Методическая статья

Моделирование инсулинорезистентности адипоцитов с помощью подкожной жировой ткани стромальной сосудистой фракции мышей

DOI:

10.3791/69769

⸱

27 марта 2026 г.

 ,  , 
1State Key Laboratory of Pathogenesis, Prevention and Treatment of High Incidence Diseases in Central Asia, Xinjiang Key Laboratory of Molecular Biology for Endemic Diseases, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Xinjiang Medical University, 2Changzhou Third People's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании представлен экспериментальный протокол с использованием стромальной сосудистой фракции, полученной из подкожной жировой ткани мыши и обработанной дексаметазоном для имитации инсулинорезистентности. Сохраняя сложность жировой ткани, он предоставляет физиологически достоверную платформу для механистических исследований.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инсулинорезистентность в жировой ткани является центральным признаком метаболических нарушений, таких как сахарный диабет 2 типа, однако многие модели in vitro опираются на бессмертные клеточные линии, которые неполно отражают клеточную сложность естественной жировой ткани. Цель этого протокола — создать воспроизводимый и экспериментально доступный метод моделирования инсулинорезистентности адипоцитов с использованием первичных адипоцитов, полученных из стромальной сосудистой фракции (SVF) подкожной жировой ткани мыши. Протокол описывает выделение клеток SVF с помощью ферментативного переваривания, их адипогенную дифференцировку в зрелые адипоциты, насыщенные липидами, и последующую индукцию инсулинорезистентности с помощью дексаметазона. Инсулинорезистентность операционно определяется и подтверждается с помощью функциональных и молекулярных показателей, включая снижение поглощения и потребления глюкозы, стимулируемой инсулином, а также снижение фосфорилирования ключевых инсулиновых сигнальных белков в пути PI3K-AKT. Сохраняя клеточную гетерогенность, полученную от SVF, этот подход обеспечивает систему на основе первичных клеток, поддерживающую исследование сигнализации инсулина адипоцитов в условиях, более близких к физиологии жировой ткани, чем обычные клеточные линии. Этот протокол предназначен для исследователей, ищущих стандартизированную платформу для изучения механизмов инсулинорезистентности адипоцитов или оценки метаболических вмешательств, при этом учитывая, что показания отражают реакции смешанной культуры, полученной из SVF, а не очищенной популяции адипоцитов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сахарный диабет 2 типа (СД2) стал одним из самых быстрорастущих неинфекционных метаболических заболеваний в мире: общее число пациентов сейчас превышает 537 миллионов, а к 2045 году прогнозируется превысить 783 миллиона. Его основные патофизиологические особенности проявляются в виде инсулинорезистентности периферических тканей (IR), сопровождаемой прогрессирующей дисфункциейβ-клеток 2. Суть ИР заключается в значительно ослабленном биологическом эффекте, вызванном физиологически концентрированным инсулином в целевых органах, что приводит к снижению поглощения глюкозы, увеличению выделения глюкозы в печени и нарушению ингибированиялиполиза 3. Жировая ткань — один из важнейших целевых органов инсулина. Ожирение приводит к тому, что жировые клетки становятся нечувствительными к инсулину, снижая поглощение глюкозы, тормозя синтез триглицеридов, одновременно увеличивая липолиз и высвобождая больше свободных жирных кислот, тем самым усугубляя системную инсулинорезистентность 4,5.

В физиологических условиях инсулин активирует путь PI3K-AKT для транслокации транспортера глюкозы 4 (GLUT4) в клеточную мембрану, способствуя поглощению глюкозы и синтезу триглицеридов в адипоцитах. Одновременно инсулин ингибирует активность жировой триглицеридлипазы (ATGL) и гормоночувствительной липазы (HSL) на поверхности липидных капель, тем самым блокируялиполиз 6. Когда происходит ИР, нарушенная инсулиновая сигнализация ослабляет ингибирование липолиза, что приводит к массовому выделению свободных жирных кислот (FFA) в кровоток. Это приводит к массовому выделению FFA в кровоток, вызывая отложение эктопических триглицеридов в таких органах, как печень, скелетные мышцы и поджелудочная железа. Это вызывает токсичность губ и хроническое воспаление, что в конечном итоге способствует появлению и прогрессированиюСД2 7. Поэтому создание зрелой модели адипоцитов, воспроизводящей in vivo характеристики IR, имеет решающее значение для разъяснения молекулярных механизмов IR и разработки новых стратегий вмешательства.

В настоящее время эмбриональная фибробластная клеточная линия 3T3-L1 у мышей стала классическим инструментом для in vitro исследований IR адипоцитов благодаря короткому индуктивному циклу и хорошей воспроизводимости 8,9. Однако эмбриональное происхождение клеток 3T3-L1, их однородный генетический фон и восприимчивость к фенотипическому дрейфу после длительного перехода приводят к значительным различиям в метаболическом поведении по сравнению с взрослыми in situ адипоцитами, ограничивая их трансляционную медицинскуюценность 10,11. В отличие от этого, стромальная сосудистая фракция (SVF), выделенная из подкожной жировой ткани грызунов, богата мультипотентными жировыми стволовыми клетками (ASC). Зрелые адипоциты, дифференцированные от этих ASC, обладают морфологическими, функциональными и транскрипционными характеристиками, которые больше похожи на нативные белые адипоциты, чем широко используемая линия клеток 3T3-L1. Это делает адипоциты, полученные из SVF, комплементарной моделью для изучения инсулиновых сигналов и резистентности в контексте, который лучше приближает сложность первичнойткани 12.

Этот протокол наиболее подходит для исследователей, стремящихся изучить действие инсулина в первичной модели адипоцита, которая сохраняет большую гетерогенность тканей по сравнению с бессмертными клетовыми линиями. Однако пользователям следует учитывать, что SVF — это смешанная популяция, включающая эндотелиальные и иммунные клетки; Таким образом, показания отражают поведение культуры, где адипоциты являются основным, но не исключительным компонентом. Эта модель может быть менее подходящей для исследований, требующих чистой, синхронизированной популяции адипоцитов.

В данном исследовании предлагается протокол построения модели инсулинорезистентной клетки с использованием зрелых адипоцитов, полученных из SVF. Протокол подробно описывает весь процесс выделения SVF, культуры, дифференцировки и индукции инсулинорезистентности, успешно имитируя инсулинорезистентное состояние адипоцитов in vivo. Оценка модели будет проводиться по уровням потребления глюкозы, клеточной морфологии и молекулярных механизмов. Это обеспечивает техническую основу для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе инсулинорезистентности в адипоцитах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментальных исследований животных Синьцзянского медицинского университета (Этическое одобрение: IAGUC-20240228-41).

1. Изоляция SVF

  1. Экспериментальные животные: используйте мышей класса C57BL/6J возрастом 4-6 недель с SPF весом 9-11 г. Размещайте их при 22 ± 2 °C в 12-часовом цикле светло-тёмно с свободным доступом к еде и воде.
  2. Стерильная подготовка: Автоклав — все приборы и расходные материалы при 121 °C в течение 30 минут. Перед экспериментами распылите ламинарную вытяжку этанолом 75% и облучите ультрафиолетовым светом в течение ≥15 минут. Проводите все процедуры в шкафе для биобезопасности класса II. Надевайте стерильные перчатки и маски.
  3. Сбор жировой ткани: Эвтаназия мышей путём вдыхания углекислого газа с последующим вывихом шейки матки. Немедленно погрузите в 75% этанол на 10 минут для дезинфекции поверхности. Используя стерильные офтальмологические ножницы, сделайте круговой разрез вдоль средней линии груди и живота. Проведите тупую диссекцию, чтобы обнажить двустороннюю паховую белую жировую ткань, расположенную на внутренней стороне бедра и простирающуюся к яичке в форме буквы V. Аккуратно удаляйте видимые лимфатические узлы. Соберите жировую ткань в предварительно охлаждённый PBS и выполните три быстрых промывания.
  4. Переваривание коллагеназы: Немедленно переложите промытую жировую ткань в стерильную культурную чашу и измельчите на фрагменты по 1-2 мм³. Добавьте 0,2% коллагеназы типа II (растворённой в PBS Дульбекко, pH 7,4, предварительно нагретой до 37 °C) при объёме 1,5-2 раза больше, чем ткань. Инкубировать при 37 °C на встряхивателе постоянной температуры при 100 об/мин в течение 10 минут. Аккуратно переворачивайте каждые 3 минуты, чтобы избежать переваривания.
  5. Завершение и фильтрация: После завершения переваривания добавьте равный объём предварительно нагретой полной среды (DMEM/F-12 + 10% FBS + 1% пенициллин-стрептомицина) при 37 °C для прекращения реакции. Аккуратно пипетить 5x-8x с помощью наконечника пипетки объёмом 1 мл. Профильтруйте клеточный фильтр диаметром 70 мкм, чтобы удалить непереваренные фрагменты ткани и зрелые адипоциты.
  6. Центрифугирование и промывка: центрифугировать фильтрат при 300 x g в течение 5 минут при 25 °C. Аккуратно отбросьте супернатант, содержащий зрелые адипоциты. Суспензируйте шарик в полном среде. Снова центрифугировать при 300 x g в течение 5 минут при 25 °C. Повторите этот шаг промывания два раза, чтобы удалить остатки коллагеназы и оставшиеся зрелые адипоциты.
  7. Посев и культивирование: Заново подвесьте конечную гранулу в 1 мл полной среды. Семена с плотностью 4 образца пахового жира мышей на 10-сантиметровую чашку для культивы. Инкубировать при 37 °C с 5% CO₂. Выполните первую замену среды через 24 часа, чтобы удалить неадгерирующие клетки. Затем меняйте среду каждые 48 часов. Проходят клетки, когда они достигают слияния 80%-90%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не проходите клетки, когда слияние превышает 90%, так как клетки достигли ингибирования контакта, а их пролиферативная способность уменьшилась.

2. Подготовка рабочего раствора коллагеназы типа II

  1. Реагенты и расходные материалы: получить коллагеназу типа II (активность ≥ 120 U/мг); BSA (безжирная кислота ≥ 98%); HEPES; PBS Дульбекко (содержит Ca²⁺ 1,8 ммоль/л, Mg²⁺ 0,9 ммоль/л), pH 7,2-7,4; 0,22 мкм стерильный фильтр с низким содержанием белка.
  2. Приготовление раствора коллагеназы типа II с 0,2%: взвесить 60 мг порошка коллагеназы типа II, 800 мг BSA и 48 мг HEPES в пробирку центрифугы объемом 50 мл. Разведите до 40 мл с помощью PBS от Dulbecco. Отрегулируйте pH до 7,4 ± 0,1 с использованием 1 M NaOH или HCl. Стерилизуйте фильтром с фильтром 0,22 мкм. Аликвотируйте 5 мл на трубку и храните при -20 °C. Избегайте повторяющихся циклов замораживания и оттаивания.
  3. Индуцировать дифференцировку, когда клетки достигают 100% слияния после прохода. Оптимальное состояние дифференцировки обозначается клетками, имеющими вихрь-подобную морфологию. Первые 48 часов используйте индукционный раствор I, затем переходите к индукционному раствору II (Таблица 1).
  4. Подтверждение успешной дифференцировки по следующим критериям: к 4-му дню индукции окрашивание маслом-красным O-выявляет накопление липидных капель в большинстве клеток (примерно 50%), сопровождаемое статистически значимым ростом (p < 0,05) экспрессии ключевых маркеров адипогенеза.

3. Создание модели инсулинорезистентности

  1. Выберите 4-й день дифференцировки в качестве отправной точки для индуцирования инсулинорезистентности. Подтвердите под микроскопом, что все клетки демонстрируют морфологический переход от веретенообразной формы к круглой, при этом цитоплазма большинства клеток заполнена каплями с высоким показателем преломления.
  2. Замените среду на индукционную среду II с 1 мкмоль/л Декс и продолжайте культивирование в течение 48 часов (Таблица 1). После этой процедуры рассматривается модель инсулинорезистентных адипоцитов. Обратите внимание, что эти клетки не проявляют дальнейших морфологических изменений. Используйте эти клетки непосредственно для анализа поглощения и потребления глюкозы и для обнаружения белков сигнальных путей инсулина.
  3. Критерии успешного установления модели инсулинорезистентности: После 48 часов лечения дексаметазоном подтверждается, что способность к усваиванию глюкозы в большинстве клеток, стимулированных инсулином 100 нм, снижается примерно на 40%. Также подтвердите статистически значимое снижение (p < 0,05) уровня фосфорилирования ключевых белков инсулиновых сигнальных путей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс требует постоянного добавления индукционной среды обслуживания II.

4. Обнаружение остаточной глюкозы в культурном супернатанте

  1. Собирайте супернатанты клеточной культуры в назначенное время. Удалить клетки центрифугированием при 4 °C и 300 x g в течение 5 минут.
  2. Измеряйте концентрацию глюкозы в супернатантах с помощью теста глюкозооксидазы-пероксидазы (GOD-POD). Вычислите концентрации по формуле:
    Концентрация глюкозы (ммоль/л) = (A(образец) - A(пусто)) / (A (стандарт) - A(пусто)) * C(стандартный)
    Потребление глюкозы (ммоль/л) = Концентрация глюкозы в свободной клеточной среде (ммоль/л) - Концентрация глюкозы в клеточном супернатанте (ммоль/л)
    Нормированное потребление глюкозы (ммоль/мг белка) = потребление сырой глюкозы (ммоль/л) / общая концентрация клеточного белка (мг/л)

5. Вестерн блот

  1. Стимулируйте клетки в заданном времени инсулином 100 нМ в полной среде в течение 10 минут при 37 °C, чтобы активировать путь PI3K-AKT. Затем добавьте 200 мкл буфера лизиса клеток в каждую чашу для культивирования размером 3,5 см. Инкубировать на льду 30 минут. Центрифуга при 13 040 x g в течение 10 минут при 4 °C. Перенесите супернатант в новую микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл. Измерьте концентрацию белка с помощью рабочего раствора BCA.
  2. Загрузите сэмплы на гель SDS-PAGE 8%. Пропустите гель при 80 В до тех пор, пока образцы не достигнут интерфейса слоек/разделяющего геля. Увеличьте напряжение до 120 В и запускайте, пока полосы маркеров не будут полностью разрешёны. Проводите передачу при постоянном токе 200 мА в течение 2 часа.
  3. Инкубировать мембрану при комнатной температуре с 5% обезжиренным молоком или BSA в течение 2 часов для блокировки. Промой мембрану три раза с помощью TBST. Затем инкубировать первичным антителом ночью при 4 °C. Первичные антитела (разбавление): AKT: 1:1000, p-AKT (Ser473): 1:1000, β-актин: 1:1000, PI3K p110α: 1:1000, фосфо-PI3K p110: 1:1000, C/EBPα: 1:2000, FABP4: 1:2000.
  4. Промой мембрану три раза с помощью TBST. Впоследствии инкубировать с вторичным антителом, конъюгированным с HRP, при комнатной температуре в течение 1 часа. Вторичные антитела (разбавление): козья противомышиная IgG-HRP: 1:5000, козья противокроличья IgG-HRP: 1:5000.
  5. Обнажить сигнал с помощью ECL хемилюминесценции. Визуализируйте и запишите экспериментальные результаты с помощью вестерн-блот-имиджера.
  6. Проанализируйте значения оттенков серого полученных полос с помощью программного обеспечения ImageJ.

6. Анализ окрашивания на глюкозу

  1. Угощайте клетки в двух указанных временных точках отдельно в течение 12 часов с использованием RPMI 1640, содержащего 1% FBS, чтобы устранить помехи от базальной глюкозы.
  2. После 10 минут стимуляции инсулином 100 нМ добавьте в каждую скважину 1 мл раствора 1x 2-NBDG. Инкубировать тарелку при 37 °C в течение 1 часа, защищая от света.
  3. Мойте клетки 2-3 раза. Добавьте 1 мл готового раствора Hoechst для окрашивания в каждую колодцу. Инкубировать тарелку при 37 °C в темноте в течение 10 минут. Медленно добавляйте раствор для окрашивания вдоль боковой стенки сосуда культуры, избегая прямого контакта с клеточным слоем, чтобы предотвратить отслоение клеток.
  4. Промыйте ячейки 2-3 раза, затем добавьте PBS. Захватывайте флуоресцентные изображения клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.
  5. Проведите количественный анализ изображений с помощью программного обеспечения ImageJ. Используйте ImageJ для разделения каждого канала, изолируя сигнал поглощения глюкозы (зелёный канал) от ядерного флуоресцентного сигнала (синий канал).
  6. Преобразуйте все изображения в 8-битные оттенки серого. Примените алгоритм автоматического порога по умолчанию для определения областей положительного сигнала.
  7. Измерьте среднюю интенсивность флуоресценции в этих областях. Нормализуйте сигнал поглощения глюкозы, деля среднюю интенсивность флуоресценции зелёного канала на соответствующую среднюю интенсивность флуоресценции синего канала.

7. Масляно-красные пятна O

  1. Разведите раствор Oil Red O водой без РНазы в соотношении 3:2. Фильтруйте раствор последовательно через фильтрующую бумагу и фильтр 0,22 мкм для подготовки рабочего раствора.
  2. Аспирируйте клеточную культурную среду и аккуратно промывайте клетки два раза PBS. Добавьте 4% параформальдегида в каждую колодцу и фиксируйте клетки при комнатной температуре на 30 минут.
  3. Добавьте фиксатор и промывайте клетки двойной дистиллированной водой. Добавьте 1 мл рабочего раствора Oil Red O в каждую скважину. Инкубировать тарелку при комнатной температуре в темноте 25 минут.
  4. После окрашивания аспирируете раствор для окрашивания. Тщательно промыйте клетки дистиллированной водой, чтобы удалить фон и окрасить артефакты. Добавьте 1 мл дистиллированной воды, чтобы покрыть клетки. Немедленно захватывайте яркие изображения с помощью инвертированного микроскопа.

8. БОДИПИ

  1. Разведите раствор BODIPY стерильной водой в соотношении объёма 1:200, чтобы подготовить рабочий раствор.
  2. Стирайте защитные защитные клетки стерильным PBS. Добавьте 30 мкл 4% параформальдегидного раствора в каждый накладной слой и фиксируйте при комнатной температуре в течение 30 минут.
  3. Аспирируйте фиксатор и три раза мойте PBS. Добавьте 30 мкл рабочего раствора BODIPY на каждую ячейку coverslip. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.
  4. Стирайте чехлы 3 раза с помощью PBS. Добавьте 30 мкл морилки DAPI на каждый слой. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 10 минут, чтобы метить ядра клеток.
  5. Постирайте чехлы ещё три раза с помощью PBS. Приступайте к монтажу: добавьте 10 мкл противозатухающего монтажного материала на чистое стекло микроскопа. С помощью щипцев аккуратно переверните защитную часть ячейки (ячеточную сторону вниз) на монтажную среду. Дайте монтировке высохнуть в темноте.
  6. Немедленно захватывайте изображения с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа.

9. Статистический анализ

  1. Каждый эксперимент включал три биологических реплики. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 10.0. Представить количественные данные, соответствующие критериям нормального распределения как среднее ± стандартное отклонение (среднее ± SD). Для двух групп, удовлетворяющих нормальности и однородности дисперсии, применим t-тест независимых выборок. Для нескольких групп выполняется односторонний ANOVA, p < 0,05 считается статистически значимым.

10. Безопасность и утилизация отходов

  1. Обращение с тканями животных
    1. Выполнять все процедуры с первичными клетками в шкафу биологической безопасности класса II в стерильных условиях.
    2. Классифицировать все отходы животных тканей, неиспользуемые органы и загрязнённые расходные материалы как биологически опасные отходы. Помещайте такие отходы в специальные мешки для биологической опасности, обрабатываются автоклавированием и, наконец, утилизируются.
  2. Обработка дексаметазона
    1. При взвешивании порошка Dex надевайте перчатки, медицинские маски и лабораторные халаты. Проводите приготовление раствора в вытяжной вытяжной камере.
    2. Собирайте отходы, заражённые Дексом, отдельно, и утилизируйте их как химические отходы.
  3. Обращение с биологически опасными материалами
    1. Тщательно продезинфицируйте рабочие поверхности и внутреннюю часть шкафов биобезопасности с помощью 70% этанола перед началом экспериментальных процедур.
    2. Убедитесь, что все жидкие отходы, образующиеся при культуре клеток, автоклавированы, чтобы сделать их неинфекционными перед утилизацией.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки SVF, выделенные из iWAT мышей C57BL/6J, проявили пунктатную суспензию при первоначальном посеве в посевных чашах. Примерно 40% клеток завершили первичное прикрепление после 18 часов посева; к пятому дню после посева клетки были полностью распространёны, а слияние достигло 95% (рисунок 1A,B). Когда клетки достигали слияния и проявляли характерное вихрево расположение, дифференциационная среда замещалась. К четвёртому дню индукции в клетках было видно множество преломны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обширные исследования показывают, что модели на основе клеток SVF обладают уникальной ценностью для моделирования патологических особенностей жировой ткани. Однако длительный цикл построения этих моделей, который обычно требует примерно 14 дней для выделения тканей, первичной культуры, индуцированной дифференцировки и обработки методом Декса, создаёт трудности для непрерывности экспериментов и стабильности клеточного состояния. Для решения этих проблем в исследовании был принят и оптимиз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликте интересов в этой работе.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82260177) и Государственной ключевой лабораторией патогенеза, профилактики и лечения заболеваний с высокой частотой заболеваемости в Центральной Азии (SKL-HIDCA-2023-20). Финансирующее агентство не повлияло на проектирование, реализацию или интерпретацию этого исследования. Финансирующее агентство не участвовало в написании или подаче этой рукописи на публикацию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 и мю; m-фильтрBiosharpBSF-XS-0232-01
2-NBDGBeyotimeS0561M
3-изобутил-1-метилксантинSigma15879
4% полиформальдегидBiosharpBL1278A
70 μ Сито M-ячейкиBiosharpBS-70-CS
Анти-AKTProteintech10175
Anti-C/EBPαAbcloneab40764
Anti-FABP4Технология клеточной сигнализации 2120-Е
Anti-pAKT (Ser473)Proteintech28731
Anti-PI3K Bioss10657R
Anti-pPI3K (стр. 110)Bioss6417R
Анти-и бета;-АКТИНProteintech60008
Набор для анализа белков BCAТермо Фишер23225
BODIPY 493/503ИнвитрогенD3922
BSA SigmaA7030
Клеточные срезы Biosharp BiosharpBS-14-RC
Контейнер для клеточной культуры, 100 мм x 20 ммКорнинг430167
Клетка для культуры, 35 мм x 10 ммКорнинг430165
Решение DAPISolarbio28718-90-3
ДексаметазонSigmaD2915
DMEM/F-12GibcoC11330500BT
Дульбекко s PBSЦитиваSH30264.02
Трубка ЭппендорфаКорнингMCT-175-C 
FBSLife-iLabAC03L0555
Флуоресцентный микроскопLeicaDMi8
Глюкозооксидаза-пероксидазаНанкин ЦзяньчэнF006-1-1
Козла против мышей IgG-HRPПекинский Чжуншань ЦзинцяоZB-2305
Козла против кроликов IgG-HRPПекинский Чжуншань ЦзинцяоZB-2301
GraphPad PrismВерсия 10.0.0/
ХепесBioFroxx1112GR025
HochestbiosharpBL803A
ImageJВерсия 1.54p/
ИнсулинSolarbio18040
Лазерный сканирующий конфокальный микроскопNikon Ti-E
Антифейдинг с монтажной средойSolarbioS2100
Масло-красный раствор для окрашивания OSigmaO0625-25G
Пенициллин-стрептомицинГиклонSV30010
Буфер RIPAТермо Фишер89901
РозиглитазонSigmaR2408
RPMI 1640VivaCellC3010-0500
Обезжиренное молокоBioFroxx1132GR500
TBS BufferSolarbioT1060
Коллагеназа типа IISigmaC6885

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. NCD Risk Factor Collaboration (NCD-RisC). Worldwide trends in underweight and obesity from 1990 to 2022: a pooled analysis of 3663 population-representative studies with 222 million children, adolescents, and adults. Lancet. 403 (10431), 1027-1050 (2024).
  2. Stumvoll, M., Goldstein, B. J., van Haeften, T. W. Type 2 diabetes: principles of pathogenesis and therapy. Lancet. 365 (9467), 1333-1346 (2005).
  3. Arkan, M. C., et al. IKK-beta links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat Med. 11 (2), 191-198 (2005).
  4. Li, M., et al. Trends in insulin resistance: insights into mechanisms and therapeutic strategy. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 216(2022).
  5. Miao, Z., et al. The causal effect of obesity on prediabetes and insulin resistance reveals the important role of adipose tissue in insulin resistance. PLoS Genet. 16 (9), e1009018(2020).
  6. Santoro, A., McGraw, T. E., Kahn, B. B. Insulin action in adipocytes, adipose remodeling, and systemic effects. Cell Metab. 33 (4), 748-757 (2021).
  7. Segalla, L., Chirumbolo, S., Sbarbati, A. Dermal white adipose tissue: Much more than a metabolic, lipid-storage organ. Tissue Cell. 71, 101583(2021).
  8. Hoehn, K. L., et al. IRS1-independent defects define major nodes of insulin resistance. Cell Metab. 7 (5), 421-433 (2008).
  9. Zhou, X., Wang, L. L., Tang, W. J., Tang, B. Astragaloside IV inhibits protein tyrosine phosphatase 1B and improves insulin resistance in insulin-resistant HepG2 cells and triglyceride accumulation in oleic acid (OA)-treated HepG2 cells. J Ethnopharmacol. 268, 113556(2021).
  10. Liu, X., Liu, X. N., Li, T. J., Liu, B. Research Progress of the Differentiation of 3T3-L1 Preadipocytes into Mature Adipocytes. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 39 (5), 727-731 (2017).
  11. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  12. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  13. Tan, S. X., et al. Selective insulin resistance in adipocytes. J Biol Chem. 290 (18), 11337-11348 (2015).
  14. Zebisch, K., Voigt, V., Wabitsch, M., Brandsch, M. Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes. Anal Biochem. 425 (1), 88-90 (2012).
  15. Wang, T., Sharma, A. K., Wolfrum, C. Novel insights into adipose tissue heterogeneity. Rev Endocr Metab Disord. 23 (1), 5-12 (2022).
  16. Taniguchi, C. M., et al. Divergent regulation of hepatic glucose and lipid metabolism by phosphoinositide 3-kinase via Akt and PKClambda/zeta. Cell Metab. 3 (5), 343-353 (2006).
  17. Jacinto, E., et al. SIN1/MIP1 maintains rictor-mTOR complex integrity and regulates Akt phosphorylation and substrate specificity. Cell. 127 (1), 125-137 (2006).
  18. Cozzone, D., et al. Isoform-specific defects of insulin stimulation of Akt/protein kinase B (PKB) in skeletal muscle cells from type 2 diabetic patients. Diabetologia. 51 (3), 512-521 (2008).
  19. Sakoda, H., et al. Dexamethasone-induced insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes is due to inhibition of glucose transport rather than insulin signal transduction. Diabetes. 49 (10), 1700-1708 (2000).
  20. Burén, J., Liu, H. X., Jensen, J., Eriksson, J. W. Dexamethasone impairs insulin signalling and glucose transport by depletion of insulin receptor substrate-1, phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B in primary cultured rat adipocytes. Eur J Endocrinol. 146 (3), 419-429 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PI3K AKT

Похожие статьи