живых клеток. Окрашивание также может проводиться после фиксации клеток формальдегидом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Описанный здесь метод позволяет дифференцировать человеческие ADSC в зрелые адипоциты, за которыми следует усиленное накопление липид, имитируя гипертрофические клетки, наблюдаемые при ожирении. Временной ход дифференцировки человеческих ADSC показан на рисунке 1. На первый день, когда клетки достигают 100% совпадения (рисунок 1A), ADSC демонстрируют удлинённую, веретенообразную морфологию. В этот момент протокол дифференцировки...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Настоящий протокол представляет собой воспроизводимую двухэтапную процедуру для дифференцировки ADSC, за которой следует инкубация с помощью FA для достижения клеточной модели, имитирующей ожирение. Критическим шагом, определяющим его эффективность, является количество проходов ADSC после его изоляции. Множественные проходы приводят к снижению потенциала дифференцировки этихклеток 10.

Во время дифференцировки адипоцитов ADSC переходят и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.

Благодарности

Статья была профинансирована Национальным научным центром Польши, гранты получили Дорота Новак (OPUS 22, No 2021/43/B/NZ3/01458) и Александра Симичижев (SONATA, 2020/39/D/NZ5/02330).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-изобутил-1-метилксантин (IBMX)MerckI5879
0,25% трипсина/0,05% pH ЭДТА 7,2IITD PAN, Wrocfigure-materials-1ой, Польша20-500
96-колодцевая пластинаТермо130188
антибиотики-антимикотический растворСигма-ОлдричA5955
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Сигма-ОлдричA3294
Счётчик ячеекН/ДН/Д
ЦентрифугаН/ДН/Д
ДексаметазонСигма-ОлдричD4902
Модифицированный Eagle Medium (DMEM) от DulbeccoIITD PAN, Wrocfigure-materials-2ой, Польша10-500содержит 1 г/л глюкозы
Модифицированная среда Dulbecco Eagle:питательная смесь F12Gibco11320-033
ЭтанолЧемпур113964200#1L
Сыворотка плода крупного рогатого скота (FBS)GibcoA5256701
hADSC стволовые клетки, полученные из человеческого жираЛонзаPT-5006
ИнкубаторН/ДН/Д
ИндометацинСигма-ОлдричI8280-5G
ИнсулинСигма-ОлдричI9278
Инвертированный микроскопН/ДН/Д
L-глутаминСигма-Олдрич25030-024
Соль натрия линолевой кислотыСигма-ОлдричL8134
Люминесцентный LipidSpotБиотиум70065
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Термо10010023
Содуимовый олеатСигма-ОлдричO7501
Soduim palmitateСигма-ОлдричP9767
Колба с культурой клеток T75Термо130190
Трипан-синийСигма-Олдрич95896HJ

Ссылки

  1. Lin, X., Li, H. Obesity: Epidemiology, pathophysiology, and therapeutics. Front Endocrinol. 12, 706978(2021).
  2. Wen, X., et al. Signaling pathways in obesity: Mechanisms and therapeutic interventions. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 298(2022).
  3. Sharma, S., Muthu, S., Jeyaraman, M., Ranjan, R., Jha, S. K. Translational products of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: bench to bedside applications. World J Stem Cells. 13 (10), 1360-1381 (2021).
  4. Guerreiro, V. A., Carvalho, D., Freitas, P. Obesity, adipose tissue, and inflammation answered in questions. J Obes. 2022, 2252516(2022).
  5. Kleinert, M., et al. Animal models of obesity and diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 140-162 (2018).
  6. Ruiz-Ojeda, F. J., Rupérez, A. I., Gomez-Llorente, C., Gil, A., Aguilera, C. M. Cell models and their application for studying adipogenic differentiation in relation to obesity: A review. Int J Mol Sci. 17 (7), 1040(2016).
  7. Małodobra-Mazur, M., et al. Metabolic differences between subcutaneous and visceral adipocytes differentiated with an excess of saturated and monounsaturated fatty acids. Genes. 11 (9), 1-16 (2020).
  8. Ishaq, A., Tchkonia, T., Kirkland, J. L., Siervo, M., Saretzki, G. Palmitate induces DNA damage and senescence in human adipocytes in vitro that can be alleviated by oleic acid but not inorganic nitrate. Exp Gerontol. 163, 111798(2022).
  9. Berger, E., Géloën, A. Insulin prevents fatty acid induced increase of adipocyte size. Adipocyte. 11 (1), 510-528 (2022).
  10. Eom, J., et al. Visualization and quantification of mesenchymal cell adipogenic differentiation potential with a lineage specific marker. J Vis Exp. (133), e57153(2018).
  11. Pietraszek-Gremplewicz, K., et al. Response of primary human adipocytes to fatty acid treatment. J Cell Mol Med. 29 (10), e70622(2025).
  12. Zhu, D., Shi, S., Wang, H., Liao, K. Growth arrest induces primary-cilium formation and sensitizes IGF-1-receptor signaling during differentiation induction of 3T3-L1 preadipocytes. J Cell Sci. 122 (15), 2760-2768 (2009).
  13. Rosen, E. D., et al. PPARγ is required for the differentiation of adipose tissue in vivo and in vitro. Mol Cell. 4 (4), 611-617 (1999).
  14. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  15. Styner, M., Sen, B., Xie, Z., Case, N., Rubin, J. Indomethacin promotes adipogenesis of mesenchymal stem cells through a cyclooxygenase independent mechanism. J Cell Biochem. 111 (4), 1042-1050 (2010).
  16. Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation: activation of CREB rescues adipogenesis from the arrest caused by inhibition of prenylation. J Biol Chem. 276 (30), 28430-28435 (2001).
  17. Inthanon, K., Sririwichitchai, R., Davies, N. M. Rapid screening of adipogenic responses to EGCG in non-induced L929 adipocytes using image-based analysis compared to the conventional 3T3-L1 method. J Appl Pharm Sci. 15 (5), 138-148 (2025).
  18. Abbasi, K., Mehdizadeh, A., Hamishehkar, H., Nouri, M., Darabi, M. Fatty acid composition of lipid fractions in white- and brown-like adipocytes derived from human mesenchymal stem cells. Adipocyte. 14 (1), 2566481(2025).
  19. Pieters, V. M., et al. A three-dimensional human adipocyte model of fatty acid-induced obesity. Biofabrication. 14 (4), 045009(2022).
  20. Watt, M. J., Hoy, A. J., Muoio, D. M., Coleman, R. A. Distinct roles of specific fatty acids in cellular processes: implications for interpreting and reporting experiments. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302, 1-3 (2012).
  21. Alsabeeh, N., Chausse, B., Kakimoto, P. A., Kowaltowski, A. J., Shirihai, O. Cell culture models of fatty acid overload: problems and solutions. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1863 (2), 143-150 (2018).
  22. Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-induced changes in adipose tissue microenvironment and their impact on cardiovascular disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vitro
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.