Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
Острая почечная травма, связанная с сепсисом (SA-AKI), связана с значительными показателями смертности. В данном исследовании наблюдается снижение регуляции circZBTB46 при HUVEC, индуцированных LPS (SA-AKI in vitro). Его гиперэкспрессия повышает жизнеспособность HUVEC, снижает апоптоз, воспаление и окислительный стресс в связи с сигналами ERBB2/AKT, что указывает на потенциальную терапевтическую цель, релевантную SA-AKI.
Циркулярные РНК являются появляющимися регуляторами стрессовых реакций, однако их роль в эндотелиальном повреждении, приводящем к острой почечной травме, связанной с сепсисом, остаётся неполностью определенной. Мы выдвинули гипотезу, что циркулярная РНК ZBTB46 (circZBTB46) обеспечивает эндотелиальную защиту, активируя сигналы ERBB2-AKT. Используя клеточную модель, в которой эндотелиальные клетки пуповины человека испытывали липополисахарид, мы количественно оценили экспрессию circZBTB46 и проверили влияние его принудительной экспрессии на выживаемость, апоптоз, воспалительные медиаторы и редокс-гомеостаз. Анализы жизнеспособности клеток и проточная цитометрия оценивали выживаемость и апоптоз. Ферментно-связанные иммуносорбентные анализы измеряли интерлейкин-6, фактор некроза опухолей α и интерлейкин-1β, а реактивные кислородные формы, малондиальдегид, супероксиддисмутазу и каталазу оценивали как показатели окислительного повреждения и антиоксидантной способности. Для определения механизма мы провели профилирование транскриптома с помощью анализа обогащения генных наборов, подтвердили наличие белков путей с помощью вестерн-блоттинга и оценили необходимость с помощью ингибитора ERBB2 AG-825. Липополисахарид подавил circZBTB46. Гиперэкспрессия CircZBTB46 повысила жизнеспособность, снизила апоптоз, снизила провоспалительные цитокины и реактивные виды кислорода, снизила малонддиальдегид, а также повысили активность супероксиддисмутазы и каталазы. Транскриптомические и белковые анализы подтвердили активацию оси ERBB2-AKT, а фармакологическая блокада ERBB2 ослабила цитопротекторию и обратила обороты в редокс-балансе. Эти результаты идентифицируют circZBTB46 как эндогенный тормоз для липополисахаридного эндотелиального повреждения через сигнализацию ERBB2-AKT и номинируют circZBTB46 как механистический узел и потенциальную терапевтическую мишень для острого повреждения почек, связанного с сепсисом.
Сепсис, опасный для жизни системный воспалительный каскад, инициируемый патогенным вторжением, часто заканчивается многоорганнойнедостаточностью 1. В этом критическом контексте SA-AKI становится преобладающим и клинически значимым осложнением в отделенияхинтенсивной терапии 2. Характеризующееся резким ухудшением фильтрационной способности почек одновременно с системной инфекцией, это состояние демонстрирует показатели смертности, превышающие показатели несептической ОПП на 38%–42% в клиническихкогортах 2. Ожидается, что примерно 60% пациентов с диагнозом сепсис ил....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Этот протокол описывает экспериментальные процедуры, используемые для изучения влияния модуляции circZBTB46 на воспалительные сигналы, окислительный стресс и активацию путей ERBB2-AKT в HUVEC.
Клеточная культура
Клетки HUVEC, использованные в этом исследовании, были получены из коммерческого источника. HUVEC использовались как представительная эндотелиальная модель клеток благодаря их широкой доступности, воспроизводимым условиям культуры и высокой эффективности трансфекции, что способствует генетической манипуляции и механистическому исследованию эндотелиальных сигнальных путей....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
qRT-ПЦР-анализ экспрессии circZBTB46 в модели in vitro SA-AKI
Этот набор экспериментов был проведён для проверки гипотезы о том, что экспрессия circZBTB46 изменяется под воздействием стимуляции LPS, а модуляция circZBTB46 влияет на жизнеспособность эндотелиальных клеток и апоптоз в модели in vitro SA-AKI. Изначально экспрессия circZBTB46 изучалась.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Во время сепсиса патогенно-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP), такие как LPS, высвобождаемые патогенами, активируют Toll-подобные рецепторы (например, TLR4), запуская системный воспалительныйответ 26. Этот процесс запускает секрецию нескольких провоспалительных медиаторов, таких как TNF-α, IL-6 и IL-1β, вызывая цитокиновуюбурю 27. Одновременно ЛПС напрямую повреждает сосудистые эндотелиальные клетки, что приводит к микроциркулятор.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы не заявляют о конкурирующих интересах. Авторы заявляют, что основные результаты, представленные в этой рукописи, ранее не публиковались и не рассматриваются для публикации в других местах.
Ни одного.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| AG-825 (ингибитор ErbB2) | MedChemExpress | HY-10197 | 10 μ M — блокировка пути |
| Биоанализатор Agilent 2100 | Agilent | G2939BA | Целостность РНК (RIN≥ 7) |
| Антитела к AKT | Proteintech | 60203-2-Ig | WB (1:15000) |
| Комплект апоптоза Annexin V-APC/PI | Elabscience | E-CK-A327 | Обнаружение апоптоза |
| Антибиотик-антимикотик | Gibco | 15240062 | Концентрация 1% |
| Комплект для количественной оценки белков BCA | Beyotime | P0012 | Концентрация белка |
| КОШКА ЭЛИСА КИТ | МЭЙМЯНЬ | MM-0897H2 | Антиоксидантный фермент |
| Комплект CCK-8 | Додзиндо | CK04 | Анализ жизнеспособности клеток |
| CircRNA seq | Fuzhou Huarong Kehui Biotechnology Co., Ltd. | PE150 | Секвенирование циркРНК и все связанные биоинформатические анализы |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Бекман Коултер | B53000 | Анализ апоптоза |
| DMEM | Gibco (Invitrogen) | 11965092 | Среда для культивирования клеток |
| Комплект для подкладки ECL | Миллипор | WBKLS0100 | Обнаружение белков |
| Антитела к ERBB2 | Sino Biological | 100271-T32 | WB (1:10000) |
| Сыворотка для плода быка (FBS) | Биологическая промышленность | 04-001-1ACS | Добавка 10% (v/v) |
| Антитела к GAPDH | Proteintech | 60004-1-Ig | WB (1:50000) |
| HUVEC | Система Процелла | CP-H082 | Источник клеточной линии |
| IL-1 и бета; ELISA Kit | МЭЙМЯНЬ | MM-0181H2 | Воспалительный фактор |
| Комплект IL-6 ELISA | МЭЙМЯНЬ | MM-0049H2 | Воспалительный фактор |
| Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | 20012850 | Секвенирование РНК |
| Липофектамин 3000 | Инвитроген | L3000008 | Трансфекционный реагент |
| ЛПС (E. coli O111:B4) | Сигма-Олдрич | L2630 | 10 μ g/mL для модели SA-AKI |
| Комплект MDA ELISA | МЭЙМЯНЬ | MM-2037H2 | Маркер окислительного стресса |
| NanoDrop 2000 | Термо Фишер | ND-2000 | Количественная оценка РНК |
| Комплект библиотеки РНК NEBNext Ultra II | NEB | E7770S | Подготовка библиотеки RNA-seq |
| oe-circZBTB46 плазмида | GenScript | Индивидуальный синтез | вектор переэкспрессии circZBTB46 |
| oe-NC плазмида | GenScript | Индивидуальный синтез | Отрицательный управляющий вектор |
| Антитело p-AKT (Ser473) | Proteintech | 66444-1-Ig | WB (1:1200) |
| PrimeScript RT Reagent Kit | Такара | RR047A | Синтез кДНК |
| Мембраны PVDF | Миллипор | IPVH00010 | Перенос западного блота |
| Система QuantStudio 5 | Термо Фишер | A28137 | ПЦР в реальном времени |
| Рибонуклеаза R | Lucigen | RNR07250 | Удаление рРНК |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime | P0013B | Экстракция белка |
| RNAiso Plus | Такара | 9109 | Общая экстракция РНК |
| SOD ELISA Kit | МЭЙМЯНЬ | MM-25469H2 | Антиоксидантный фермент |
| TB Green Premix Ex Taq | Такара | RR420A | Реагент qPCR |
| TNF и альфа; ELISA Kit | МЭЙМЯНЬ | MM-0122H2 | Воспалительный фактор |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.