Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Круговая РНК ZBTB46 снижает апоптоз и окислительный стресс в эндотелиальных клетках человека, повреждённых липополисахаридом, модулируя сигнализацию ERBB2-AKT

260 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69765

⸱

13 февраля 2026 г.

1Department of Emergency, Fuzhou University Affiliated Provincial Hospital, Fujian Provincial Hospital, 2Fujian Provincial Key Laboratory of Emergency Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Острая почечная травма, связанная с сепсисом (SA-AKI), связана с значительными показателями смертности. В данном исследовании наблюдается снижение регуляции circZBTB46 при HUVEC, индуцированных LPS (SA-AKI in vitro). Его гиперэкспрессия повышает жизнеспособность HUVEC, снижает апоптоз, воспаление и окислительный стресс в связи с сигналами ERBB2/AKT, что указывает на потенциальную терапевтическую цель, релевантную SA-AKI.

Аннотация

Циркулярные РНК являются появляющимися регуляторами стрессовых реакций, однако их роль в эндотелиальном повреждении, приводящем к острой почечной травме, связанной с сепсисом, остаётся неполностью определенной. Мы выдвинули гипотезу, что циркулярная РНК ZBTB46 (circZBTB46) обеспечивает эндотелиальную защиту, активируя сигналы ERBB2-AKT. Используя клеточную модель, в которой эндотелиальные клетки пуповины человека испытывали липополисахарид, мы количественно оценили экспрессию circZBTB46 и проверили влияние его принудительной экспрессии на выживаемость, апоптоз, воспалительные медиаторы и редокс-гомеостаз. Анализы жизнеспособности клеток и проточная цитометрия оценивали выживаемость и апоптоз. Ферментно-связанные иммуносорбентные анализы измеряли интерлейкин-6, фактор некроза опухолей α и интерлейкин-1β, а реактивные кислородные формы, малондиальдегид, супероксиддисмутазу и каталазу оценивали как показатели окислительного повреждения и антиоксидантной способности. Для определения механизма мы провели профилирование транскриптома с помощью анализа обогащения генных наборов, подтвердили наличие белков путей с помощью вестерн-блоттинга и оценили необходимость с помощью ингибитора ERBB2 AG-825. Липополисахарид подавил circZBTB46. Гиперэкспрессия CircZBTB46 повысила жизнеспособность, снизила апоптоз, снизила провоспалительные цитокины и реактивные виды кислорода, снизила малонддиальдегид, а также повысили активность супероксиддисмутазы и каталазы. Транскриптомические и белковые анализы подтвердили активацию оси ERBB2-AKT, а фармакологическая блокада ERBB2 ослабила цитопротекторию и обратила обороты в редокс-балансе. Эти результаты идентифицируют circZBTB46 как эндогенный тормоз для липополисахаридного эндотелиального повреждения через сигнализацию ERBB2-AKT и номинируют circZBTB46 как механистический узел и потенциальную терапевтическую мишень для острого повреждения почек, связанного с сепсисом.

Введение

Сепсис, опасный для жизни системный воспалительный каскад, инициируемый патогенным вторжением, часто заканчивается многоорганнойнедостаточностью 1. В этом критическом контексте SA-AKI становится преобладающим и клинически значимым осложнением в отделенияхинтенсивной терапии 2. Характеризующееся резким ухудшением фильтрационной способности почек одновременно с системной инфекцией, это состояние демонстрирует показатели смертности, превышающие показатели несептической ОПП на 38%–42% в клиническихкогортах 2. Ожидается, что примерно 60% пациентов с диагнозом сепсис или септический шок заболеютSA-AKI 3. Таким образом, SA-AKI стал серьёзной проблемой в интенсивной терапии, значительно способствуя заболеваемости исмертности 4. В настоящее время механизм SA-AKI остаётся неполностью изученным. Хотя доклинические исследования включали микроциркуляторную дисфункцию, изменения в клеточном метаболизме и дисбалансы в системе ренин-ангиотензин-альдостерона (РААС), дисфункцию митохондрий и воспалительную дисрегуляцию, патофизиологический механизм SA-ОПП остаётся неуловимой, и в настоящее время отсутствуют оптимальные меры для ранней диагностики и дальнейшеголечения 5,6,7,8. SA-AKI характеризуется усиленным апоптозом, чрезмерным окислительным стрессом ивоспалением 9. В рамках этих исследований липополисахарид (ЛПС) был использован в системе in vitro для имитации проявлений ОПП, ассоциированного с сепсисом, в эндотелиальных клетках вены человека (HUVEC) для предварительного целевогоисследования 5.

В последние годы круговые РНК (циркРНК), недавно выявленная категория некодируемых молекул РНК, привлекают всё больше внимания за свою роль в различныхзаболеваниях 10. ЦиркРНК обладают стабильной круговой структурой и участвуют в клеточных физиологических и патологических процессах, служа молекулярными губками для микроРНК (миРНК), регулируя транскрипцию генов или участвуя в белковыхвзаимодействиях 11. Исследования показали, что циркРНК критически участвуют в модулировании воспаления, окислительного стресса и апоптотических путей, что приводит к увеличению внимания к их возможным последствиям при сепсисе и сопутствующих состояниях, включая острое повреждениепочек 12. Например, hsa_circ_0072463 был определен как перспективный диагностический маркер и терапевтическая мишень для SA-AKI13. Сообщалось, что Circ_001653 облегчал SA-AKI через набор BUD1314. Однако функциональная значимость циркРНК в SA-AKI остаётся в значительной степени неизученной.

Это исследование было разработано для изучения влияния circZBTB46 на функцию эндотелиальных клеток, окислительный стресс и воспалительные реакции с помощью системы in vitro SA-AKI. Построив модель HUVEC, индуцированную LPS, мы исследовали эндотелиальное повреждение при эндотоксинной стимуляции. Следует отметить, что HUVEC с проблемами LPS представляют собой редукционистскую эндотоксин/TLR4-модель эндотелиального стресса, которая релевантна, но не эквивалентна мультифакторной патофизиологии острого повреждения почек, ассоциированных с сепсисом. Эта модель в основном отражает воспалительные активации, окислительный стресс и эндотелиальные ответы, связанные с апоптозом, при этом опускаются ключевые компоненты in vivo , такие как гемодинамические изменения, каскады комплемента и свертывания, молекулярные паттерны, связанные с повреждением, и гетерогенные микробные стимулы. В рамках этого экспериментального контекста мы исследовали, облегчает ли circZBTB46 окислительный стресс и апоптоз, вызванный LPS, модулируя сигнальный путь ERBB2, тем самым защищая функцию эндотелиальных клеток. Насколько нам известно, это исследование предоставляет первые доказательства связи circZBTB46 с эндотелиальными стрессовыми реакциями в контексте острого повреждения почек, связанного с сепсисом. Выясняя молекулярные механизмы, лежащие в основе эндотелиальной защиты с помощью circZBTB46, это исследование может углубить понимание патогенных механизмов SA-AKI и проложить путь к инновационным терапевтическим подходам, основанным на circRNA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол описывает экспериментальные процедуры, используемые для изучения влияния модуляции circZBTB46 на воспалительные сигналы, окислительный стресс и активацию путей ERBB2-AKT в HUVEC.

Клеточная культура
Клетки HUVEC, использованные в этом исследовании, были получены из коммерческого источника. HUVEC использовались как представительная эндотелиальная модель клеток благодаря их широкой доступности, воспроизводимым условиям культуры и высокой эффективности трансфекции, что способствует генетической манипуляции и механистическому исследованию эндотелиальных сигнальных путей при воспалительномстрессе 15,16. HUVEC культивировались в DMEM с добавлением 10% (v/v) сыворотки плода и антибиотиково-антимикотического коктейля в концентрации 1%. Все клеточные культуры поддерживались в стандартных физиологических условиях в увлажнённой камере (37 °C, 5%CO2), что способствовало устойчивому клеточному пролиферированию при сохранении >95% жизнеспособности, подтвержденной анализом исключения трипана-синего. Хотя эндотелиально-специфические среды (например, EGM-2 или M199, дополняемые добавками для эндотелиального роста) обычно рекомендуются для долгосрочного поддержания HUVEC, в этом исследовании использовался DMEM для обеспечения согласованности между экспериментальными методами лечения и совместимости с анализами стимуляции LPS и фармакологическими ингибиторами. Для анализов ингибиторов AG-825 инкубировать HUVEC свежим DMEM с 10 мкм AG-825 в течение 1 часа. Затем добавьте раствор LPS в скважины для достижения конечной концентрации 10 мкг/мл и продолжайте культуру в течение 24 часов. Для минимизации потенциального фенотипического дрейфа HUVEC использовались при низком прохождении и подвергались экспериментальным условиям на основе DMEM только для краткосрочных анализов. Все функциональные эксперименты проводились в определённых окнах обработки, а не в длительном посевировании.

Трансфекция клеток
Для прояснения биологической роли circZBTB46 GenScript синтезировали и валидировали плазмиды с гиперэкспрессией (oe-circZBTB46) и соответствующие конструктивные отрицательные контрольные структуры (oe-NC). HUVEC засеивались в пластины с 6 колодцями с плотностью 1 x 10⁵ ячейки на скважину и культивировались за ночь до достижения слияния ~70%-80% во время трансфекции. Для каждой скважины плазмидная ДНК объемом 2,5 мкг (oe-circZBTB46 или oe-NC) разбавялась в 125 мкл восстановленной сывороточной среды и смешивалась с 2,5 мкл реагента P3000 (пробирка A). Параллельно 3,75 мкл липофектамин 3000 было разведено в 125 мкл восстановленной сывороточной среды (трубка B). Трубки A и B затем комбинировали, аккуратно смешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15–20 минут для формирования комплекса (итоговый комплексный объём: 250 мкл/скважины). Комплексы добавлялись каплями в клетки в полной среде без антибиотиков. После 6 часов инкубации при 37 °C при 5%CO2 трансфекционная среда заменялась свежей полноценной формой роста. Клетки культивировали в течение 48 часов перед последующим анализом. Все процедуры следовали инструкциям производителя.

Модель, индуцированная LPS.
Для создания модели in vitro SA-AKI HUVEC (5 x 105 ячеек/скважины), трансфицированные oe-circZBTB46 или NC, были засеяны в пластины с 96 лунками и поддерживались в течение 24 часов до достижения 80% совпадения. После этого эти клетки проходили лечение LPS при 10 мкг/мл в течение 24 часов. HUVEC без лечения LPS выступали в качестве контрольной группы.

qRT-PCR
Полная экстракция РНК из HUVEC осуществлялась с использованием коммерческого реагента. Обратная транскрипция для синтеза кДНК проводилась с помощью коммерческого реагента. Количественное ПЦР (qPCR) проводилось в тройном экземпляре с использованием системы реального времени ПЦР вместе с мастер-миксом. Экспрессионные количества целевых генов калибровались по U6, анализ проводился с помощью метода 2−ΔΔCT 17,18. Для анализа экспрессии циркРНК U6 малая ядерная РНК использовалась в качестве внутреннего ориентира для нормализации, так как она широко применяется для количественной оценки малых некодирующих РНК и, как сообщается, демонстрирует относительно стабильную экспрессию в краткосрочных экспериментальных условиях in vitro. Последовательности праймеров, применяемых в этом исследовании, приведены следующим образом:

circZBTB46-Вперед: 5'-CGGCGCTCATGAGTAAGAAC-3'

circZBTB46-Реверс: 5'-CGCCTCTTCTACAGACTGGG-3'

U6-Нападающий: 5'-TGCTATCACTTCAGCAGCA-3'

U6-Реверс: 5'-GAGGTCATGCTAATCTCTCTG-3'.

Анализ CCK-8
Жизнеспособность HUVEC оценивалась с помощью коммерчески приобретённого CCK-8. Кратко говоря, клетки были засеяны в пластину с 96 лунами, и клетки подвергались культуре адгезии в течение 24 часов. После этого в каждую скважину добавляли по 10 мкл раствора CCK-8, и клетки дополнительно инкубировали при 37 °C в течение 2 часов. Для измерения оптической плотности (OD) на длине волны 450 нм использовался считыватель микропластин. Предварительные наблюдения показали, что 10 мкг/мл LPS значительно снижает жизнеспособность HUVEC, что привело к выбору этой концентрации для последующих экспериментальных процессов.

Проточная цитометрия
Изначально HUVEC отделялись трипсином без ЭДТА согласно стандартным процедурам. В соответствии с рекомендациями производителя для Annexin V-APC/PI Apoptosis Assay Kit, клеточные суспензии центрифугировались при 1000 x г в течение 5 минут при 4 °C после ферментативной диссоциации. Затем гранулированные клетки были дважды промыты ледяным PBS при аналогичных условиях и вновь суспендированы в 100 мкл 1x буфера связывания. Каждый образец обработали 5 мкл конъюгата Annexin V-FITC и 5 мкл раствора окрашивания йодида пропидия (PI), после чего следовала 10-минутная инкубация в темноте при комнатной температуре (20-25 °C). Наконец, во все образцы было добавлено 400 мкл 1x связывающего буфера, а апоптоз анализировался в течение 1 часа с помощью потокового цитометра. Сначала мероприятия были закрыты FSC/SSC для исключения мусора. Для анализа апоптоза на графике Annexin V-FITC vs PI применялись квадрантные элементы с использованием соответствующих контролей (неокрашенные и однократные/компенсирующие контроли) для определения живых (Annexin V-/PI-), ранних апоптотических (Annexin V+/PI-), поздних апоптотических (Annexin V+/PI+) и некротических (Annexin V-/PI+) популяций. Один и тот же шаблон гейтинга и пороги применялись ко всем выборкам.

Анализ ELISA
Концентрации воспалительных факторов — фактора некроза опухоли-α (TNF-α), интерлейкина-6 (IL-6) и интерлейкина-1β (IL-1β) — в супернатанте культивируемых HUVEC измерялись с помощью коммерчески доступных наборов ELISA. В частности, согласно инструкциям производителя использовались наборы для человека TNF-α ELISA, набор ELISA для человека IL-6 и комплект для ИФА для человека IL-1β. Для каждого анализа в одну скважину загружалось 50 мкл неразбавлённого супернатанта клеточной культуры. Стандартные кривые генерировались с использованием предоставленных последовательных разбавлений (TNF-α: 0-1000 пг/мл; ИЛ-6: 0-500 пг/мл; IL-1β: 0-200 пг/мл). После пробы и стандартного добавления пластины инкубировали при 37 °C в течение 90 минут, после чего следовало пять промыв с буфером для промывания. Затем был добавлен антитела, конъюгированный с биотином, который инкубировался при 37 °C в течение 60 минут. После ещё одного этапа промывки был добавлен стрептавидин-HRP, который инкубировался при 37 °C в течение 30 минут. После финальной промывки был добавлен субстрат с 3,3',5,5'-тетраметилбензидином (TMB), который инкубировался при 37 °C в темноте в течение 15 минут. Реакция завершалась стоп-раствором, и поглощение немедленно измерялось на 450 нм с опорной длиной волны 630 нм. Каждый образец и стандарт анализировались в дубликате, и все эксперименты включали три независимых биологических реплики. Уровни маркеров окислительного стресса — малондиальдегид (MDA), супероксиддисмутазы (SOD) и каталазы (CAT) — в супернатанте оценивались с помощью наборов MDA, SOD ELISA и CAT ELISA Kit соответственно, согласно предоставленнымпротоколам 19,20,21. Для анализов MDA и SOD на скважину использовалось 40 мкл супернатанта без разбавления; для CAT образцы разбавлялись в соотношении 1:10 с помощью буфера анализа перед загрузкой. Стандартные кривые были подготовлены согласно спецификациям комплекта (MDA: 0-60 нмоль/мл; SOD: 0-100 U/mL; CAT: 0-100 U/mL). Инкубационные этапы выполнялись следующим образом: MDA — 60 минут при 37 °C; SOD — 60 мин при 37 °C; CAT — 30 минут при 37 °C. Пластины промывались 4 раза между ключевыми этапами инкубации. Развитие цвета достигалось добавлением соответствующих субстратов и инкубацией при 37 °C (MDA: 15 мин; SOD: 20 мин; CAT: 15 мин). Абсорбция была измерена на 450 нм для SOD и CAT, а для MDA — на 532 нм. Все измерения проводились в дубликативных колодцах, а затем повторялись на трёх независимых биологических репликах.

Секвенирование РНК
Общая РНК извлекалась из HUVEC с помощью коммерческих реагентов согласно инструкциям производителя. Чистота и концентрация РНК оценивались с помощью спектрофотометра путём измерения поглощения на 260 нм и 280 нм (A260/A280), а целостность РНК оценивалась с помощью биоанализатора. Для дальнейшей подготовки библиотеки использовались только образцы РНК с числом целостности РНК (RIN) ≥ 7. Рибосомная РНК удалялась во время подготовки библиотеки с помощью стандартной процедуры истощения рРНК, проводимой коммерческой компанией. По мере показаний обработка РНазой R применялась до создания библиотеки для селективного переваривания линейных РНК и обогащения видов круговой РНК. Фрагментация РНК затем проводилась при повышенных температурных условиях согласно стандартному протоколу руководства по подготовке библиотеки РНК для получения фрагментов РНК соответствующего размера. Секвенирующие библиотеки были подготовлены с использованием РНК-библиотеки подготовки согласно инструкциям производителя и секвенированы на платформе Illumina с использованием стратегии секвенирования с парными концами и длиной чтения 150 bp (PE150). Глубина секвенирования была достаточной для поддержки анализа по всему транскриптому. Исходные чтения секвенирования обрабатывались с использованием стандартных процедур контроля качества для удаления последовательностей адаптеров и чтений низкого качества. Чистые считывания были согласованы с человеческим эталонным геномом, а уровень экспрессии генов был количественнооценен 22,23. Дифференциально экспрессированные гены (DEG) между HUVEC с переэкспрессией circZBTB46 и HUVEC, обработанными NC, при стимуляции LPS, были выявлены с помощью проверенных статистических методов. Анализ обогащения множества генов (GSEA) был проведён для выявления сигнальных путей, связанных с избыточной экспрессией circZBTB46. Гены ранжировались на основе дифференциальной экспрессии между экспериментальными группами. Для анализа обогащения использовались отобранные наборы генов из базы данных молекулярных подписей (MSigDB). Значимость обогащения оценивалась на основе нормированного балла обогащения (NES) и частоты ложного обнаружения (FDR), при этом FDR < 0,25 считался статистически значимым. Секвенирование циркРНК и все связанные биоинформатические анализы были переданы на аутсорсинг.

Идентификация DEG
Для скрининга DEG уровни выражения между двумя различными группами сравнивались с помощью программного пакета DESeq (2012) R. Пороги статистической значимости были определены как p < 0,05 с |log2FC| значение превышает 0,58. Тепловая карта была сгенерирована пакетом Pheatmap R, а для рисования — пакет Goplot2 R.

Анализ функционального обогащения
Анализ обогащения GO и KEGG, полученный на основе линейных транскриптов, проводился на онлайн-платформе EnrichR, а Bubble Chart был построен на основе пакета GOplot R. Программное обеспечение GSEA использовалось на основе матрицы экспрессии и файлов наборов генов, предоставляемых базой данных MSigDB, с установленными параметрами анализа (например, количество перестановок и статистические методы). Обогащение наборов генов оценивалось с использованием нормированного шкала обогащения (NES), P-значения и значений FDR, что позволило глубоко исследовать функции и потенциальные биологические механизмы дифференциально экспрессируемых генов.

Вестерн блот
Общий белок был извлечен из HUVEC (примерно 1 x 10⁶ клетки) с помощью буфера лизиса RIPA с дополнением ингибиторами протеазы и фосфатазы. Концентрация белка была определена с помощью BCA Protein Quantification Kit. Равные количества белка (20 мкг на полосу) были устранены электрофорезом на гелях с 10% натрием додецилсульфат-полиакриламидом (SDS-PAGE) при 80 В в течение 30 минут, затем 120 В в течение 60 минут. Впоследствии белки переносились на мембраны поливинилиденфторида (PVDF) с помощью системы влажного переноса при 100 В в течение 90 минут при 4 °C. Мембраны блокировались 5% обезжиренным молоком в Tris-буферном физиологическом растворе с 0,1% Tween-20 (TBST) в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего следовала инкубация первичными антителами, разбавлёнными в том же блокирующем буфере (обычно 1:1000 для целевых белков и 1:5000 для GAPDH) при 4 °C ночью. Основные использованные антитела были следующими: ERBB2, p-AKT, AKT и GAPDH. После инкубации мембраны промывались 3 раза (по 10 минут за промывку) с помощью TBST, а затем инкубировали с помощью козьего пероксидазы (HRP), конъюгированного козьим анти-кроличьим антителом (1:5000 в блокирующем буфере) в течение 1 часа при комнатной температуре. После трёх дополнительных промывочек TBST (по 10 минут каждая) белковые полоски были визуализированы с помощью усиленного хемилилюминесцентного (ECL) Western Blotting Substrate Kit и получены изображения с помощью системы визуализации. Интенсивность полос была количественно измерена с помощью программного обеспечения.

Статистический анализ
Статистические оценки проводились с использованием GraphPad Prism 10. Данные отображаются как средние ± стандартной ошибке средних (SEM). p-значение было определено < 0,05 для обозначения статистической значимости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

qRT-ПЦР-анализ экспрессии circZBTB46 в модели in vitro SA-AKI
Этот набор экспериментов был проведён для проверки гипотезы о том, что экспрессия circZBTB46 изменяется под воздействием стимуляции LPS, а модуляция circZBTB46 влияет на жизнеспособность эндотелиальных клеток и апоптоз в модели in vitro SA-AKI. Изначально экспрессия circZBTB46 изучалась...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Во время сепсиса патогенно-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP), такие как LPS, высвобождаемые патогенами, активируют Toll-подобные рецепторы (например, TLR4), запуская системный воспалительныйответ 26. Этот процесс запускает секрецию нескольких провоспалительных медиаторов, таких как TNF-α, IL-6 и IL-1β, вызывая цитокиновуюбурю 27. Одновременно ЛПС напрямую повреждает сосудистые эндотелиальные клетки, что приводит к микроциркулятор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах. Авторы заявляют, что основные результаты, представленные в этой рукописи, ранее не публиковались и не рассматриваются для публикации в других местах.

Благодарности

Ни одного.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AG-825 (ингибитор ErbB2)MedChemExpressHY-1019710 μ M — блокировка пути
Биоанализатор Agilent 2100AgilentG2939BAЦелостность РНК (RIN≥ 7)
Антитела к AKTProteintech60203-2-IgWB (1:15000)
Комплект апоптоза Annexin V-APC/PIElabscienceE-CK-A327Обнаружение апоптоза
Антибиотик-антимикотикGibco15240062Концентрация 1%
Комплект для количественной оценки белков BCABeyotimeP0012Концентрация белка
КОШКА ЭЛИСА КИТМЭЙМЯНЬMM-0897H2Антиоксидантный фермент
Комплект CCK-8ДодзиндоCK04Анализ жизнеспособности клеток
CircRNA seqFuzhou Huarong Kehui Biotechnology Co., Ltd.PE150Секвенирование циркРНК и все связанные биоинформатические анализы
CytoFLEX Flow CytometerБекман КоултерB53000Анализ апоптоза
DMEMGibco (Invitrogen)11965092Среда для культивирования клеток
Комплект для подкладки ECLМиллипорWBKLS0100Обнаружение белков
Антитела к ERBB2Sino Biological100271-T32WB (1:10000)
Сыворотка для плода быка (FBS)Биологическая промышленность04-001-1ACSДобавка 10% (v/v)
Антитела к GAPDHProteintech60004-1-IgWB (1:50000)
HUVECСистема ПроцеллаCP-H082Источник клеточной линии
IL-1 и бета; ELISA KitМЭЙМЯНЬMM-0181H2Воспалительный фактор
Комплект IL-6 ELISAМЭЙМЯНЬMM-0049H2Воспалительный фактор
Illumina NovaSeq 6000Illumina20012850Секвенирование РНК
Липофектамин 3000ИнвитрогенL3000008Трансфекционный реагент
ЛПС (E. coli O111:B4)Сигма-ОлдричL263010 μ g/mL для модели SA-AKI
Комплект MDA ELISAМЭЙМЯНЬMM-2037H2Маркер окислительного стресса
NanoDrop 2000Термо ФишерND-2000Количественная оценка РНК
Комплект библиотеки РНК NEBNext Ultra IINEBE7770SПодготовка библиотеки RNA-seq
oe-circZBTB46 плазмидаGenScriptИндивидуальный синтезвектор переэкспрессии circZBTB46
oe-NC плазмидаGenScriptИндивидуальный синтезОтрицательный управляющий вектор
Антитело p-AKT (Ser473)Proteintech66444-1-IgWB (1:1200)
PrimeScript RT Reagent KitТакараRR047AСинтез кДНК
Мембраны PVDFМиллипорIPVH00010Перенос западного блота
Система QuantStudio 5Термо ФишерA28137ПЦР в реальном времени
Рибонуклеаза RLucigenRNR07250Удаление рРНК
RIPA Lysis BufferBeyotimeP0013BЭкстракция белка
RNAiso PlusТакара9109Общая экстракция РНК
SOD ELISA KitМЭЙМЯНЬMM-25469H2Антиоксидантный фермент
TB Green Premix Ex TaqТакараRR420AРеагент qPCR
TNF и альфа; ELISA KitМЭЙМЯНЬMM-0122H2Воспалительный фактор

Ссылки

  1. Vincent, J. L. Current sepsis therapeutics. EBioMedicine. 86, 104318(2022).
  2. White, K. C., et al. Sepsis-associated acute kidney injury in the intensive care unit: incidence, patient characteristics, timing, trajectory, treatment, and associated outcomes. Intensive Care Med. 49 (9), 1079-1079 (2023).
  3. Poston, J. T., Koyner, J. L. Sepsis-associated acute kidney injury. BMJ. 364, k4891(2019).
  4. Bora, E. S., Arda, D. B., Erbas, O. The renoprotective effect of tibolone in sepsis-induced acute kidney injury. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 168 (4), 311-318 (2024).
  5. van der Slikke, E. C., et al. Sepsis is associated with mitochondrial DNA damage and a reduced mitochondrial mass in the kidney of patients with sepsis-AKI. Crit. Care. 25 (1), 36(2021).
  6. Kuwabara, S., Goggins, E., Okusa, M. D. The pathophysiology of sepsis-associated AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1050-1069 (2022).
  7. Pais, T., Jorge, S., Lopes, J. A. Acute kidney injury in sepsis. Int J Mol Sci. 25 (11), 5924(2024).
  8. Sun, J., et al. Mitochondria in sepsis-induced AKI. J Am Soc Nephrol. 30 (7), 1151-1161 (2019).
  9. Zheng, Q., et al. PRDM16 suppresses ferroptosis to protect against sepsis-associated acute kidney injury by targeting the NRF2/GPX4 axis. Redox Biol. 78, 103417(2024).
  10. Beltrán-García, J., et al. Circular RNAs in sepsis: biogenesis, function, and clinical significance. Cells. 9 (6), 1544(2020).
  11. Xu, X., et al. CircRNA inhibits DNA damage repair by interacting with host gene. Mol Cancer. 19 (1), 128(2020).
  12. Chen, Y., et al. Non-coding RNAs in sepsis-associated acute kidney injury. Front Physiol. 13, 830924(2022).
  13. Peng, X., et al. Discovery and verification of mmu_Circ_26986/hsa_Circ_0072463 as a potential biomarker and intervention target for sepsis-associated acute kidney injury. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 154(2024).
  14. Li, X., et al. Circ_001653 alleviates sepsis-associated acute kidney injury by recruiting BUD13 to regulate KEAP1/NRF2/HO-1 signaling pathway. J Inflamm (Lond). 21 (1), 37(2024).
  15. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  16. Kocherova, I., et al. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) co-culture with osteogenic cells: from molecular communication to engineering prevascularised bone grafts. J Cell Mol Med. 23 (8), 5253-5267 (2019).
  17. Duan, Z. Y., et al. U6 can be used as a housekeeping gene for urinary sediment miRNA studies of IgA nephropathy. Sci Rep. 8 (1), 10875(2018).
  18. Veryaskina, Y. A., Titov, S. E., Zhimulev, I. F. Reference genes for qPCR-based miRNA expression profiling in 14 human tissues. Med Princ Pract. 31 (4), 322-332 (2022).
  19. Demirci-Çekiç, S., et al. Biomarkers of oxidative stress and antioxidant defense. Arch Biochem Biophys. 724, 109077(2022).
  20. Ighodaro, O. M., Akinloye, O. A. First line defence antioxidants—superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx): their fundamental role in the entire antioxidant defence grid. Alexandria J Med. 54 (4), 287-293 (2018).
  21. Del Rio, D., Stewart, A. J., Pellegrini, N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 15 (4), 316-328 (2005).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows–Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  23. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2026).
  24. Dauphinee, S. M., Karsan, A. Lipopolysaccharide signaling in endothelial cells. Lab Invest. 86 (1), 9-22 (2006).
  25. Li, F., et al. Qiliqiangxin alleviates Ang II-induced CMEC apoptosis by downregulating autophagy via the ErbB2–AKT–FoxO3a axis. Life Sci. 273, 119239(2021).
  26. Cicchinelli, S., et al. PAMPs and DAMPs in sepsis: a review of their molecular features and potential clinical implications. Int J Mol Sci. 25 (2), 962(2024).
  27. Das, U. N. Infection, inflammation, and immunity in sepsis. Biomolecules. 13 (9), 1322(2023).
  28. Zhou, W. Y., et al. Circular RNA: metabolism, functions and interactions with proteins. Mol Cancer. 19 (1), 172(2020).
  29. Li, S., et al. CircZBTB46 predicts poor prognosis and promotes disease progression of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia. Clin Exp Med. 23 (8), 4649-4664 (2023).
  30. Fu, Y., et al. Circular RNA ZBTB46 depletion alleviates the progression of atherosclerosis by regulating the ubiquitination and degradation of hnRNPA2B1 via the AKT/mTOR pathway. Immun. Ageing. 20 (1), 66(2023).
  31. Long, F., et al. CircZBTB46 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptotic cell death by upregulating SCD. Cancers (Basel). 15 (2), 459(2023).
  32. Uckun, F. M., Qazi, S. Upregulated expression of ERBB2/HER2 in multiple myeloma as a predictor of poor survival outcomes. Int J Mol Sci. 24 (12), 9943(2023).
  33. Moutafi, M., et al. Quantitative measurement of HER2 expression to subclassify ERBB2-unamplified breast cancer. Lab Invest. 102 (10), 1101(2022).
  34. Wei, D., et al. KIF11 promotes cell proliferation via ERBB2/PI3K/AKT signaling pathway in gallbladder cancer. Int J Biol Sci. 17 (2), 514-526 (2021).
  35. Fan, K., et al. ERBB2 S310F mutation independently activates PI3K/AKT and MAPK pathways through homodimers to contribute to gallbladder carcinoma growth. Med Oncol. 39 (5), 64(2022).
  36. Zhu, W., et al. Macrophage migration inhibitory factor facilitates the therapeutic efficacy of mesenchymal stem cell-derived exosomes in acute myocardial infarction through upregulating miR-133a-3p. J Nanobiotechnol. 19 (1), 61(2021).
  37. Du, H., et al. Anti-leukemia activity of polysaccharide from Sargassum fusiforme via the PI3K/AKT/BAD pathway in vivo and in vitro. Mar Drugs. 21 (5), 289(2023).
  38. Wang, W., et al. Hydroxysafflor yellow A ameliorates alcohol-induced liver injury through PI3K/Akt and STAT3/NF-κB signaling pathways. Phytomedicine. 132, 155814(2024).
  39. Yao, L., et al. Finerenone ameliorates mitochondrial dysfunction via PI3K/Akt/eNOS signaling pathway in diabetic tubulopathy. Redox Biol. 68, 102946(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CircZBTB46повреждение липополисахаридамирегуляция апоптозаанализ жизнеспособности клетокпроточная цитометрияострое повреждение почек
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.